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Biology

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

doi: 10.3791/60242 Published: September 17, 2019

Summary

Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.

Abstract

O repovoamento do fígado após ferimento é uma característica crucial dos mamíferos que impede a falha imediata do órgão e a morte após a exposição de toxinas ambientais. Uma compreensão mais profunda das mudanças na expressão gênica que ocorrem durante a repovoação poderia ajudar a identificar alvos terapêuticos para promover a restauração da função hepática no cenário de lesões. No entanto, os métodos para isolar especificamente os hepatócitos repovoadores são inibidos pela falta de marcadores celulares, números de células limitados e a fragilidade dessas células. O desenvolvimento de traduzir a tecnologia Ribossoma da purificação da afinidade (armadilha) conjuntamente com o modelo de Fah-/- mouse para recapitular o repovoamento no ajuste de ferimento de fígado permite o perfilamento da expressão de gene do repovoamento Hepatócitos. Com TRAP, o tipo de célula-específico traduzindo mRNA é rapidamente e eficientemente isolado. Nós desenvolvemos um método que utilize a armadilha com isolação afinidade-baseada de traduzir o mRNA dos hepatócitos que expressam seletivamente a proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetaram a proteína ribosomal (RP), GFP: RPL10A. A armadilha contorna o período de tempo longo exigido para a classificação fluorescência-ativada da pilha que poderia mudar o perfil da expressão de Gene. Além disso, desde que somente os hepatócitos repovoamento expressam a proteína de fusão de GFP: RPL10A, o mRNA isolado é desprovido da contaminação dos hepatócitos feridos circunvizinhos e dos outros tipos da pilha no fígado. O mRNA afinidade-purified é da alta qualidade e permite a jusante PCR-ou a análise sequenciando-baseada high-throughput da expressão de Gene.

Introduction

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Como o principal órgão metabólico em vertebrados, o fígado é responsável pela homeostase da glicose, síntese de proteínas séricas, secreção de ácido biliar e metabolismo xenobiótico e desintoxicação. O fígado possui uma extraordinária capacidade de regenerar o parênquima lesionado após a exposição a toxinas para prevenir a insuficiência hepática imediata1. Entretanto, a falha da regeneração pode ocorrer no ajuste do overconsumption do paracetamol ou do álcool, que pode conduzir à falha de fígado aguda2. Além disso, a lesão hepática crônica causada por infecção por hepatite viral, doença hepática gordurosa e esteatohepatite pode causar fibrose hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular3. O único tratamento curativo disponível para doença hepática em estágio terminal é o transplante, mas é limitado pela escassez de órgãos, impedindo o tratamento eficiente para todos os pacientes4. Uma melhor compreensão do processo de recuperação após lesão hepática tóxica é, portanto, crucial para o desenvolvimento de tratamentos para estimular a regeneração suficiente para resgatar a função no órgão doente.

O sistema modelo mais amplamente aplicado para o estudo da regeneração hepática é a hepatectomia parcial em roedores, em que uma grande proporção do fígado é ressecada para estimular a rápida expansão do hepatócitos5. No entanto, a hepatectomia parcial não recapitulou a expansão dos hepatócitos após lesão hepática tóxica devido à falta de infiltração de células imunológicas e necrose celular de hepatócitos, muitas vezes observada no ajuste de lesão hepática aguda em humanos6. Um sistema mais adequado para modelar esta forma de renovação de órgãos é o Fah-/- mouse, que carece de fumarilacetoacetato hidrolase funcional (Fah) necessário para o metabolismo da tirosina adequada e desenvolve danos graves no fígado levando à morte7. Estes ratos podem ser mantidos em um estado saudável indefinidamente pelo tratamento com o nitisinona da droga na água bebendo. Alternativamente, a expressão de Fah pode ser restaurada pela entrega do transgene a um subconjunto dos hepatocytes, que expandirá para repovoar o fígado em cima da remoção do nitisinona8.

Para analisar as alterações da expressão gênica de repovoamento de hepatócitos, é necessária uma ferramenta para isolar especificamente os hepatócitos replicantes no Fah-/- mouse sem contaminação dos hepatócitos feridos vizinhos e outros tipos de células. Infelizmente, a triagem celular por fluorescência (FACS) dos hepatócitos é difícil, pois (1) a fragilidade dos hepatócitos que repovoam leva à má recuperação após a perfusão hepática, (2) replicar hepatócitos são altamente variáveis em tamanho, tornando o isolamento de uma população pura por FACS difícil, e (3) o tempo do procedimento da perfusão do fígado ao isolamento do RNA é maior de 2 h, daqui os perfis da expressão de gene podem sofrer mudanças artificiais substanciais antes que as amostras estejam adquiridas9.

