Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تحديد سمات تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية في كبد الماوس

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242

Summary

ترجمة تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP) تمكن العزل السريع والفعال للخلية نوع محدد ترجمة mRNA. هنا، نقوم بشرح طريقة تجمع بين حقن الوريد الخلفي الهيدروديناميكي في نموذج الماوس لإعادة السكان الكبد وTRAP لدراسة ملف تعريف التعبير عن إعادة ملء خلايا الكبد.

Abstract

إعادة سكان الكبد بعد الإصابة هي سمة حاسمة من سمات الثدييات التي تمنع الفشل الفوري للأعضاء والوفاة بعد التعرض للسموم البيئية. ويمكن أن يساعد الفهم الأعمق للتغيرات في التعبير الجيني التي تحدث أثناء إعادة التجمعات السكانية في تحديد الأهداف العلاجية لتعزيز استعادة وظيفة الكبد في تحديد الإصابات. ومع ذلك، فإن أساليب عزل خلايا الكبد المعاد إسكانها على وجه التحديد تمنعها عدم وجود علامات الخلايا، وأرقام الخلايا المحدودة، وهشاشة هذه الخلايا. تطوير ترجمة تكنولوجيا تنقية التقارب الريبوسوسوم (TRAP) جنبا إلى جنب مع نموذج فاه-/- الماوس لتلخيص إعادة السكان في وضع إصابة الكبد يسمح بتوصيف التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد. مع TRAP، يتم عزل mRNA ترجمة نوع الخلية بسرعة وكفاءة. قمنا بتطوير طريقة تستخدم TRAP مع العزلة القائمة على التقارب من ترجمة mRNA من خلايا الكبد التي تعبر بشكل انتقائي عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسومة بروتين ريبوسومال (RP)، GFP:RPL10A. TRAP يتحايل على الفترة الزمنية الطويلة المطلوبة لفرز الخلايا المنشطة الفلورية التي يمكن أن تغير ملف تعريف التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، منذ فقط إعادة ملء خلايا الكبد التعبير عن GFP: RPL10A بروتين الانصهار، وmRNA معزولة خالية من التلوث من خلايا الكبد المصابة المحيطة بها وأنواع الخلايا الأخرى في الكبد. وmRNA تنقية التقارب هي ذات جودة عالية ويسمح المصب PCR- أو عالية الإنتاجية تحليل التسلسل القائم على التعبير الجيني.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

كما الجهاز الأيضي الرئيسي في الفقاريات، والكبد هو المسؤول عن التوازن الجلوكوز، تخليق بروتين المصل، إفراز حمض الصفراء، والتمثيل الغذائي xenobiotic وإزالة السموم. الكبد يملك قدرة غير عادية لتجديد parenchyma المصابة عند التعرض للسموم لمنع فشل الكبد الفوري1. ومع ذلك، يمكن أن يحدث فشل التجديد في إعداد الأسيتامينوفين أو الكحول الإفراط في الاستهلاك، والتي يمكن أن تؤدي إلى فشل الكبد الحاد2. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسبب إصابة الكبد المزمنة الناجمة عن عدوى التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية، والتهاب الكبد الدهني تليف الكبد، وتليف الكبد، وسرطان الكبد الخلوي3. العلاج العلاجي الوحيد المتاح لمرض الكبد في المرحلة النهائية هو زرع ولكن محدودة بسبب نقص الأعضاء، ومنع العلاج الفعال لجميع المرضى4. وبالتالي فإن التوصل إلى فهم أفضل لعملية التعافي بعد إصابة الكبد السامة أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات لتحفيز التجدد الكافي لإنقاذ وظيفة في الجهاز المريض.

نظام النموذج الأكثر تطبيقا على نطاق واسع لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي في القوارض ، حيث يتم استئصال نسبة كبيرة من الكبد لتحفيز التوسع السريع في خلايا الكبد5. ومع ذلك، استئصال الكبد الجزئي لا يلخص توسع خلايا الكبد بعد إصابة الكبد السامة بسبب عدم وجود تسلل الخلايا المناعية ونخر الخلايا الكبدية غالبا ما لوحظ في وضع إصابة الكبد الحادفي البشر6. وهناك نظام أكثر ملاءمة لنمذجة هذا الشكل من تجديد الأعضاء هو فاه-/- الماوس، الذي يفتقر إلى fumarylacetoacetate الهيدرولاز الوظيفية (FAH) المطلوبة لعملية التمثيل الغذائي التيروزين السليم ويتطور تلف الكبد الشديد مما يؤدي إلى الموت7. ويمكن الحفاظ على هذه الفئران في حالة صحية إلى أجل غير مسمى عن طريق العلاج مع نيتيزينون المخدرات في مياه الشرب. بدلا من ذلك، يمكن استعادة التعبير FAH عن طريق تسليم transgene إلى مجموعة فرعية من خلايا الكبد، والتي سوف تتوسع لإعادة ملء الكبد عند إزالة نيتيسينون8.

لتوصيف التغيرات في التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد، هناك حاجة إلى أداة لعزل خلايا الكبد المتماثلة على وجه التحديد في فاه-/- الماوس دون تلوث من خلايا الكبد المصابة المجاورة وأنواع الخلايا الأخرى. لسوء الحظ، فرز الخلايا بمساعدة الفلورة (FACS) من خلايا الكبد من الصعب منذ (1) هشاشة إعادة ملء خلايا الكبد يؤدي إلى الانتعاش الفقراء بعد التسريب الكبد، (2) تكرار خلايا الكبد هي متغيرة للغاية في الحجم، مما يجعل العزلة من السكان نقية من قبل FACS صعبة، و (3) وقت الإجراء من التسريب الكبد لعزل الحمض النووي الريبي هو أكبر من 2 ح، وبالتالي ملامح التعبير الجيني قد تخضع لتغييرات اصطناعية كبيرة قبل الحصول على عينات9.

