マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

Summary

リボソームアフィニティ精製(TRAP)の翻訳により、細胞型特異的翻訳mRNAの迅速かつ効率的な単離が可能になります。ここでは、肝再集団とTRAPのマウスモデルにおける流体力学的尾静脈注射を組み合わせた方法を示し、再入発性肝細胞の発現プロファイルを調べる。

Abstract

損傷後の肝臓の再集団は、環境毒素の暴露後の即時臓器不全および死亡を防ぐ哺乳類の重要な特徴である。再集団化中に起こる遺伝子発現の変化をより深く理解することは、傷害の設定における肝機能の回復を促進する治療標的の同定に役立つ可能性がある。それにもかかわらず、再入発性肝細胞を特異的に単離する方法は、細胞マーカーの欠如、限られた細胞数、およびこれらの細胞の脆弱性によって阻害される。肝臓損傷の設定で再集団を再キャパチングするFah-/-マウスモデルと連動したリボソームアフィニティ精製(TRAP)技術の開発により、再入生の遺伝子発現プロファイリングが可能肝 細胞。TRAPを使用すると、細胞型特異的翻訳mRNAは迅速かつ効率的に単離されます。緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きリボソームタンパク質(RP)、GFP:RPL10Aを選択的に発現する肝細胞からのmRNAの翻訳を親和性ベースで単離したTRAPを利用する方法を開発した。TRAPは、遺伝子発現プロファイルを変化させる可能性のある蛍光活性化細胞選別に必要な長い期間を回避します。さらに、再入発性肝細胞のみがGFP:RPL10A融合タンパク質を発現するので、単離されたmRNAは、肝臓の周囲の負傷した肝細胞および他の細胞型からの汚染を欠いている。親和性精製mRNAは高品質であり、遺伝子発現の下流PCRまたはハイスループットシーケンシングベースの解析を可能にします。

Introduction

脊椎動物の主要な代謝器官として、肝臓はグルコース恒常性、血清タンパク質合成、胆汁酸分泌、および異生物代謝および解毒を担当しています。肝臓は、即時肝不全を防ぐために毒素にさらされた場合に負傷したパレンキマを再生する特別な能力を有^する1.しかし、再生の失敗は、アセトアミノフェンまたはアルコール過剰摂取の設定で起こり、急性肝不全2を引き起こす可能性^がある。さらに、ウイルス性肝炎感染、脂肪肝疾患、および脂肪肝炎によって引き起こされる慢性肝損傷は、肝線維症、肝硬変、および肝細胞^癌3を引き起こす可能性がある。終末期肝疾患に対する唯一の利用可能な治癒治療は移植であるが、臓器不足によって制限され、すべての患者に対する効率的な治療を妨^げる4.したがって、有毒な肝臓損傷後の回復過程のより良い理解は、病気の臓器の機能を救出するのに十分な再生を刺激する治療法の開発のために重要である。

肝臓再生の研究のための最も広く適用されたモデルシステムは、げっ歯類の部分肝切除術であり、肝臓の大部分が急速な肝細胞拡張を刺激するために切除^{される5。}しかし、部分的肝切除術は、^ヒト6における急性肝傷害の設定においてしばしば観察される免疫細胞浸潤および肝細胞壊死の欠如による有毒な肝損傷に続く肝細胞拡張を再発しない。臓器再生のこの形態をモデル化するより適切なシステムは、適切なチロシン代謝に必要な機能性フマリアルセトー酢酸ヒドロラーゼ(FAH)を欠き、死亡につながる重度の肝臓損傷を発症するFah-/-^{マウスである7。}これらのマウスは、飲料水中の薬物ニティシネによる治療によって無期限に健康な状態に維持することができる。あるいは、FAH発現は、肝細胞のサブセットへのトランスジーン送達によって復元することができ、これはニティシノン^除去8の際に肝臓を再設定するために拡大する。

再入発肝細胞の遺伝子発現変化をプロファイリングするためには、隣接する負傷した肝細胞および他の細胞型から汚染されることなく、Fah-/-マウス中の複製肝細胞を特異的に分離するツールが必要である。残念ながら、(1)肝細胞の再入発性の脆弱性は肝灌流後の回復不良につながり、(2)肝細胞の複製は大きさが大きく変動し、単離を行うため、肝細胞の蛍光補助細胞選別(FACS)は困難である。FACSによる純粋な集団の困難な、および(3)肝臓灌流からRNA単離までの手順時間が2時間を超えるため、遺伝子発現プロファイルは、サンプルが獲得される前に実質的な人工的な変化を受ける可能性^{がある9。}

あるいは、肝細胞の再入発におけるエピトープタグ付きリボソームの発現は、臓器収穫直後の親和性精製を用いてリボソームに結合したmRNAをバルク肝臓で積極的に翻訳する迅速な単離を可能にする。組織は、ライサットします。ここでは、翻訳リボソームアフィニティ^{精製(TRAP)10}に続いてハイスループットRNAシーケンシング(TRAP-seq)を行い、Fah-/--における肝細胞の再入発においてmRNAを特異的に分離およびプロファイルするプロトコルについて説明する。マウス⁹.FAHと緑色蛍光タンパク質タグ付きリボソームタンパク質(GFP:RPL10A)の共発現により、GFP:RPL10Aを含むポリソームに結合したmRNAの翻訳の親和性精製が可能になります。この方法は、肝細胞の再入発性に脆弱な再入発性を分離するために肝灌流などの細胞解離ステップを回避する。代わりに、臓器組織および抗体全体のリシスを利用して、標的細胞から特異的にRNAを迅速に抽出します。最後に、TRAP-seqを介した豊富で高品質なmRNAの単離により、シーケンシング解析などの下流アプリケーションを使用して、再集団化プロセス中の遺伝子発現の動的変化をプロファイリングすることができます。

Protocol

マウスの使用を含むすべての方法は、ペンシルバニア大学のペン動物福祉局のIACUCによって提供されるガイドラインと一致しています。

1. 試薬の調製

1. シクロヘキシミド
   1. 0.1 g/mLシクロヘキシミドの500 μLを作るために、メタノールの500 μLでシクロヘキシミドの50mgを中断する。
      注意:シクロヘキシミドは、環境に非常に有毒であり、先天性奇形を引き起こす可能性があります。シクロヘキシミドを含むすべての廃棄物およびバッファーは、適切な処分のために収集する必要があります。
      注:シクロヘキシミドは、最大1日間4°Cで保存することができます。シクロヘキシミドは翻訳を阻害する。
2. ディチオスレイトール (DTT)
   1. 1 MTTの1 mLを作るために、RNaseフリー水でDTT粉末の0.15グラムを中断します。
      注意:DTTは、皮膚、眼、気道に刺激を引き起こす可能性があります。
      注:DTTは洗剤です。DTTは-20°Cで保存することができる。50 μL のシングルユース アリコートに 1 M DTT を格納することをお勧めします。
3. デオキシコレート (DOC)
   1. 10%のDOCを作るために、50 mL円錐形チューブにDOCの1グラムを中断し、10 mLまでRNaseフリー水を追加します。粉末が溶けになるまで激しく振ります。
      注:10%のDOC溶液はわずかに黄色で、室温(RT)で最大1年間保存することができます。DOCは核リシスに使用されます。
4. GFP抗体
   1. 初めて使用する場合のアリコGFP抗体。スナップはアリコートを凍結し、-80 °Cで保存します。
      注:50 μg の GFP 抗体を単一使用のアリコートに保存することをお勧めします。
5. B ビオチン化タンパク質 L
   1. 1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)でビオチン化タンパク質Lを再中断し、最終濃度1 μg/μLを作ります。
      注:再懸濁液は-20 °Cで最大6ヶ月間保存することができる。

2. バッファの準備

1. ウシ血清アルブミン(BSA)バッファー
   1. 3%BSAバッファーの50 mLを作るために、1.5gのIgG-およびプロテアーゼフリーBSA粉末をPBSの40 mLに加え、その後ボルテックスを加えます。BSAが溶解した後、50 mLの最終体積にPBSを追加します。
      注:BSAバッファーは、最大6ヶ月間4°Cで保存できます。
2. 解剖バッファー
   1. 解剖バッファーストックの50 mLを作るために、10xハンクのバランス塩溶液(HBSS)の5 mL、1M 4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジンタンエネルホン酸(HEPES)の125 μL、1Mグルコースの1,750 μL、および1M NaCo₃の200 μLを組み合わせます。50 mLの最終容積にRNaseフリー水を追加します。
      注:解剖バッファーストックは、最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。
   2. 使用直前に、0.1 g/mLのシクロヘキシミドの100 μg/mLを加え、氷の上に保管してください。
3. 高塩バッファー
   1. 高塩バッファーストックの50 mLを作るために、1 M HEPESの1 mL、2 M KClの8.75 mL、1M MgCl₂の500 μL、および100%非イルフェニルポリエチレングリコール(材料表)の500 μLをRNaseフリー水に加えます。
      注:高塩バッファーストックは、最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。
   2. 使用直前に、1 M DTT の 0.5 μL/mL および 0.1 g/mL シクロヘキシミドの 1 μL/mL を追加します。新鮮な高塩分バッファーを氷の上に置いてください。
4. 低塩バッファー
   1. 低塩バッファーストックの50 mLを作るために、1 M HEPESの1 mL、2 M KClの3.75 mL、1M MgCl₂の500 μL、および100%非イルフェニルポリエチレングリコールの500 μLをRNaseフリー水の44.25 Mlに加えます。
      注:低塩バッファーストックは、最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。
   2. 使用前に1M DTTの0.5 μL/mLおよび0.1 g/mLの1 μL/mLを加える。新鮮な低塩分バッファーを氷の上に置いてください。
5. 組織リシスバッファー
   1. 50 mLの組織リシスバッファーストックを作るために、1 M HEPESの1 mL、2 M KClの3.75 mL、および1M MgCl₂の500 μLを組み合わせます。50 mLの決勝にRNaseフリー水を追加します。
      注:解剖バッファーストックは、最大6ヶ月間4°Cで保存することができます。
   2. EDTAフリープロテアーゼ阻害剤の1錠/10mL、0.1g/mLシクロヘキシミドの1μL/mL、RNase阻害剤の10μL/mLを使用直前に追加します。新鮮な組織のリシスバッファーを氷の上に保管してください。

3. 磁気ビーズに対する抗体の結合

1. 抗体
   1. すべてのサンプルに必要なGFP抗体の量を計算し、1つの余分なサンプルを準備します。
      注:各サンプルについて、各GFP抗体の50 μgが必要です。
   2. 氷上のGFP抗体を解凍し、最高速度(>13,000 x g)で4°Cで10分間回転させ、上清を新しいマイクロ遠心管に移します。
      注:抗体調製工程はビーズ調製前に行うことができ、解凍抗体は氷上に保つことができる。あるいは、この部分は、磁気ビーズおよびビオチン化タンパク質Lのインキュベーション中に行うことができる。
2. 磁気ビーズの再サスペンド
   1. 穏やかなピペッティングによって磁気ビーズ(材料の表)を再中断する。
   2. 各サンプルに150 μLの磁気ビーズを使用します。すべてのサンプルに必要な磁気ビーズの体積を計算し、1つの余分な準備をします。再懸濁した磁気ビーズを1.5 mLまたは2mLマイクロ遠心分離管に移します。実験に1mLを超える必要がある場合は、合計量を同じ量に分割します。
   3. 磁気スタンドにビーズを集めて1分間取り出し、上清を取り除きます。磁気スタンドからマイクロ遠心管を取り出し、PBSの1 mLを追加し、ビーズを洗うために上下にピペッティングします。磁気スタンドにビーズを集めて1分間取り出し、PBSを取り外します。
3. タンパク質Lコーティングビーズの調製
   1. 各サンプルに対して、60 μL のビオチン化タンパク質 L を使用します。タンパク質Lを以前に再懸濁し、-20°Cで保存した場合は、氷上でタンパク質Lを解凍する。タンパク質Lを使用する前に再懸濁した場合は、すべてのサンプルに必要な量を取り、1つの余分な準備をします。
   2. 再懸濁および洗浄された磁気ビーズにビオチン化タンパク質Lの計算量を追加します。1x PBSを追加して、1.5 mLマイクロ遠心管を使用する場合は最終容積1mL、2mLマイクロ遠心管を使用する場合は1.5mLを追加します。チューブローター上のRTで35分間、バイオミニル化タンパク質Lを用いた磁気ビーズをインキュベートする。
      注:ビーズがビオチン化タンパク質Lでインキュベートしている間、抗体はこの工程で調製することができる。
   3. 磁気スタンドにタンパク質Lコーティングビーズを1分間集め、上清を取り除きます。磁気スタンドからマイクロ遠心管を取り出し、3%BSAバッファーの1 mLを加え、その後、タンパク質Lコーティングビーズを洗浄するために少なくとも5回穏やかなピペッティングを加えます。
   4. >1分間の磁気スタンドにコーティングされたビーズを集め、上清を取り除きます。3%BSAで洗浄工程を4回繰り返します(合計5回)。
4. 抗体結合
   1. 計算された量のGFP抗体をタンパク質Lコーティングビーズに加え、チューブローターで4°Cで1時間インキュベートします。
      注:抗体インキュベーション後、親和性マトリックスを渦にしないように特別な注意を払う。
   2. インキュベーション中に、すべてのサンプルに必要な総体積を計算して低塩バッファーを調製し、使用前に低塩バッファーストックに0.1 g/mLシクロオキシミドの0.5 μL/mLと1 μL/mLを追加します。
      注:GFP共役ビーズの各チューブを洗浄するための低塩バッファーの3 mLと、GFP共役ビーズの再懸濁のための200 μL/サンプルが必要です。新鮮な低塩分バッファーは、数時間氷の上に保つことができます。
   3. >1分間の磁気スタンドにアフィニティマトリックスを集め、上清を取り除く。低塩バッファーの1 mLを追加し、親和性マトリックスを洗浄するために上下に穏やかにピペット。>1分間の磁気スタンドにアフィニティマトリックスを集め、低塩バッファーを除去します。低塩分バッファーで洗浄手順をもう2回繰り返します(合計3回)。
   4. 各サンプルに200 μLのアフィニティマトリックスが含まれるように、低塩バッファーでビーズを再定束します。
      注:親和性マトリックスは、最大2週間4°Cで0.02%NaN3に保存することができます。アフィニティマトリックスは、低塩バッファーで3回素早く洗浄し、アフィニティマトリックスが1週間以上保存されている場合、少なくとも10分間、4°Cのチューブローターで穏やかに再懸濁する必要があります。プロトコルは、この手順の後に一時停止できます。
      注意:アジ化ナトリウムは、環境に非常に有毒です。酸との接触は有毒ガスを生成します。すべての廃棄物は、適切な処分のために収集する必要があります。

4. 肝組織リシス

1. バッファの準備と機器のセットアップ
   1. 必要なマイクロ遠心管の数を計算し、ラベルを付け、氷の上で冷やします。
      注:通常、各サンプルには7つの1.5mLマイクロ遠心管が必要です:残りの解剖肝臓に対して1つ、均質化された肝臓溶解物の4mLに4、上清を移用する場合は2です。
   2. すべてのサンプルに必要な総体積を計算して新鮮な解剖バッファーを準備し、0.1 g/mLシクロヘキシミドの1 μL/mLを追加します。実験中冷たく保つために氷の上に新鮮な解剖バッファーを置きます。
      注:各サンプルについて、10 mLの解剖バッファーが必要です。
   3. すべてのサンプルに必要な総体積を計算して新鮮なリシスバッファーを調製し、EDTAフリープロターゼ阻害剤の1錠/10mL、0.1g/mLシクロヘキシミドの1μL/mL、およびRNase阻害剤の10 μL/mLをそれぞれ追加します。実験を通して氷の上にリシスバッファーを保ちます。
      注:各サンプルについて、4 mLのリシスバッファーが必要です。
   4. 肝臓片の均質化中にポリテトラフルオロエチレン(PTFE)ガラス管を氷上に置くことができるように、組織粉砕機(材料の表)をセットアップします。PTFEガラス管に4mLの冷たいリシスバッファーを入れます。
2. 肝臓の均質化を再設定する
   1. TRAPベクターを注射した8−12週齢のFah-/-マウスを安楽死させ、承認された動物実験ガイドラインに従って麻酔および頸部脱臼を伴って1−4週間再移化した。
   2. 解剖ボードの上にマウスを置き、70%のエタノールで腹部をスプレーします。鉗子を使用して腹部の皮膚と腹膜を低くテントし、はさみを使用して横切開を行います。内臓を切らないように注意して、広いU字型の絞り飛ばしを作るためにはさみで切断し続けます。胸骨の上に胸膜フラップをひっくり返して肝臓を露出させる。
   3. 細かいはさみと鉗子を使用して肝臓を慎重に取り除き、すぐに組織を冷たい解剖バッファーに入れ、すすいでください。凍結組織を均質化するには、組織を解凍することなく、冷たいリシスバッファーを持つPTFEガラスチューブに所望の量の肝臓組織を素早く移動します。
      注:解剖された組織は、解剖バッファーで洗浄した後、フラッシュ冷凍し、-80°Cで保存することができます。プロトコルは、この手順の後に一時停止できます。
   4. ペトリ皿に肝臓を重量を量り、肝臓片の200−500 mgを分離し、PTFEガラスチューブに移動します。残りの肝臓組織を冷蔵したマイクロ遠心管に入れ、フラッシュフリーズします。
   5. 300 rpmから始まるモーター駆動ホモジナイザーでサンプルを均質化し、肝臓構造から肝細胞を少なくとも5回のストロークで解離します。毎回ガラス管を下げるが、タンパク質の発性を引き起こす可能性のある通気を防ぐために、溶液の上に害虫が上昇しないように注意してください。
   6. 少なくとも12回の完全なストロークのための肝臓組織を完全に均質化するために900 rpmに速度を上げます。
   7. 1.5 mLマイクロ遠心分離管あたり1mL以下のリサートで、標識された、事前に冷却されたチューブにライサートを移します。4 mLのリシスバッファーを使用する場合は、1チューブを保持し、残りの3チューブをフラッシュ凍結します。
      注:溶解物は、次の動物を解剖し、新鮮な溶解物を準備しながら、最大1時間氷の上に保つことができます。均質化された肝臓は、リシス工程後にフラッシュ凍結し、-80°Cで保存することができる。凍結リサエートを使用すると、単離されたRNAが50%減少する可能性があります。プロトコルは、この手順の後に一時停止できます。
3. 核リシス
   1. 肝臓は4°Cで2,000 x gで10分間遠心分離し、氷上の新しい、冷蔵マイクロ遠心管に上清を移します。
   2. 10%ノンニルフェニルポリエチレングリコールの上清容積の1/9を加え、最終濃度1%の非ニルフェニルポリエチレングリコールを作り、マイクロ遠心管を穏やかに反転して混合する。
   3. マイクロ遠心管を素早くスピンダウンし、10%DOCのサンプル体積の1/9を加えて最終濃度1%DOCを作り、マイクロ遠心管を穏やかに反転して混合します。マイクロ遠心管を素早くスピンダウンし、氷の上で5分間インキュベートします。
   4. 核リサートを4°Cで20,000 x gで10分間遠心分離し、氷上の新しい冷蔵マイクロ遠心管に上清を移します。
      注:ミトコンドリア枯渇した上清は、残りのサンプルが収集されている間、数時間氷の上に置くことができます。

5. 免疫沈殿

1. 各チューブについて、インキュベーション後の標的濃縮をアフィニティマトリックスと比較する前免疫沈殿制御として上清の総体積の1%を取り出す。免疫沈殿前制御を一晩4°Cのチューブローターに置き、免疫沈殿サンプルが処理されるのと同じ方法で処理します。
2. 各サンプルに 200 μL のアフィニティ マトリックスを追加します。各サンプルにアフィニティマトリックスを追加する前に、穏やかなピペッティングによってビーズを再懸濁するように特別な注意を払います。チューブローターで穏やかに混合して一晩4°Cでアフィニティマトリックスでライサテをインキュベートします。
   注:プロトコルは、この手順の後 1 日まで一時停止できます。

6. RNA分離

1. バッファの準備と機器のセットアップ
   1. 磁気ラックを4°Cに置き、少なくとも30分間冷やし、実験を通してラックを氷の上に置きます。
   2. 必要なマイクロ遠心管の数を計算し、氷上または4°Cで事前に冷やします。
      注:通常、各サンプルは、最終的な精製RNAに対して1マイクロ遠心管を必要とする。
   3. ステップ5.2からチューブを素早くスピンダウンし、磁気ラックに少なくとも1分間置いてビーズを収集し、追加のマイクロ遠心管に上清を回収または廃棄します。
      注:非連結分数を含む収集された上清は、フラッシュ冷凍し、-80°Cで保存し、精製後の転写濃縮のための結合分画と比較することができます。プロトコルは、この手順の後に一時停止できます。
   4. 高塩バッファーストックに 1 M DTT の 0.5 μL/mL および 0.1 g/mL シクロヘキシミドの 1 μL/mL を追加して、高塩バッファーストックを調製します。
      注:各サンプルについて、5mLの高塩バッファーが必要です。
2. RNA分離
   1. 各チューブに新鮮な高塩分バッファーの1 mLを追加し、気泡を導入することなく、少なくとも5回穏やかなピペッティングを続けます。
      注:不十分な洗浄は、結合されていない転写物の背景を導入する可能性があり、気泡の導入はRNAの劣化を加速する可能性があります。
   2. 磁気スタンドにビーズを集めて1分間取り出し、上清を取り除きます。高塩バッファーで洗浄工程を4回繰り返します(合計5回)。
   3. 残りの高塩バッファーを取り外し、磁気スタンドからマイクロ遠心管を取り出し、RTで5分間温めます。
   4. ビーズを100μLのリシスバッファー(RNA単離キットに付属)でβ-メルカプトエタノールで再中断します。
      注:デナタントグアニジンチオシアネートを含む任意のRNA単離および精製キットは、アフィニティマトリックスから結合RNAを放出するリシスバッファーとして使用することができる。グアニジンチオシアネートは低温で結晶化することができるので、RNA抽出はRTで処理されるべきです。
   5. ビードとバッファーを最高速度で少なくとも5秒の渦にし、マイクロ遠心管の側面のバッファーを素早くスピンダウンし、RTのバッファーでビーズをインキュベートして10分間、ビーズ結合RNAをリシスバッファーに放出する。
   6. >1分間の磁気スタンドにビーズを集め、キット(材料の表)に指定されているRNA精製プロトコルに従ってすぐにRNAクリーンアップに進むために上清を収集します。
      注:また、エリシスバッファーにELERNAを含有する上清は、解凍時にRTに温めてクリーンアップする前に最大1ヶ月間-80°Cで保存することもできる。
   7. 単離されたRNAの最大品質を達成するために、DNase消化およびすべてのRNA溶出ステップを含むすべての任意ステップを実行する。RNA絶縁キットまたはRNaseフリー水によって提供される溶出バッファーを60°Cに加熱し、最大RNA回収を行います。
      注:単離されたRNAは、最大1ヶ月間-20°Cまたは-80°Cで数年間保存することができます。プロトコルは、この手順の後に一時停止できます。

7. オプションのRNA品質分析(推奨)

1. バイオアナライ^ザ11を用いてRNAの品質を評価し、分光光度^計12を用いて量を評価し、十分で高品質なRNAを得るために免疫沈殿プロセスを繰り返す必要があるかどうかを判断する。
   注:ハイスループット シーケンスに最適な RNA 品質は、ライブラリ準備キットおよびシーケンス プラットフォームで指定されたプロトコルに従う必要があります。

8. ダウンストリームアプリケーション

注:TRAPプロトコルによって単離された総RNAは、RNA-seq(TRAP-seq)を含む多数の標準的なダウンストリームアプリケーションで使用できます。標準の逆転写および定量的PCRプロトコルは、TRAPの後に使用することもできる。

1. TRAP-seqの場合は、標準^方法13に従ってRNA-seqライブラリー調製を行う。
2. RNA-seqの場合は、ポリアデニル化ポリ(A)転写物のオリゴd(T)ベースの濃縮を用いた市販のRNA-seqキットを用いてcDNAシーケンシングライブラリーを調製する。あるいは、ポリ(A)濃縮に推奨される総RNA品質が推奨よりも低い場合は、rRNA枯渇モジュールを使用します。ただし、シーケンスの後により多くの rRNA アライメントが見られます。

Representative Results

^Fah-/-マウスの肝細胞を再移植する遺伝子発現をプロファイリングするために、Gfp:Rpl10a融合およびFahトランスジーンはトランスポゾン含有プラスミ^ド8(TRAPベクター)内で肝臓に共送される流体力学注入 (図 1A)ニチシノンの除去は、負傷したパレンキ^マ9を再設定するためにFAHを安定的に発現する肝細胞の選択圧力を作成する有毒な肝臓損傷を誘発する。免疫蛍光染色は、肝再集団の2週間後に肝細胞を再入発するFAHとGFP:RPL10A融合タンパク質の共発現を確認する(図1B)。

以下の代表的な実験では、TRAP-seqは、静止および再入発性マウス肝細胞を用いて行った。まず、静止肝細胞からGFPタグ付きリボソームを得るために、トランスジェニック^{ローザLSL-GFP-L10A}マウスを犠牲の7日前にAAV8-TBG-Creを注射し、全ヘパト^サイト14でRPL10A発現を誘導した。また、野生型マウスから採取した肝臓サンプルを陰性対照として処理し、mRNAの翻訳の単離が特異的であることを確認し、GFP:RPL10Aを発現するマウスからのみRNAを抽出することができた。単離されたRNAの濃度は融合タンパク質を発現する細胞の数と相関し、静止サンプルはAAV8-TBG-Cre注射後に全ての肝細胞がGFP:RPL10Aを発現して以来最高の収率を生み出す(図2A)。逆に、GFP:RPL10Aトランスジーンを持たない野生型コントロールでは、ほとんどRNAが検出されず、TRAP手順が非常に特異的で背景が低いことを示す。TrapをGFP:RPL10A変性肝細胞で再集団化した肝臓組織に用いた場合、豊富で高品質なRNAが得られた(図2B)。対照的に、陰性対照試料のバイオアナライザを介してRNA微量は検出されなかった。

下流遺伝子発現解析は、TRAP単離RNA上の逆転転写および定量PCRまたはRNA-seqを介して行うことができる。Gsta1はグルタチオンの代謝に重要な役割を果たすグルタチオンSトランスフェラーゼをコードし、酸化ストレス損傷から肝臓を保護する主な解毒ペプチ^ド15。Gsta1発現は、静止肝細胞と比較して肝細胞の再入発性において10倍以上誘導されるが、入力RNAの欠如により野生型マウスからTRAP単離RNAでは閾値サイクル(Ct)値は検出されなかった(図3)。A)RNAの品質は遺伝子発現解析に大きな影響を与える可能性があります。RNA-seq実験の場合、RNA品質の評価は、ライブラリー調製キットおよびシーケンシングプラットフォームの推奨に従って行われるべきである(図3B)。バイオアナリライザは、多くの場合、RNA完全性数(RIN)を決定するために使用され、高いRINはゲノムに対するmRNAアライメントの高い率と相関する(図3B、左)、一方、より低いRINはリボソーム読み取り率の高さにつながることを示すmRNA分解(図3B、右)。図 3C,DはTRAP-seqが静止および再入発性肝細胞における微分遺伝子発現を同定できることを示している。例えば、Alb発現は阻害され、AFP発現は肝臓再集団の間に調節され、複製肝細胞は肝代謝機能を阻害する分化状態が小さいことを反映している。再人口^9,16.

図1:Fah-/-を有するTRAPの実施^により、再入生肝細胞の遺伝子発現変化をプロファイルする。(A)睡眠美女トランスポゾンシステムにおけるFAHとのGFP:RPL10A融合タンパク質を発現する概略図を、Fah-/-^マウスに注入した。緑色の六角形は、FAHおよびGFP:RPL10Aの安定した発現を有する肝細胞を再入発することを示し、黒い六角形は負傷し、死亡した肝細胞を表す。(B)代表的な免疫蛍光染色は、再入発性肝細胞におけるGFPタグ付きリボソームタンパク質L10A(緑色)およびFAH(赤色)の共発現を示す。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:TRAPは、高品質RNAの細胞タイプ特異的な単離を可能にします。(A)RNAの収率は、GFP:RPL10Aを発現する肝細胞の数と正の相関を有する。野生型マウスからのRNAの低収率は、GFP:RPL10Aの発現なしにソースからのTRAPの特異性を示す。(B)GFP:RPL10Aを発現する肝臓の再入発から分離された全RNAのバイオアナライザ痕跡と野生型肝臓からはTRAPの特異性を示す。GFP:RPL10Aトランスジーンを欠損する野生型肝組織から単離された総RNAは、最小RNAが収集されたことを示し、一方、トランスジーン発現組織は十分な高品質のRNAを提供する。リボソームRNAピークは、成功したTRAP¹⁰の後に存在する。FU、蛍光ユニット。RIN、RNA整合性番号。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:TRAP単離RNAは、下流遺伝子発現解析に使用することができる。(A)静止および再入発性肝細胞におけるGsta1の代表的な逆転転写および定量的PCR結果。野生型動物から単離されたRNAではCt値は検出されなかった。(B)ハイスループットシーケンシング後の単離RNAのアライメント解析は、単離後にRNA完全性を決定することの重要性を実証する。高品質のRNAはmRNA読み取りの割合が高い(緑色)が、低品質のRNAはリボソーム読み取り(赤色)の割合がはるかに高くなります。RIN、RNA整合性番号。(C,D)統合ゲノミクスビューア(IGV)のRNA-seqのトラックは、静止および(C)アルブおよび(D)Afplociで肝細胞を再入込みから精製したmRNAアフィニティの読み取りである。3' 読み取りバイアスは、ポリ(A) 選択パイプラインの典型的な例です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

TRAP-seqは、エピトープタグ付きリボソームを介してmRNAを翻訳する細胞タイプ特異的な単離のための技術であり、FACS⁹の時間要件などの制限を回避するFACSアプローチに代わるものを提示する。その代わりに、TRAPはバルク組織から直接RNAを迅速かつ効率的に単離できるため、遺伝子発現の変化を回避できます。TRAP-seqは、ニチシノンの除去後の肝細胞拡張が細胞自律性であり、統合された肝細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングを可能にするため、再入発性のFah-/-^マウス肝臓での使用に特に適しています。トランスジーン。TRAPベクターはまた、cDNA、ショートヘアピンRNA、およびガイドRNAを含む遺伝子活性化またはサイレンシング^分子17と共発現し、特定の遺伝子の活性化または阻害のグローバル遺伝子発現に及ぼす影響を研究することができる。あるいは、Rosa^LSL-GFP-L10Aトランスジェニックマウスは、Cre組換え細胞活性を有する任意の細胞における遺伝子発現をプロファイルする能力を提供する。GFP:RPL10AはCreを発現する任意の細胞で特異的に発現することができるので、肝臓損傷および再集団化の間に肝臓における他の細胞型の役割を研究することができる。例えば、CK19-CreマウスをTRAPトランスジェニックマウスと交差させるには、再集団化過程における胆汁上皮における遺伝子発現の変化を研究するために、CHOLANG-seqに続いてCHO-seqでGFP:RPL10Aを発現するために使用することができる。

遺伝子発現の正確なプロファイリングを確実にするためには、組織解剖の前にすべてのバッファーとアフィニティマトリックスを調極することが重要です。ポリソーム安定^化10を確保し、RNAの劣化を防ぐために特に指定されていない限り、すべてのステップはコールドバッファを備えた氷上で実行する必要があります。すべてのバッファーはRNaseフリー試薬で調製する必要があり、TRAP-seqプロトコルは、RNAの分解と免疫沈殿RNAの低収率を防ぐために、RNaseフリー環境で行われるべきです。親和性マトリックスは、一晩チューブローターに穏やかな再サスペンションで使用する2週間前まで準備することができます。抗体共役のタンパク質Lコーティング磁気ビーズの破壊を防ぐために、マトリックスを激しく振らないように特別な注意が必要です。アフィニティマトリックスを調製する方法としては、バイオチン化タンパク質Lに対する磁気ビーズの結合、続いて抗GFP抗体によるインキュベーションが含まれる。しかし、市販のタンパク質A/G磁気ビーズを置換することができます。使用する場合は、最初の結合ステップをスキップし、抗体結合に直接進みます。さらに、代替エピトープタグは、適切な変更を伴う上記のプロトコルで実現可能であると考考える。

RNAの分離および精製工程を一時停止できる点はさま々あります(上記のプロトコルを参照)。しかし、いったん肝臓試料が採取されると、この^{ステップ10}で凍結して単離されたRNAの収量が約50%低下する可能性があるとして、免疫沈殿を継続することが推奨される。組織は、mRNA翻訳を阻害するためにシクロヘキシミドを含む解剖バッファーで迅速にすすいでください。不十分な組織リシスはまた、低RNA収率に貢献することができます。最小限の通気を確保しながら、組織の塊がモーターホモジナイザーで見えなくなるまで、氷上の組織を均質化することが重要^です。さらに、高塩バッファーによる十分な洗浄は、親和性マトリックスへのリボソームタンパク質の非特異的結合の除去を確実にするために重要である。野生型陰性制御を含めると、免疫沈殿の特異性および洗浄工程の効率を評価するのに役立つ。さらに、RNaseフリーDNase処理を含む市販のRNA精製キットを使用すると、RNA純度が向上します。

さらに、GFP:RPL10A融合タンパク質の発現と豊富さを検証し、下流分析のために十分なRNAを得るために必要な組織の量を評価することをお勧めします。組織切片またはライサットは、GFP:RPL10Aの発現を検証するために免疫ベースの検出方法に使用することができる。単離されたRNAの量は、(1)GFP:RPL10Aを発現する細胞の数、(2)トランスジーンの発現レベル、および(3)トランスジーンを発現する細胞の大きさおよびプロイディによって異なる。推奨される組織量の半分と2倍を用いたパイロット実験は、TRAP-seqに最適な入力リサートを決定する際に役立つ可能性があります。我々の手の中では、GFP:RPL10Aを発現する肝細胞の1〜2%程度のRNAを200mgから再移^入Fah-/-肝臓から、トランス^ジーン発現9を有する〜2 x 10 5ポリプロイド肝細胞を表す〜150 ngのRNAを得ることができた。

TRAP-seqの方法論はリボソーム結合mRNAを単離し、細胞の翻訳mRNAプールをプロファイリングする。したがって、結果として得られるシーケンス読み取りは、トランスクリプトームではなく「トランスレートム」に対応します。TRAP は架橋された複合体ではなくネイティブで実行されるため、リボソームフットプリントの変換は収集されません。フットプリント解析が望ましい場合は、上記のプロトコルを関連する架橋で修正し、その後に免疫沈殿(CLIP)方法^論18を変更する必要があります。TRAPのもう一つの制限は、GFP:RPL10A融合タンパク質を発現する十分な数の細胞の要件である。細胞型の目的が小さい実験では、複数の生物学的試料を組み合わせて、RNA-seq¹⁹を可能にするために十分なRNAを単離する必要がある場合がある。さらに、TRAP-seqは、目的とする細胞タイプにおけるGFP:RPL10Aの存在を必要とする。これは、細胞に特定の送達システムがない場合、またはCre発現を駆動する細胞タイプの特定のプロモーターが利用できない場合に問題を引き起こす可能性があります。

最近の単細胞RNA-seq(scRNA-seq)技術の開発により、様々な細胞タイプのシリコ同定に続く直接シーケンシングが可能になり、特定の細胞タイプの利益に対してソートすることなくシーケンシングが可能^{になりました20 、21、22。}しかし、scRNA-seqは依然として臓器からの細胞の解離を必要とする。^Fah-/-再集団モデルの場合、肝臓灌流および肝細胞の単離は、負傷者と複製肝細胞の両方の脆弱性のために非常に困難かつ非効率的である。実際、Fahプラスミドの流体力学的注射後に再集団化を受けているFah-/-マウスから十分な肝細胞を単離することはできていません。さらに、組織の処理にかかる時間の中で、遺伝子発現レベルが変化する可能性があります。肝臓灌流のためのプロトコルは、暖かい虚血時間の30分までかかります。将来的には、肝臓灌流を最適化して処理時間を短縮し、分離効率を高める方法論により、scRNA-seqをFah-/-^マウスモデルシステムに統合し、他の傷害モデルや再集団モデルに統合する可能性がある。これはまた、すべての肝細胞型の研究を可能にします。

結論として、TRAP-seqとFah-/-^マウスの統合により、肝細胞の複製の特定の単離および遺伝子発現プロファイリングが可能になり、肝臓の再集団化を促進する可能性のある治療標的を同定できる。この方法は、潜在的な薬物標的またはバイオマーカーを同定するために、遺伝子発現変化の疾患特異的同定のために肝臓および他の臓器系の他の細胞型を研究するために実施することができる。類似技術は、親和性精製を用いて肝細胞を再入発することから核を収集し、次いでこれらの特異^細胞16のエピジェネティック分析を行うために使用することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated	DWK Life Sciences (Wheaton)	358007
Absolutely RNA Miniprep Kit	Agilent	400800
Anti-GFP antibodies	Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core	GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
Cycloheximide	Millipore Sigma	C7698
Deoxycholic acid, DOC	Millipore Sigma	D2510
D-Glucose, Dextrose	Fisher Scientific	D16
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Thermo Fisher Scientific	65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid	Fisher Scientific	FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific	Thermo Fisher Scientific	AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2	Millipore Sigma	M8266
Methanol	Fisher Scientific	A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module	New England BioLabs	E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630	Millipore Sigma	I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated	Ambion	AM9932
Overhead Stirrer	DWK Life Sciences (Wheaton)	903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4	Ambion	AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated	Thermo Fisher Scientific	29997
Potassium chloride, KCl	Millipore Sigma	P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents	Agilent	5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Invitrogen	AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors	Promega	N2515
Sodium azide, NaN3	Millipore Sigma	S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3	Millipore Sigma	S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor	Invitrogen	AM2694