Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.

Abstract

Lever repopulatie na letsel is een cruciaal kenmerk van zoogdieren die onmiddellijk orgaan falen en overlijden na blootstelling van milieu-toxines voorkomt. Een dieper begrip van de veranderingen in genexpressie die optreden tijdens de herbevolking kan helpen bij het identificeren van therapeutische doelen ter bevordering van het herstel van de leverfunctie bij het instellen van verwondingen. Niettemin, methoden om specifiek te isoleren van de herbevolkingende hepatocyten worden geremd door een gebrek aan celmarkeringen, beperkte celaantallen, en de kwetsbaarheid van deze cellen. De ontwikkeling van het vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) technologie in combinatie met de Fah-/- Mouse model te even herbevolking in de setting van leverletsel maakt het mogelijk genexpressie profilering van de repopulatie hepatocyten. Met TRAP, Cell Type-specifieke vertalen mRNA is snel en efficiënt geïsoleerd. We ontwikkelden een methode die gebruik maakt van TRAP met affiniteit gebaseerde isolatie van het vertalen van mRNA van hepatocyten die selectief uitdrukken het groene fluorescerende eiwit (GFP)-tagged ribosomale eiwitten (RP), GFP: RPL10A. TRAP omzeilt de lange periode die nodig is voor het sorteren van fluorescentie-geactiveerde cellen die het genexpressie profiel kunnen veranderen. Bovendien, aangezien alleen de herbevolkende hepatocyten Express de GFP: RPL10A fusie-eiwit, de geïsoleerde mRNA is verstoken van besmetting van de omringende geblesseerde hepatocyten en andere celtypen in de lever. De affiniteits-gezuiverde mRNA is van hoge kwaliteit en maakt downstream PCR-of high-throughput sequencing-gebaseerde analyse van genexpressie mogelijk.

Introduction

Als de belangrijkste metabole orgaan in gewervelde dieren, de lever is verantwoordelijk voor glucose homeostase, serumeiwit synthese, gal zuur secretie, en xenobiotische metabolisme en detoxificatie. De lever bezit een buitengewone capaciteit om het geblesseerde parenchym te regenereren bij blootstelling aan toxines om onmiddellijke leverfalen1te voorkomen. Echter, falen van regeneratie kan optreden in de setting van paracetamol of alcohol overconsumptie, wat kan leiden tot acuut leverfalen2. Bovendien, chronische leverschade veroorzaakt door virale hepatitis infectie, vette leverziekte, en Steatohepatitis kan leverfibrose veroorzaken, cirrose, en hepatocellulaire carcinoom3. De enige beschikbare curatieve behandeling voor eindstadium leverziekte is transplantatie, maar wordt beperkt door orgaan tekort, waardoor een efficiënte behandeling voor alle patiënten4. Een beter begrip van het herstelproces na toxische leverbeschadiging is daarom cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen om regeneratie te stimuleren die voldoende is om de functie in het zieke orgaan te redden.

Het meest breed toegepaste modelsysteem voor de studie van lever regeneratie is partiële hepatectomie bij knaagdieren, waarbij een groot deel van de lever wordt doorgeperfectioneerd om snelle hepatocyten uitbreiding5te stimuleren. Echter, partiële hepatectomie niet recapituleren hepatocyten expansie na toxische leverschade als gevolg van het gebrek aan immuuncel infiltratie en hepatocyten cel necrose vaak waargenomen in de setting van acute leverschade bij de mens6. Een geschikter systeem om deze vorm van orgel vernieuwing te modelleren is de Fah-/- Mouse, die geen functionele fumarylacetoacetaat hydrolase (FAH) vereist voor een goede tyrosine metabolisme en ontwikkelt ernstige leverschade leidt tot de dood7. Deze muizen kunnen worden gehandhaafd in een gezonde toestand voor onbepaalde tijd door behandeling met de drug nitisinon in het drinkwater. Als alternatief kan Fah expressie worden hersteld door transgen levering aan een subset van hepatocyten, die zal uitbreiden naar de lever opnieuw bevolken op nitisinon verwijderen8.

Voor het profiel van de genetische expressie veranderingen van het herbevolgen van hepatocyten, een instrument om specifiek te isoleren repliceren hepatocyten in de Fah-/- Mouse zonder besmetting van de naburige gewonde hepatocyten en andere celtypen is vereist. Helaas, fluorescentie-geassisteerde celsortering (FACS) van hepatocyten is moeilijk sinds (1) de kwetsbaarheid van het hervullen van hepatocyten leidt tot slecht herstel na lever perfusie, (2) replicerende hepatocyten zijn zeer variabel in grootte, waardoor isolatie van een zuivere populatie door FACS moeilijk, en (3) de procedure tijd van lever perfusie tot RNA-isolatie is groter dan 2 uur, vandaar dat genexpressie profielen aanzienlijke kunstmatige veranderingen kunnen ondergaan voordat monsters worden verworven9.