بدلا من ذلك، فإن التعبير عن ريبوسوسومات ذات علامات النعوت على وجه التحديد في إعادة ملء خلايا الكبد يسمح للعزل السريع من ترجمة بنشاط mRNA ملزمة الريبوسوسوم باستخدام تنقية التقارب مباشرة بعد حصاد الأعضاء، مع الكبد السائبة الأنسجة lysates. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتنفيذ ترجمة الريبوسوم تنقية التقارب (TRAP)10 تليها عالية الإنتاجية RNA-التسلسل (TRAP-seq)، لعزل على وجه التحديد والملف الشخصي mRNA في إعادة ملء خلايا الكبد في Fah-/- الماوس9. التعبير المشترك للبروتين الفلورسنت الأخضر الموسومة ريبوسومال (GFP: RPL10A) مع FAH يسمح تنقية تقارب ترجمة mRNA ملزمة polysomes التي تحتوي على GFP: RPL10A. يتفادى هذا الأسلوب أي خطوات تفكك الخلايا، مثل التسريب الكبد لعزل الخلايا الكبدية الهشة. بدلا من ذلك، فإنه يستخدم lysis من أنسجة الأعضاء كلها والأجسام المضادة لاستخراج بسرعة الحمض النووي الريبي على وجه التحديد من الخلايا المستهدفة. وأخيراً، فإن عزل الميرنا الوفيرة وعالية الجودة عن طريق TRAP-seq يمكّن التطبيقات النهائية مثل تحليل التسلسل من تحديد التغير الديناميكي في التعبير الجيني أثناء عملية إعادة السكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع الطرق التي تنطوي على استخدام الفئران تتفق مع المبادئ التوجيهية التي قدمتها IACUC من مكتب بن لرعاية الحيوان في جامعة بنسلفانيا.

1. إعداد الكاشف

  1. سيكلوهيكسميد
    1. لجعل 500 درجة مئوية من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد، تعليق 50 ملغ من سيكلوهيكسميد في 500 ميكرولتر من الميثانول.
      تحذير: سيكلوهيكسميد سام للغاية للبيئة ويمكن أن يسبب تشوهات خلقية. وينبغي جمع جميع النفايات والمخازن المؤقتة المحتوية على السيكلوهيكساميد من أجل التخلص منها على النحو السليم.
      ملاحظة: يمكن تخزين سيكلوهيكسميد عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يوم واحد. سيكلوهيكسميد يمنع الترجمة.
  2. ديثيوثريتول (DTT)
    1. لجعل 1 مل من 1 M DTT، تعليق 0.15 غرام من مسحوق DTT في المياه الخالية من RNase.
      تحذير: يمكن أن يسبب DTT تهيجًا في الجلد والعين والجهاز التنفسي.
      ملاحظة: DTT هو المنظفات. يمكن تخزين DTT عند -20 درجة مئوية. فمن المستحسن لتخزين 1 M DTT في aliquots استخدام واحد من 50 درجة مئوية.
  3. ديوكسيشولات (DOC)
    1. لجعل 10٪ DOC، تعليق 1 غرام من DOC في أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة المياه الخالية من RNase تصل إلى 10 مل. يهز بقوة حتى يذوب المسحوق.
      ملاحظة: حل DOC 10٪ أصفر قليلا ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة تصل إلى 1 سنة. يستخدم DOC للإنتليس النووي.
  4. الأجسام المضادة GFP
    1. Aliquot GFP الأجسام المضادة عند استخدام لأول مرة. التقط تجميد aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: من المستحسن تخزين 50 ميكروغرام من الأجسام المضادة GFP في aliquots استخدام واحد.
  5. ب بروتين ببيوتينلاتي ل
    1. إعادة تعليق البروتين biotinylated L في 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لجعل التركيز النهائي 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحل المعلق عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. إعداد العازلة

  1. الزلال المصل البقري (BSA) العازلة
    1. لجعل 50 مل من 3٪ BSA العازلة، إضافة 1.5 غرام من IgG- والبروات خالية من مسحوق BSA في 40 مل من PBS تليها دوامة. بعد حل BSA، إضافة PBS إلى حجم نهائي من 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت BSA عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
  2. المخزن المؤقت للتشريح
    1. لجعل 50 مل من المخزون المخزن الاحتياطي، والجمع بين 5 مل من 10X هانك محلول الملح المتوازن (HBSS)، 125 ميكرولتر من 1 م 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-piperazineethanesulfonic حمض (HEPES)، 1750 ميكرولتر من 1 M الجلوكوز، و 200 ميكرولتر من 1 M NaHCO3. إضافة المياه الخالية من RNase إلى حجم نهائي قدره 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون المخزن المؤقت للتشريح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. قبل الاستخدام مباشرة، أضف 100 ميكروغرام/مل من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد يُحفظ على الجليد.
  3. العازلة عالية الملح
    1. لجعل 50 مل من المخزون الاحتياطي عالية الملح، إضافة 1 مل من 1 م HEPES، 8.75 مل من 2 مل كيلو كل، 500 ميكرولتر من 1 م كلو 500 ميكرولتر من 100٪ nonylphenyl البولي ايثيلين غليكول(جدول المواد)إلى المياه الخالية من RNase.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون الاحتياطي عالي الملح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. قبل الاستخدام مباشرة، يضاف 0.5 ميكرولتر/مل من 1 M DTT و1 ميكرولتر/مل من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد. الحفاظ على العازلة الطازجة عالية الملح على الجليد.
  4. العازلة منخفضة الملح
    1. لجعل 50 مل من المخزون الاحتياطي منخفض الملح، إضافة 1 مل من 1 م HEPES، 3.75 مل من 2 مل كيلو كل، 500 ميكرولتر من 1 م كلو 500 ميكرولتر من 100٪ البولي إثيلين البولي الإيثيلين 100٪ إلى 44.25 مل من المياه الخالية من RNase.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون الاحتياطي منخفض الملح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. إضافة 0.5 ميكرولتر/مل من DTT 1 M و1 μL/mL من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد قبل الاستخدام. الحفاظ على العازلة الطازجة منخفضة الملح على الجليد.
  5. العازلة اللليس الأنسجة
    1. لجعل 50 مل من مخزون الأنسجة الاحتياطية، والجمع بين 1 مل من 1 م HEPES، 3.75 مل من 2 مل كيلو كل، و 500 درجة مئوية من 1 م كل2. إضافة المياه الخالية من RNase إلى النهائي من 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون المخزن المؤقت للتشريح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. إضافة 1 قرص / 10 مل من مثبطات البروتياز خالية من EDTA، 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد، 10 ميكرولتر / مل من مثبطات RNase كل مباشرة قبل الاستخدام. الحفاظ على الأنسجة الطازجة العازلة على الجليد.

3. اقتران الأجسام المضادة للحبات المغناطيسية

  1. الاجسام المضاده
    1. حساب كمية الأجسام المضادة GFP المطلوبة لجميع العينات والاستعداد لعينة إضافية واحدة.
      ملاحظة: لكل عينة، مطلوب 50 ميكروغرام من كل جسم مضاد GFP.
    2. ذوبان الأجسام المضادة GFP على الجليد وتدور في أقصى سرعة (> 13،000 × ز)لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية ونقل supernatants إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ خطوة إعداد الأجسام المضادة قبل إعداد حبة ويمكن الاحتفاظ الأجسام المضادة المذابة على الجليد. بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ هذا الجزء أثناء حضانة حبة المغناطيسي والبروتين biotinylated L.
  2. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي
    1. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي(جدول المواد)عن طريق الأنابيب لطيف.
    2. لكل عينة، واستخدام 150 درجة مئوية من حبة المغناطيسي. حساب حجم حبة المغناطيسي المطلوبة لجميع العينات وإعداد واحد إضافي. نقل الخرز المغناطيسي المعلق إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل أو 2 مل. إذا كان أكثر من 1 مل مطلوب لتجربة، قم بتقسيم المبلغ الإجمالي إلى أحجام متساوية.
    3. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. إزالة أنبوب microcentrifuge من موقف المغناطيسي وإضافة 1 مل من PBS تليها الأنابيب صعودا وهبوطا لغسل الخرز. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة PBS.
  3. إعداد حبات البروتين المغلفة L
    1. لكل عينة، استخدم 60 ميكرولتر من البروتين الحي النيدي L. إذا تم إعادة تعليق البروتين L سابقا وتخزينها في -20 درجة مئوية، ذوبان البروتين L على الجليد. إذا تم إعادة تعليق البروتين L قبل الاستخدام، خذ الكمية المطلوبة لجميع العينات وإعداد واحد إضافي.
    2. إضافة الحجم المحسوب من البروتين biotinylated L إلى الخرز المغناطيسي المعاد تعليقها وغسلها. إضافة 1X PBS لجعل المجلد النهائي 1 مل إذا كان استخدام أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل، أو 1.5 مل إذا كان استخدام أنبوب الطرد المركزي الصغير 2 مل. حضانة الخرز المغناطيسي مع البروتين biotinylated L لمدة 35 دقيقة في RT على مدور أنبوب.
      ملاحظة: يمكن إعداد الأجسام المضادة في هذه الخطوة في حين أن الخرز وحضانة مع البروتين biotinylated L.
    3. جمع الخرز البروتين L المغلفة على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. إزالة أنبوب الطاردة الدقيقة من الحامل المغناطيسي وإضافة 1 مل من 3٪ BSA العازلة تليها الأنابيب لطيف لمدة 5 مرات على الأقل لغسل الخرز البروتين L المغلفة.
    4. جمع الخرز المغلفة على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. كرر خطوات الغسيل مع BSA 3٪ لمدة 4 مرات أخرى (ما مجموعه 5 مرات).
  4. ربط الأجسام المضادة
    1. إضافة الكمية المحسوبة من الأجسام المضادة GFP في حبات البروتين L المغلفة وحضانة لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية على مدور أنبوب.
      ملاحظة: بعد حضانة الأجسام المضادة، والحرص الخاص على عدم دوامة مصفوفة التقارب.
    2. أثناء الحضانة، قم بإعداد المخزن المؤقت منخفض الملح عن طريق حساب الحجم الإجمالي المطلوب لجميع العينات وإضافة 0.5 ميكرولتر/مل من 1 MTT و1 ميكرولتر/مل من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد إلى المخزون الاحتياطي منخفض الملح قبل الاستخدام.
      ملاحظة: مطلوب 3 مل من العازلة منخفضة الملح لغسل كل أنبوب من الخرز GFP المترافق و 200 درجة مئوية / عينة لإعادة تعليق الخرز GFP المترافق. يمكن الاحتفاظ بحاجز الملح المنخفض الطازج على الجليد لبضع ساعات.
    3. جمع مصفوفة التقارب على موقف المغناطيسي ل >1 دقيقة وإزالة supernatant. أضف 1 مل من المخزن المؤقت قليل الملح وسعر الماصة برفق صعودا وهبوطا لغسل مصفوفة التقارب. جمع مصفوفة التقارب على موقف المغناطيسي ل >1 دقيقة وإزالة العازلة منخفضة الملح. كرر خطوات الغسيل مع العازلة منخفضة الملح لمدة 2 مرة أخرى (ما مجموعه 3 مرات).
    4. إعادة تعليق الخرز في العازلة منخفضة الملح بحيث يكون كل عينة 200 ميكرولتر من مصفوفة التقارب.
      ملاحظة: يمكن تخزين مصفوفة التقارب في 0.02٪ NaN3 عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. وينبغي غسل مصفوفة التقارب بسرعة في المخزن المؤقت منخفض الملح 3 مرات وإعادة تعليقها بلطف على مدور أنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل إذا تم إعداد مصفوفة التقارب في غضون أسبوع واحد أو بين عشية وضحاها إذا تم تخزين مصفوفة التقارب لأكثر من 1 أسبوع. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
      تحذير: أزيد الصوديوم هو سام للغاية للبيئة. الاتصال مع الأحماض تنتج الغاز السام. وينبغي جمع جميع النفايات من أجل التخلص منها على النحو السليم.