Alternativamente, a expressão de ribossomas epitope-etiquetados especificamente em repovoamento hepatócitos permite o isolamento rápido de traduzir ativamente o mRNA limitado por ribossomas usando a purificação da afinidade imediatamente depois da colheita do órgão, com fígado maioria lisados de tecido. Aqui, nós descrevemos um protocolo para executar a purificação da afinidade da traduzir-ribosome (armadilha)10 seguido pelo RNA-seqüenciamento da elevado-produção (armadilha-Seq), para isolar especificamente e perfil mRNA em repovoamento hepatócitos no Fah-/- rato9. A coexpressão da proteína ribossomal proteína-etiquetada verde fluorescente (GFP: RPL10A) com Fah permite a purificação da afinidade de traduzir o mRNA limitado por detectados que contem GFP: RPL10A. Este método evita todas as etapas da dissociação da pilha, tais como a perfusão do fígado para isolar os hepatocytes repovoamento frágeis. Em lugar de, utiliza o lysis do tecido inteiro do órgão e os anticorpos para extrair ràpida o RNA especificamente das pilhas do alvo. Finalmente, o isolamento de mRNA abundante e de alta qualidade via TRAP-Seq permite que aplicações downstream, como a análise de sequenciamento, analisem a mudança dinâmica da expressão gênica durante o processo de repopulação.

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Protocol

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Todos os métodos que envolvem o uso de camundongos são consistentes com as diretrizes fornecidas pelo IACUC do Penn Office de bem-estar animal na Universidade da Pensilvânia.

1. preparação do reagente

  1. Cicloheximida
    1. Para fazer 500 μL de 0,1 g/mL de cicloheximida, suspender 50 mg de cicloheximida em 500 μL de metanol.
      Atenção: A cicloheximida é extremamente tóxica para o meio ambiente e pode causar malformação congênita. Todos os resíduos e tampões contendo cicloheximida devem ser recolhidos para eliminação adequada.
      Nota: A cicloheximida pode ser armazenada a 4 ° c por até 1 dia. Cycloheximide inibe a tradução.
  2. Dithiothreitol (DTT)
    1. Para fazer 1 mL de 1 M DTT, suspenda 0,15 g de pó de DTT em água RNase-livre.
      Atenção: O DTT pode causar irritação na pele, olho e trato respiratório.
      Nota: O DTT é um detergente. O DTT pode ser armazenado a-20 ° c. Recomenda-se armazenar 1 M DTT em alíquotas de uso único de 50 μL.
  3. Deoxycholate (DOC)
    1. Para fazer 10% DOC, suspenda 1 g de DOC em um tubo cônico 50 mL e adicione água RNase-livre até 10 mL. Agitar vigorosamente até que o pó seja dissolvido.
      Nota: A solução de 10% DOC é ligeiramente amarela e pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT) por até 1 ano. DOC é usado para lise nuclear.
  4. Anticorpos GFP
    1. Aliquot GFP anticorpos ao utilizar pela primeira vez. Fixar congelar as alíquotas e armazenar em-80 ° c.
      Nota: Recomenda-se armazenar 50 μg de anticorpos GFP em alíquotas de uso único.
  5. B proteína biotinilada L
    1. Ressuscitou a proteína L biotinylated em 1x fosfato-tamponado salino (PBS) para fazer a concentração final 1 μg/μL.
      Nota: A solução de ressuspensão pode ser armazenada a-20 ° c por até 6 meses.

2. preparação do tampão

  1. Tampão de albumina sérica bovina (BSA)
    1. Para fazer 50 mL do tampão de 3% BSA, adicione 1,5 g de IgG-e pó protease-livre de BSA em 40 mL de PBS seguido pelo vortex. Depois que o BSA é dissolvido, adicione PBS a um volume final de 50 mL.
      Nota: O tampão de BSA pode ser armazenado em 4 ° c por até seis meses.
  2. Tampão de dissecção
    1. Para fazer 50 mL de estoque de tampão de dissecção, combine 5 mL de solução de sal balanceada de 10x Hank (HBSS), 125 μL de 1 M 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineetanoesulfonic Acid (HEPES), 1.750 μL de 1m de glicose e 200 μL de 1 M NaHCO3. Adicione água RNase-livre a um volume final de 50 mL.
      Nota: O estoque de tampão de dissecção pode ser armazenado a 4 ° c por até seis meses.
    2. Imediatamente antes do uso, adicione 100 μg/mL de 0,1 g/mL de cicloheximida e mantenha-se no gelo.
  3. Tampão do elevado-sal
    1. Para fazer 50 ml de estoque de tampão de sal alto, adicionar 1 ml de 1 m HEPES, 8,75 ml de 2 m KCl, 500 μL de 1 m MgCl2e 500 μL de 100% nonilfenil polietileno glicol (tabela de materiais) para RNase-água livre.
      Nota: O estoque do tampão do elevado-sal pode ser armazenado em 4 ° c por até seis meses.
    2. Imediatamente antes da utilização, adicione 0,5 μL/mL de 1 M de DTT e 1 μL/mL de 0,1 g/mL de cicloheximida. Mantenha o tampão fresco do alto-sal no gelo.
  4. Tampão do baixo-sal
    1. Para fazer 50 ml de estoque de tampão de sal baixo, adicionar 1 ml de 1 m de HEPES, 3,75 ml de 2 m KCl, 500 μL de 1 m MgCl2, e 500 μL de 100% nonilfenil polietileno glicol a 44,25 ml de água RNase-livre.
      Nota: O estoque do tampão do baixo-sal pode ser armazenado em 4 ° c por até seis meses.
    2. Adicionar 0,5 μL/mL de 1 M DTT e 1 μL/mL de 0,1 g/mL de cicloheximida antes da utilização. Mantenha o tampão fresco do baixo-sal no gelo.
  5. Tampão do lysis do tecido
    1. Para fazer 50 mL de estoque de tampão de Lise tecidual, combine 1 mL de HEPES de 1 M, 3,75 mL de KCl de 2 M e 500 μL de 1 M MgCl2. Adicione água RNase-livre a uma final de 50 mL.
      Nota: O estoque de tampão de dissecção pode ser armazenado a 4 ° c por até seis meses.
    2. Adicionar 1 comprimido/10 mL de inibidor da protease livre de EDTA, 1 μL/mL de 0,1 g/mL de cicloheximida, 10 μL/mL de inibidores de RNase cada imediatamente antes da utilização. Mantenha o tampão de lise do tecido fresco no gelo.

3. conjugação de anticorpos para grânulos magnéticos

  1. Anticorpos
    1. Calcule a quantidade de anticorpos GFP necessários para todas as amostras e prepare-se para uma amostra extra.
      Nota: Para cada amostra, é necessário 50 μg de cada anticorpo GFP.
    2. Thaw anticorpos GFP no gelo e girar na velocidade máxima (> 13000 x g) para 10 min a 4 ° c e transferir sobrenadantes para um novo tubo de microcentrífuga.
      Nota: A etapa da preparação do anticorpo pode ser executada antes da preparação do grânulo e os anticorpos descongelado podem ser mantidos no gelo. Alternativamente, esta parte pode ser realizada durante a incubação do grânulo magnético e proteína biotinylated L.
  2. Resuspend grânulos magnéticos
    1. Resuspend grânulos magnéticos (tabela de materiais) pela pipetagem delicada.
    2. Para cada amostra, utilizar 150 μL de talão magnético. Calcule o volume de talão magnético exigido para todas as amostras e prepare um extra. Transfira os grânulos magnéticos reressuscipados para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou 2 mL. Se mais de 1 mL for necessário para um experimento, divida o valor total em volumes iguais.
    3. Colete grânulos em um suporte magnético por > 1 min e retire o sobrenadante. Retire o tubo de microcentrífuga do suporte magnético e adicione 1 mL de PBS seguido de pipetagem para cima e para baixo para lavar as contas. Colete contas em um suporte magnético para > 1 min e remover PBS.
  3. Preparação de grânulos revestidos de proteína L
    1. Para cada amostra, utilizar 60 μL de proteína L. biotinilada. Se a proteína L for previamente ressuscipended e armazenada a-20 ° c, descongele a proteína L no gelo. Se a proteína L for ressuscipended antes do uso, tome a quantidade exigida para todas as amostras e prepare uma extra.
    2. Adicione o volume calculado da proteína L biotinylated aos grânulos magnéticos ressuspenso e lavado. Adicione 1X PBS para fazer o volume final 1 mL se estiver usando um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, ou 1,5 mL se estiver usando um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Incubar grânulos magnéticos com proteína L biotinylated para 35 min em RT em um rotator do tubo.
      Nota: Os anticorpos podem ser preparados nesta etapa, enquanto os grânulos estão incubando com proteína biotinylated L.
    3. Colete grânulos revestidos de proteína L em um suporte magnético por > 1 min e retire o sobrenadante. Retire o tubo do microcentrifugador do suporte magnético e adicione 1 mL do amortecedor de 3% BSA seguido pela pipetagem delicada por pelo menos 5 vezes para lavar as contas L-revestidas da proteína.
    4. Colete grânulos revestidos em um suporte magnético por > 1 min e retire o sobrenadante. Repita os passos de lavagem com 3% de BSA por mais 4 vezes (um total de 5 vezes).
  4. Ligação de anticorpos
    1. Adicione a quantidade calculada de anticorpos GFP na proteína L-revestido de grânulos e incubar por 1 h a 4 ° c em um rotator do tubo.
      Nota: Após a incubação do anticorpo, tome o cuidado especial para não Vortex a matriz da afinidade.
    2. Durante a incubação, prepare o tampão do baixo-sal calculando o volume total exigido para todas as amostras e adicione 0,5 μL/mL de 1 M de DTT e de 1 μL/mL de cicloheximida de 0,1 g/mL ao estoque do amortecedor do baixo-sal antes do uso.
      Nota: é necessário 3 ml de tampão de sal baixo para lavar cada tubo de grânulos conjugados com GFP e 200 μl/amostra para reressuscitaçao dos grânulos conjugados com GFP. O tampão fresco do baixo-sal pode ser mantido no gelo por algumas horas.
    3. Colete a matriz de afinidade em um suporte magnético por > 1 min e retire o sobrenadante. Adicione 1 mL de tampão de sal baixo e gentilmente pipeta para cima e para baixo para lavar a matriz de afinidade. Colete a matriz de afinidade em um suporte magnético por > 1 min e remova o buffer de sal baixo. Repita os passos de lavagem com tampão de sal baixo por mais 2 vezes (um total de 3 vezes).
    4. Ressuspender os grânulos em tampão de baixo sal para que cada amostra tenha 200 μL de matriz de afinidade.
      Nota: A matriz de afinidade pode ser armazenada em 0, 2% NaN3 a 4 ° c por até 2 semanas. A matriz de afinidade deve ser rapidamente lavada em tampão de sal baixo 3 vezes e ressuscitada suavemente em um rotor de tubo a 4 ° c por pelo menos 10 min se a matriz de afinidade é preparada dentro de 1 semana ou durante a noite se a matriz de afinidade é armazenada por mais de 1 semana. O protocolo pode ser pausado após esta etapa.
      Atenção: A azida sódica é extremamente tóxica para o ambiente. O contato com ácidos produz gás tóxico. Todos os resíduos devem ser recolhidos para eliminação adequada.

