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Biology

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

Abstract

상해 후에 간 재인구는 환경 독소의 노출 후에 즉각적인 기관 실패 그리고 죽음을 방지하는 포유동물의 중요한 특징입니다. 재인구 도중 생기는 유전자 발현에 있는 변경의 더 깊은 이해는 상해의 조정에 있는 간 기능의 회복을 승진시키기 위하여 치료 표적을 확인하는 것을 도울 수 있었습니다. 그럼에도 불구하고, 재채백 간세포를 구체적으로 분리하는 방법은 세포 마커의 부족, 제한된 세포 수, 및 이들 세포의 취약성에 의해 억제된다. Fah -/- 마우스 모델과 함께 리보솜 친화성 정제(TRAP) 기술을 번역하여 간 손상 설정에서 재인구를 재추정할 수 있도록 하여 재채우기의 유전자 발현 프로파일링을 허용합니다. 간세포. TRAP을 사용하면 세포 유형별 번역 mRNA가 신속하고 효율적으로 분리됩니다. 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)태그 리보좀 단백질 (RP), GFP :RPL10A를 선택적으로 발현하는 간세포에서 mRNA를 번역하는 친화성 기반 격리와 TRAP을 활용하는 방법을 개발했습니다. TRAP은 유전자 발현 단면도를 바꿀 수 있는 형광 활성화 세포 선별에 필요한 긴 기간을 우회한다. 더욱이, 재채백 된 간세포만이 GFP:RPL10A 융합 단백질을 발현하기 때문에, 단리된 mRNA는 주변의 부상당한 간세포 및 간에서 다른 세포 유형으로부터의 오염이 결여된다. 친화도 정제 mRNA는 고품질이며 다운스트림 PCR- 또는 고처리량 시퀀싱 기반 유전자 발현 분석을 허용합니다.

Introduction

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척추 동물의 주요 대사 기관으로, 간은 포도 당 항상성에 대 한 책임, 혈 청 단백질 합성, 담 즙 산 분 비, 그리고 xenobiotic 물질 대사 와 해독. 간은 즉각적인 간 부전을 방지하기 위해 독소에 노출시 부상당한 자렌치를 재생하는 특별한 능력을 가지고1. 그러나, 재생의 실패는 급성 간 기능 부전으로 이어질 수있는 아세트 아미노 펜 또는 알코올 과소비의 설정에서 발생할 수 있습니다2. 또한, 바이러스성 간염 감염, 지방간 질환 및 지방 간염으로 인한 만성 간 손상은 간 섬유증, 간경변 및 간세포 암종을 일으킬 수 있습니다3. 말기 간 질환에 대한 유일한 치료 치료는 이식이지만 장기 부족에 의해 제한되어 모든 환자에 대한 효율적인 치료를방지4. 따라서 독성 간 손상 후 회복 과정을 더 잘 이해하는 것은 병들린 장기의 기능을 구출하기에 충분한 재생을 자극하는 치료법의 개발에 중요합니다.

간 재생 연구를 위한 가장 광범위하게 적용된 모델 시스템은 설치류의 부분 간절제술이며, 이 때 간장의 상당 부분이 절제되어 급속한 간세포 팽창을자극한다 5. 그러나, 부분 간절제술은 인간에서 급성 간 손상의 설정에서 종종 관찰되는 면역 세포 침윤 및 간세포 괴사의 부족으로 인한 독성 간 손상에 따른 간세포 팽창을 되풀이하지 않는다6. 장기 재생의이 형태를 모델링하는 더 적합한 시스템은 Fah-/- 마우스, 이는 적절한 티로신 대사에 필요한 기능적 fumarylacetoacetatetatehydrolase (FAH)가 부족하고 죽음에 이르는 심각한 간 손상을 개발7. 이들 마우스는 식수에서 니티시논의 약물로 치료함으로써 무기한 건강한 상태로 유지될 수 있다. 대안적으로, FAH 발현은 간세포의 서브세트로의 이식유전자 전달에 의해 복원될 수 있으며, 이는 니티시노네 제거 시 간을 다시 채우도록 확장될 것이다8.

간세포 를 다시 채우는 유전자 발현 변화를 프로파일링하기 위해, 이웃의 부상당한 간세포 및 기타 세포 유형으로부터의 오염 없이Fah-/- 마우스에서 복제 된 간세포를 구체적으로 분리하는 도구가 필요합니다. 불행하게도, 간세포의 형광 보조 세포 선별 (FACS)은 (1) 간 관류 후 가난한 회복으로 이어지기 때문에 어렵고, (2) 간세포를 복제하는 것은 크기가 매우 다양하여 격리를 만듭니다. FACS에 의한 순수한 집단의 어렵고, (3) 간 관류에서 RNA 격리까지의 절차 시간이 2시간보다 크므로, 따라서 유전자 발현 프로파일은 샘플이 획득되기 전에 상당한 인공 변화를 겪을 수 있다9.

양자구를 다시 채우는 데 에피토프 태그가 달린 리보솜의 발현은 장기 수확 직후, 대량 간으로 리보솜에 의해 결합된 리보솜에 의한 mRNA를 능동적으로 번역하는 신속한 분리를 허용한다. 조직이 lysates. 여기서, 우리는 번역-리보솜 친화도 정제(TRAP)10을 수행하고 고처리량 RNA-seq(TRAP-seq)를 수행하는 프로토콜을 설명하고, Fah에서간세포를 재채우시에서 mRNA를 구체적으로 분리및 프로파일링하는 데있다.-- 마우스9. FAH를 가진 녹색 형광 단백질 태그 리보솜 단백질 (GFP:RPL10A)의 공동 발현은 GFP:RPL10A를 포함하는 폴리좀에 의해 결합된 mRNA번역의 친화도 정제를 허용합니다. 이 방법은 간 관류와 같은 모든 세포 해리 단계를 피하여 간세포를 다시 채우는 연약한 것을 분리합니다. 대신, 그것은 표적으로 한 세포에서 RNA를 급속하게 추출하기 위하여 전체 기관 조직 및 항체의 lysis를 이용합니다. 마지막으로 TRAP-seq를 통해 풍부하고 고품질의 mRNA를 분리하면 시퀀싱 분석과 같은 다운스트림 애플리케이션을 통해 재수집 프로세스 중에 유전자 발현의 동적 변화를 프로파일링할 수 있습니다.

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Protocol

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마우스의 사용을 관련시키는 모든 방법은 펜실베니아 대학에 있는 동물 복지의 펜트 오피스의 IACUC에 의해 제공된 지침과 일치합니다.

1. 시약 준비

  1. 사이클로색시미드
    1. 0.1 g/mL 사이클로헨시미드 500 μL을 만들려면 50 mg의 사이클로헵시미드를 메탄올 500 μL에 일시 중단하십시오.
      주의 사항: 사이클로육시미드는 환경에 매우 독성이 있으며 선천성 기형을 일으킬 수 있습니다. 사이클로육시미드를 함유한 모든 폐기물과 완충제는 적절한 처리를 위해 수거되어야 합니다.
      참고: 사이클로육시미드는 최대 1일 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 사이클로육시미드는 번역을 억제합니다.
  2. 디티오트레이톨 (DTT)
    1. 1 M DTT의 1 mL을 만들려면 RNase가없는 물에 0.15g의 DTT 분말을 일시 중단하십시오.
      주의 사항: DTT는 피부, 눈 및 호흡기에 자극을 일으킬 수 있습니다.
      참고: DTT는 세제입니다. DTT는 -20°C에서 보관할 수 있다. 1M DTT를 50 μL의 일회용 별표에 저장하는 것이 좋습니다.
  3. 디옥시콜레이트 (DOC)
    1. 10% DOC를 만들려면 50mL 원유관에 DOC 1 g을 일시 중단하고 RNase가 없는 물을 최대 10 mL까지 추가합니다. 파우더가 녹을 때까지 힘차게 흔들어 주세요.
      참고: 10% DOC 용액은 약간 노란색이며 실온(RT)에서 최대 1년간 보관할 수 있습니다. DOC는 핵 용해에 사용됩니다.
  4. GFP 항체
    1. Aliquot GFP 항체를 처음 사용할 때. 스냅은 aliquots를 동결하고 -80 °C에서 저장합니다.
      참고: 50 μg의 GFP 항체를 일회용 알리쿼트에 저장하는 것이 좋습니다.
  5. B 생체 질화 단백질 L
    1. 1x 인산완충식염수(PBS)에 생체측 단백질 L을 다시 일시 중단하여 최종 농도1 μg/μL을 만듭니다.
      참고: 재중단 된 용액은 최대 6 개월 동안 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

2. 버퍼 준비

  1. 소 혈청 알부민 (BSA) 버퍼
    1. 3% BSA 버퍼의 50 mL을 만들려면, 1.5 g의 IgG- 및 프로테아제 프리 BSA 파우더를 40 mL의 PBS에 넣고 소용돌이를 넣습니다. BSA가 용해된 후, PBS를 최종 부피 50 mL에 추가합니다.
      참고: BSA 버퍼는 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
  2. 해부 버퍼
    1. 해부 완충재 50mL을 만들려면 행크의 균형 잡힌 염액(HBSS) 5 mL, 1M 4-4-1-1-피페라진에탄에설포닉산(HEPES), 1M 포도당 1,750μL, 1M NaH3Co의 200 μL을 결합합니다. 50 mL의 최종 부피에 RNase없는 물을 추가합니다.
      참고: 해부 완충스톡은 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
    2. 사용 직전에 0.1 g/mL의 사이클로헵시미드 100 μg/mL를 넣고 얼음을 유지하십시오.
  3. 고염 완충제
    1. 50 mL의 고염 완충재를 만들려면 1 M HEPES 1 mL, 2 M KCl 8.75 mL, 1 M MgCl2의500 μL, 100 % 노일페닐 폴리에틸렌 글리콜(재료 표)을RNase가없는 물에 추가하십시오.
      참고: 고염 완충재는 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
    2. 사용 직전에 0.5 μL/mL의 1M DTT와 0.1 g/mL 의 0.1 g/mL 사이클로헨시미드를 추가하십시오. 신선한 고염 완충액을 얼음 위에 보관하십시오.
  4. 저염 버퍼
    1. 저염 완충재 50mL을 만들려면 1M HEPES 1 mL, 3.75 mL 의 2 M KCl, 500 μL 의 1 M MgCl2,100 % 노일페닐 폴리에틸렌 글리콜 500 μL을 44.25 Ml의 RNase 없는 물에 추가하십시오.
      참고: 저염 완충재는 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
    2. 사용 전에 0.5 μL/mL의 1M DTT및 1 μL/mL의 0.1 g/mL 사이클로헨시미드를 추가하십시오. 신선한 저염 완충제는 얼음 위에 보관하십시오.
  5. 조직 분해 완충제
    1. 50 mL의 조직 분해 완충스톡을 만들려면 1 m HEPES 1 mL, 3.75 mL 의 2 M KCl 및 500 μL의 1 M MgCl2를결합합니다. 50 mL의 결승에 RNase 없는 물을 추가합니다.
      참고: 해부 완충스톡은 최대 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
    2. 사용 직전에 EDTA 프리 프로테아제 억제제 1정/10 mL, 0.1 g/mL 사이클로헨시미드 1μl/mL, RNase 억제제 10 μL/mL을 추가하십시오. 얼음에 신선한 조직 lysis 버퍼를 유지합니다.

3. 자기 구슬에 대한 항체의 컨쥬레이션

  1. 항 체
    1. 모든 시료에 필요한 GFP 항체의 양을 계산하고 1개의 추가 샘플을 준비합니다.
      참고: 각 샘플에 대해 각 GFP 항체의 50 μg가 필요합니다.
    2. 얼음에 GFP 항체를 해동하고 4 °C에서 10 분 동안 최대 속도 (>13,000 x g)로회전하고 새로운 미세 원심 분리튜브로 초나토인을 옮니다.
      참고: 항체 제제 단계는 비드 제제 이전에 수행될 수 있고 해동된 항체는 얼음 상에 보관될 수 있다. 대안적으로, 이 부분은 자기 비드 및 생체측단백질 L의 배양 동안에 수행될 수 있다.
  2. 마그네틱 비드 재부착
    1. 부드러운 파이펫팅에 의해 자기 비드(재료표)를다시 일시 중단합니다.
    2. 각 샘플에 대해 자기 비드 150 μL을 사용하십시오. 모든 샘플에 필요한 자기 비드의 부피를 계산하고 추가 하나를 준비합니다. 재중단된 자기 구슬을 1.5 mL 또는 2 mL 마이크로 원심 분리튜브로 옮김. 실험에 1mL 이상이 필요한 경우 총 량을 동일한 볼륨으로 분할합니다.
    3. 자기 스탠드에서 >1 분 동안 구슬을 수집하고 상급을 제거합니다. 마그네틱 스탠드에서 마이크로 원심 분리튜브를 제거하고 PBS 1 mL을 추가한 다음 비드를 위아래로 피펫팅합니다. >1 분 동안 자기 스탠드에 구슬을 수집하고 PBS를 제거합니다.
  3. 단백질 L 코팅 구슬의 준비
    1. 각 샘플에 60 μL의 생체 질화 단백질 L을 사용하십시오. 단백질 L이 이전에 -20°C에서 다시 중단되고 저장되는 경우, 단백질 L을 얼음 위에 녹인다. 단백질 L을 사용하기 전에 다시 중단하는 경우, 모든 샘플에 필요한 양을 가지고 추가 하나를 준비하십시오.
    2. 재중단 및 세척된 자기 구슬에 생물학적 단백질 L의 계산된 부피를 추가합니다. 1x PBS를 추가하여 1.5 mL 미세원원지 튜브를 사용하는 경우 최종 부피 1 mL, 또는 2 mL 마이크로 원심 분리튜브를 사용하는 경우 1.5 mL를 만듭니다. 튜브 회전자에서 RT에서 35 분 동안 생체 살균 단백질 L로 자기 구슬을 배양하십시오.
      참고: 항체는 구슬이 생체 질화된 단백질 L로 배양하는 동안 이 단계에서 제조될 수 있다.
    3. 마그네틱 스탠드에 단백질 L 코팅 구슬을 모으고 >1 분 동안 장식품을 제거하십시오. 마그네틱 스탠드에서 미세원심분리튜브를 제거하고 3% BSA 버퍼 1 mL을 추가한 다음 단백질 L 코팅 구슬을 5회 이상 부드럽게 피펫팅합니다.
    4. 마그네틱 스탠드에 코팅 된 구슬을 모으고 >1 분 동안 장신구를 제거하십시오. 3% BSA로 세탁 단계를 다른 4회(총 5회)에 반복합니다.
  4. 항체 결합
    1. 계산된 양의 GFP 항체를 단백질 L 코팅 비드에 넣고 튜브 로터상에서 4°C에서 1시간 동안 배양한다.
      참고: 항체 배양 후, 선호도 매트릭스를 소용돌이하지 않도록 특별한주의를 기울입니다.
    2. 인큐베이션 중에 모든 시료에 필요한 총 부피를 계산하여 저염 완충액을 준비하고 사용하기 전에 낮은 염분 완충재에 0.5 μL/mL의 1M DTT 및 0.1 g/mL의 사이클로힙시미드 1μl/mL을 추가합니다.
      참고: GFP 컨쥬게이션 비드의 각 튜브를 세척하기 위한 저염 완충제 3mL과 GFP 컨쥬게이션 비드의 재서스펜션을 위한 200 μL/샘플이 필요합니다. 신선한 저염 완충제는 2시간 동안 얼음위에 보관할 수 있습니다.
    3. 자기 스탠드에서 1 분 동안 친화성 매트릭스를 수집하고 상급을 제거합니다. 1 mL의 저염 버퍼를 추가하고 상하로 부드럽게 파이펫을 사용하여 선호도 매트릭스를 세척합니다. 자기 스탠드에서 1분 동안 친화성 매트릭스를 수집하고 저염 버퍼를 제거합니다. 저염 완충액으로 세탁 단계를 다른 2회(총 3회)에 반복합니다.
    4. 각 샘플에 200 μL의 선호도 매트릭스가 있도록 저염 버퍼에서 비드를 다시 일시 중단합니다.
      참고: 선호도 매트릭스는 최대 2주 동안 4°C에서 0.02% NaN3에 보관될 수 있다. 선호도 매트릭스는 선호도 매트릭스가 1주일 이상 보관된 경우 1주일 또는 하룻밤 내에 상화 매트릭스가 제조된 경우, 4°C에서 튜브 로터에서 3회 재세척하고 튜브 로터에 부드럽게 재중단해야 한다. 이 단계 이후에 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
      주의 사항: 아지드 나트륨은 환경에 매우 독성이 있습니다. 산과의 접촉은 독성 가스를 생성합니다. 모든 폐기물은 적절한 처리를 위해 수거되어야 합니다.

4. 간 조직 Lysis

  1. 버퍼 준비 및 장비 설정
    1. 필요한 미세 원심 분리튜브의 수를 계산하고, 라벨을 붙이고 얼음에 식힙니다.
      참고: 일반적으로 각 샘플마다 7개의 1.5 mL 마이크로원지 지 관이 필요합니다: 나머지 해부된 간은 1개, 균질화된 간 용해액의 4mL에 대해 4개, 과다한 산나트륨 을 옮기는 경우 2개.
    2. 모든 샘플에 필요한 총 부피를 계산하여 신선한 해부 버퍼를 준비하고 0.1 g/mL 사이클로헵시미드의 1 μL/mL을 추가합니다. 실험 내내 차가운 상태를 유지하기 위해 신선한 해부 버퍼를 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 각 샘플에 대해 10 mL의 해부 버퍼가 필요합니다.
    3. 모든 시료에 필요한 총 부피를 계산하여 신선한 용해 완충액을 준비하고 EDTA 프리 프로테아제 억제제 1 정/10 mL, 0.1 g/mL 사이클로헤이드 1μl/mL, RNase 억제제 10 μL/mL을 각각 추가합니다. 실험 전반에 걸쳐 얼음에 대한 해부 완충장치를 유지합니다.
      참고: 각 샘플에 대해 4 mL의 용해 버퍼가 필요합니다.
    4. 조직 분쇄기(재료의 표)를설정하여 폴리테트라 플루오로에틸렌 (PTFE) - 유리 튜브가 간 조각의 균질화 중에 얼음 위에 놓일 수 있도록합니다. PTFE 유리 튜브에 4 mL의 냉매 완충장치를 넣습니다.
  2. 간 균질화 다시 채우기
    1. 8-12주 된 Fah를안락사시키고 TRAP 벡터를 주입하고 승인된 동물 실험 지침에 따라 마취 및 자궁 경부 탈구로 1-4주 동안 다시 채워집니다.
    2. 마우스를 해부 보드에 놓고 70 % 에탄올로 복부를 스프레이하십시오. 집게를 사용하여 복부에 피부와 복막을 낮게 텐트하고 가위를 사용하여 횡절개를 합니다. 내장을 자르지 않도록 주의하여 넓은 U 자형 의 각막 플랩을 만들기 위해 가위로 계속 자릅니다. 간을 노출하기 위해 흉골 위에 peritone 플랩을 뒤집습니다.
    3. 조심스럽게 미세 가위와 집게를 사용하여 간을 제거하고 신속하게 헹구기 위해 차가운 해부 완충제에 조직을 배치합니다. 동결 된 조직을 균질화하려면 조직을 해동하지 않고 차가운 용해 완충액으로 원하는 양의 간 조직을 PTFE 유리 튜브로 신속하게 옮기십시오.
      참고: 해부된 조직은 해부 완충액으로 세척한 후 -80°C에서 플래시 냉동 및 보관할 수 있다. 이 단계 이후에 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
    4. 페트리 접시에 간을 무게와 간 조각의 200-500 mg을 분리하고 PTFE 유리 튜브로 이동합니다. 남은 간 조직을 미리 냉각된 미세원원지 튜브에 넣고 플래시 동결합니다.
    5. 300 rpm에서 시작하여 적어도 5 스트로크 동안 간 구조에서 간세포를 해리시키는 모터 구동 균질화제에서 샘플을 균질화합니다. 매번 유리관을 낮추되 단백질 변성의 원인이 될 수 있는 폭기를 방지하기 위하여 유봉이 용액 위로 상승하지 않도록 주의하십시오.
    6. 속도를 900 rpm으로 올려 간 조직을 최소 12 회 이상 균일하게 균질화하십시오.
    7. 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브 당 용해액1 mL 이하의 라벨이 부착된 미리 냉각된 튜브로 용해액을 옮김을 전달합니다. 4 mL의 용해 버퍼를 사용하는 경우, 1 개의 튜브를 유지하고 나머지 3 개의 튜브를 플래시동결하십시오.
      참고: 용해염은 다음 동물을 해부하고 신선한 용해를 준비하는 동안 최대 1 시간 동안 얼음에 보관 할 수 있습니다. 균질화된 간은 용해 단계 후 플래시 냉동 및 -80°C에서 보관될 수 있다. 냉동 용해물을 사용하는 경우 고립 된 RNA에서 50 % 감소가있을 수 있습니다. 이 단계 이후에 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
  3. 핵 라해스
    1. 10 분 동안 4 °C에서 2,000 x g에서 간 을 용해시키고 얼음에 새로운 미리 냉각 된 미세 원심 분리 튜브로 상급을 옮니다.
    2. 10% 논일페닐 폴리에틸렌 글리콜의 상급 부피 1/9를 첨가하여 최종 농도 1% 노일페닐 폴리에틸렌 글리콜을 만들고 미세원심지 튜브를 부드럽게 반전시켜 혼합합니다.
    3. 미세원심지 튜브를 빠르게 스핀다운하고 샘플 부피의 1/9를 10% DOC를 추가하여 최종 농도1% DOC를 만들고 미세원심지 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 미세 원심분리기 튜브를 빠르게 회전시키고 얼음에 5 분 동안 배양하십시오.
    4. 핵용해액을 4°C에서 20,000 x g에서 10분 간 10분 간 냉각시키고 얼음 위에 미리 냉각된 새로운 미세원원지 튜브로 옮긴다.
      참고: 미토콘드리아고갈된 상월제는 나머지 샘플을 수집하는 동안 몇 시간 동안 얼음위에 놓을 수 있습니다.

5. 면역 침전

  1. 각 튜브에 대해, 상복부 초음파 전 대조군으로서 상수의 총 부피의 1%를 꺼내 어투과 매트릭스와 배양 후 표적 농축을 비교한다. 밤새 4°C에서 튜브 회전자 위에 사전 면역 침전 제어를 배치하고, 면역 침전된 샘플이 처리되는 것과 같은 방식으로 처리한다.
  2. 각 샘플에 선호도 매트릭스 200 μL을 추가합니다. 각 샘플에 선호도 매트릭스를 추가하기 전에 부드러운 파이펫팅으로 구슬을 다시 일시 중단하는 데 각별한 주의를 기울이십시오. 튜브 회전자상에서 부드럽게 혼합하여 밤새 4°C에서 친화성 매트릭스로 라이세드를 배양합니다.
    참고: 이 단계 이후 최대 하루 동안 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

6. RNA 격리

  1. 버퍼 준비 및 장비 설정
    1. 마그네틱 랙을 최소 30분 동안 4°C에 놓고 냉각을 사전에 하고 실험 내내 랙을 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 필요한 미세 원심분리튜브의 수를 계산하고 얼음 또는 4 °C에서 미리 식힙니다.
      참고: 일반적으로 각 샘플은 최종 정제 RNA에 대해 1개의 미세 원심분리튜브를 필요로 합니다.
    3. 5.2 단계에서 튜브를 빠르게 스핀 다운하고 적어도 1 분 동안 자기 랙에 놓음으로써 구슬을 수집하십시오.
      참고: 언바운드 분획을 포함하는 수집된 상급체는 정제 후 전사체 농축을 위한 결합 분획과 비교하기 위해 -80°C에서 플래시 동결 및 저장될 수 있다. 이 단계 이후에 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
    4. 고염 완충재에 0.5 μL/mL의 1M DTT및 0.1 g/mL의 사이클로헨시미드의 1 μL/mL을 추가하여 고염 완충액을 준비합니다.
      참고: 각 샘플에 대해 5 mL의 고염 완충제가 필요합니다.
  2. RNA 격리
    1. 각 튜브에 신선한 고염 완충액 1mL를 넣고 거품을 내주지 않고 적어도 5회 이상 부드러운 파이펫팅을 합니다.
      참고: 불충분한 세척은 거품의 소개가 RNA 분해를 가속화할 수 있는 동안 언바운드 전사체의 배경을 소개할 수 있었습니다.
    2. 자기 스탠드에서 >1 분 동안 구슬을 수집하고 상급을 제거합니다. 고염 완충제으로 세탁 단계를 4회(총 5회) 반복합니다.
    3. 남은 고염 완충액을 제거하고 자기 스탠드에서 미세 원심 분리 튜브를 제거하고 RT에서 5 분 동안 따뜻하게하십시오.
    4. β-메르카포에탄올로 100 μL의 용해 완충제(RNA 절연 키트에 제공)에서 비드를 다시 중단시금.
      참고: 다나투란트 구아니딘 티오시야네이트를 함유하는 임의의 RNA 분리 및 정제 키트는 친화성 매트릭스로부터 결합된 RNA를 방출하는 용해 완충제으로서 사용될 수 있다. 구니딘 티오차네이트는 저온에서 결정화될 수 있기 때문에 RNA 추출은 RT에서 처리되어야 합니다.
    5. 최고 속도에서 적어도 5s에 대한 비드 및 버퍼를 소용돌이, 신속하게 마이크로 원심 분리 튜브의 측면에 버퍼를 수집하고 10 분 동안 RT에서 버퍼로 구슬을 배양하여 비드 결합 RNA를 용해 완충액으로 방출합니다.
    6. >1분 동안 자기 스탠드 상에 비드를 수집하고 상판체를 수집하여 키트에 명시된 RNA 정제 프로토콜에 따라 RNA 정화를 즉시진행한다(자료표).
      참고: 용해 완충액에 용출된 RNA를 함유하는 상상물질은 해동 시 RT까지 예열하여 정화하기 전에 최대 1개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있다.
    7. 단리된 RNA의 최대 품질을 달성하려면 DNase 소화 및 모든 RNA 용출 단계를 포함한 모든 선택적 단계를 수행합니다. RNA 분리 키트 또는 RNase-free 물에 의해 제공되는 용출 완충제를 최대 RNA 복구를 위해 60°C로 가열합니다.
      참고: 단리된 RNA는 최대 1개월 동안 -20°C 또는 -80°C에서 수년 동안 보관될 수 있다. 이 단계 이후에 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

7. RNA 품질 분석(권장)

  1. 생체 분석기11을 사용하여 RNA 품질을 평가하고 분광광도계12를 사용하여 면역 침전 과정을 반복하는 것이 충분하고 고품질의 RNA를 얻기 위해 필요한지 확인합니다.
    참고: 고처리량 시퀀싱을 위한 최적의 RNA 품질은 라이브러리 준비 키트 및 시퀀싱 플랫폼에 지정된 프로토콜을 따라야 합니다.

8. 다운스트림 응용 프로그램

참고: TRAP 프로토콜에 의해 단리된 총 RNA는 RNA-seq(TRAP-seq)를 포함하는 다수의 표준 다운스트림 애플리케이션에서 사용될 수 있다. 표준 역전사 및 정량적 PCR 프로토콜은 TRAP 다음에 사용될 수도 있다.

  1. TRAP-seq의 경우, 표준 방법13에따라 RNA-seq 라이브러리 준비를 수행한다.
  2. RNA-seq의 경우, 폴리아데닐화 폴리(A) 전사체의 올리고 d(T) 기반 농축을 이용한 상업용 RNA-seq 키트를 사용하여 cDNA 염기서열 라이브러리를 준비합니다. 대안적으로, 총 RNA 품질이 폴리(A) 농축에 권장되는 것보다 낮은 경우, rRNA 고갈 모듈을 사용한다. 그러나, 시퀀싱 후 더 많은 rRNA 정렬을 볼 것으로 예상.

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Representative Results

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Fah-/- 마우스의 간세포를 다시 채우는 유전자 발현을 프로파일링하기 위해, Gfp:Rpl10a 융합 및 Fah 트랜스게전유전자는 트랜스포종 함유 플라스미드8(TRAP 벡터) 내에서 간으로 공동 전달된다. 유체 역학 주입(그림 1A). 니티시돈의 제거는 부상당한 자렌치마를 다시 채우기 위해 FAH를 안정적으로 발현하는 간세포에 대한 선택 압력을 생성하는 독성 간 손상을 유발한다9. 면역형광 염색은 간 재포종의 2주 후에 간세포를 재채우면서 FAH 및 GFP:RPL10A 융합 단백질의 공동 발현을 확인한다(도1B).

다음의 대표적인 실험에서, TRAP-seq는 마우스 간세포 및 재채기를 사용하여 수행하였다. 먼저, 정지된 간세포로부터 GFP 태그가 붙은 리보솜을 얻기 위해, 형질전환로사 LSL-GFP-L10A 마우스를 AAV8-TBG-Cre 7일 전에 주입하여 모든 간세포에서 RPL10A 발현을 유도하였다. 우리는 또한 mRNA 번역의 격리가 특이적이었다는 것을 확인하기 위하여 음성 통제로 야생 모형 마우스에서 집합된 간 견본을 가공했습니다, RNA는 GFP:RPL10A를 표현하는 마우스에서만 추출될 수 있었다는 것을 의미하. 분리된 RNA의 농도는 융합 단백질을 발현하는 세포의 수와 상관관계가 있으며, 모든 간세포가 GFP를 발현하기 때문에 가장 높은 수율을 생성하는 정지 샘플과 상관:RPL10A AAV8-TBG-Cre 주입 후(그림 2A). 반대로, 거의 모든 RNA는 GFP:RPL10A 이식유전자가 없는 야생 형 대조군에서 검출가능하였고, 이는 TRAP 절차가 매우 특이적이고 배경이 낮다는 것을 나타낸다. TRAP이 GFP로 재모합을 받는 간 조직에 사용되었을 때:RPL10A-형질 전환 간세포, 풍부하고 고품질의 RNA를 수득하였다(도2B). 대조적으로, 음성 대조군 견본을 위한 바이오분석기를 통해 RNA 추적이 검출되지 않았습니다.

다운스트림 유전자 발현 분석은 TRAP-절연 RNA상에서 역전사 및 정량적 PCR 또는 RNA-seq를 통해 수행될 수 있다. Gsta1은 산화 스트레스 손상으로부터 간을 보호하는 주요 해독 펩티드인 글루타티온의 대사에 중요한 역할을 하는 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 인코딩한다15. Gsta1 발현은 정지된 간세포에 비해 간세포를 재채기하는 데 10배 이상 유도되는 반면, 임계주기(Ct) 값은 입력 RNA의 부족으로 인해 야생형 마우스로부터 TRAP 단리RNA로 검출되지않았다(그림 3) A).RNA 품질이 유전자 발현 분석에 큰 영향을 줄 수 있습니다. RNA-seq 실험의 경우, 라이브러리 제제 키트 및 시퀀싱 플랫폼의 권고에 따라 RNA 품질의 평가를 수행해야한다(도 3B). 바이오 분석기는 종종 RNA 무결성 번호 (RIN)를 결정하는 데 사용되며, 높은 RIN은 게놈에 대한 mRNA 정렬의 높은 비율과 상관 관계가 있는(그림 3B,왼쪽), 반면 낮은 RIN은 리보좀 판독의 높은 비율로 이어지는 반면, mRNA 저하(그림 3B,오른쪽). 그림 3 C,D는 TRAP-seq가 정지및 다시 채우는 간세포에서 차등 유전자 발현을 식별할 수 있음을 보여준다. 예를 들어, Alb 발현은 억제되고 Afp 발현은 간 재모합 중에 업게질되며, 복제 된 간세포가 간 대사 기능을 억제하는 덜 분화 된 상태를 가정한다는 것을 반영합니다. 재채우기9,16.

Figure 1
그림 1: Fah를가진 TRAP의 구현-/- 다시 채우는 간세포의 유전자 발현 변경을 프로파일링하기 위하여. (A)GFP:RPL10A 융합 단백질을 슬리핑 뷰티 트랜스포종 시스템에서 FAH와 발현한 회로도가 이어서Fah-/- 마우스에 주입하였다. 녹색 육각형은 FAH와 GFP:RPL10A의 안정적인 표현으로 간세포를 다시 채우는 것을 나타내지만 검은 육각형은 부상을 입고 죽어가는 간세포입니다. (b)대표적인 면역형광 염색은 재채기 간세포에서 GFP 태그된 리보소말 단백질 L10A(녹색) 및 FAH(적색)의 공동 발현을 입증한다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: TRAP은 고품질 RNA의 세포 유형별 분리를 허용합니다. (A)RNA의 수율은 GFP:RPL10A를 발현하는 간세포의 수와 긍정적으로 상관된다. 야생형 마우스로부터의 RNA의 낮은 수율은 GFP:RPL10A의 발현 없이 소스로부터 TRAP의 특이성을 입증한다. (B)GFP:RPL10A및 야생형 간에서 재채우징된 간으로부터 분리된 총 RNA의 바이오분석기 트레이스는 TRAP의 특이성을 입증한다. GFP가 없는 야생형 간 조직으로부터 분리된 총 RNA:RPL10A 이식유전자는 최소한의 RNA가 수집되었음을 보여 주지만, 이식유전자 발현 조직은 충분한 고품질 RNA를 제공한다. 리보소말 RNA 피크는 성공적인 TRAP10다음에 존재한다는 점에 유의하십시오. FU, 형광 유닛. RIN, RNA 무결성 번호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: TRAP-단리RNA는 다운스트림 유전자 발현 분석을 위해 사용될 수 있다. (A)대표적인 역전사 및 간세포 를 다시 채우는 Gsta1의 정량적 PCR 결과. 야생형 동물로부터 분리된 RNA로 Ct 값이 검출되지 않았다. (B)고처리량 시퀀싱 후 단리된 RNA의 정렬 분석, 격리 후 RNA 무결성 을 결정하는 것의 중요성을 입증하였다. 고품질 RNA는 mRNA 읽기(녹색)의 더 높은 백분율을 초래하고, 낮은 품질의 RNA는 대부분의 mRNA가 저하됨에 따라 리보솜 읽기(빨간색)의 훨씬 더 높은 백분율로 이어집니다. RIN, RNA 무결성 번호. (C,D) 통합 유전체학 뷰어(IGV)의 RNA-seq의 트랙은(C) Alb(D) Afp loci에서 정지 및 재채우기 간세포로부터 정제된 mRNA 친화성의 판독을 판독한다. 3' 읽기 바이어스는 폴리(A) 선택 파이프라인의 전형입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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TRAP-seq는 에피토프 태그리보솜을 통해 mRNA를 번역하는 세포 유형별 격리를 위한 기술이며 FACS9의시간 요구 사항과 같은 제한을 우회하기 때문에 FACS 접근법에 대한 대안을 제시한다. 대신, TRAP은 대량 조직에서 직접 RNA의 신속하고 효율적인 격리를 허용, 유전자 발현에 있는 어떤 변경든지 피하는 것을 돕습니다. TRAP-seq는 특히 다시 채우는 Fah-/- 마우스 간에서 사용하기에 적합하며, 니티시돈의 제거 후 간세포 확장은 세포 자율적이며 간세포 의 서브세트의 유전자 발현 프로파일링을 일체화하여 가능하게 합니다. 전이 유전자. TRAP 벡터는 또한 cDNA, 단발머리핀 RNA 및 가이드 RNA를 포함하는 유전자 활성화 또는 -침묵 분자17과병현될 수 있으며, 특정 유전자의 활성화 또는 억제의 글로벌 유전자 발현에 미치는 영향을 연구한다. 대안적으로, RosaLSL-GFP-L10A 형질전환 마우스는 Cre 재조합 활성을 가진 임의의 세포에서 유전자 발현을 프로파일화하는 능력을 제공한다. GFP:RPL10A는 Cre를 발현하는 임의의 세포에서 구체적으로 발현될 수 있기 때문에, 간 손상 및 재모합 동안 간에서 다른 세포 유형의 역할을 연구할 수 있었다. 예를 들어, TRAP 형질전환 마우스를 사용하여 CK19-Cre 마우스를 교차하여 GFP:RPL10A를 담관옥시에서 발현하고 TRAP-seq이어서 재모합 과정 동안 담즙 상피에서 유전자 발현의 변화를 연구할 수 있다.

유전자 발현의 정확한 프로파일링을 보장하기 위해, 조직 해부 전에 모든 완충제 및 친화성 매트릭스를 준비하는 것이 중요하다. 다각성안정화(10)를 보장하고 RNA 분해를 방지하기 위해 달리 지정하지 않는 한 모든 단계는 차가운 완충액이 있는 얼음에서 수행되어야 합니다. 모든 완충제는 RNase-free 시약으로 제조되어야 하며, TRAP-seq 프로토콜은 RNA 분해 및 면역침전된 RNA의 낮은 수율을 방지하기 위해 RNase 없는 환경에서 수행되어야 한다. 선호도 매트릭스는 튜브 로터에서 하룻밤 동안 부드러운 재서스펜션과 함께 사용하기 2주 전까지 제조할 수 있다. 항체 컨쥬게이드, 단백질 L 코팅 자기 구슬의 붕괴를 방지하기 위해 매트릭스를 적극적으로 흔들지 않도록 특별한주의를 기울여야합니다. 친화성 매트릭스를 준비하는 방법은 생체측화된 단백질 L에 자기 비드의 컨쥬게이션을 포함하고 그 다음에 항 GFP 항체를 가진 배양. 그러나, 시판되는 단백질 A/G 자기 비드는 대체될 수 있다; 사용되는 경우, 초기 활용 단계를 건너뛰고 항체 결합으로 직접 진행한다. 또한 대체 에피토프 태그는 적절한 수정을 통해 위의 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

RNA 격리 및 정제 단계가 일시 중지될 수 있는 다양한 지점이 있습니다(위의 프로토콜 참조). 그러나, 일단 간 견본이 수확되면, 면역 침전을 계속하는 것이 좋습니다, 고립된 RNA의 수율은 이 단계에서 동결로 ~50%까지 떨어질 수 있기 때문에10. 조직은 mRNA 번역을 억제하기 위해 사이클로헵시미드를 포함하는 해부 버퍼로 신속하게 헹구어야합니다. 불충분 한 조직 lysis 또한 낮은 RNA 수율에 기여할 수 있습니다. 최소한의 폭기10을보장하면서 모터 균질화로 조직 덩어리가 보이지 않을 때까지 얼음에 조직을 균질화하는 것이 중요합니다. 추가적으로, 높은 염완완충으로 충분한 세척은 선호도 매트릭스에 리보소말 단백질의 비특이적 결합의 제거를 보장하기 위해 중요하다. 야생형 음성 대조군을 포함하는 것은 면역침전의 특이성 및 세척 단계의 효율을 평가하는 데 도움이 된다. 또한, RNase-free DNase 처리를 포함하는 상용 RNA 정제 키트를 사용하면 RNA 순도가 증가한다.

더욱이, GFP:RPL10A 융합 단백질의 발현 및 풍부성을 확인하고 다운스트림 분석을 위한 충분한 RNA를 얻는 데 필요한 조직의 양을 평가하는 것이 좋습니다. 조직 절편 또는 용해제는 GFP:RPL10A의 발현을 검증하기 위해 면역 기반 검출 방법에 사용될 수 있었다. 단리된 RNA의 양은 (1) GFP:RPL10A를 발현하는 세포의 수, (2) 이식유전자의 발현 수준, 및 (3) 이식유전자를 발현하는 세포의 크기 및 ploidy에 의해 달라질 수 있다. 조직의 권장량의 절반을 두 배로 사용하는 파일럿 실험은 TRAP-seq에 대한 최적의 입력 용해량을 결정하는 데 유용할 수 있습니다. 우리의 손에, 우리는 GFP를 발현하는 간세포의 1-2 %만큼 적은 ~150 ng의 RNA를 얻을 수 있었다 : RPL10A에서 200 mg의 재 채우기 Fah-/- 간, 트랜스 유전자 발현을 가진 ~2 x 105 다각형 간세포를 나타내는9.

TRAP-seq 방법론은 리보솜 결합 mRNA를 분리하여 세포의 번역 mRNA 풀을 프로파일링합니다. 따라서 생성된 시퀀싱 읽기는 전사체가 아닌 '트랜스라토메'에 해당합니다. TRAP은 가교 된 복합체가 아닌 네이티브에서 수행되기 때문에 리보솜 발자국을 번역하는 것은 수집되지 않습니다. 풋프린트 분석이 필요한 경우, 상기 프로토콜은 관련 가교로 수정해야 하며, 그 다음에 면역침전(CLIP)방법론18을참조해야 한다. TRAP의 또 다른 한계는 GFP:RPL10A 융합 단백질을 발현하는 충분한 수의 세포의 요구이다. 관심 있는 세포 유형이 작은 실험의 경우, 여러 생물학적 샘플을 결합하는 것은 RNA-seq19를가능하게 하기에 충분한 RNA를 분리하는 데 필요할 수 있다. 더욱이, TRAP-seq는 관심있는 세포 유형에서 GFP:RPL10A의 존재를 요구한다. 이는 세포에 대한 특정 전달 시스템이 없거나 Cre 발현을 유도하는 세포 형 특정 프로모터가 사용할 수 없는 경우 도전이 될 수 있다.

최근 단세포 RNA-seq(scRNA-seq) 기술의 개발로 인해 다양한 세포 유형의 실리코 식별이 뒤따르고, 특정 세포 유형의 관심사를 분류하지 않고 시퀀싱이 가능해졌습니다20 ,21,22. 그러나, scRNA-seq는 아직도 기관에서 세포의 해리를 요구합니다. Fah-/- 재모명 모델의 경우, 간 관류 및 간세포 분리는 부상및 복제 간세포의 취약성으로 인해 매우 어렵고 비효율적입니다. 사실, 우리는 아직 Fah 플라스미드의 유체 역학 주입 후 재집단을 겪고 있는 Fah -/- 마우스로부터 충분한 간세포를 분리할 수 없었습니다. 추가적으로, 조직을 처리하는 데 걸리는 시간에, 유전자 발현 수준은 변경될 수 있었습니다. 간 관류프로토콜은 따뜻한 허혈 시간30분까지 소요됩니다. 처리 시간을 줄이고 격리 효율을 높이기 위해 간 관류를 최적화하는 미래의 방법론은 ScRNA-seq를Fah-/- 마우스 모델 시스템과 다른 부상 및 재인구 모델에 통합할 수 있게 합니다. 이것은 또한 모든 간 세포 모형의 연구 결과 가능하게 할 것입니다.

결론적으로, TRAP-seq와FAh-/- 마우스의 통합은 간 재인구를 촉진할 수 있는 치료 표적을 확인하기 위하여 복제 간세포의 특정 격리 및 유전자 발현 프로파일링을 허용합니다. 이 방법은 잠재적인 약물 표적 또는 바이오마커를 식별하기 위해 유전자 발현 변화의 질병 특이적 식별을 위해 간 및 기타 장기 시스템에서 다른 세포 유형을 연구하기 위해 구현될 수 있다. 유사한 기술은 친화성 정제를 사용하여 간세포를 다시 채우는 것에서 핵을 수집하고, 그 후 이들 특정 세포의 후생유전학적 분석을 수행하기 위해 사용될 수있다 16.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), P30-DK050306 (KJW에 대한 파일럿 보조금)에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

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References

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마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링
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Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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