4. أنسجة الكبد اللمعة

  1. إعداد المخزن المؤقت وإعداد المعدات
    1. حساب عدد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المطلوبة، والتسمية والبرد على الجليد.
      ملاحظة: وعادة ما تكون هناك حاجة إلى سبعة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل لكل عينة: 1 للكبد تشريح المتبقية، 4 ل 4 مل من lysate الكبد المتجانسة، و 2 لنقل supernatants.
    2. إعداد المخزن المؤقت تشريح جديدة عن طريق حساب الحجم الإجمالي المطلوب لجميع العينات وإضافة 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد. ضع المخزن الاحتياطي تشريح جديدة على الجليد للحفاظ على البرد طوال التجربة.
      ملاحظة: لكل عينة، مطلوب 10 مل من المخزن المؤقت تشريح.
    3. إعداد العازلة lysis جديدة عن طريق حساب الحجم الإجمالي المطلوب لجميع العينات وإضافة 1 قرص / 10 مل من مثبطات البروتياز EDTA خالية، 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد، و 10 ميكرولتر / مل من مثبطات RNase لكل منهما. الحفاظ على العازلة lysis على الجليد طوال التجربة.
      ملاحظة: لكل عينة، 4 مل من المخزن المؤقت lysis مطلوب.
    4. إعداد طاحونة الأنسجة(جدول المواد)بحيث يمكن وضع أنابيب الزجاج متعدد تترافلوروإيثيلين (PTFE) على الجليد أثناء تجانس قطع الكبد. وضع 4 مل من العازلة lysis الباردة في أنابيب PTFE الزجاج.
  2. إعادة ملء الكبد التجانس
    1. قتلفأر يبلغ من العمر 8-12 أسبوعًايتم حقنه بناقل TRAP وأعيد إسكانه لمدة أسبوع أو أربعة أسابيع بالتخدير وخلع عنق الرحم وفقًا للمبادئ التوجيهية التجريبية الحيوانية المعتمدة.
    2. وضع الماوس على لوحة تشريح ورذاذ البطن مع الإيثانول 70٪. خيمة الجلد وperitoneum منخفضة في البطن باستخدام ملقط واستخدام مقص لجعل شق عرضية. الاستمرار في قطع مع مقص لجعل واسعة على شكل U رفرف الهيوم، مع الحرص على عدم قطع الحشوة. قلب رفرف العضد على القص لفضح الكبد.
    3. إزالة الكبد بعناية باستخدام مقص غرامة وملقط ووضع الأنسجة بسرعة في المخزن البارد العازلة لشطف. لتجانس الأنسجة المجمدة، بسرعة نقل الكمية المطلوبة من أنسجة الكبد في أنابيب زجاجية PTFE مع العازلة lysis الباردة دون ذوبان الأنسجة.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الأنسجة تشريح فلاش المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية بعد غسلها مع المخزن المؤقت. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
    4. وزن الكبد على طبق بيتري وعزل 200-500 ملغ من قطع الكبد والانتقال إلى أنابيب زجاج PTFE. ضع أنسجة الكبد المتبقية في أنبوب مجهري مُبرّد مسبقًا وتجمد فلاش.
    5. تجانس العينات في المجانسة التي يحركها المحرك بدءا من 300 دورة في الدقيقة لفصل خلايا الكبد من بنية الكبد لمدة 5 السكتات الدماغية على الأقل. خفض أنبوب الزجاج في كل مرة ولكن الحرص على عدم السماح للآفات ترتفع فوق الحل لمنع التأليه التي يمكن أن تسبب إزالة النُثّة البروتين.
    6. رفع السرعة إلى 900 دورة في الدقيقة لتجانس أنسجة الكبد تماما لمدة 12 السكتات الدماغية الكاملة على الأقل.
    7. نقل lysate في أنابيب وصفت وقبل المبردة، مع ما لا يزيد عن 1 مل من lysate لكل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. إذا تم استخدام 4 مل من العازلة lysis، والحفاظ على 1 أنبوب وفلاش تجميد الأنابيب المتبقية 3.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالليسات على الجليد لمدة تصل إلى 1 ساعة أثناء تشريح الحيوان التالي وإعداد lysates الطازجة. يمكن أن يكون فلاش الكبد المتجانس ة مجمدة بعد خطوة الانتهاليس وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن أن يكون هناك انخفاض بنسبة 50٪ في الحمض النووي الريبي المعزول إذا تم استخدام lysates المجمدة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
  3. اللّيلة النووية
    1. طرد مركزي في الكبد lysate في 2000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونقل supernatant إلى أنبوب جديد، prechilled microcentrifuge على الجليد.
    2. إضافة 1/9 من حجم supernatant من 10٪ nonylphenyl البولي ايثيلين غليكول لجعل التركيز النهائي 1٪ nonylphenyl البولي ايثيلين غليكول ومزيج عن طريق عكس بلطف أنابيب الطرد المركزي الصغير.
    3. تدور بسرعة أسفل أنابيب الطرد المركزي الصغير وإضافة 1/9 من حجم العينة من 10٪ DOC لجعل التركيز النهائي 1٪ DOC ومزيج عن طريق عكس بلطف أنابيب الطرد المركزي الصغير. تدور بسرعة أسفل أنابيب الطرد المركزي الصغير وحضانة على الجليد لمدة 5 دقائق.
    4. طرد مركزي الليسات النووية في 20،000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونقل supernatant إلى أنبوب جديد، prechilled microcentrifuge على الجليد.
      ملاحظة: ويمكن وضع الميتوكوندريا المنضبة على الجليد لبضع ساعات في حين يتم جمع العينات المتبقية.