4. lise do tecido hepático

  1. Preparação de buffer e configuração do equipamento
    1. Calcule o número de tubos de microcentrífuga necessários, etiqueta e frio no gelo.
      Nota: Normalmente, sete tubos de microcentrífuga de 1,5 mL são necessários para cada amostra: 1 para o fígado dissecado remanescente, 4 para 4 mL de lisado hepático homogeneizado e 2 para a transferência de sobrenadantes.
    2. Prepare o tampão de dissecção fresco calculando o volume total exigido para todas as amostras e adicione 1 μL/mL de 0,1 g/mL de cicloheximida. Coloque o tampão de dissecção fresca no gelo para manter o frio durante todo o experimento.
      Nota: Para cada amostra, são necessários 10 mL de tampão de dissecção.
    3. Prepare o tampão de Lise fresco calculando o volume total necessário para todas as amostras e adicione 1 comprimido/10 mL de inibidor da protease livre de EDTA, 1 μL/mL de 0,1 g/mL de cicloheximida e 10 μL/mL de inibidores de RNase cada um. Mantenha o tampão de Lise no gelo durante todo o experimento.
      Nota: Para cada amostra, é necessário 4 mL de tampão de Lise.
    4. Configurar o moedor de tecido (tabela de materiais) de modo que o politetrafluoroetileno (PTFE)-tubos de vidro pode ser colocado no gelo durante a homogeneização de partes do fígado. Coloque 4 mL de tampão de Lise fria nos tubos de vidro PTFE.
  2. Repopulando a homogeneização hepática
    1. Eutanizar um 8 − 12-week-old Fah-/- mouse injetado com o vetor armadilha e repovoada por 1 − 4 semanas com anestesia e luxação cervical de acordo com as diretrizes experimentais de animais aprovados.
    2. Coloque o mouse sobre uma placa de dissecção e pulverize o abdômen com 70% de etanol. Tenda a pele e peritônio baixo no abdômen usando fórceps e usar tesouras para fazer uma incisão transversal. Continue a cortar com a tesoura para fazer uma aleta peritoneal em forma de U larga, com cuidado para não cortar as vísceras. Vire a aleta peritoneal sobre o esterno para expor o fígado.
    3. Cuidadosamente Retire o fígado usando tesouras finas e fórceps e rapidamente colocar o tecido em buffer de dissecção fria para enxaguar. Para homogeneizar os tecidos congelados, mova rapidamente a quantidade desejada de tecido hepático em tubos de vidro PTFE com tampão de Lise fria sem descongelar o tecido.
      Nota: O tecido dissecado pode ser flash-congelado e armazenado em-80 ° c depois que é lavado com tampão de dissecção. O protocolo pode ser pausado após esta etapa.
    4. Pese o fígado em uma placa de Petri e isole 200 − 500 mgs de partes do fígado e mova-se nos tubos do PTFE-vidro. Coloque o tecido hepático remanescente num tubo de microcentrífuga pré-refrigerado e congele o flash.
    5. Homogeneizar as amostras em um homogeneizador movido a motor a partir de 300 RPM para dissociar os hepatócitos da estrutura hepática por pelo menos 5 traços. Abaixe o tubo de vidro cada vez mas tome o cuidado para não deixar o pilão levantar-se acima da solução para impedir a aeração que poderia causar a desnaturação da proteína.
    6. Aumente a velocidade para 900 rpm para homogeneizar totalmente os tecidos do fígado por pelo menos 12 traços completos.
    7. Transfira o lisado para os tubos rotulados e pré-refrigerados, com não mais de 1 mL de lisado por tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Se for utilizado 4 mL de tampão de Lise, mantenha 1 tubo e o flash congele os restantes 3 tubos.
      Nota: Os lisados podem ser mantidos no gelo por até 1 h, enquanto dissecam o próximo animal e preparando lisados frescos. O fígado homogeneizado pode ser flash congelado após a etapa de Lise e armazenado em-80 ° c. Pode haver uma diminuição de 50% no RNA isolado se os lisados congelados forem usados. O protocolo pode ser pausado após esta etapa.
  3. Lise nuclear
    1. Centrifugue o lisado do fígado em 2.000 x g em 4 ° c por 10 minutos e transfira o sobrenadante a um tubo novo, prerefrigerado do microcentrifugador no gelo.
    2. Adicione 1/9 do volume do sobrenadante do polietileno glicol do nonilfenil de 10% para fazer a concentração final glicol do polietileno do nonilfenil de 1% e misture-o suavemente invertendo os tubos do microcentrifugador.
    3. Gire rapidamente para baixo os tubos do microcentrifugador e adicione 1/9 do volume da amostra de DOC de 10% para fazer a concentração final 1% DOC e misture delicadamente invertendo os tubos do microcentrifugador. Gire rapidamente para baixo os tubos do microcentrifugador e incubar no gelo por 5 minutos.
    4. Centrifugue o lisado nuclear a 20.000 x g a 4 ° c durante 10 min e transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga pré-refrigerado no gelo.
      Nota: O sobrenadante empobrecido da mitocôndria pode ser colocado no gelo por um par de horas enquanto as amostras restantes estão sendo coletadas.

5. imunoprecipitação

  1. Para cada tubo, tirar 1% do volume total do sobrenadante como um controle de pré-imunoprecipitação para comparar o enriquecimento alvo após a incubação com a matriz de afinidade. Coloc controles da pre-imunoprecipitação em um rotator do tubo em 4 ° c durante a noite, a mesma maneira que as amostras Immunoprecipitated são processadas.
  2. Adicione 200 μL de matriz de afinidade a cada amostra. Tome cuidado extra para ressuscitar as contas por pipetagem suave antes de adicionar a matriz de afinidade para cada amostra. Incubar os lisados com matriz da afinidade em 4 ° c durante a noite com mistura delicada em um rotator do tubo.
    Nota: O protocolo pode ser pausado por até um dia após esta etapa.

6. isolação do RNA

  1. Preparação de buffer e configuração do equipamento
    1. Coloque o rack magnético a 4 ° c por pelo menos 30 min para pré-resfriar e mantenha o rack no gelo durante todo o experimento.
    2. Calcule o número de tubos do microcentrifugador exigidos e pre-chill no gelo ou em 4 ° c.
      Nota: Normalmente, cada amostra requer 1 tubo de microcentrífuga para o RNA purificado final.
    3. Gire rapidamente para baixo os tubos da etapa 5,2 e colete os grânulos coloc na cremalheira magnética por pelo menos 1 minuto. colete ou descarte o sobrenadante em tubos de microcentrífuga adicionais.
      Nota: O sobrenadante coletado que contém fração não acoplada pode ser congelado em flash e armazenado em-80 ° c para comparar com a fração de limite para o enriquecimento de transcrição após a purificação. O protocolo pode ser pausado após esta etapa.
    4. Prepare o tampão do elevado-sal adicionando 0,5 μL/ml de 1 M de DTT e de 1 μl/ml de 0,1 g/ml cicloheximida ao estoque do amortecedor do elevado-sal.
      Nota: Para cada amostra, é necessário 5 mL de tampão de sal alto.
  2. Isolação do RNA
    1. Adicione 1 mL de tampão fresco de alto sal a cada tubo seguido de pipetagem suave durante pelo menos 5 vezes sem introduzir bolhas.
      Nota: A lavagem insuficiente poderia introduzir fundos de transcritos não acoplado quando a introdução das bolhas poderia acelerar a degradação do RNA.
    2. Colete grânulos em um suporte magnético por > 1 min e retire o sobrenadante. Repita os passos de lavagem com tampão de sal alto por mais 4 vezes (um total de 5 vezes).
    3. Retire o amortecedor de sal elevado restante e remova os tubos do microcentrifugador do carrinho magnético e coloc em RT por 5 minutos para aquecer-se acima.
    4. Ressuscitem os grânulos em 100 μL de tampão de lise (fornecido no kit de isolamento de RNA) com β-Mercaptoetanol.
      Nota: Todo o jogo do isolamento e da purificação do RNA que contenha o tiocianato desnaturante do guanidina pode ser usado como um amortecedor do lysis para liberar o RNA encadernado da matriz da afinidade. A extração do RNA deve ser processada no RT desde que o tiocianato do guanidina pode cristalizar em baixas temperaturas.
    5. Vórtice os grânulos e o amortecedor para pelo menos 5 s na velocidade a mais elevada, gire rapidamente para baixo para recolher o amortecedor na parte lateral do tubo do microcentrifugador e incubar os grânulos com o amortecedor em RT por 10 minutos para liberar o RNA grânulo-ligado no amortecedor do lysis.
    6. Colete grânulos em um suporte magnético por > 1 min e colete o sobrenadante para proceder imediatamente à limpeza do RNA de acordo com o protocolo de purificação de RNA conforme especificado no Kit (tabela de materiais).
      Nota: O sobrenadante contendo o RNA eluída no tampão do lysis pode igualmente ser armazenado em-80 ° c para até 1 mês antes da limpeza aquecendo-se a RT em cima do descongelar.
    7. Para conseguir a qualidade máxima do RNA isolado, execute todas as etapas opcionais que incluem a digestão de DNase e todas as etapas da eluição do RNA. Aqueça acima o amortecedor da eluição fornecido pelo jogo do isolamento do RNA ou pela água RNase-livre ao ° c 60 para a recuperação máxima do RNA.
      Nota: O RNA isolado pode ser armazenado em-20 ° c por até 1 mês ou-80 ° c por diversos anos. O protocolo pode ser pausado após esta etapa.

7. análise de qualidade de RNA opcional (recomendado)

  1. Avalie a qualidade do RNA usando um Bioanalyzer11 e uma quantidade com um espectrofotômetro12 para determinar se repetir o processo da imunoprecipitação é exigido para obter o RNA amplo e de alta qualidade.
    Nota: A qualidade ideal de RNA para sequenciamento de alta taxa de transferência deve seguir protocolos especificados por kits de preparação de biblioteca e plataformas de sequenciamento.

8. aplicações a jusante

Nota: O RNA total isolado pelo protocolo da armadilha pode ser usado em um número de aplicações a jusante padrão, incluindo o RNA-Seq (TRAP-Seq). A transcrição reversa padrão e os protocolos quantitativos do PCR podem igualmente ser usados depois da armadilha.

  1. Para TRAP-Seq, execute a preparação da biblioteca de RNA-Seq de acordo com os métodos padrão13.
  2. Para RNA-Seq, prepare bibliotecas de sequenciamento de cDNA usando kits comerciais de RNA-Seq com o enriquecimento baseado em oligo d (T) de transcritos poliadenilados de poli (A). Alternativamente, se a qualidade total do RNA for inferior à recomendada para o enriquecimento poli (A), use os módulos de depleção de rRNA. Entretanto, espere ver mais alinhamento do rRNA após o sequenciamento.

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Representative Results

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Para analisar a expressão gênica no repovoamento de hepatócitos do Fah-/- mouse, GFP: Rpl10a Fusion e Fah transgenes são coentregues dentro de um plasmídeo contendo Transposon8 (Trap vector) para fígados por injeção hidrodinâmica (Figura 1A). A remoção de nitisinona induz uma lesão hepática tóxica que cria uma pressão de seleção para os hepatócitos que expressam estavelmente a FAH para repovoar o parênquima lesionado9. A coloração por imunofluorescência confirma a coexpressão de FAH e a proteína de fusão GFP: RPL10A na repovoação de hepatócitos após duas semanas de repovoamento hepático (Figura 1B).

Na seguinte experiência representativa, o Trap-Seq foi executado usando hepatocytes quiescentes e repovoamento do rato. Primeiramente, para obter os ribossomas GFP-etiquetados dos hepatócitos quiescentes, os ratos transgênicas de rosaLSL-GFP-L10A foram injetados com AAV8-TBG-CRE 7 dias antes do sacrifício para induzir o GFP: expressão RPL10A em todos os hepatócitos14. Nós igualmente processamos uma amostra do fígado coletada de um rato selvagem do tipo como um controle negativo para assegurar o isolamento de traduzir o mRNA era específico, significando que o RNA poderia somente ser extraído dos ratos que expressam GFP: RPL10A. A concentração de RNA isolado correlacionou-se com o número de células que expressam a proteína de fusão, com a amostra quiescente produzindo o maior rendimento, uma vez que todos os hepatócitos expressam GFP: RPL10A após a injeção de AAV8-TBG-CRE (Figura 2A). Inversamente, quase nenhum RNA era detectável em controles selvagens do tipo que não tiveram o transgene de GFP: RPL10A, indicando que o procedimento da armadilha é altamente específico e tem um baixo fundo. Quando a TRAP foi utilizada no tecido hepático submetido a repovoamento com GFP: RPL10A-os hepatócitos transduados, o RNA abundante e de alta qualidade foi obtido (Figura 2B). Ao contrário, nenhum traço do RNA foi detectado através do Bioanalyzer para a amostra negativa do controle.

A análise da expressão de gene a jusante pode ser realizada através da transcrição reversa e do PCR quantitativo ou do RNA-Seq no RNA armadilha-isolado. Gsta1 codifica Glutationa S-transferase que desempenha um papel importante para o metabolismo da glutationa, o principal peptídeo desintoxicante para proteger o fígado contra dano de estresse oxidativo15. A expressão de Gsta1 é induzida por mais de 10 vezes em repovoação de hepatócitos em comparação aos hepatócitos quiescentes, enquanto nenhum valor do ciclo limiar (TC) foi detectado com RNA isolado de armadilha do rato tipo selvagem devido à falta de RNA de entrada (Figura 3 A). Note que a qualidade do RNA pode impactar extremamente a análise da expressão genética. No caso de experimentos de RNA-Seq, a avaliação da qualidade do RNA deve ser realizada de acordo com as recomendações do kit de preparação da biblioteca e da plataforma de sequenciamento (Figura 3B). Um bioanalisador é usado frequentemente para determinar o número da integridade do RNA (RIN), com um RIN elevado que correlacionar com uma taxa mais elevada de alinhamentos do mRNA ao genoma (Figura 3B, esquerdo), visto que um Rin mais baixo que conduz a uma taxa mais elevada de leituras ribosomal, indicando degradação do mRNA (Figura 3B, direita). Figura 3 C, D demonstra que Trap-Seq pode identificar a expressão genética diferencial em hepatócitos quiescentes e repovoamento. Por exemplo, a expressão de Alb é inibida e a expressão de AFP é upregulada durante a repovoação hepática, refletindo que os hepatócitos replicantes assumem um estado menos diferenciado para inibir as funções metabólicas hepáticas durante repovoamento9,16.

Figure 1
Figura 1: implementação de Trap com Fah-/- para a alteração da expressão gênica do perfil dos hepatócitos repovoantes. (A) esquema de expressar a proteína de fusão GFP: RPL10A com Fah no sistema de Transposon de beleza adormecida seguida de injeção no Fah-/- mouse. Os hexágonos verdes indicam a repovoação de hepatócitos com expressão estável de FAH e GFP: RPL10A, enquanto os hexágonos pretos representam hepatócitos feridos e moribundos. (B) a coloração representativa da imunofluorescência demonstra a coexpressão da proteína ribossomal L10A (verde) e do Fah (vermelho) etiquetada com GFP nos hepatocytes repovoamento. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: a armadilha permite a isolação tipo-específica da pilha do RNA de alta qualidade. (A) o rendimento do RNA está positivamente correlacionado com o número de hepatócitos expressando GFP: RPL10A. O baixo rendimento do RNA de um rato selvagem do tipo demonstra a especificidade do TRAP das fontes sem a expressão de GFP: RPL10A. (B) vestígios de BIOANALISADOR de RNA total isolados de fígados repovoadores expressando GFP: RPL10A e de fígados tipo selvagem demonstram a especificidade da Trap. O RNA total isolado do tipo selvagem tecido do fígado desprovido do GFP: o transgene de RPL10A mostra que o RNA mínimo estêve coletado, visto que o tecido deexpressão fornece o RNA de alta qualidade amplo. Observe que os picos de RNA ribossômico estão presentes após armadilha bem-sucedida10. FU, unidade de fluorescência. RIN, número de integridade do RNA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: o RNA armadilha-isolado pode ser usado para a análise da expressão de gene a jusante. (A) transcrição reversa representativa e resultados quantitativos de PCR de Gsta1 em hepatócitos quiescentes e repovoamento. Nenhum valor do CT foi detectado com o RNA isolado dos animais selvagens do tipo. (B) análise de alinhamento do RNA isolado após sequenciamento de alta produtividade, demonstrando a importância da determinação da integridade do RNA após o isolamento. O RNA de alta qualidade resulta em uma maior porcentagem de leituras de mRNA (verde), enquanto o RNA de baixa qualidade leva a uma porcentagem muito maior de leituras de ribosmas (vermelho), pois a maioria dos mRNA é degradada. RIN, número de integridade do RNA. (C,D) Faixas de visualizador de genômica Integrativa (IGV) de RNA-Seq leituras de mRNA afinidade-purificada de hepatócitos quiescentes e repovoamento no (C) Alb e (D) AFP loci. Observe que o viés de leitura de 3 ' é típico de um pipeline de seleção de poli (A). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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A armadilha-seq é uma técnica para o isolamento tipo-específico da pilha de traduzir o mRNA através dos ribossomas epitope-etiquetados e apresenta uma alternativa às aproximações de FACS, porque contorna limitações tais como exigências de tempo de FACS9. Em vez disso, TRAP permite o isolamento rápido e eficiente do RNA diretamente dos tecidos a granel, ajudando a evitar quaisquer alterações na expressão gênica. Trap-seq é especialmente adequado para uso no fígado de repovoamento Fah-/- mouse, como a expansão de hepatócitos após a remoção de nitisinona é célula autônoma e permite a criação de perfis de expressão gênica do subconjunto de hepatócitos com transgenes. O vetor TRAP também pode ser coexpresso com moléculas ativadoras ou Silenciadoras de genes17, incluindo cDNA, RNA de hairpin curto e RNA guia, para estudar os efeitos sobre a expressão gênica global de ativação ou inibição de um gene específico. Alternativamente, o rato transgênico rosaLSL-GFP-L10A fornece a capacidade de analisar a expressão gênica em qualquer célula com atividade de recombinase CRE. Desde GFP: RPL10A pode ser expressado especificamente em todas as pilhas que expressam CRE, o papel de outros tipos da pilha no fígado durante ferimento de fígado e o repovoamento poderia ser estudado. Por exemplo, cruzar o rato CK19-CRE com o rato transgênicas da armadilha podia ser usado para expressar GFP: RPL10A nos colangiócitos seguidos por Trap-Seq para estudar a mudança da expressão de Gene no epitélio biliar durante o processo do repovoamento.

Para garantir o perfil exato da expressão gênica, é fundamental preparar todos os buffers e a matriz de afinidade antes da dissecção tecidual. Todas as etapas devem ser executadas no gelo com amortecedores frios a menos que especificado de outra maneira para assegurar a estabilização polysome10 e para impedir a degradação do RNA. Todos os tampões devem ser preparados com os reagentes RNase-livres e o protocolo TRAP-Seq deve ser realizado em um ambiente RNase-livre para impedir a degradação do RNA e o baixo rendimento do RNA Immunoprecipitated. A matriz da afinidade pode ser preparada até 2 semanas antes do uso com ressuspensão delicado em um rotator do tubo durante a noite. Cuidados especiais devem ser tomados para não agitar vigorosamente a matriz para evitar a ruptura do anticorpo-conjugados, proteína L-revestido de grânulos magnéticos. Os métodos para preparar a matriz de afinidade incluem a conjugação de grânulos magnéticos à proteína biotinylated L seguida pela incubação com anticorpos do anti-GFP. Entretanto, as esferas magnéticas comercialmente disponíveis da proteína A/G podem ser substituídas; Se usado, pule a etapa de conjugação inicial e prossiga diretamente para a ligação de anticorpos. Além disso, as etiquetas alternativas do epítopo são presumivelmente praticáveis com o protocolo acima com modificação apropriada.

Há vários pontos em que a etapa de isolamento e purificação de RNA pode ser pausada (consulte o protocolo acima). Entretanto, uma vez que as amostras do fígado foram colhidas, continuando à imunoprecipitação recomenda-se, porque o rendimento do RNA isolado poderia cair por ~ 50% com congelação nesta etapa10. Os tecidos devem ser rapidamente enxaguados com tampão de dissecção que contém cicloheximida para inibir a tradução de mRNA. A Lise tecidual insuficiente também pode contribuir para o baixo rendimento de RNA. É fundamental homogeneizar os tecidos no gelo até que não haja partes de tecido visíveis com o homogeneizador do motor, assegurando a aeração mínima10. Adicionalmente, a lavagem suficiente com tampão do elevado-sal é crucial assegurar a remoção da ligação inespecíficos de proteínas ribosomal à matriz da afinidade. Incluir um tipo selvagem controle negativo ajuda a avaliar a especificidade da imunoprecipitação e a eficiência dos passos de lavagem. Adicionalmente, usar um jogo comercial da purificação do RNA que inclua o tratamento RNase-livre de DNase aumentará a pureza do RNA.

Além disso, recomenda-se verificar a expressão e a abundância da proteína de fusão GFP: RPL10A e avaliar a quantidade de tecido necessária para obter um RNA amplo para análise a jusante. Seções de tecidos ou lisados podem ser usados para métodos de detecção imuno-baseados para validar a expressão de GFP: RPL10A. A quantidade de RNA isolada pode variar de acordo com: (1) o número de células expressando GFP: RPL10A, (2) o nível de expressão do transgene, e (3) o tamanho e ploidia das células expressando o transgene. Um experimento piloto usando metade e o dobro da quantidade recomendada de tecido pode ser útil para determinar o lisado de entrada ideal para TRAP-Seq. Em nossas mãos, poderíamos obter ~ 150 ng de RNA com tão pouco como 1-2% dos hepatócitos expressando GFP: RPL10A de 200 mg de repovoamento Fah-/- fígado, representando ~ 2 x 105 hepatócitos poliploides com expressão transgênica9.

A metodologia TRAP-Seq isola o mRNA vinculado ao Ribossome para analisar uma célula que traduz o pool de mRNA. O seqüenciamento resultante lê, portanto, corresponder ao ' translatome ' em vez do transcriptoma. Observe que a conversão de pegadas ribosalgumas não será coletada, pois TRAP é executado em complexos nativos em vez de reticulados. Se as análises de footprinting são desejadas, o protocolo acima deve ser modificado com o cross-linking relevante seguido por metodologias da imunoprecipitação (grampo)18. Outra limitação do TRAP é a exigência de um número suficiente de células que expressam a proteína de fusão GFP: RPL10A. Para experimentos em que o tipo de célula de interesse é pequeno, a combinação de múltiplas amostras biológicas pode ser necessária para isolar RNA suficiente para permitir RNA-Seq19. Além disso, TRAP-Seq requer a presença de GFP: RPL10A no tipo de célula de interesse. Isso pode representar um desafio se não houver um sistema de entrega específico para as células ou se um promotor específico do tipo de célula para conduzir a expressão CRE não estiver disponível.

O desenvolvimento recente da tecnologia do RNA-Seq da único-pilha (scRNA-Seq) permitiu o seqüenciamento direto seguido perto na identificação do silico de vários tipos da pilha, permitindo arranjar em seqüência sem classificar para tipos específicos da pilha de interesses20 ,21,22. No entanto, scRNA-Seq ainda requer dissociação de células do órgão. No caso do modelo Fah-/- repovoamento, a perfusão hepática e o isolamento de hepatócitos são extremamente difíceis e ineficientes devido à fragilidade dos hepatócitos feridos e replicantes. Na verdade, ainda não conseguimos isolar hepatócitos suficientes de ratos Fah-/- submetidos a repovoamento após injeção hidrodinâmica de plasmícitos Fah . Adicionalmente, no tempo que leva para processar os tecidos, os níveis de expressão gênica podem mudar. Os protocolos para perfusão hepática levam até 30 min de tempo de isquemia quente. As metodologias futuras para otimizar a perfusão hepática para diminuir o tempo de processamento e aumentar a eficiência de isolamento podem permitir a integração do scrna-Seq ao sistema modelo Fah-/- mouse e possivelmente a outros modelos de lesão e repovoamento. Isso também permitiria o estudo de todos os tipos de células hepáticas.

Em conclusão, a integração de Trap-Seq com o Fah-/- mouse permite o isolamento específico e a expressão gênica de perfis de replicação de hepatócitos para identificar alvos terapêuticos que poderiam promover a repovoação hepática. Este método pode ser implementado para estudar outros tipos de células no fígado e outros sistemas de órgãos para a identificação específica da doença de alterações de expressão gênica para identificar potenciais alvos de drogas ou biomarcadores. Uma técnica análoga pode ser usada para coletar núcleos de repovoamento hepatócitos usando a purificação da afinidade, e para executar então uma análise epigenéticas destas pilhas específicas16.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelas seguintes concessões: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), e p30-DK050306 (concessão do piloto a KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

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References

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Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse
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Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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