Als alternatief kan de uitdrukking van met epitope gelabelde ribosomen die specifiek zijn voor het hervullen van hepatocyten, de snelle isolatie van actief vertalen van mRNA gebonden door ribosomen met behulp van affiniteits zuivering onmiddellijk na orgaanoogst, met bulk lever weefsel lysaten. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van vertalen-ribosome affiniteits zuivering (TRAP)10 gevolgd door RNA-sequencing met hoge doorvoer (trap-SEQ), om specifiek mRNA te isoleren en te profiel bij het hervullen van hepatocyten in de Fah-/- muis9. Coexpressie van groen fluorescerend eiwit-gelabeld ribosomaal eiwit (GFP: RPL10A) met FAH maakt affiniteits zuivering van het vertalen van mRNA gebonden door polysomes met GFP: RPL10A. Deze methode vermijdt elke celdissociatie stappen, zoals lever perfusie om fragiele repopulatie hepatocyten te isoleren. In plaats daarvan maakt het gebruik van Lysis van heel orgaanweefsel en antilichamen om snel het RNA specifiek uit de doelcellen te halen. Tot slot maakt het isoleren van overvloedige, kwalitatief hoogwaardige mRNA via TRAP-SEQ downstreamtoepassingen zoals sequentieanalyse mogelijk om de dynamische verandering van genexpressie tijdens het repopulatie proces te profiel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden die betrekking hebben op het gebruik van muizen zijn consistent met de richtlijnen die door de IACUC van de Penn Office of Animal Welfare aan de Universiteit van Pennsylvania.

1. bereiding van het reagens

  1. Haring
    1. Om 500 μl van 0,1 g/ml haring te maken, schorst u 50 mg haring in 500 μL methanol.
      Let op: Cycloheximide is zeer giftig voor het milieu en kan aangeboren misvorming veroorzaken. Alle afvalstoffen en buffers die haring bevatten, moeten worden ingezameld voor de juiste verwijdering.
      Opmerking: Cycloheximide kan maximaal 1 dag bij 4 °C worden bewaard. Cycloheximide remt de vertaling.
  2. Dithiothreitol (DTT)
    1. Om 1 mL van 1 M DTT te maken, schorst u 0,15 g DTT poeder in RNase-vrij water.
      Let op: DTT kan irritatie van de huid, het oog en de luchtwegen veroorzaken.
      Opmerking: DTT is een reinigingsmiddel. DTT kan bij-20 °C worden bewaard. Het wordt aanbevolen om 1 M DTT op te slaan in aliquots voor eenmalig gebruik van 50 μL.
  3. Deoxycholaat (DOC)
    1. Om 10% DOC te maken, onderbreek 1 g DOC in een conische buis van 50 mL en voeg RNase-vrij water tot 10 mL toe. Schud krachtig totdat het poeder is opgelost.
      Opmerking: De oplossing van 10% DOC is licht geel en kan tot 1 jaar bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard. DOC wordt gebruikt voor nucleaire lysis.
  4. GFP-antilichamen
    1. Aliquot GFP-antilichamen bij gebruik voor de eerste keer. Snap bevriezen de aliquots en bewaren bij-80 °C.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om 50 μg GFP-antilichamen op te slaan in aliquots voor eenmalig gebruik.
  5. B biotinyleerd proteïne L
    1. Respendeer biotinyleerd proteïne L in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om de uiteindelijke concentratie 1 μg/μL te maken.
      Opmerking: De resuspendeerde oplossing kan maximaal 6 maanden bij-20 °C worden bewaard.

2. buffer voorbereiding

  1. Boviene serumalbumine (BSA) buffer
    1. Om 50 mL 3% BSA-buffer te maken, voegt u 1,5 g IgG-en protease vrij BSA-poeder toe aan 40 mL PBS gevolgd door Vortex. Nadat de BSA is opgelost, voegt u PBS toe aan een eindvolume van 50 mL.
      Opmerking: De BSA-buffer kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
  2. Dissectie buffer
    1. Om 50 mL dissectie buffervoorraad te maken, combineer 5 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van 10x Hank (HBSS), 125 μL van 1 M 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur (HEPES), 1.750 μL van 1 M glucose en 200 μL van 1 M NaHCO3. Voeg RNase-vrij water toe aan een eindvolume van 50 mL.
      Opmerking: De dissectie buffervoorraad kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
    2. Voeg onmiddellijk vóór gebruik 100 μg/ml 0,1 g/ml haring toe en blijf op ijs.
  3. Hoog-zout buffer
    1. Voeg 1 mL 1 M HEPES, 8,75 mL van 2 M KCl, 500 μL van 1 M MgCl2en 500 μL 100% nonylphenyl polyethyleenglycol (tabel met materialen) toe aan RNase-vrij water om 50 ml hoogzout buffervoorraad te maken.
      Opmerking: De hoog-zout buffer kolf kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
    2. Voeg onmiddellijk vóór gebruik 0,5 μL/mL van 1 M DTT en 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide toe. Houd de verse hoogzout buffer op ijs.
  4. Laag-zout buffer
    1. Voeg 1 mL 1 M HEPES, 3,75 mL van 2 M KCl, 500 μL van 1 M MgCl2en 500 μL 100% nonylphenyl polyethyleenglycol toe aan 44,25 ml RNase-vrij water om 50 ml zoutlaag zout te maken.
      Opmerking: De laag-zout buffervoorraad kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
    2. Voeg vóór gebruik 0,5 μl/ml van 1 M DTT en 1 μL/ml 0,1 g/ml haring toe. Houd de verse laag-zout buffer op ijs.
  5. Weefsel lysis buffer
    1. Om 50 mL weefsel lysisbuffer voorraad te maken, Combineer 1 mL van 1 M HEPES, 3,75 mL van 2 M KCl en 500 μL van 1 M MgCl2. Voeg RNase-vrij water toe aan een finale van 50 mL.
      Opmerking: De dissectie buffervoorraad kan gedurende maximaal zes maanden bij 4 °C worden bewaard.
    2. Voeg 1 Tablet/10 mL EDTA-vrije proteaseremmer toe, 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide, 10 μL/mL RNase remmers, elk onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik. Bewaar de verse weefsellysisbuffer op ijs.

3. conjugatie van antilichamen tegen magnetische kralen

  1. Antilichamen
    1. Bereken de hoeveelheid GFP-antilichamen die voor alle monsters nodig is en bereid een extra monster voor.
      Opmerking: Voor elk monster is 50 μg van elk GFP-antilichaam vereist.
    2. Dooi GFP antilichamen op ijs en spin op maximale snelheid (> 13000 x g) gedurende 10 minuten bij 4 °c en breng supernatanten over naar een nieuwe microcentrifuge buis.
      Opmerking: De voorbereidingsstap van het antilichaam kan voorafgaand aan de kraal voorbereiding worden uitgevoerd en de ontdooide antilichamen kunnen op ijs worden gehouden. Als alternatief kan dit deel worden uitgevoerd tijdens de incubatie van de magnetische kraal en biotinyleerd proteïne L.
  2. Resuspend magnetische kralen
    1. Respendeer magnetische kralen (tabel met materialen) door voorzichtig pipetteren.
    2. Gebruik voor elk monster 150 μL magnetische kraal. Bereken het volume van de magnetische kraal vereist voor alle monsters en bereiden een extra. Breng de geresuspendeerde magnetische kralen over naar een micro centrifugebuis van 1,5 mL of 2 mL. Als er meer dan 1 mL is vereist voor een experiment, splitst u het totaalbedrag op in gelijke volumes.
    3. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Verwijder de microcentrifuge buis van de magnetische standaard en voeg 1 mL PBS toe, gevolgd door pipetteren op en neer om de kralen te wassen. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 min en verwijder PBS.
  3. Bereiding van eiwit L-gecoate kralen
    1. Gebruik voor elk monster 60 μL biotinyleerd proteïne L. Als proteïne L eerder is geresuspendeerd en opgeslagen bij-20 °C, ontdooit u proteïne L op ijs. Als proteïne L vóór gebruik opnieuw wordt opgehangen, neem dan het benodigde bedrag voor alle monsters en bereid een extra voor.
    2. Voeg het berekende volume biotinyleerd proteïne L toe aan de geresuspendeerde en gewassen magnetische kralen. Voeg 1x PBS toe om het laatste volume 1 mL te maken bij gebruik van een micro centrifugebuis van 1,5 mL of 1,5 mL bij gebruik van een micro centrifugebuis van 2 mL. Inbroed magnetische parels met biotinyleerd proteïne L voor 35 min bij RT op een buis Rotator.
      Opmerking: Bij deze stap kunnen antilichamen worden bereid terwijl de parels worden geïnbroed met biotinyleerd proteïne L.
    3. Verzamel eiwit L-gecoate parels op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Verwijder de microcentrifuge buis van de magnetische standaard en voeg 1 mL 3% BSA-buffer toe, gevolgd door voorzichtig pipetteren gedurende ten minste 5 keer om de proteïne L-gecoate kralen te wassen.
    4. Verzamel gecoate parels op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Herhaal de wasstappen met 3% BSA voor nog eens 4 keer (in totaal 5 keer).
  4. Antilichaam binding
    1. Voeg de berekende hoeveelheid GFP-antilichamen toe aan de proteïne-L-gecoate kralen en incureer gedurende 1 uur bij 4 °C op een buis Rotator.
      Opmerking: Zorg er na de incubatie van het antilichaam voor dat u de affiniteits matrix niet Vortex.
    2. Bereid tijdens de incubatie-laag-zout buffer door het totale volume te berekenen dat voor alle monsters nodig is en Voeg 0,5 μl/ml van 1 M DTT en 1 μl/ml 0,1 g/ml haring toe aan de buffervoorraad met een laag zout vóór gebruik.
      NB: 3 ml laag-zout buffer voor het wassen van elke buis GFP-geconjugeerde kralen en 200 μL/monster voor het resuspensie van de GFP-geconjugeerde kralen is vereist. Verse zoutpan buffer kan een paar uur op ijs worden gehouden.
    3. Verzamel de affiniteits matrix op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Voeg 1 mL laag-zout buffer toe en Pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag om de affiniteits matrix te wassen. Verzamel de affiniteits matrix op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder de laag-zout buffer. Herhaal de wasstappen met een laag-zout buffer voor nog eens 2 keer (in totaal 3 keer).
    4. Respendeer de parels in een laag-zout buffer zodat elk monster 200 μL affiniteits matrix heeft.
      Opmerking: De affiniteits matrix kan worden opgeslagen in 0,02% NaN3 bij 4 °c gedurende maximaal 2 weken. De affiniteits matrix moet in 3 keer snel worden gewassen in een laag-zout buffer en gedurende ten minste 10 minuten zachtjes worden geresuspendeerd op een buisrotator bij 4 °C als de affiniteits matrix wordt bereid binnen 1 week of 's nachts als de affiniteits matrix gedurende 1 week wordt opgeslagen. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
      Let op: Natrium natriumazide is zeer giftig voor het milieu. Contact met zuren produceert giftig gas. Alle afvalstoffen moeten worden ingezameld voor de juiste verwijdering.

4. Lysis van lever weefsels

  1. Buffer voorbereiding en installatie van apparatuur
    1. Bereken het aantal benodigde microcentrifuge buizen, label en chill op ijs.
      Opmerking: Gewoonlijk zijn zeven 1,5 mL micro centrifugebuizen vereist voor elk monster: 1 voor de resterende ontleed lever, 4 voor 4 mL gehomogeniseerde lever lysaat, en 2 voor het overbrengen van supernatants.
    2. Bereid verse dissectie buffer door het totale volume te berekenen dat nodig is voor alle monsters en voeg 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide toe. Plaats de verse dissectie buffer op ijs om het hele experiment koud te houden.
      Opmerking: Voor elk monster is 10 mL dissectie buffer vereist.
    3. Bereid de nieuwe lysisbuffer voor door het totale vereiste volume voor alle monsters te berekenen en voeg 1 Tablet/10 mL EDTA-vrije proteaseremmer, 1 μL/mL 0,1 g/mL Cycloheximide en 10 μL/mL RNase remmers toe. Houd de lysisbuffer op ijs tijdens het experiment.
      Opmerking: Voor elk monster is 4 mL lysisbuffer vereist.
    4. Stel de weefsel slijper (tabel met materialen) zo in dat de buizen van polytetrafluorethyleen (PTFE)-glas op ijs kunnen worden geplaatst tijdens de homogenisatie van lever stukken. Zet 4 mL koude lysisbuffer in de PTFE-glazen buizen.
  2. Herbevolkende lever homogenisatie
    1. Euthanize een 8 − 12-weekse Fah-/- muis geïnjecteerd met de trap vector en herbevolkt voor 1 − 4 weken met anesthesie en cervicale dislocatie volgens goedgekeurde dierlijke experimentele richtlijnen.
    2. Plaats de muis op een dissectie bord en spray de buik met 70% ethanol. Tent de huid en het peritoneum laag in de buik met behulp van een tang en gebruik een schaar om een dwarse incisie te maken. Blijf met de schaar snijden om een brede U-vormige peritoneale flap te maken, met zorg om de ingewanden niet te snijden. Draai de peritoneale flap over het borstbeen om de lever bloot te leggen.
    3. Verwijder voorzichtig de lever met behulp van fijne schaar en Tang en plaats het weefsel snel in de koude dissectie buffer om te spoelen. Om bevroren weefsels te homogeniseren, verplaats de gewenste hoeveelheid leverweefsel snel in PTFE-glazen buizen met koude lysisbuffer zonder het weefsel te ontdooien.
      Opmerking: Het ontleed weefsel kan worden ingevroren en opgeslagen bij-80 °C nadat het is gewassen met dissectie buffer. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
    4. Weeg de lever op een Petri schaaltje en Isoleer 200 − 500 mg lever stukken en ga in de PTFE-glazen buizen. Plaats het resterende leverweefsel in een voorgekoelde micro centrifugebuis en vlam blokkeren.
    5. Homogeniseren de monsters in een motor-aangedreven homogenisator beginnend bij 300 rpm om hepatocyten van de lever structuur te ontkoppelen voor minstens 5 slagen. Verlaag de glazen buis elke keer maar zorg ervoor dat de stamper niet boven de oplossing stijgt om beluchting te voorkomen die eiwit denaturatie kan veroorzaken.
    6. Verhoog de snelheid tot 900 rpm om de lever weefsels volledig te homogeniseren voor ten minste 12 volledige slagen.
    7. Breng het lysaat over in de gelabelde en voorgekoelde buisjes, met niet meer dan 1 mL lysaat per 1,5 mL micro centrifugebuizen. Als 4 mL lysisbuffer wordt gebruikt, Houd 1 tube en Flash de resterende 3 tubes in de vriezer.
      Opmerking: De lysaten kunnen tot 1 uur op ijs worden gehouden terwijl ze het volgende dier ontleden en verse lysaten bereiden. De gehomogeniseerde lever kan na de lysisstap in de vlam worden bevroren en bij-80 °C worden bewaard. Er kan een afname van 50% in geïsoleerd RNA zijn als bevroren lysaten worden gebruikt. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
  3. Nucleaire Lysis
    1. Centrifugeer het lever lysaat op 2.000 x g bij 4 °c gedurende 10 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe, voorgekoelde microcentrifuge buis op ijs.
    2. Voeg 1/9 van het supernatans volume van 10% nonylphenyl polyethyleenglycol toe om de uiteindelijke concentratie 1% nonylfenylpolyethyleenglycol te maken en meng door de micro centrifugebuizen voorzichtig te inverteren.
    3. Draai de microcentrifuge buizen snel af en voeg 1/9 van het monstervolume van 10% DOC toe om de eindconcentratie 1% DOC te maken en meng door de micro centrifugebuizen voorzichtig te inverteren. Draai de micro centrifugebuizen snel af en inincuberen op ijs gedurende 5 minuten.
    4. Centrifugeer het nucleaire lysaat op 20.000 x g bij 4 °c gedurende 10 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe, voorgekoelde microcentrifuge buis op ijs.
      Opmerking: De mitochondriën-uitgeput supernatant kan worden geplaatst op ijs voor een paar uur, terwijl de resterende monsters worden verzameld.

5. immunoprecipitatie

  1. Neem voor elke buis 1% van het totale volume van de supernatant in als een pre-Immunoprecipitation-controle om de doel verrijking te vergelijken na incubatie met de affiniteits matrix. Plaats pre-Immunoprecipitation-controles op een buis Rotator bij 4 °C 's nachts, op dezelfde manier als de immunoprecipitated monsters worden verwerkt.
  2. Voeg aan elk monster 200 μL affiniteits matrix toe. Neem extra zorg om de parels te hervatten door voorzichtig te pipetteren voordat u de affiniteits matrix aan elk monster toevoegt. Inbroed de lysaten met affiniteits matrix bij 4 °C 's nachts met zachte menging op een buis Rotator.
    Opmerking: Het protocol kan tot een dag na deze stap worden onderbroken.

6. RNA-isolatie

  1. Buffer voorbereiding en installatie van apparatuur
    1. Plaats het magnetische rek bij 4 °C gedurende ten minste 30 minuten om vooraf te koelen en houd het rek tijdens het experiment op ijs.
    2. Bereken het aantal benodigde microcentrifuge buizen en pre-chill op ijs of bij 4 °C.
      Opmerking: Gewoonlijk vereist elk monster 1 micro centrifugebuis voor het uiteindelijke gezuiverde RNA.
    3. Draai de buizen snel uit stap 5,2 en vang de parels op door het op de magnetische rek te plaatsen gedurende ten minste 1 min. Verzamel of gooi het supernatant in extra micro centrifugebuizen.
      Opmerking: Het verzamelde supernatant dat niet-afhankelijke fractie bevat, kan in Flash worden bevroren en bij-80 °C worden opgeslagen om te vergelijken met de gebonden fractie voor transcriptie verrijking na zuivering. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.
    4. Bereid een hoogzout buffer voor door 0,5 μL/ml van 1 M DTT en 1 μl/ml 0,1 g/ml haring toe te voegen aan de buffervoorraad met een hoog zoutgehalte.
      Opmerking: Voor elk monster is 5 mL hoogzout buffer vereist.
  2. RNA-isolatie
    1. Voeg 1 mL verse hoogzout buffer toe aan elke buis gevolgd door zachte pipetteren gedurende ten minste 5 keer zonder de invoering van bubbels.
      Opmerking: Onvoldoende wassen kan achtergronden van ongebonden transcripten introduceren terwijl de introductie van bubbels de afbraak van RNA kan versnellen.
    2. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 minuut en verwijder het supernatant. Herhaal de wasstappen met een hoog-zout buffer voor nog eens 4 keer (in totaal 5 keer).
    3. Verwijder de resterende hoogzout buffer en verwijder micro centrifugebuizen van de magnetische standaard en plaats bij RT gedurende 5 minuten om op te warmen.
    4. Rebreng de parels in 100 μL lysisbuffer (in de RNA Isolation Kit) met β-mercaptoethanol.
      Opmerking: Elke RNA-isolatie-en reinigingsset die het denaturerende guanidine-thiocyanaat bevat, kan worden gebruikt als een lysisbuffer om gebonden RNA vrij te maken van de affiniteits matrix. RNA-extractie moet worden verwerkt bij RT omdat guanidine thiocyanaat kan kristalliseren bij lage temperaturen.
    5. Vortex de kralen en buffer voor ten minste 5 s op de hoogste snelheid, draai snel naar beneden om de buffer op de zijkant van de micro centrifugebuis te verzamelen en inbroed de kralen met de buffer bij RT gedurende 10 minuten om het Bead-gebonden RNA in de lysisbuffer vrij te geven.
    6. Verzamel kralen op een magnetische standaard voor > 1 min en verzamel de supernatant om onmiddellijk door te gaan naar RNA Cleanup volgens het RNA-zuiverings protocol zoals gespecificeerd in de Kit (tabel met materialen).
      Opmerking: Het supernatant met het opgeelde RNA in lysisbuffer kan ook tot 1 maand voor het opruimen bij-80 °C worden bewaard door het opwarmen tot RT bij ontdooien.
    7. Om een maximale kwaliteit van het geïsoleerde RNA te bereiken, voert u alle optionele stappen uit, waaronder DNase spijsvertering en alle RNA elutie Steps. Verwarm de elutie buffer van de RNA Isolation Kit of RNase-vrij water tot 60 °C voor maximaal RNA herstel.
      Opmerking: Het geïsoleerde RNA kan gedurende meerdere jaren bij-20 °C worden bewaard voor maximaal 1 maand of-80 °C. Het protocol kan na deze stap worden onderbroken.

7. optionele RNA-kwaliteitsanalyse (aanbevolen)

  1. Evalueer de RNA-kwaliteit met een bioanalyzer11 en een hoeveelheid met een spectrofotometer12 om te bepalen of het immunoprecipitatie proces herhaald moet worden om voldoende en kwalitatief hoogwaardig RNA te verkrijgen.
    Opmerking: De optimale RNA-kwaliteit voor sequentiëren met hoge doorvoer moet de protocollen volgen die zijn gespecificeerd door bibliotheek voorbereidings kits en volgorde platforms.

8. downstreamtoepassingen

Opmerking: Totaal RNA geïsoleerd door het TRAP-protocol kan worden gebruikt in een aantal standaard downstream-toepassingen, met inbegrip van RNA-SEQ (TRAP-SEQ). Standaard reverse transcriptie en kwantitatieve PCR-protocollen kunnen ook worden gebruikt na val.

  1. Voor de TRAP-SEQ voert u de RNA-SEQ-bibliotheek voorbereiding uit volgens de standaardmethoden13.
  2. Voor RNA-seq, voorbereiding cDNA sequencing bibliotheken met behulp van commerciële RNA-SEQ kits met oligo d (T)-gebaseerde verrijking van poly adenylated poly (A) transcripten. Als alternatief, als de totale RNA-kwaliteit lager is dan aanbevolen voor poly (A) verrijking, gebruik rRNA depletie modules. Verwacht echter meer rRNA-uitlijning na sequentiëren te zien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor het profiel van genexpressie bij het hervullen van hepatocyten van de Fah-/- Mouse, worden GFP: Rpl10a Fusion en Fah transgenes samen geleverd binnen een transposon-bevattende plasmide8 (trap vector) tot levers door hydrodynamische injectie (Figuur 1A). De verwijdering van nitisinon induceert een toxische leverbeschadiging die een selectiedruk creëert voor hepatocyten die een stabiel beeld geven van FAH om de geblesseerde parenchym9opnieuw te bevolken. Immunofluorescentie kleuring bevestigt de co-expressie van FAH en de GFP: RPL10A fusie-eiwit bij het hervullen van hepatocyten na twee weken lever repopulatie (Figuur 1B).

In de volgende representatieve experiment, TRAP-SEQ werd uitgevoerd met behulp van stilaan en herbevolkende muis hepatocyten. Ten eerste, voor het verkrijgen van GFP-Tagged ribosomen van stilte hepatocyten, transgene RosaLSL-GFP-L10A muizen werden geïnjecteerd met AAV8-TBG-CRE 7 dagen voorafgaand aan het offeren voor het opwekken van GFP: RPL10A expressie in alle hepatocyten14. We verwerkte ook een lever monster verzameld van een wild type muis als een negatieve controle om ervoor te zorgen isolatie van het vertalen van mRNA was specifiek, wat betekent dat RNA alleen kan worden geëxtraheerd uit muizen uitdrukken GFP: RPL10A. De concentratie van geïsoleerd RNA gecorreleerd met het aantal cellen uitdrukken van de fusie-eiwit, met de stilstaand monster produceren van de hoogste opbrengst sinds alle hepatocyten Express GFP: RPL10A na AAV8-TBG-CRE injectie (Figuur 2A). Omgekeerd was nauwelijks enig RNA detecteerbaar in wild type controles die niet de GFP: RPL10A transgene hadden, wat aangeeft dat de TRAP-procedure zeer specifiek is en een lage achtergrond heeft. Wanneer TRAP werd gebruikt op leverweefsel ondergaan herbevolking met GFP: RPL10A-transduced hepatocyten, overvloedig, hoge kwaliteit RNA werd verkregen (Figuur 2B). Er werd daarentegen geen RNA-Trace gedetecteerd via bioanalyzer voor het negatieve controlemonster.

Downstream genexpressie analyse kan worden uitgevoerd via omgekeerde transcriptie en kwantitatieve PCR of RNA-SEQ op TRAP-geïsoleerd RNA. Gsta1 codeert glutathion S-transferase die een belangrijke rol speelt voor het metabolisme van glutathion, de belangrijkste ontgiftende peptide ter bescherming van de lever tegen oxidatieve stress schade15. Gsta1 expressie wordt geïnduceerd door meer dan 10-voudige in het hervullen van hepatocyten in vergelijking met stilstaand hepatocyten, terwijl geen drempel cyclus (CT) waarde werd gedetecteerd met trap-geïsoleerd RNA van de wild type muis als gevolg van het gebrek aan input RNA (Figuur 3 A). Merk op dat de RNA-kwaliteit een grote invloed kan hebben op de genexpressie analyse. In het geval van RNA-SEQ-experimenten moet de beoordeling van de RNA-kwaliteit worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de Library Preparation Kit en het sequencing platform (Figuur 3B). Een bioanalysator wordt vaak gebruikt om het RNA-integriteits nummer (RIN) te bepalen, waarbij een hoog RIN corgerelateerd is aan een hoger percentage mRNA-overeenstemmingen met het genoom (Figuur 3B, links), terwijl een lager Rin leidt tot een hoger percentage ribosomale Lees- mRNA-afbraak (Figuur 3B, rechts). Figuur 3 C, D toont aan dat de traps-SEQ differentiële genexpressie kan identificeren bij het stileren en herbevolgen van hepatocyten. Bijvoorbeeld, Alb expressie wordt geremd en AFP expressie is upregulated tijdens de lever repopulatie, weerspiegelen dat de replicerende hepatocyten veronderstellen een minder gedifferentieerde toestand voor de remming van de metabole functies van de lever tijdens herbevolking9,16.

Figure 1
Figuur 1: uitvoering van de val met Fah-/- profile genexpressie verandering van herbevolkende hepatocyten. (A) Schematische voorstelling van het GFP: RPL10A fusie-eiwit met Fah in het Sleeping Beauty transposon-systeem, gevolgd door een injectie in de Fah-/- Mouse. Groene zeshoeken wijzen op het herbevolken van hepatocyten met een stabiele uitdrukking van FAH en GFP: RPL10A, terwijl zwarte zeshoeken gewond zijn, stervende hepatocyten. B) representatieve immunofluorescentie kleuring toont de coexpressie aan van GFP-gelabeld ribosomaal proteïne L10A (groen) en Fah (rood) in de herbevolkende hepatocyten. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: trap maakt het mogelijk celtypespecifieke isolatie van hoge kwaliteit RNA. A) de opbrengst van RNA is positief gecorreleerd met het aantal hepatocyten dat GFP uitdrukt: RPL10A. De lage opbrengst van RNA van een wild type muis toont de specificiteit van de val uit bronnen zonder de uitdrukking van GFP: RPL10A. B) bioanalysator sporen van totaal RNA geïsoleerd van het hervullen van levers die GFP UITDRUKKEN: RPL10A en van wild type levers tonen de specificiteit van de val aan. Totaal RNA geïsoleerd van wild type leverweefsel verstoken van de GFP: RPL10A transgen toont aan dat minimale RNA is verzameld, terwijl transgen-uitdrukken weefsel biedt voldoende hoge kwaliteit RNA. Merk op dat ribosomale RNA pieken aanwezig zijn na succesvolle TRAP10. FU, fluorescentie-eenheid. , RNA-integriteits getal. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: trap-GEÏSOLEERD RNA kan worden gebruikt voor downstream genexpressie analyse. A) representatieve omgekeerde transcriptie en kwantitatieve PCR-resultaten van Gsta1 bij het stileren en hervullen van hepatocyten. Er werd geen CT-waarde gedetecteerd met RNA geïsoleerd van wild type dieren. (B) uitlijnings analyse van geïsoleerd RNA na sequentiëren van hoge doorvoer, waaruit blijkt dat het belangrijk is om RNA-integriteit te bepalen na isolatie. Hoge kwaliteit RNA resulteert in een hoger percentage mRNA leesbewerkingen (groen), terwijl lage kwaliteit RNA leidt tot een veel hoger percentage van ribosoom leest (rood), zoals de meeste mRNA is afgebroken. , RNA-integriteits getal. (C,D) Integrative Genomics Viewer (IGV) tracks van RNA-SEQ leesbewerkingen van mRNA-affiniteit-gezuiverd van stilstaat en herbevolkende hepatocyten op de (C) Alb en (D) AFP loci. Merk op dat de 3 ' read bias is typerend voor een poly (A) selectie pijpleiding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TRAP-SEQ is een techniek voor celtypespecifieke isolatie van het vertalen van mRNA via epitope-Tagged ribosomen en presenteert een alternatief voor FACS benaderingen, als het omzeilt beperkingen zoals tijd vereisten van FACS9. In plaats daarvan, TRAP maakt snelle en efficiënte isolatie van RNA rechtstreeks uit bulk weefsels, helpen om te voorkomen dat eventuele veranderingen in genexpressie. De trap-SEQ is bijzonder geschikt voor gebruik in de herbevolkende Fah-/- Mouse lever, aangezien de hepatocyten expansie na verwijdering van nitisinon cel autonoom is en genexpressie profilering mogelijk maakt van de subset van hepatocyten met geïntegreerde transgenes. De TRAP vector kan ook worden samengedruct met gen-activerende of-silencing moleculen17, waaronder cDNA, Short-haarspeld RNA, en gids RNA, om de effecten op globale genexpressie van activering of remming van een specifiek gen te bestuderen. Als alternatief biedt de RosaLSL-GFP-L10A transgene muis de mogelijkheid om genexpressie in elke cel te profiel met CRE of activiteit. Sinds GFP: RPL10A kan specifiek worden uitgedrukt in cellen die CRE uitdrukken, de rol van andere celtypen in de lever tijdens leverschade en herbevolking kan worden bestudeerd. Bijvoorbeeld, kruising CK19-CRE muis met de TRAP transgene muis kan worden gebruikt om GFP uitdrukken: RPL10A in cholangiocyten gevolgd door TRAP-SEQ om de verandering van genexpressie in het galepitheel te bestuderen tijdens het repopulatie proces.

Om een nauwkeurige profilering van genexpressie te garanderen, is het van cruciaal belang om alle buffers en de affiniteits matrix voor te bereiden vóór weefsel dissectie. Alle stappen moeten worden uitgevoerd op ijs met koude buffers tenzij anders gespecificeerd om polysome stabilisatie10 te garanderen en RNA-degradatie te voorkomen. Alle buffers moeten worden bereid met RNase-vrije reagentia en het TRAP-SEQ-protocol moet worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving om RNA-afbraak en lage opbrengst van immunoprecipitated RNA te voorkomen. De affiniteits matrix kan worden bereid tot 2 weken voorafgaand aan gebruik met zachte resuspensie op een buis Rotator 's nachts. Er moet speciale aandacht worden besteed aan het niet krachtig schudden van de matrix om verstoring van de met antilichamen geconjugeerde, proteïne L-gecoate magnetische parels te voorkomen. De methoden voor het voorbereiden van de affiniteits matrix omvatten conjugatie van magnetische kralen aan biotinyleerd proteïne L, gevolgd door incubatie met anti-GFP-antilichamen. Echter, commercieel verkrijgbare eiwitten A/G magnetische kralen kunnen worden vervangen; indien gebruikt, sla de initiële conjugatie stap over en ga direct naar antilichaam binding. Bovendien zijn alternatieve epitoop Tags vermoedelijk haalbaar met het bovenstaande protocol met passende modificatie.

Er zijn verschillende punten waarop de RNA-isolatie-en zuiveringsstap kan worden onderbroken (zie protocol hierboven). Echter, zodra de lever monsters zijn geoogst, voortzetting van de immunoprecipitatie wordt aanbevolen, als de opbrengst van geïsoleerde RNA kan dalen door ~ 50% met bevriezing in deze stap10. Weefsels moeten snel worden gespoeld met dissectie buffer die haring voor remming van mRNA vertaling bevat. Onvoldoende weefsel lysis kan ook bijdragen tot een lage RNA-opbrengst. Het is van cruciaal belang om weefsels op ijs te homogeniseren totdat er geen weefsel brokken zichtbaar zijn met de motor homogenisator, terwijl minimale beluchting10wordt verzekerd. Bovendien is voldoende wassen met een hoog-zout buffer cruciaal om te zorgen voor het verwijderen van niet-specifieke binding van ribosomale eiwitten aan de affiniteits matrix. Met inbegrip van een wild type negatieve controle helpt bij het beoordelen van de specificiteit van de immunoprecipitatie en de efficiëntie van de wasstappen. Bovendien zal het gebruik van een commerciële RNA-zuiverings pakket dat RNase-vrije DNase-behandeling bevat de RNA-zuiverheid verhogen.

Bovendien wordt aanbevolen om de expressie en de overvloed van de GFP: RPL10A Fusion-eiwit te controleren en de hoeveelheid weefsel te beoordelen die nodig is om voldoende RNA te verkrijgen voor downstream-analyse. Weefsel secties of lysaten kunnen worden gebruikt voor detectiemethoden op basis van immuno om de uitdrukking van GFP te valideren: RPL10A. De hoeveelheid RNA geïsoleerd kan variëren door: (1) het aantal cellen dat GFP uitdrukt: RPL10A, (2) het uitdrukkings niveau van het transgen, en (3) de grootte en de ploïdie van de cellen die het transgen uitdrukken. Een pilot experiment met behulp van de helft en het dubbele van de hoeveelheid van de aanbevolen hoeveelheid weefsel kan nuttig zijn bij het bepalen van de optimale invoer lysaat voor TRAP-SEQ. In onze handen, we konden verkrijgen ~ 150 ng van RNA met zo weinig als 1-2% hepatocyten uitdrukken GFP: RPL10A van 200 mg van de herbevolkende Fah-/- lever, vertegenwoordigt ~ 2 x 105 polyploïde hepatocyten met transgen expressie9.

De TRAP-SEQ-methodologie isoleert ribosome-gebonden mRNA voor het profiel van een cel vertalen mRNA pool. De resulterende sequentiëren leest dus overeen met de "translatome" in plaats van de transcriptome. Merk op dat het vertalen van ribosoom voetafdrukken niet zal worden verzameld, als trap wordt uitgevoerd op inheemse in plaats van gecrosslinkt complexen. Als de analyse van Footprinting gewenst is, moet het bovenstaande protocol worden aangepast met relevante cross-linking gevolgd door immunoprecipitatie (clip) methodieken18. Een andere beperking van de val is de eis van een voldoende aantal cellen uitdrukken van de GFP: RPL10A fusie-eiwit. Voor experimenten waarbij het celtype van belang klein is, kan het combineren van meerdere biologische monsters nodig zijn om voldoende RNA te isoleren om RNA-SEQ19mogelijk te maken. Bovendien vereist TRAP-SEQ de aanwezigheid van GFP: RPL10A in het celtype van belang. Dit kan een uitdaging vormen als er geen specifiek bezorgingssysteem is voor de cellen of als een specifieke Promoter van het type Cell om CRE-expressie te stimuleren niet beschikbaar is.

De recente ontwikkeling van single-cell RNA-SEQ (scRNA-SEQ) technologie heeft directe sequencing gevolgd door in silico identificatie van verschillende celtypen, waardoor sequentiëren zonder sortering voor specifieke celtypen van interesses20 ,21,22. Echter, scRNA-SEQ vereist nog steeds dissociatie van cellen uit het orgel. In het geval van de Fah-/- herbevolking model, lever perfusie en hepatocyte isolatie is uiterst moeilijk en inefficiënt vanwege de kwetsbaarheid van zowel de geblesseerd en replicerende hepatocyten. In feite zijn we nog niet in staat geweest om voldoende hepatocyten te isoleren van Fah-/- muizen die herbevolking ondergingen na hydrodynamische injectie van Fah plasmids. Bovendien, in de tijd die het duurt om weefsels te verwerken, genexpressie niveaus kunnen veranderen. Protocollen voor lever perfusie nemen tot 30 minuten van warme ischemie tijd. Toekomstige methodologieën voor het optimaliseren van lever perfusie om de verwerkingstijd te verkorten en de isolatie-efficiëntie te verhogen, kunnen scrna-SEQ-integratie met het Fah-/- Mouse-modelsysteem mogelijk maken en eventueel andere verwondingen en herbevolking modellen. Dit zou ook de studie van alle lever celtypen mogelijk te maken.

Kortom, de integratie van trap-SEQ met de Fah-/- Mouse maakt specifieke isolatie en genexpressie profilering van het repliceren van hepatocyten mogelijk om therapeutische doelen te identificeren die de lever herbevolking kunnen bevorderen. Deze methode kan worden geïmplementeerd om andere celtypen in de lever en andere orgaansystemen te bestuderen voor ziektespecifieke identificatie van genexpressie wijzigingen om mogelijke geneesmiddel doelen of biomarkers te identificeren. Een analoge techniek kan worden gebruikt voor het verzamelen van kernen van het hervullen van hepatocyten met behulp van affiniteits zuivering, en vervolgens voor het uitvoeren van een epigenetische analyse van deze specifieke cellen16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de volgende subsidies: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) en P30-DK050306 (Pilot Grant aan KJW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated DWK Life Sciences (Wheaton) 358007
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent 400800
Anti-GFP antibodies Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free Jackson ImmunoResearch 001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Cycloheximide Millipore Sigma C7698
Deoxycholic acid, DOC Millipore Sigma D2510
D-Glucose, Dextrose Fisher Scientific D16
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Thermo Fisher Scientific 65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2  Millipore Sigma M8266
Methanol Fisher Scientific A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module New England BioLabs E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 Millipore Sigma I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated Ambion AM9932
Overhead Stirrer DWK Life Sciences (Wheaton) 903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4 Ambion AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated Thermo Fisher Scientific 29997
Potassium chloride, KCl Millipore Sigma P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents Agilent 5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution Invitrogen AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2515
Sodium azide, NaN3 Millipore Sigma S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3 Millipore Sigma S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor Invitrogen AM2694

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).

Tags

Biologie afgifte 151 lever regeneratie celtypespecifiek val TRAP-seq RNA-seq immunoprecipitatie expressie profilering hepatocyte hydrodynamische staart-ader injectie
Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, A. W., Zahm, A. M.,… More

Wang, A. W., Zahm, A. M., Wangensteen, K. J. Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver. J. Vis. Exp. (151), e60242, doi:10.3791/60242 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter