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Biology

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Abstract

La repoblación hepática después de una lesión es una característica crucial de los mamíferos que evita la falla inmediata de los órganos y la muerte después de la exposición de toxinas ambientales. Una comprensión más profunda de los cambios en la expresión génica que se producen durante la repoblación podría ayudar a identificar dianas terapéuticas para promover la restauración de la función hepática en el entorno de lesiones. Sin embargo, los métodos para aislar específicamente los hepatocitos repobladores se ven inhibidos por la falta de marcadores celulares, números celulares limitados y la fragilidad de estas células. El desarrollo de la tecnología de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) en conjunto con el modelo de ratón Fah-/- para recapitular la repoblación en el entorno de la lesión hepática permite el perfil de expresión génica de la repoblación Hepatocitos. Con TRAP, el ARNm de traducción específico del tipo de celda se aísla rápida y eficientemente. Desarrollamos un método que utiliza TRAP con aislamiento basado en afinidad de traducir mRNA de hepatocitos que expresan selectivamente la proteína fluorescente verde (GFP) con etiqueta de proteína ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP elude el largo período de tiempo requerido para la clasificación celular activada por fluorescencia que podría cambiar el perfil de expresión génica. Además, dado que sólo los hepatocitos repobladores expresan la proteína de fusión GFP:RPL10A, el ARNm aislado está desprovisto de contaminación de los hepatocitos heridos circundantes y otros tipos de células en el hígado. El ARNm purificado por afinidad es de alta calidad y permite el análisis basado en la secuenciación descendente de PCR o de alto rendimiento de la expresión génica.

Introduction

Como el principal órgano metabólico en vertebrados, el hígado es responsable de la homeostasis de glucosa, síntesis de proteínas séricas, secreción de ácido biliar, y metabolismo xenobiótico y desintoxicación. El hígado posee una capacidad extraordinaria para regenerar el parénquima lesionado al exponerse a toxinas para prevenir la insuficiencia hepática inmediata1. Sin embargo, el fracaso de la regeneración puede ocurrir en el entorno de paracetamol o consumo excesivo de alcohol, que puede conducir a insuficiencia hepática aguda2. Además, la lesión hepática crónica causada por la infección por hepatitis viral, la enfermedad del hígado graso y la esteatohepatitis puede causar fibrosis hepática, cirrosis y carcinoma hepatocelular3. El único tratamiento curativo disponible para la enfermedad hepática terminal es el trasplante, pero está limitado por la escasez de órganos, lo que impide un tratamiento eficiente para todos los pacientes4. Por lo tanto, una mejor comprensión del proceso de recuperación después de una lesión hepática tóxica es crucial para el desarrollo de tratamientos para estimular la regeneración suficiente para la función de rescate en el órgano enfermo.

El sistema modelo más ampliamente aplicado para el estudio de la regeneración hepática es la hepatectomía parcial en roedores, en la que una gran proporción del hígado se resecta para estimular la rápida expansión de los hepatocitos5. Sin embargo, la hepatoectomía parcial no recapitula la expansión de los hepatocitos después de una lesión hepática tóxica debido a la falta de infiltración de células inmunitarias y necrosis celular de hepatocitos a menudo observada en el entorno de lesión hepática aguda en humanos6. Un sistema más adecuado para modelar esta forma de renovación de órganos es el ratón Fah-/-, que carece de fumarylacetoacetato hidrolasa funcional (FAH) necesario para el metabolismo adecuado de la tirosina y desarrolla daño hepático grave que conduce a la muerte7. Estos ratones se pueden mantener en un estado saludable indefinidamente por el tratamiento con el medicamento nitisinona en el agua potable. Alternativamente, la expresión DE FAH se puede restaurar mediante la entrega transgénica a un subconjunto de hepatocitos, que se expandirán para repoblar el hígado tras la eliminación de nitisinona8.

Para perfilar los cambios en la expresión génica de los hepatocitos repoblados, se requiere una herramienta para aislar específicamente los hepatocitos replicantes en el ratón Fah-/- sin contaminación de los hepatocitos heridos vecinas y otros tipos de células. Desafortunadamente, la clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS) de hepatocitos es difícil ya que (1) la fragilidad de repoblar hepatocitos conduce a una mala recuperación después de la perfusión hepática, (2) replicar hepatocitos son muy variables en tamaño, haciendo que el aislamiento de una población pura por FACS difícil, y (3) el tiempo de procedimiento de la perfusión hepática al aislamiento de ARN es mayor que 2 h, por lo tanto los perfiles de expresión génica pueden sufrir cambios artificiales sustanciales antes de que se adquieran muestras9.

Alternativamente, la expresión de ribosomas etiquetados con epítopos específicamente en la repoblación de hepatocitos permite el aislamiento rápido de traducir activamente el ARNm unido por ribosomas utilizando la purificación de afinidad inmediatamente después de la cosecha de órganos, con hígado a granel tejidos. Aquí, describimos un protocolo para realizar la purificación de afinidad de traducción-ribosoma (TRAP)10 seguido de la secuenciación de ARN de alto rendimiento (TRAP-seq), para aislar y perfilar específicamente el ARNm en la repoblación de hepatocitos en el Fah-/- ratón9. La coexpresión de proteína ribosomal con etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP:RPL10A) con FAH permite la purificación de afinidad de la traducción de ARNm unido por polisomas que contienen GFP:RPL10A. Este método evita cualquier paso de disociación celular, como la perfusión hepática para aislar los hepatocitos repobladores frágiles. En su lugar, utiliza lisis de tejido de órganoentero y anticuerpos para extraer rápidamente el ARN específicamente de las células diana. Por último, el aislamiento de ARNm abundante y de alta calidad a través de TRAP-seq permite que las aplicaciones posteriores, como el análisis de secuenciación, perfilen el cambio dinámico de la expresión génica durante el proceso de repoblación.

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Protocol

Todos los métodos que implican el uso de ratones son consistentes con las pautas proporcionadas por la IACUC de la Oficina Penn de Bienestar Animal de la Universidad de Pensilvania.

1. Preparación de reactivos

  1. Cicloheximida
    1. Para hacer 500 ml de 0,1 g/mL de cicloheximida, suspenda 50 mg de cicloheximida en 500 ml de metanol.
      PRECAUCION: La cicloheximida es extremadamente tóxica para el medio ambiente y puede causar malformación congénita. Todos los desechos y tampones que contengan cicloheximida deben recogerse para su eliminación adecuada.
      NOTA: La cicloheximida se puede almacenar a 4oC durante un máximo de 1 día. La cicloheximida inhibe la traducción.
  2. Ditiothreitol (TDT)
    1. Para hacer 1 ml de TDT de 1 M, suspenda 0,15 g de polvo de TDT en agua libre de RNase.
      PRECAUCION: La TDT puede causar irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias.
      NOTA: La TDT es un detergente. La TDT se puede almacenar a -20 oC. Se recomienda almacenar 1 M TDT en alícuotas de un solo uso de 50 l.
  3. Desoxicolato (DOC)
    1. Para hacer 10% DOC, suspenda 1 g de DOC en un tubo cónico de 50 ml y agregue agua libre de RNase hasta 10 ml. Agitar vigorosamente hasta que el polvo se disuelva.
      NOTA: La solución 10% DOC es ligeramente amarilla y se puede almacenar a temperatura ambiente (RT) durante un máximo de 1 año. Doc se utiliza para la lisis nuclear.
  4. Anticuerpos GFP
    1. Anticuerpos Aliquot GFP cuando se usa por primera vez. Congele las alícuotas y guárdelas a -80 oC.
      NOTA: Se recomienda almacenar 50 g de anticuerpos GFP en alícuotas de un solo uso.
  5. Proteína biotinilada B L
    1. Resuspenda la proteína biotinilada L en 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) para realizar la concentración final de 1 g/l.
      NOTA: La solución resuspendida se puede almacenar a -20 oC durante un máximo de 6 meses.

2. Preparación del tampón

  1. búfer de albúmina sérica bovina (BSA)
    1. Para hacer 50 ml de 3% de bsa bSA, agregue 1,5 g de polvo de BSA libre de IgG y proteasa en 40 ml de PBS seguido de vórtice. Después de disolver el BSA, agregue PBS a un volumen final de 50 ml.
      NOTA: El búfer de BSA se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
  2. Búfer de disección
    1. Para hacer 50 ml de tampón de disección, combine 5 ml de solución salina equilibrada (HBSS) de 10x Hank, 125 ml de 1 M 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfónico ácido (HEPES), 1.750 ml de glucosa de 1 M y 200 ol de 1 M NaHCO3. Añadir agua libre de RNase a un volumen final de 50 ml.
      NOTA: El stock tampón de disección se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Inmediatamente antes de su uso, añadir 100 g/ml de 0,1 g/ml de cicloheximida y mantener en hielo.
  3. Tampón de alta sal
    1. Para hacer 50 ml de tampón de alta sal, añadir 1 ml de 1 M HEPES, 8,75 mL de 2 M KCl, 500 ml de 1 M MgCl2y 500 ml de 100% de polietilenglicol de no yelfenilo(Tabla de materiales)al agua libre de RNase.
      NOTA: El stock de tampón de alta sal se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Inmediatamente antes de su uso, añadir 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml. Mantenga el amortiguador fresco de alta sal en hielo.
  4. Tampón de baja sal
    1. Para hacer 50 ml de tampón de sal baja, añadir 1 ml de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl, 500 ml de 1 M MgCl2y 500 ml de 100% de polietilenglicol de no yelfenilo a 44,25 ml de agua libre de RNase.
      NOTA: El stock de tampón de sal baja se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Añadir 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml antes de su uso. Mantenga el tampón fresco bajo en sal en hielo.
  5. Tampón de lisis tisular de tejido
    1. Para hacer 50 ml de tampón de lisis tisular, combinar 1 mL de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl y 500 ml de 1 M MgCl2. Añadir agua libre de RNase a una final de 50 ml.
      NOTA: El stock tampón de disección se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Añadir 1 comprimido/10 ml de inhibidor de la proteasa libre de EDTA, 1 l/ml de 0,1 g/ml de cicloheximida, 10 ml/ml de inhibidores de la RNase cada uno inmediatamente antes de su uso. Mantenga el tampón de lisis de tejido fresco en hielo.

3. Conjugación de anticuerpos con cuentas magnéticas

  1. Anticuerpos
    1. Calcular la cantidad de anticuerpos GFP necesarios para todas las muestras y prepararse para una muestra adicional.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 50 g de cada anticuerpo GFP.
    2. Descongelar los anticuerpos GFP sobre hielo y girar a la velocidad máxima (>13.000 x g) durante 10 min a 4oC y transferir sobrenadores a un nuevo tubo de microcentrífuga.
      NOTA: El paso de preparación de anticuerpos se puede realizar antes de la preparación del cordón y los anticuerpos desconesdados se pueden mantener en hielo. Alternativamente, esta parte se puede realizar durante la incubación del cordón magnético y la proteína biotinilada L.
  2. Resuspender perlas magnéticas
    1. Resuspenda los perlas magnéticas(Tabla de Materiales)mediante pipeteo suave.
    2. Para cada muestra, utilice 150 s de perla magnética. Calcule el volumen de perlas magnéticas necesarias para todas las muestras y prepare una extra. Transfiera las perlas magnéticas resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o 2 ml. Si se requiere más de 1 ml para un experimento, divida la cantidad total en volúmenes iguales.
    3. Recoger cuentas en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y añada 1 ml de PBS seguido de pipeteo hacia arriba y hacia abajo para lavar las perlas. Recoger perlas en un soporte magnético durante >1 min y eliminar PBS.
  3. Preparación de perlas recubiertas de proteína En
    1. Para cada muestra, utilice 60 ml de proteína biotinilada L. Si la proteína L se resuspende previamente y se almacena a -20 oC, desconde la proteína L sobre hielo. Si la proteína L se resuspende antes de su uso, tome la cantidad necesaria para todas las muestras y prepare una adicional.
    2. Añadir el volumen calculado de proteína biotinilada L a las cuentas magnéticas resuspendidas y lavadas. Añadir 1x PBS para hacer el volumen final 1 mL si utiliza un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, o 1,5 ml si utiliza un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Incubar perlas magnéticas con proteína biotinilada L durante 35 minutos a RT en un rotatorio de tubo.
      NOTA: Los anticuerpos se pueden preparar en este paso mientras las cuentas se incuban con proteína biotinilada L.
    3. Recoger las cuentas recubiertas de proteína En L en un soporte magnético durante >1 min y eliminar el sobrenadante. Retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y añada 1 ml de tampón BSA al 3% seguido de un suave pipeteo durante al menos 5 veces para lavar las perlas recubiertas de proteína En.
    4. Recoger las cuentas recubiertas en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Repita los pasos de lavado con 3% de BSA para otras 4 veces (un total de 5 veces).
  4. Encuadernación de anticuerpos
    1. Añadir la cantidad calculada de anticuerpos GFP en las cuentas recubiertas de proteína L e incubar durante 1 h a 4 oC en un rotator de tubo.
      NOTA: Después de la incubación de anticuerpos, tenga especial cuidado de no vórtice la matriz de afinidad.
    2. Durante la incubación, prepare el tampón bajo en sal calculando el volumen total requerido para todas las muestras y agregue 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 L/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml a un tampón de sal baja antes de su uso.
      NOTA: Se requieren 3 ml de tampón de sal baja para el lavado de cada tubo de perlas conjugadas con GFP y 200 l/muestra para la resuspensión de las perlas conjugadas con GFP. El tampón fresco bajo en sal se puede mantener en hielo durante un par de horas.
    3. Recoger la matriz de afinidad en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Agregue 1 ml de tampón de sal baja y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar la matriz de afinidad. Recoja la matriz de afinidad en un soporte magnético durante >1 min y elimine el búfer de baja sal. Repita los pasos de lavado con tampón bajo en sal por otras 2 veces (un total de 3 veces).
    4. Resuspenda las perlas en el búfer de baja sal para que cada muestra tenga 200 ml de matriz de afinidad.
      NOTA: La matriz de afinidad se puede almacenar en 0.02% NaN3 a 4 oC durante un máximo de 2 semanas. La matriz de afinidad debe lavarse rápidamente en tampón de sal baja 3 veces y resuspenderse suavemente en un rotador de tubo a 4 oC durante al menos 10 minutos si la matriz de afinidad se prepara dentro de 1 semana o durante la noche si la matriz de afinidad se almacena durante más de 1 semana. El protocolo se puede pausar después de este paso.
      PRECAUCION: La azida sódica es extremadamente tóxica para el medio ambiente. El contacto con ácidos produce gas tóxico. Todos los desechos deben ser recogidos para su correcta eliminación.

4. Lisis de tejido hepático

  1. Preparación del búfer y configuración del equipo
    1. Calcule el número de tubos de microcentrífuga necesarios, etiquete y enfríe en hielo.
      NOTA: Por lo general, se requieren siete tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada muestra: 1 para el hígado diseccionado restante, 4 para 4 ml de lisato hepático homogeneizado y 2 para transferir supernatantes.
    2. Prepare un nuevo tampón de disección calculando el volumen total necesario para todas las muestras y añada 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml. Coloque el tampón de disección fresco en hielo para mantener el frío durante todo el experimento.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 10 ml de búfer de disección.
    3. Prepare el tampón de lisis fresca calculando el volumen total requerido para todas las muestras y agregue 1 comprimido/10 ml de inhibidor de la proteasa libre de EDTA, 1 L/ml de 0,1 g/ml de cicloheximida y 10 ml/ml de inhibidores de la rnalosa cada una. Mantenga el tampón de lisis en hielo durante todo el experimento.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 4 ml de tampón de lisis.
    4. Configure la trituradora de tejido(Tabla de Materiales)para que los tubos de vidrio de politetrafluoroetileno (PTFE) se puedan colocar en hielo durante la homogeneización de piezas hepáticas. Ponga 4 ml de tampón de lisis fría en los tubos de vidrio PTFE.
  2. Repoblación de homogeneización hepática
    1. Eutanasia un ratón Fah-/- de 8 a 12 semanas de edad inyectado con el vector TRAP y repoblado durante 1 x 4 semanas con anestesia y luxación cervical de acuerdo con las pautas experimentales de animales aprobadas.
    2. Coloque el ratón sobre una placa de disección y rocíe el abdomen con 70% de etanol. Tienda de la piel y peritoneo bajo en el abdomen usando fórceps y utilizar tijeras para hacer una incisión transversal. Continúe cortando con las tijeras para hacer una solapa peritoneal ancha en forma de U, con cuidado de no cortar las vísceras. Voltee la solapa peritoneal sobre el esternón para exponer el hígado.
    3. Retire cuidadosamente el hígado con tijeras finas y fórceps y coloque rápidamente el tejido en tampón de disección fría para enjuagar. Para homogeneizar los tejidos congelados, mueva rápidamente la cantidad deseada de tejido hepático en tubos de vidrio PTFE con tampón de lisis fría sin descongelar el tejido.
      NOTA: El tejido diseccionado puede congelarse con flash y almacenarse a -80 oC después de lavarse con tampón de disección. El protocolo se puede pausar después de este paso.
    4. Pesar el hígado en una placa de Petri y aislar 200-500 mg de piezas de hígado y pasar a los tubos de vidrio PTFE. Coloque el tejido hepático restante en un tubo de microcentrífuga preenfriado y congele el flash.
    5. Homogeneizar las muestras en un homogeneizador motorizado a partir de 300 rpm para disociar los hepatocitos de la estructura hepática durante al menos 5 golpes. Baje el tubo de vidrio cada vez, pero tenga cuidado de no dejar que el pestillo se eleve por encima de la solución para evitar la aireación que podría causar desnaturalización de proteínas.
    6. Eleva la velocidad a 900 rpm para homogeneizar completamente los tejidos hepáticos durante al menos 12 golpes completos.
    7. Transfiera el lisado a los tubos etiquetados y preenfriados, con no más de 1 ml de lisado por tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Si se utilizan 4 ml de tampón de lisis, mantenga 1 tubo y flash congele los 3 tubos restantes.
      NOTA: Los lysates se pueden mantener en hielo hasta 1 h mientras se disección el siguiente animal y preparando lisados frescos. El hígado homogeneizado puede congelarse después de la etapa de lisis y almacenarse a -80 oC. Podría haber una disminución del 50% en el ARN aislado si se utilizan lisados congelados. El protocolo se puede pausar después de este paso.
  3. Lisis nuclear
    1. Centrifugar el lisado hepático a 2.000 x g a 4 oC durante 10 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga pretallado en hielo.
    2. Añadir 1/9 del volumen sobrenadante de 10% de polietilenglicol sin yellfenilo para hacer la concentración final 1% polietilenglicol de no yelfenilo y mezclar invirtiendo suavemente los tubos de microcentrífuga.
    3. Gire rápidamente los tubos de microcentrífuga y agregue 1/9 del volumen de la muestra de 10% DOC para hacer la concentración final 1% DOC y mezclar invirtiendo suavemente los tubos de microcentrífuga. Gire rápidamente por los tubos de microcentrífuga e incubar en hielo durante 5 min.
    4. Centrifugar el lisado nuclear a 20.000 x g a 4 oC durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrípicos pretallado sobre hielo.
      NOTA: El sobrenadante agotante agotado en las mitocondrias se puede colocar en hielo durante un par de horas mientras se recogen las muestras restantes.

5. Inmunoprecipitación

  1. Para cada tubo, saque el 1% del volumen total del sobrenadante como control previo a la inmunoprecipitación para comparar el enriquecimiento objetivo después de la incubación con la matriz de afinidad. Colocar los controles de preinmunoprecipitación en un rotatorio de tubo a 4 oC durante la noche, de la misma manera que se procesan las muestras inmunopreciadas.
  2. Agregue 200 s de matriz de afinidad a cada muestra. Tenga especial cuidado de resuspender las cuentas mediante pipeteo suave antes de agregar la matriz de afinidad a cada muestra. Incubar los lysates con matriz de afinidad a 4oC durante la noche con una mezcla suave en un rotator de tubo.
    NOTA: El protocolo se puede pausar hasta un día después de este paso.

6. Aislamiento de ARN

  1. Preparación del búfer y configuración del equipo
    1. Coloque el estante magnético a 4 oC durante al menos 30 minutos para que se enfríe previamente y mantenga el estante en hielo durante todo el experimento.
    2. Calcular el número de tubos de microcentrífuga necesarios y pre-enfriar en hielo o a 4 oC.
      NOTA: Por lo general, cada muestra requiere 1 tubo de microcentrífuga para el ARN purificado final.
    3. Gire rápidamente por los tubos del paso 5.2 y recoja las perlas colocando en el bastidor magnético durante al menos 1 min. Recoger o desechar el sobrenadante en tubos de microcentrífuga adicionales.
      NOTA: El sobrenadante recogido que contiene fracción no enlazada puede congelarse y almacenarse a -80 oC para compararlo con la fracción enlazada para el enriquecimiento de transcripciones después de la purificación. El protocolo se puede pausar después de este paso.
    4. Prepare el tampón de alta sal añadiendo 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml a la culata de alta sal.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 5 ml de tampón de alta sal.
  2. Aislamiento de ARN
    1. Añadir 1 ml de tampón fresco de alta sal a cada tubo seguido de pipeteo suave durante al menos 5 veces sin introducir burbujas.
      NOTA: Un lavado insuficiente podría introducir antecedentes de transcripciones no enlazadas, mientras que la introducción de burbujas podría acelerar la degradación del ARN.
    2. Recoger cuentas en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Repita los pasos de lavado con tampón de alta sal por otras 4 veces (un total de 5 veces).
    3. Retire el tampón de alta sal restante y retire los tubos de microcentrífuga del soporte magnético y colóquelos en RT durante 5 minutos para calentarlos.
    4. Resuspenda las perlas en 100 ml de tampón de lisis (proporcionado en el kit de aislamiento de ARN) con el mercaptoetanol.
      NOTA: Cualquier kit de aislamiento y purificación de ARN que contenga el tiocianato de guanidina desnaturalizante se puede utilizar como un tampón de lisis para liberar el ARN enlazado de la matriz de afinidad. La extracción de ARN debe procesarse en RT ya que el tiocianato de guanidina puede cristalizarse a bajas temperaturas.
    5. Vortex las perlas y el tampón durante al menos 5 s a la velocidad más alta, gire rápidamente hacia abajo para recoger el tampón en el lado del tubo de microcentrífuga e incubar las perlas con el tampón en RT durante 10 minutos para liberar el ARN enlazado al cordón en el búfer de lisis.
    6. Recoger perlas en un soporte magnético durante >1 min y recoger el sobrenadante para proceder inmediatamente a la limpieza del ARN de acuerdo con el protocolo de purificación de ARN como se especifica en el kit(Tabla de materiales).
      NOTA: El sobrenadante que contiene el ARN eludido en el tampón de lisis también se puede almacenar a -80 oC durante un máximo de 1 mes antes de la limpieza calentando hasta RT al descongelarse.
    7. Para lograr la máxima calidad del ARN aislado, realice todos los pasos opcionales, incluyendo la digestión DNase y todos los pasos de elución de ARN. Caliente el tampón de elución proporcionado por el kit de aislamiento de ARN o agua libre de RNase a 60 oC para una recuperación máxima del ARN.
      NOTA: El ARN aislado se puede almacenar a -20 oC durante un máximo de 1 mes o -80 oC durante varios años. El protocolo se puede pausar después de este paso.

7. Análisis opcional de la calidad del ARN (recomendado)

  1. Evalúe la calidad del ARN utilizando un bioanalizador11 y la cantidad con un espectrofotómetro12 para determinar si es necesario repetir el proceso de inmunoprecipitación para obtener un ARN amplio y de alta calidad.
    NOTA: La calidad óptima del ARN para la secuenciación de alto rendimiento debe seguir los protocolos especificados por los kits de preparación de bibliotecas y las plataformas de secuenciación.

8. Aplicaciones posteriores

NOTA: El ARN total aislado por el protocolo TRAP se puede utilizar en una serie de aplicaciones descendentes estándar, incluyendo RNA-seq (TRAP-seq). La transcripción inversa estándar y los protocolos PCR cuantitativos también se pueden utilizar siguiendo trap.

  1. Para TRAP-seq, realice la preparación de la biblioteca RNA-seq de acuerdo con los métodos estándar13.
  2. Para RNA-seq, prepare bibliotecas de secuenciación de ADNc utilizando kits comerciales de ARN-seq con enriquecimiento basado en oligo d(T) de transcripciones poliadeniladas de poliadenilados. Alternativamente, si la calidad total del ARN es menor que la recomendada para el enriquecimiento de poli(A), utilice módulos de agotamiento de rRNA. Sin embargo, espere ver más alineación rRNA después de la secuenciación.

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Representative Results

Para perfilar la expresión génica en la repoblación de hepatocitos del ratón Fah-/-, la fusión Gfp:Rpl10a y los transgenes de Fah se entregan conjuntamente dentro de un plásmido que contiene transposón8 (vector TRAP) a los hígados por inyección hidrodinámica(Figura 1A). La eliminación de la nitisinona induce una lesión hepática tóxica que crea una presión de selección para los hepatocitos que expresan establemente FAH para repoblar el parénquima lesionado9. La tinción de inmunofluorescencia confirma la coexpresión de FAH y la proteína de fusión GFP:RPL10A en la repoblación de hepatocitos después de dos semanas de repoblación hepática(Figura 1B).

En el siguiente experimento representativo, TRAP-seq se realizó utilizando hepatocitos de ratón en reposo y repoblados. En primer lugar, para obtener ribosomas etiquetados con GFP a partir de hepatocitos en reposo, se inyectaron ratones transgénicos RosaLSL-GFP-L10A con AAV8-TBG-Cre 7 días antes del sacrificio para inducir la expresión de GFP:RPL10A en todos los hepatocitos14. También procesamos una muestra de hígado recopilada de un ratón de tipo salvaje como un control negativo para garantizar que el aislamiento del ARNm de traducción fuera específico, lo que significa que el ARN sólo se podía extraer de ratones que expresaban GFP:RPL10A. La concentración de ARN aislado se correlacionó con el número de células que expresan la proteína de fusión, con la muestra de reposo produciendo el mayor rendimiento ya que todos los hepatocitos expresan GFP:RPL10A después de la inyección AAV8-TBG-Cre(Figura 2A). Por el contrario, apenas se detectó ningún ARN en controles de tipo salvaje que no tenían el transgén GFP:RPL10A, lo que indica que el procedimiento TRAP es muy específico y tiene un fondo bajo. Cuando trap se utilizó en tejido hepático sometido a repoblación con hepatocitos transducidos por GFP:RPL10A, se obtuvo ARN abundante y de alta calidad (Figura 2B). Por el contrario, no se detectó ningún rastro de ARN a través de bioanalizador para la muestra de control negativo.

El análisis de la expresión génica aguas abajo se puede llevar a cabo mediante transcripción inversa y PCR cuantitativo o ARN-seq en ARN aislado por TRAP. Gsta1 codifica glutatión S-transferasa que juega un papel importante para el metabolismo del glutatión, el principal péptido desintoxicante para proteger el hígado contra el daño por estrés oxidativo15. La expresión de Gsta1 es inducida por más de 10 veces en la repoblación de hepatocitos en comparación con los hepatocitos en reposo, mientras que no se detectó ningún valor de ciclo umbral (Ct) con ARN aislado por TRAP del ratón de tipo salvaje debido a la falta de ARN de entrada(Figura 3 A). Tenga en cuenta que la calidad del ARN puede afectar en gran medida el análisis de la expresión génica. En el caso de los experimentos RNA-seq, la evaluación de la calidad del ARN debe realizarse de acuerdo con las recomendaciones del kit de preparación de la biblioteca y la plataforma de secuenciación(Figura 3B). Un bioanalizador se utiliza a menudo para determinar el número de integridad del ARN (RIN), con un RIN alto que se correlaciona con una mayor tasa de alineaciones de ARNm al genoma(Figura 3B, izquierda), mientras que un RIN más bajo que conduce a una tasa más alta de lecturas ribosomales, lo que indica degradación del ARNm(Figura 3B,derecha). Figura 3 C,D demuestra que TRAP-seq puede identificar la expresión génica diferencial en hepatocitos en reposo y repoblación. Por ejemplo, la expresión Alb se inhibe y la expresión Afp se regula durante la repoblación hepática, lo que refleja que los hepatocitos replicantes asumen un estado menos diferenciado para inhibir las funciones metabólicas del hígado durante repoblación9,16.

Figure 1
Figura 1: Implementación de TRAP con Fah-/- para perfilar el cambio de expresión génica de los hepatocitos repoblados. (A) Esquema de la expresión de la proteína de fusión GFP:RPL10A con FAH en el sistema de transposón Sleeping Beauty seguido de inyección en el ratón Fah-/-. Los hexágonos verdes indican hepatocitos repoblados con expresión estable de FAH y GFP:RPL10A, mientras que los hexágonos negros representan hepatocitos heridos y moribundos. (B) La tinción representativa de la inmunofluorescencia demuestra la coexpresión de la proteína ribosomal L10A (verde) y FAH (rojo) con etiqueta GFP en los hepatocitos repobladores. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: TRAP permite el aislamiento específico del tipo de celda del ARN de alta calidad. (A) El rendimiento del ARN se correlaciona positivamente con el número de hepatocitos que expresan GFP:RPL10A. El bajo rendimiento del ARN de un ratón de tipo salvaje demuestra la especificidad de TRAP de fuentes sin la expresión de GFP:RPL10A. (B) Los rastros bioanalizadores de ARN total aislado de hígados repoblados que expresan GFP:RPL10A y de hígados de tipo salvaje demuestran la especificidad de TRAP. El ARN total aislado del tejido hepático de tipo salvaje desprovisto del transgén GFP:RPL10A muestra que se ha recogido un ARN mínimo, mientras que el tejido que expresa el transgeno proporciona un ARN amplio de alta calidad. Tenga en cuenta que los picos de ARN ribosomal están presentes después de TRAP10exitoso. FU, unidad de fluorescencia. RIN, número de integridad del ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El ARN aislado por TRAP se puede utilizar para el análisis de la expresión génica aguas abajo. (A) Representante de transcripción inversa y resultados cuantitativos de PCR de Gsta1 en hepatocitos en reposo y repoblación. No se detectó ningún valor Ct con ARN aislado de animales de tipo salvaje. (B) Análisis de alineación del ARN aislado después de la secuenciación de alto rendimiento, demostrando la importancia de determinar la integridad del ARN después del aislamiento. ARN de alta calidad resulta en un mayor porcentaje de lecturas de ARNm (verde), mientras que el ARN de baja calidad conduce a un porcentaje mucho mayor de lecturas ribosomasomas (rojo), ya que la mayoría de arnm se degrada. RIN, número de integridad del ARN. (C,D) Las pistas del Visor de Genómica Integrativa (IGV) de las lecturas de ARN-seq de ARNm acanado con afinidad de hepatocitos en reposo y repoblación en los(C) Alb y (D) Loci Afp. Tenga en cuenta que el sesgo de lectura de 3' es típico de una canalización de selección poli(A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

TRAP-seq es una técnica para el aislamiento específico del tipo de celda de la traducción de ARNm a través de ribosomas etiquetados con epítopos y presenta una alternativa a los enfoques FACS, ya que elude limitaciones como los requisitos de tiempo de FACS9. En su lugar, TRAP permite el aislamiento rápido y eficiente del ARN directamente de los tejidos a granel, ayudando a evitar cualquier alteración en la expresión génica. TRAP-seq es especialmente adecuado para su uso en el repoblado hígado de ratón Fah-/-, ya que la expansión de hepatocitos tras la eliminación de la nitisinona es autónoma de células y permite la elaboración de perfiles de expresión génica del subconjunto de hepatocitos con integrado Transgenes. El vector TRAP también puede ser coexpresado con moléculas de activación o silenciamiento de genes17,incluyendo ADNc, ARN de horquilla corta y ARN guía, para estudiar los efectos en la expresión génica global de activación o inhibición de un gen específico. Alternativamente, el ratón transgénico RosaLSL-GFP-L10A proporciona la capacidad de perfilar la expresión génica en cualquier célula con actividad Cre recombinase. Dado que GFP:RPL10A se puede expresar específicamente en cualquier célula que expresa Cre, el papel de otros tipos de células en el hígado durante la lesión hepática y la repoblación podría ser estudiado. Por ejemplo, el cruce del ratón CK19-Cre con el ratón transgénico TRAP podría utilizarse para expresar GFP:RPL10A en cholangiocitos seguido de TRAP-seq para estudiar el cambio de expresión génica en el epitelio biliar durante el proceso de repoblación.

Para garantizar un perfil preciso de la expresión génica, es fundamental preparar todos los tampones y la matriz de afinidad antes de la disección tisular. Todas las etapas deben realizarse sobre hielo con búferes fríos a menos que se especifique lo contrario para garantizar la estabilización de polisoma10 y evitar la degradación del ARN. Todos los tampones deben prepararse con reactivos libres de RNase y el protocolo TRAP-seq debe llevarse a cabo en un entorno libre de RNase para evitar la degradación del ARN y el bajo rendimiento del ARN inmunoprecipitado. La matriz de afinidad se puede preparar hasta 2 semanas antes de su uso con una resuspensión suave en un rotadores de tubo durante la noche. Se debe tener especial cuidado de no agitar vigorosamente la matriz para evitar la interrupción de las perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos y recubiertas de proteína Conferida en L. Los métodos para preparar la matriz de afinidad incluyen la conjugación de perlas magnéticas a la proteína biotintilada L seguida de la incubación con anticuerpos anti-GFP. Sin embargo, se pueden sustituir las perlas magnéticas a proteínas A/G disponibles comercialmente; si se utiliza, omita el paso de conjugación inicial y proceda directamente a la unión de anticuerpos. Además, las etiquetas de epítopos alternativas son presumiblemente factibles con el protocolo anterior con la modificación adecuada.

Hay varios puntos en los que el paso de aislamiento y purificación del ARN se puede pausar (ver protocolo arriba). Sin embargo, una vez que se han cosechado muestras de hígado, se recomienda continuar con la inmunoprecipitación, ya que el rendimiento del ARN aislado podría disminuir en un 50 % con la congelación en este paso10. Los tejidos se deben enjuagar rápidamente con tampón de disección que contiene cicloheximida para inhibir la traducción del ARNm. La lisis tisular insuficiente también podría contribuir a un bajo rendimiento de ARN. Es fundamental homogeneizar los tejidos sobre hielo hasta que no se puedan ver fragmentos de tejido con el homogeneizador del motor, garantizando al mismo tiempo una aireación mínima10. Además, el lavado suficiente con tampón de alta sal es crucial para asegurar la eliminación de la unión inespecífica de proteínas ribosomales a la matriz de afinidad. Incluir un control negativo de tipo salvaje ayuda a evaluar la especificidad de la inmunoprecipitación y la eficiencia de los pasos de lavado. Además, el uso de un kit de purificación de ARN comercial que incluya el tratamiento DNase libre de RNase aumentará la pureza del ARN.

Además, se recomienda verificar la expresión y abundancia de la proteína de fusión GFP:RPL10A y evaluar la cantidad de tejido necesario para obtener un amplio ARN para el análisis posterior. Las secciones de tejido o lisados podrían utilizarse para métodos de detección inmunobasados para validar la expresión de GFP:RPL10A. La cantidad de ARN aislado puede variar por: (1) el número de células que expresan GFP:RPL10A, (2) el nivel de expresión del transgén y (3) el tamaño y la ploimide de las células que expresan el transgén. Un experimento piloto con la mitad y el doble de la cantidad de tejido recomendada podría ser útil para determinar el lisado de entrada óptimo para TRAP-seq. En nuestras manos, podríamos obtener 150 ng de ARN con tan poco como 1-2% de hepatocitos que expresan GFP:RPL10A a partir de 200 mg del hígado Fahrepoblante-/-, que representa 2 x 105 hepatocitos poliploides con expresión transgénica9.

La metodología TRAP-seq aísla el ARNm enlazado a ribosomas para perfilar el grupo de mRNA de traducción de una célula. Por lo tanto, las lecturas de secuenciación resultantes corresponden al "translatome" en lugar del transcriptoma. Tenga en cuenta que la traducción de huellas ribosomas no se recopilará, ya que TRAP se realiza en complejos nativos en lugar de entrelazados. Si se desean análisis de huella, el protocolo anterior debe modificarse con reticulación pertinente seguido de metodologías de inmunoprecipitación (CLIP)18. Otra limitación de TRAP es el requisito de un número suficiente de células que expresan la proteína de fusión GFP:RPL10A. Para los experimentos en los que el tipo de interés celular es pequeño, puede ser necesario combinar múltiples muestras biológicas para aislar el ARN suficiente para permitir el ARN-seq19. Además, TRAP-seq requiere la presencia de GFP:RPL10A en el tipo de celda de interés. Esto podría suponer un desafío si no hay un sistema de entrega específico a las celdas o si un promotor específico de tipo de celda para impulsar la expresión Cre no está disponible.

El reciente desarrollo de la tecnología de ARN-seq (scRNA-seq) de una sola célula ha permitido la secuenciación directa seguida de la identificación en silico de varios tipos de células, permitiendo la secuenciación sin clasificar para tipos específicos de intereses celulares20 ,21,22. Sin embargo, scRNA-seq todavía requiere disociación de las células del órgano. En el caso del modelo de repoblación deFah-/-, la perfusión hepática y el aislamiento de hepatocitos son extremadamente difíciles e ineficientes debido a la fragilidad de los hepatocitos lesionados y replicantes. De hecho, todavía no hemos sido capaces de aislar suficientes hepatocitos de Fah-/- ratones sometidos a repoblación después de la inyección hidrodinámica de plásmidos de fahhasia. Además, en el tiempo que se tarda en procesar los tejidos, los niveles de expresión génica podrían cambiar. Los protocolos para la perfusión hepática tardan hasta 30 minutos de tiempo de isquemia caliente. Las metodologías futuras para optimizar la perfusión hepática para reducir el tiempo de procesamiento y aumentar la eficiencia de aislamiento podrían permitir la integración scRNA-seq al sistema de modelo de ratón Fah-/- y posiblemente a otros modelos de lesiones y repoblación. Esto también permitiría el estudio de todos los tipos de células hepáticas.

En conclusión, la integración de TRAP-seq con el ratón Fah-/- permite el aislamiento específico y la generación de perfiles de expresión génica de la replicación de hepatocitos para identificar dianas terapéuticas que podrían promover la repoblación hepática. Este método se puede implementar para estudiar otros tipos de células en el hígado y otros sistemas de órganos para la identificación específica de la enfermedad de los cambios en la expresión génica para identificar posibles dianas o biomarcadores de fármacos. Se puede utilizar una técnica análoga para recoger núcleos de hepatocitos repoblados utilizando purificación de afinidad, y luego para realizar un análisis epigenético de estas células específicas16.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) y P30-DK050306 (Subvención piloto a KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

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References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).

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Biología Número 151 regeneración hepática tipo de célula específica TRAP TRAP-seq RNA-seq inmunoprecipitación perfilado de expresión hepatocito inyección hidrodinámica de cola y vena
Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón
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Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

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