5. الترسيب المناعي

  1. لكل أنبوب، تأخذ 1٪ من الحجم الإجمالي للsupernatant كمراقبة ما قبل المناعةه لمقارنة التخصيب المستهدف بعد الحضانة مع مصفوفة التقارب. وضع ضوابط الترسيب قبل المناعة على مدور أنبوب في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، بنفس الطريقة التي تتم بها معالجة العينات المناعية.
  2. إضافة 200 ميكرو لتر من مصفوفة التقارب إلى كل عينة. خذ عناية إضافية لإعادة تعليق الخرز عن طريق الأنابيب لطيف قبل إضافة مصفوفة تقارب لكل عينة. احتضان lysates مع مصفوفة تقارب في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع خلط لطيف على مدور أنبوب.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً لمدة تصل إلى يوم واحد بعد هذه الخطوة.

6. عزل الحمض النووي الريبي

  1. إعداد المخزن المؤقت وإعداد المعدات
    1. ضع الحامل المغناطيسي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للتبريد والحفاظ على الرف على الجليد طوال التجربة.
    2. حساب عدد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المطلوبة وقبل البرد على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: عادة، كل عينة يتطلب 1 أنبوب الطرد المركزي الدقيق لRNA تنقية النهائي.
    3. تدور بسرعة أسفل الأنابيب من الخطوة 5.2 وجمع الخرز عن طريق وضع على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن أن يكون supernatant التي تم جمعها التي تحتوي على كسر غير منضم فلاش المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية للمقارنة مع كسر ملزمة لإثراء النص بعد تنقية. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
    4. إعداد العازلة عالية الملح عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر / مل من 1 M DTT و 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد إلى المخزون الاحتياطي عالية الملح.
      ملاحظة: لكل عينة، مطلوب 5 مل من العازلة عالية الملح.
  2. عزل الجيش الملكي النيبالي
    1. أضف 1 مل من العازل الطازج عالي الملح إلى كل أنبوب متبوعاً بأنابيب لطيفة لمدة 5 مرات على الأقل دون إدخال فقاعات.
      ملاحظة: عدم كفاية الغسيل يمكن أن يقدم خلفيات من النصوص غير المنضمة في حين أن إدخال فقاعات يمكن أن يسرع تدهور الحمض النووي الريبي.
    2. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. كرر خطوات الغسيل مع العازلة عالية الملح لمدة 4 مرات أخرى (ما مجموعه 5 مرات).
    3. إزالة العازلة المتبقية عالية الملح وإزالة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من موقف المغناطيسي ومكان في RT لمدة 5 دقائق للاحماء.
    4. إعادة تعليق الخرز في 100 درجة مئوية من العازلة lysis (المقدمة في عدة العزلRNA) مع β-mercaptoethanol.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي مجموعة عزل وتنقية الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ثيوسيانات غوانيدين denaturant كمخزن مؤقت للتحلل لإطلاق RNA ملزمة من مصفوفة التقارب. وينبغي معالجة استخراج الحمض النووي الريبي في RT منذ guanidine ثيوسيانات يمكن أن تتبلور في درجات حرارة منخفضة.
    5. دوامة الخرز والعازلة لمدة 5 s على الأقل في أعلى سرعة، تدور بسرعة إلى أسفل لجمع العازلة على جانب أنبوب الطرد المركزي الصغير واحتضان الخرز مع العازلة في RT لمدة 10 دقيقة لإطلاق سراح RNA حبة ملزمة في العازلة lysis.
    6. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وجمع supernatant للمضي قدما على الفور لتنظيف الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول تنقية RNA كما هو محدد في مجموعة(جدول المواد).
      ملاحظة: كما يمكن تخزين الـ supernatant الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي في مخزن الليسافي عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد قبل التنظيف عن طريق الإحتراث إلى RT عند الذوبان.
    7. لتحقيق أقصى جودة من الحمض النووي الريبي المعزول، قم بتنفيذ جميع الخطوات الاختيارية بما في ذلك الهضم DNase وجميع خطوات elution RNA. قم بتسخين حاجز الإلتواء الذي توفره مجموعة عزل RNA أو المياه الخالية من RNase إلى 60 درجة مئوية لتحقيق أقصى قدر من استرداد الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي المعزول عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد أو -80 درجة مئوية لعدة سنوات. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.

7. اختياري تحليل جودة الحمض النووي الريبي (مستحسن)

  1. تقييم نوعية الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي11 وكمية مع مقياس الطيف12 لتحديد ما إذا كان تكرار عملية هطول الأمطار المناعية مطلوب للحصول على الحمض النووي الريبي وافرة وعالية الجودة.
    ملاحظة: يجب أن تتبع جودة RNA المثلى لتسلسل الإنتاجية العالية البروتوكولات المحددة بواسطة مجموعات إعداد المكتبة ومنصات التسلسل.

8. تطبيقات المصب

ملاحظة: يمكن استخدام إجمالي RNA المعزول بواسطة بروتوكول TRAP في عدد من التطبيقات القياسية في المصب، بما في ذلك RNA-seq (TRAP-seq). كما يمكن استخدام النسخ العكسي القياسي وبروتوكولات PCR الكمية بعد الملائمة.

  1. لTRAP-seq، قم بإجراء إعداد مكتبة RNA-seq وفقًا للأساليب القياسية13.
  2. بالنسبة لـ RNA-seq، قم بإعداد مكتبات تسلسل cDNA باستخدام مجموعات RNA-seq التجارية مع التخصيب القائم على القلة d(T) لنصوص بولي (A) متعددة السنوات. بدلاً من ذلك، إذا كانت جودة الحمض النووي الريبي الإجمالي أقل من الموصى بها لإثراء بولي(A)، استخدم وحدات استنفاد rRNA. ومع ذلك، نتوقع أن نرى المزيد من محاذاة rRNA بعد التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لتوصيف التعبير الجيني في إعادة ملء خلايا الكبد من Fah-/- الماوس، Gfp:Rpl10a الانصهار وFah transgenes يتم تسليمها بشكل مشترك داخل transposon التي تحتوي على بلازميد8 (ناقلات TRAP) إلى الكبد من قبل حقن الهيدروديناميك(الشكل 1ألف). إزالة النيتيزينون يسبب إصابة الكبد السامة التي تخلق ضغط اختيار لخلايا الكبد يعبّر بشكل ملحوظ FAH لإعادة ملء parenchyma المصاب9. تلطيخ المناعة يؤكد التعبير المشترك للFAH وGFP:RPL10A بروتين الانصهار في إعادة ملء خلايا الكبد بعد أسبوعين من إعادة سكان الكبد(الشكل 1ب).

في التجربة التمثيلية التالية، تم إجراء TRAP-seq باستخدام خلايا كبد الماوس هادئة وإعادة ملء. أولا، للحصول على الريبوسوميس ذات العلامات GFP من الخلايا الكبدية الهادئة، تم حقن الفئران RosaLSL-GFP-L10A المعدلة وراثيا مع AAV8-TBG-Cre 7 أيام قبل التضحية للحث على التعبير GFP: RPL10A في جميع الخلايا الكبدية14. كما قمنا بمعالجة عينة كبد تم جمعها من فأر ة من النوع البري كتحكم سلبي لضمان عزل ترجمة الحمض النووي الريبي كان محدداً، مما يعني أن الحمض النووي الريبي لا يمكن استخراجه إلا من الفئران التي تعبر عن GFP:RPL10A. ويرتبط تركيز الحمض النووي الريبي المعزول مع عدد الخلايا التي تعبر عن البروتين الانصهار، مع عينة هادئة تنتج أعلى عائد منذ جميع خلايا الكبد التعبير GFP: RPL10A بعد AAV8-TBG-Cre حقن(الشكل 2A). وعلى العكس من ذلك، بالكاد كان أي RNA يمكن الكشف عنها في عناصر التحكم النوع البرية التي لم يكن لديها transgene GFP:RPL10A، مما يشير إلى إجراء TRAP محددة للغاية ولها خلفية منخفضة. عندما تم استخدام TRAP على أنسجة الكبد التي تمر بإعادة السكان مع GFP: RPL10A-المنقولة الكبد، وفيرة، تم الحصول على الحمض النووي الريبي عالية الجودة(الشكل 2ب). وعلى النقيض من ذلك، لم يتم الكشف عن أي أثر الحمض النووي الريبي عن طريق المحلل الحيوي لعينة التحكم السلبية.

ويمكن إجراء تحليل التعبير الجيني في المصب عن طريق النسخ العكسي وPCR الكمي أو RNA-seq على الحمض النووي الريبي المعزول TRAP. Gsta1 ترميز الجلوتاثيون S-transferase الذي يلعب دورا هاما لعملية التمثيل الغذائي من الجلوتاثيون، الببتيد إزالة السموم الرئيسية لحماية الكبد من أضرار الإجهاد التأكسدي15. يتم حث التعبير Gsta1 من قبل أكثر من 10 أضعاف في إعادة ملء خلايا الكبد بالمقارنة مع خلايا الكبد هادئة، في حين لم يتم الكشف عن قيمة دورة عتبة (Ct) مع الحمض النووي الريبي معزولة TRAP من الماوس نوع البرية بسبب عدم وجود الحمض النووي الريبي المدخلات(الشكل 3 A).لاحظ أن نوعية الحمض النووي الريبي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على تحليل التعبير الجيني. في حالة تجارب الحمض النووي الريبي، ينبغي إجراء تقييم لجودة الحمض النووي الريبي وفقا ً لتوصيات مجموعة إعداد المكتبة ومنصة التسلسل(الشكل 3B). غالباً ما يستخدم المحلل الحيوي لتحديد رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN)، مع ارتفاع RIN يرتبط مع معدل أعلى من محاذاة الحمض النووي الريبي إلى الجينوم(الشكل 3B، إلى اليسار)، في حين أن انخفاض RIN يؤدي إلى معدل أعلى من قراءة ريبوسومال، مما يشير إلى تدهور الحمض النووي الريبي(الشكل 3يمين). الشكل 3 C,D يوضح أن TRAP-seq يمكن تحديد التعبير الجيني التفاضلي في هادئة وإعادة ملء خلايا الكبد. على سبيل المثال، يتم تثبيط التعبير Alb والتعبير وكالة فرانس برس هو upregulated خلال إعادة السكان الكبد، مما يعكس أن خلايا الكبد تكرار تفترض حالة أقل تميزا لمنع وظائف التمثيل الغذائي الكبد خلال إعادة السكان9،16.

Figure 1
الشكل 1: تنفيذ TRAP مع Fah-/- لتغيير التعبير الجيني الشخصي لإعادة ملء خلايا الكبد. (أ)مخطط للتعبير عن GFP:RPL10A بروتين الانصهار مع FAH في نظام ترانسبوسون الجمال النائم تليها حقن في فاه-/- الماوس. السداسي الأخضر تشير إلى إعادة ملء خلايا الكبد مع التعبير مستقرة من FAH وGFP: RPL10A، في حين أن السداسي الأسود تمثل المصابين، والموت خلايا الكبد. (ب)تلطيخ المناعة التمثيلي يدل على التعبير المشترك للبروتين ريبوسومال L10A (الأخضر) وFAH (الأحمر) في خلايا الكبد المعاد إسكانها. شريط مقياس = 50 درجة.

Figure 2
الشكل 2: يسمح TRAP بعزل نوع الخلية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة. (أ)يرتبط العائد من الحمض النووي الريبي بشكل إيجابي مع عدد من خلايا الكبد التي تعبر GFP: RPL10A. يوضح العائد المنخفض من RNA من ماوس نوع البرية خصوصية TRAP من المصادر دون تعبير GFP:RPL10A. (B)آثار محلل حيوي من الحمض النووي الريبي الكلي معزولة عن إعادة ملء الكبد التعبير عن GFP:RPL10A ومن الكبد نوع البرية تثبت خصوصية TRAP. مجموع الحمض النووي الريبي معزولة من أنسجة الكبد نوع البرية خالية من GFP:RPL10A transgene يظهر أنه تم جمع الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي، في حين أن الأنسجة التي تعبر عن الجينات يوفر RNA وافرة عالية الجودة. لاحظ أن قمم RNA ريبوسومال موجودة بعد نجاح TRAP10. وحدة الفلورة رين، رقم سلامة الحمض النووي الريبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يمكن استخدام الحمض النووي الريبي المعزول TRAP لتحليل التعبير الجيني في المصب. (أ)النسخ العكسي التمثيلي ونتائج PCR الكمية من Gsta1 في القرفصاء وإعادة ملء خلايا الكبد. لم يتم الكشف عن أي قيمة Ct مع RNA معزولة عن الحيوانات من النوع البري. (ب)تحليل محاذاة الحمض النووي الريبي المعزول بعد تسلسل الإنتاجية العالية، مما يدل على أهمية تحديد سلامة الحمض النووي الريبي بعد العزلة. [رنا] [هيغ-كليتي] ينتج في نسبة مئويّة [هيغر] من [مرنا] يقرأ (اللون الأخضر), بينما [لوو-كليتي] [رنا] يقود إلى نسبة مئويّة [هيغر] كثير من [ريبوسم] يقرأ (أحمر), بما أنّ كثير [مرنا] يكون حطّمت. رين، رقم سلامة الحمض النووي الريبي. (C,D) التكاملي الجينوم المشاهد (IGV) المسارات من RNA-seq يقرأ من mRNA تقارب تنقية من هادئة وإعادة ملء خلايا الكبد في (C) Alb و (D) Afp loci. لاحظ أن انحياز القراءة 3 نموذجي ة من خط أنابيب تحديد بولي(A). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TRAP-seq هو تقنية لعزل نوع الخلية محددة من ترجمة mRNA عن طريق ريبوسوسومات ذات علامات النعت، ويقدم بديلا لنهج FACS، كما أنه يتحايل على القيود مثل متطلبات الوقت من FACS9. بدلا ً من ذلك، يسمح TRAP بعزل الحمض النووي الريبي بسرعة وكفاءة مباشرة من الأنسجة السائبة، مما يساعد على تجنب أي تغييرات في التعبير الجيني. TRAP-seq هو مناسب بشكل خاص للاستخدام في إعادة ملء كبد فاه-/- الماوس، كما توسيع خلايا الكبد بعد إزالة النيتسيون هو الخلية المستقلة وتمكن من تحديد ملامح التعبير الجيني للمجموعة الفرعية من خلايا الكبد مع متكاملة الجينات المتحولة. ويمكن أيضا أن يكون ناقلات TRAP مشترك مع تنشيط الجينات أو إسكات الجزيئات17، بما في ذلك cDNA ، RNA دبوس الشعر القصير ، وتوجيه الحمض النووي الريبي ، لدراسة الآثار على التعبير الجيني العالمي لتنشيط أو تثبيط جين معين. بدلا من ذلك، يوفر الماوس المعدل وراثيا ROSALSL-GFP-L10A القدرة على التعبير الجيني الشخصي في أي خلية مع نشاط Recombinase Cre. منذ GFP: RPL10A يمكن التعبير عنها على وجه التحديد في أي الخلايا التي تعبر عن كري، يمكن دراسة دور أنواع الخلايا الأخرى في الكبد أثناء إصابة الكبد وإعادة السكان. على سبيل المثال، عبور CK19-Cre الماوس مع الماوس المعدلة وراثيا TRAP يمكن استخدامها للتعبير GFP: RPL10A في الخلايا الأقنية تليها TRAP-seq لدراسة تغيير التعبير الجيني في ظهارة الصفراوية خلال عملية إعادة السكان.

لضمان التنميط الدقيق للتعبير الجيني، من الضروري إعداد جميع المخازن المؤقتة ومصفوفة التقارب قبل تشريح الأنسجة. وينبغي تنفيذ جميع الخطوات على الجليد مع المخازن الاحتياطية الباردة ما لم ينص على خلاف ذلك لضمان استقرار متعدد النقاط10 ومنع تدهور الحمض النووي الريبي. وينبغي إعداد جميع المخازن المؤقتة باستخدام الكواشف الخالية من RNase، وينبغي تنفيذ بروتوكول TRAP-seq في بيئة خالية من الرنا سي لمنع تدهور الحمض النووي الريبي وانخفاض غلة الحمض النووي الريبي المناعي. يمكن إعداد مصفوفة التقارب لمدة تصل إلى أسبوعين قبل استخدامها مع إعادة تعليق لطيف على مدور أنبوب بين عشية وضحاها. وينبغي توخي الحذر الخاص لعدم هز المصفوفة بقوة لمنع تعطيل الخرز المغناطيسي المطلي بالجسم المضاد للجسم والبروتين L المغلفة. وتشمل طرق إعداد مصفوفة التقارب اقتران الخرز المغناطيسي للبروتين biotinylated L تليها الحضانة مع الأجسام المضادة للGFP. ومع ذلك، يمكن استبدال البروتين A / G المتاحة تجاريا الخرز المغناطيسي؛ إذا استخدمت، تخطي الخطوة الاقتران الأولية والمضي قدما مباشرة إلى ربط الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، يفترض أن تكون العلامات النعوت البديلة ممكنة مع إدخال التعديل المناسب على البروتوكول المذكور أعلاه.

هناك نقاط مختلفة حيث يمكن إيقاف خطوة عزل وتنقية الحمض النووي الريبي (انظر البروتوكول أعلاه). ومع ذلك، بمجرد أن يتم حصاد عينات الكبد، وينصح الاستمرار في الترسيب المناعي، كما يمكن أن ينخفض العائد من الحمض النووي الريبي معزولة بنسبة ~ 50٪ مع تجميد في هذه الخطوة10. يجب شطف الأنسجة بسرعة مع المخزن المؤقت الذي يحتوي على سيكلوهيكسميد لمنع ترجمة mRNA. كما يمكن أن يسهم عدم كفاية الليسات في انخفاض عائد الحمض النووي الريبي. من المهم لتجانس الأنسجة على الجليد حتى لا تكون قطع الأنسجة مرئية مع الخالطول الحركي مع ضمان الحد الأدنى من التبذير10. بالإضافة إلى ذلك، الغسيل الكافي مع العازلة عالية الملح أمر بالغ الأهمية لضمان إزالة ملزمغير محدد من البروتينات ريبوسومال إلى مصفوفة التقارب. بما في ذلك السيطرة السلبية نوع البرية يساعد على تقييم خصوصية الترسيب المناعي وكفاءة خطوات الغسيل. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي التجارية التي تشمل علاج DNase خالية من RNase زيادة نقاء الحمض النووي الريبي.

وعلاوة على ذلك، فمن المستحسن للتحقق من التعبير ووفرة من البروتين الانصهار GFP:RPL10A وتقييم كمية الأنسجة اللازمة للحصول على الحمض النووي الريبي وافرة لتحليل المصب. يمكن استخدام أقسام الأنسجة أو lysates لطرق الكشف المستندة إلى المناعة للتحقق من صحة التعبير عن GFP:RPL10A. يمكن أن تختلف كمية الحمض النووي الريبي المعزولة حسب: (1) عدد الخلايا التي تعبر عن GFP:RPL10A، (2) مستوى التعبير عن الترانسجين، و (3) حجم وploidy من الخلايا التي تعبر عن transgene. تجربة تجريبية باستخدام نصف ومضاعفة كمية الكمية الموصى بها من الأنسجة يمكن أن تكون مفيدة في تحديد lysate الإدخال الأمثل لTRAP-seq. في أيدينا، يمكننا الحصول على ~ 150 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مع أقل من 1-2٪ من خلايا الكبد التعبير GFP: RPL10A من 200 ملغ من إعادة ملء فاه-/- الكبد، مما يمثل ~ 2 × 105 خلايا الكبد متعددة اللمعات مع التعبير transgene9.

منهجية TRAP-seq عزل الريبوسم ملزمة mRNA لتوصيف تجمع mRNA ترجمة الخلية. وبالتالي فإن التسلسل الناتج عن ذلك يتوافق مع "الترجمة" بدلاً من النسخ. لاحظ أنه لن يتم جمع آثار أقدام الريبوسوم ترجمة، كما يتم تنفيذ TRAP على المجمعات الأصلية بدلاً من المترابطة. وإذا رغبت في إجراء تحليلات للآثار، ينبغي تعديل البروتوكول المذكور أعلاه بالربط المتبادل ذي الصلة متبوعاً بمنهجيات الترسيب المناعي(CLIP) 18. آخر قيد TRAP هو شرط عدد كاف من الخلايا التي تعبر عن GFP:RPL10A بروتين الانصهار. بالنسبة للتجارب التي يكون فيها نوع الخلية من الفائدة صغيرًا، قد يلزم الجمع بين عينات بيولوجية متعددة لعزل الحمض النووي الريبي الكافي لتمكين RNA-seq19. وعلاوة على ذلك، TRAP-seq يتطلب وجود GFP: RPL10A في نوع الخلية من الفائدة. قد يشكل هذا تحدياً إذا لم يكن هناك نظام تسليم محدد للخلايا أو إذا لم يتوفر مروج محدد من نوع الخلية لدفع تعبير Cre.

وقد سمح التطور الأخير لتكنولوجيا RNA-seq أحاديالخلية (scRNA-seq) بالتسلسل المباشر متبوعاً بتحديد السيليكو لأنواع الخلايا المختلفة، مما يتيح التسلسل دون فرز لأنواع محددة من الخلايا من المصالح20 ،21،22. ومع ذلك، لا يزال scRNA-seq يتطلب فصل الخلايا عن الجهاز. في حالة نموذج فاه-/- إعادة السكان، التسريب الكبد وعزل الكبد من الصعب للغاية وغير فعالة بسبب هشاشة كل من المصابين وتكرار خلايا الكبد. في الواقع، لم نتمكن بعد من عزل ما يكفي من خلايا الكبد من Fah-/- الفئران التي تمر بإعادة السكان بعد الحقن الهيدرودينامي من البلازميدات فاه. بالإضافة إلى ذلك، في الوقت الذي يستغرقه معالجة الأنسجة، يمكن أن تتغير مستويات التعبير الجيني. بروتوكولات لضخ الكبد يستغرق ما يصل إلى 30 دقيقة من وقت نقص التروية الدافئة. المنهجيات المستقبلية لتحسين ضخ الكبد لتقليل وقت المعالجة وزيادة كفاءة العزلة يمكن أن تسمح بالتكامل scRNA-seq لنظام نموذج Fah-/- الماوس وربما لنماذج أخرى من الإصابات وإعادة السكان. وهذا من شأنه أيضا تمكين دراسة جميع أنواع خلايا الكبد.

في الختام، فإن دمج TRAP-seq مع فاه-/- الماوس يسمح العزلة المحددة وتوصيف التعبير الجيني لتكرار خلايا الكبد لتحديد الأهداف العلاجية التي يمكن أن تعزز إعادة سكان الكبد. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة لدراسة أنواع الخلايا الأخرى في الكبد وأجهزة الأعضاء الأخرى لتحديد التغيرات في التعبير الجيني الخاصة بالأمراض لتحديد الأهداف المحتملة للأدوية أو المؤشرات البيولوجية. ويمكن استخدام تقنية مماثلة لجمع النوى من إعادة ملء خلايا الكبد باستخدام تنقية التقارب، ومن ثم لإجراء تحليل جيني لهذه الخلايا المحددة16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: F31-DK113666 (AWW)، K01-DK102868 (AMZ)، K08-DK106478 (KJW)، و P30-DK050306 (منحة تجريبية إلى KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28, (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22, (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276, (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176, (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7, (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47, (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128, (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124, (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30, (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64, (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542, (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29, (3), 539-544 (2019).
تحديد سمات تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية في كبد الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter