Summary
淡水イガイの保全は、生殖パターンと種のプロセスを監視に依存しています。本研究では、ギルの内容をサンプリングし、幼虫の発達を特徴付け、収集されたデータのデジタルリポジトリを提供するための非致命的なプロトコルを標準化する。このプロトコルデータベースパッケージは、イガイの研究者が侵略種を回収する上で重要なツールとなります。
Abstract
絶滅危惧種の時期、発達、生殖パターンを積極的に監視することは、集団回復を管理する上で重要です。淡水イガイは、世界で最も侵略された生物の一つですが、初期の幼虫(陰鬱な)発達と陰気な期間に関する情報は、多くの種のためにまだ欠けています。これまでの研究では、雌のイガイが宿主の魚を寄生する準備ができている複雑な生命史段階に焦点を当ててきたが、幼虫の発達の時期と時期に焦点を当てた研究はほとんどない。ここで説明するプロトコルは、研究者が非致死的に雌のイガイの重力の状態を評価することを可能にします。この研究の結果は、この方法は、サンプリングが行われた後に重力を維持したり、再びグラビディになる女性のムール貝の能力に影響を与えないことを示しています。この方法の利点は、連邦の脅威または絶滅危惧種や高い保全懸念の他の集団にその使用を許可することができます。このプロトコルは、保存または生きている個体の両方での使用に適応することができ、様々なイガイ種で試験された。提供されるデータベースは、生殖習慣のタイミングに関する幅広い情報のリポジトリであり、将来の淡水ムール貝の研究、保全、および回復の取り組みを容易にします。
Introduction
淡水システムにおける人口の持続性は、繁殖と募集の成功に依存する。寄生生物の場合、ライフサイクルの複雑さ(例えば、幼虫の発達と宿主のアトラクション戦略の段階)を特定することは、生物の生殖習慣と募集に影響を与える重要なプロセスに関する洞察を与えることができます。このような情報は、種が侵略され、残りの集団を維持するために成功した募集が必要な場合、または回復が絶滅した集団を再確立するために捕虜の伝播を使用する必要がある場合に重要になります。
淡水イガイ(ビバルビア:ユニオンダ)は、世界中の生物の中で最も侵略されたグループの一つと考えられており、種特異的な生殖習慣のコンパイルは、研究の努力に役立つ可能性があります1,2,3、4、5.現在、800種以上が世界中に分布しており、淡水イガイは北米と南米、東南アジアで多様性のホットスポットを持っていますが、多くの種2では本質的な生命史情報は不明です。5,6,7.この順序内の家族は、宿主7、8への愛着の間に自由に生きている少年に完全な変身を完全に寄生幼虫期を有することを特徴とする。このユニークな生命史の段階は、現在危機にある淡水システムの生物多様性に貢献しています9.高レベルの侵略は、水路の汚染、生息地の改変と破壊、宿主魚の豊富さと多様性の減少、および侵略種1の導入を含む多くの人為的脅威に起因する可能性があります。 10.ベンチックフィルターフィーダーとして、ムール貝は基板に浸透し、流域11に流出する汚染物質や汚染物質の影響を受けやすい。ムール貝種の回収は、炭素隔離、食料源、フィルター供給による水質浄化など、多種多様な生態系サービスを提供する上で適切である11。さらに、イガイは生態系の健全性を示し、生物多様性を促進し、生態系の回復力を高める12が見出されている。
多くの淡水イガイ研究は、種の状態評価と管理戦略をより良く知らせるために、早期の生活の歴史要件を調査することに焦点を当てています。この研究に関連する淡水ムール貝の家族(例えば、ヒリダイ、マルガリチリデリダ、ユニオンダイ)は、メスが幼虫(グロチディア)を彼らの群れエラ8で雄鶏するユニークな生命史戦略を持っています。様々な戦略を通じて、雌のムール貝は、グロチディア13で脊椎動物の宿主を寄生させるために、成熟したエラから成熟したグロチジアを追放する。エラ内の糸球体発達に関する研究は、皮下注射器を利用して生きているムール貝から生殖腺液をサンプリングし、ゲームの産生14、15、16を評価する技術から改変された。研究者が生殖腺サンプリングのためのこの非致命的な方法論を検証したように、それは雄鶏の発達15、16を評価するために、マーシャルギルサンプリングに適応した。一部のムール貝種は、外側の2つのエラ(子宮内枝)、内側の2つのエラ(内枝)のみ、または4つのエラ(テトラブランチ)すべてでグロチディアをひもで結ぶことができるので、系統的関係を解読するために使用できますが、この特性はそうではありません。すべての種17のために知られています。雌のムール貝が冬の間にグロチディアを雄鶏(乳状)または夏の短い期間(頻脈)18のいずれによって分類するために、以前に雌のムール貝種を分類するために使用されてきた。アノドンタの生殖周期が19日に研究されたときに、ムール貝の雄鶏の冬の上にサポートされました.しかし、基本的な生殖生物学は長年にわたってより徹底的に研究され、この二分法は総一般化であり、一部の種の生殖期間は当初推定された20、21よりもはるかに複雑であることがわかった。例えば、ヒリデラ属(家族ヒリダイ)、グレブラ属、エリプティオ属(家族ユニオンダイダエ)の種は、繁殖シーズン22、23、繁殖期あたり3匹の雄鶏の上方で観察されている。 24.種特異的、時には集団特異的な20の複雑さは、生殖習慣は、雌のムール貝が産生する可能性のある雌の雌の雌の時期と持続時間に関する知識のギャップをもたらした。
皮下注射器は、エラの内容物を抽出するために使用されているが、すべての研究で同等の結果を確保するために標準化の欠如のために結果を報告することは複雑です。以前は、グロチジアの4つの発達段階(すなわち、卵、胚、未熟、完全に発達した)がUnionidaeで同定されたが、標準的な手順16、25、26に採用されていない。マルガリーチリダイのメンバーを観察する他の研究は、「未熟なグロチジア」の分類を「発症グロチジア」に置き換え、潜在的な混乱を引き起こし、27、28。異なる幼虫の発達段階を特徴付ける一貫性の欠如は、多くの研究者が一般的に、幼虫の発達の複雑さを包含しない「グラビッド」として、雌を「グラビッド」と表現する。宿主魚試験を行う生命史研究は、完全に発達したグロチジアを持つ重力女性の必要性を優先しているが、この情報は、出版され、未発表の文献29、30全体に散在している。現在、卵、未熟なグロチディア、宿主への付着準備が整った完全に発達したグロチディアの間の移行のタイミングを含む、多くのイガイ種の生殖習慣に関するデータが欠けています。ほとんどの種では、メスがどれくらいの期間グロチディアをうろつき、どれだけ早く受精卵が完全に発達するかは不明である。知識のギャップは、多くの場合、非致死的な効果のためにテストされ、補完するために科学界に促進することができるエラの内容物を抽出する標準化された方法の必要性を提示し、保全の懸念の種のために広いです保護された集団に脅威を与えることなく、主流のデータ収集方法論24,31,32.
本研究は、3つの目的を持っていた:1)ギルサンプリング技術を形式化し、その中で雌のイガイに対する致死的および非致命的な影響をテストし、2)陰鬱な発達の異なる段階を特徴付け、標準化された同定方法を記述し、さまざまな幼虫の段階を報告し、3) 収集されたデータのパブリック リポジトリを作成します。フィールド調査、長期監視プロジェクト、博物館コレクションはすべて、ここで説明するプロトコルが実装される機会と、より広範な関心を持つデータを収集する機会を表します。形式化されたプロトコルには、幼虫の発達の各段階を差別化するためのビジュアルと文字記述が含まれています。カテゴリを標準化することにより、収集された結果は、すべての発生と種間で比較することができます。データが収集されると、すべてのデータは、このプロトコルを使用して収集された重力情報のデータベースである淡水ムールール貝グラビティアルマナック(FMGA)に提出することができます。収集したすべての重力情報を保存し、コンパイルするための最終製品は、将来の研究、保全、および回復の努力を容易にするための研究ツールを提供します。この方法論を様々なイガイプロジェクトに組み込み、FMGAにデータを提出することは、年間を通じてムール貝種の重力状態に関する知識の幅を広げるであろう。生物の非常に侵略されたグループとして、このプロトコルと淡水イガイの生殖習慣に関するデータベースは、人口動態を理解し、これらの種の保全を促進するために不可欠です。
Protocol
1. グラビッド女性コレクション
注:魚類野生生物サービスの淡水ムール調査プロトコル33を参照して、絶滅危惧種のサンプリングサイトを適切に調査する方法について説明してください。適切な連邦許可は、存在するすべての種の保護された種と州の許可のフィールドコレクションの前に取得する必要があります。
- 触覚的な方法(ステップ1.2)を使用してフィールドから生きているイガイを収集するか、博物館から保存された標本を利用します(ステップ1.3)。
注:乾燥を防ぎ、ストレスを軽減するために、コレクション後に生きているムール貝を涼しく濡らし続けることが重要であり、グラビッドムール貝の最小限の取り扱いは、女性が早期にエラの内容を放出するのを避けるために重要です34。 - 女性の重力を評価するコレクション中の目視検査(例えば、マントルルアーレの存在、コングルティナテスなど)または収集後の目視検査(例えば、内側を見て、エラが膨張しているかどうかを確認するのに十分な開いている弁を優しくこじ開く)によって、図 1)
注:種は、時には2つの外側のエラ(外皮)、2つの内側のエラ(内枝)、または4つのエラ(四面体)すべてがマルシャル17である場合もあるので、グロチジアがマルシャルエラ内でどのように羽ばたくかによって異なります。プロトコルはここで一時停止することができ、灰色の女性はギルサンプリングのためにラボに戻って輸送することができます。
図1:優しく覗く個人が開きます。生きているムール貝の重力を確認するには、親指(A)でバルブを優しく開くか、慎重にバルチを開くために鏡やリバースペンチを使用します(B)。この方法に関連する注意事項については、プロトコルの手順 2.3 を確認してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 保存された標本に対して、バルブを開き、エラを検査して、個体が重力メスであるかどうかを判断して目視検査を行います(図2)。
図2:グラビッドな女性を識別する方法。メスのムール貝の雄鶏のエラは、女性がグラビディとうねっているときに膨張して表示されます。写真AとCは横の視点からエラを示し、写真BとDはエラの腹部の眺めを提供する。赤いボックスは、グラビッド(A/B)とグラビッド(C/D)メスのランプシリス・ストラミニア・ムール貝の違いを強調するためにエラの輪郭を描きます。個人の総長は79のmm (A/B)および88のmm (C/D)である。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. ギルコンテンツサンプリング
注:このプロトコルは、サンプリングがフィールドと実験室の生きたイガイに、または保存された標本で起こるかどうかに適合させることができます。
- 採取後24時間以内にサンプル評価が行われない場合、またはエラの場合は、抽出35またはエタノール(EtOH)の24時間以内にエラの内容物が評価される場合、滅菌水の約1mLのプラスチックマイクロ遠心分離管を準備する内容はEtOHに保存されている博物館の標本からです。グロチディアが走査型電子顕微鏡(SEM)イメージング用である場合は、70%EtOHを使用し、グロチディアが遺伝子検査に使用される場合は、非変性95%EtOH36を使用する。
- 10 mLシリンジ上の無菌20Gベベル先端針の紙包装を取り外します。キャップを外して針を露出させ、1.5 mLのプラスチックチューブを用意してギル含有量を収集します。黒いストッパーが0 mL/ccラインにあるように、シリンジのハンドルをずっと下に押します。
注:生殖不能の注射器は、ギルの内容物がサンプリングされるたびに使用する必要があります。使用済みのシリンジは、先端を10%の漂白液に浸し、1mLの滅菌水で充填し、プランジャーを0mL/ccに戻してシンジをすすいで、最後に清潔な布でシリンジを乾燥させ、現場で殺菌することができます。 - グラビッドメスをピックアップし、親指の先端を使用して2つのバルブを静かに開きます。
注意:動物に危害を加えないように注意してください。弁を広く開けるか速すぎると、内転筋の伸びが大きくなり、死亡率を引き起こす可能性があります。薄い貝殻の標本(例えば、アノドンタ、レプトデア、ウターバックリアなどの種)と若い個体は、このステップで特に脆弱です。壊れやすい貝殻の種を強制的に処理すると、殻を割り、死亡率を引き起こす可能性があります。場合によっては、前部および後部のシェルマージンから薄い殻の動物を絞り込み、腹部の表面を見ながら、シェルがわずかに屈曲し、ギャップを引き起こし、貝殻を観察したり、殻を開けたり、壊れやすいものを損傷することを防ぎます。シェルマージン。
注:ツールは、このステップを支援するために使用することができますが、注意して使用しない場合は死亡率を引き起こす可能性があり、可能な限り避ける必要があります。例えば、鏡面または変更されたリバースペンチのセットは、個々の開いたままにするのを助けるために使用され、くさびはバルブを開く支柱を助けるために使用することができます。これらの器具は、他の人が助けるために利用可能である場合(すなわち、ある人が動物を開いたまま、別の人が抽出用の注射器を操縦する)必要とされない場合があります。マントル組織をペリオストラカムから損傷または分離すると、成長変形および死亡率37を引き起こす可能性があります。したがって、マントル組織とシェルの外側のマージンとの間の接続を切断しないようにすることが重要です。 - 注射器の針先を使用して、膨張したマーシャルギルの単一の水管を穏やかに貫通します。次に、針のベベ先端を利用して、エラの内容物をそっとすくい取ります。
注:ギルの内容物は、通常、針のベベの先端に表示されるべき乳白色の一貫性を有する。- 顕微鏡が容易に入手可能な場合は、注射器の内容物をペトリ皿に直接堆積します。それ以外の場合は、後で評価するために、指定された液体(ステップ2.1を参照)で1.5 mLプラスチックマイクロ遠心管に内容物を保管してください。
注:損傷を避け、生存率を低下させるために輸送中のグロチディアサンプルの妨害および取り扱いを最小限に抑える32、35。
- 顕微鏡が容易に入手可能な場合は、注射器の内容物をペトリ皿に直接堆積します。それ以外の場合は、後で評価するために、指定された液体(ステップ2.1を参照)で1.5 mLプラスチックマイクロ遠心管に内容物を保管してください。
- 属種の同定、重力状態、女性の長さ(mm)、コレクターと連絡先情報、状態、郡、排水、特定の収集場所、緯度と経度、ギルの一意の識別子に関する情報を記録します。サンプル、調査サイトの一意の識別子、およびギルの内容が抽出された場合の収集日 (図 3)。各収集船舶に一意の識別子を記録し、輸送中に正確なデータ記録を確保します。
- アイデンティティ検証のためにムール貝の外側の右弁を撮影し、画像に読みやすい一意の識別子でラベル付けされたチューブを含めます。必要に応じて、ムール貝が見つかった環境とコミュニティに関する情報を補完するために、他のアバイオティクスおよび生物学的パラメータを収集します(提案については図3を参照)。
図 3: フィールド重力データシートの例。信頼性の高い情報を生成するためにギルサンプルを採取する場合は、正確なデータレポートが必要です。これは、各ギルサンプルと共に収集する最小フィールドと余分なアバイオティックパラメータを含むフィールドデータシートの例です。詳細については、プロトコルの手順 4.1 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
3. エラ内容の実験室評価
- エラの内容物が1.5mLのチューブに入っている場合は、ペトリ皿に移し、皿の底を水で満たします。ペトリ皿を円形にゆっくりと旋回し、皿の中央に内容物を集め、サンプルをより集中的に見ることができます。
注:1.5 mLチューブは、エラの内容物がチューブの壁に付着している場合は、噴出ボトルを使用して洗い流すか、水で満たされたピペットを転送する必要があります。 - ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置き、サンプルを評価します。可能であれば、顕微鏡下でエラサンプルの写真を撮り、そのサンプルの一意の識別子でラベルを付けます。
- 各エラサンプルにどの発生段階が存在するかを記録します。図 4をガイドとして使用して、各開発段階を特徴付ける。いくつかのケースでは、女性は、複数の発達段階で幼虫をむち維にしている可能性があります。したがって、特定のサンプル内で観察されたすべての発達段階(例えば、EGG/DG/IMG/FDG)を報告する。保存されたグロチジアが評価されたら、セクション4に進みます。完全に発達したグロチジアが同定され、EtOHが保存に使用されなかった場合は、ステップ3.3に進みます。
注:卵、卵塊。DG, グロチジアを開発;IMG, 未熟なグロチジア;FDG、完全に開発されたグロチジア。
- 各エラサンプルにどの発生段階が存在するかを記録します。図 4をガイドとして使用して、各開発段階を特徴付ける。いくつかのケースでは、女性は、複数の発達段階で幼虫をむち維にしている可能性があります。したがって、特定のサンプル内で観察されたすべての発達段階(例えば、EGG/DG/IMG/FDG)を報告する。保存されたグロチジアが評価されたら、セクション4に進みます。完全に発達したグロチジアが同定され、EtOHが保存に使用されなかった場合は、ステップ3.3に進みます。
図4:マルシャルエラにおけるグロチジア発達の様々な段階の表現。(A)卵塊(EGG)は卵をまとめる膜を持っている。各卵膜の中には、分化細胞の不透明な球状質量があります。不透明な球状質量は、初期の細胞分裂中に複数の球状質量に分割される可能性がありますが、明確な二枚貝の形状が観察されるまでEGGとして記録する必要があります。(B)未熟なグロチジア(IMG)は、卵膜内に含まれる明確な二枚貝状の塊を有する。(C)グロチジア(DG)の発症は、明確な二枚貝の形状、卵膜なし、および内部の組織化されていない組織を持ち、しばしば見た目があいまいである。Glochidia(DG)の開発は、NaClに曝露された場合には反応せず、データが記録されたときに「DG(T)」に分類されます。(D)完全に発達したグロチジア(FDG)は、明確な二枚貝の形状と明らかな付加筋組織を有し、グロチジアを閉じ込めることを可能にする。完全に発達したグロチジア(FDG)は、保存後に2つの開口弁として観察されることが多い。NaClにさらされ、「FDG(T)」に分類される場合、2つの開いている弁は通常、閉じたり、開閉したりしてスナップします。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- 塩化ナトリウム(NaCl)試験を実施し、エラ試料35のサブセット液滴にNaClの結晶を添加して完全に発達したグロチジアの生存率をさらに評価する。実行可能なグロチディアは、開いている位置から弁を閉じることによってNaClに応答します。データが記録されるときに、指定の最後に '(T)' を含む塩分テスト済みのグロチディアを報告します。
注:完全に発達したグロチジアはまた、NaClにさらされることなく開閉を積極的にスナップして観察されてもよい。
4. データベースへの報告
- オンラインソフトウェアプログラム38、39、40を使用して開発されたFMGAウェブ(http://arcg.is/089uee)にアクセスします。FMGA ページには、デスクトップ データ入力フォームへのリンクと、モバイル デバイス用のアプリケーションのダウンロードが表示されます。モバイル アプリは、フィールド内のデータ入力と自動ジオリファレンス41を有効にします。
注:淡水ムール貝種の生命史イベントに関連する重力カレンダーや他のグラフィックスもFMGAダッシュボードで見つけることができます。- モバイル アプリまたはデスクトップ サイトを使用して、ドロップダウン メニューとテキスト入力フィールドを使用して、データ入力フォームに結果を記録します。大規模な既存のデータセットの場合は、テンプレート スプレッドシートの作成者に問い合わせてください。適切な列見出しの下に記録されたデータを入力し、スプレッドシート上の各レコードまたは行が、1 人のグラビッド個人からのギル サンプルの観測値を表していることを念頭に置いてください。
- 結果を送信すると、管理者によって検証された後に FMGA データベースに追加されます。
注: データが FMGA データベースで検証およびコンパイルされると、FMGA ダッシュボードに表示されるすべてのグラビティ カレンダーやその他のインタラクティブグラフィックスが更新されます。
Representative Results
このプロトコルは、2015年1月から2015年12月までブルースクリーク(ウォルトン郡、フロリダ州)の750 m 2ストレッチ内の淡水ムール貝コミュニティを監視した捕獲マーク再捕獲研究中に適用されました。フィールド サンプリングは 4 週間ごとに行われる予定でした。しかし、流量の多いイベントのため、2015年4月または9月にはサンプリングは行われなかった。米国地質調査所、米国魚類野生生物局、フロリダ魚類野生生物保護委員会を含む州および連邦政府機関は、フィールド調査とギルサンプリングを支援しました。調査中に遭遇した各重女性は、上述のプロトコルを用いて現場のギル含有量サンプリングを行い、タグ付け(材料表参照)を行い、河川基板に戻した。エラサンプルは95%EtOHに保存され、米国地質調査所の湿地と水生研究センターの研究室に運ばれ、エラの内容物の評価を行いました。
女性にタグを付け、年間を通じて毎月の間隔で再取得することにより、我々は合計90人の個人に対するギルサンプリングプロトコルの致死的および非致命的な影響の両方を評価した。この研究の間に再捕獲された次の7種:エリプティオ・プルタ(n =5)、フスコニア・バーキ(n =1)、ハミオタ・オーストラリス(n =19)、オボバリア・チョクタウェンシス(n=1)、ストロフィタス・ウィリアムズ(n=1)。 ビロサ・リネサ(n=60)、ビロサ・ビベックス(n=3)。私たちのサンプリングには、全長24mmから80mmまでの個体と、米国絶滅危惧種法で保護されている2種(F.バーキとH.オーストラリス)が含まれていました。この研究で利用されるすべてのデータは、私たちはサイエンスベース(https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)42上の私たちのデータセットへのアクセスを提供しています。
生存者シップは、ギルサンプル収集後に生きて捕獲された個体数によって評価された。高い生存者を観察しました (97%)いくつかの死亡率を有する研究の間に、おそらく捕食に寄与し、現場の観察によって示される。結果は、個人の約51%(90の46)が連続したサンプリングイベントの間に重力を保つことがわかった。別の10%の個体(90人中9人)がグラビッドで発見され、グラビアではなく再捕獲され、再びグラビッドが見つかった。この研究では、約39%の個体(90人中35人)がグラビアで発見され、エラサンプルが採取されたが、年間を通じて再び捕獲された場合、彼らは再びグラビッドを見つけられなかった。結果は、ここで説明するプロトコルが致死的でも致死的でもなく、エラがサンプリングされた後の現在のブローディング期間を実質的に妨げないことを示している。
この研究のサンプルサイズは種間で等しくないが、この研究の結果は、このプロトコルの有益で実用的な応用を強調する。V.lienosaの重力カレンダーは、FDGをうろつく重力の女性が、EGGをうろつくメスだけが見つかった8月を除いて、ほぼ毎月に発見されたことを示しています(図5A)。女性H.オーストラリスは、7月、8月、12月に重力(NG)ではないことが判明した。女性の大部分は1月と2月にFDGを悩ましていたが、10月と11月にも見つかった(図5B)。5月から6月にかけて女性がEGGをうろついていたが、E.プルタの個体は見つからず、6月には1匹の重症女性(GFR)が記録された(図5C)。唯一の重VID F.バーキ女性は6月にGFRで発見され、7月にNGを再捕獲しました。同じO.チョクタウェンシス個体は2月にFDGを回収し、7月にNGを再捕獲した。S.ウィリアムズは1人しか見つからず、3回捕獲された。このメスは3月にFDG、5月にNG、6月にGFR、8月にEGGが見つかりました(図5C)。2月から6月にかけて、V.vibexのグラビッドメスが見つかりました(図5C)。
図5:ブルース・クリーク、FLにおける研究の結果を、重力カレンダー形式で表示する。(A)ヴィロサ・リノサのグラビディティ・カレンダーがキャプチャ/リキャプチャーされます。(B)ハミオタ・オーストラリスのグラビティカレンダーをキャプチャ/再キャプチャします。(C)10個未満の個体を持つ全種の重力カレンダーをサンプリング。Y 軸には、1 月 (Ja)、2 月 (F)、3 月 (Mr)、5 月 (マイ)、6 月 (Jn)、7 月 (Jl) 8 月 (A)、10 月 (O)、11 月 (N) および 12 月 (D) の省略形が含まれます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
意義
侵略された種の保全は、現在の集団内での成功した募集に依存する。場合によっては、これらの危険な集団の募集を増強するために人工的な伝播が必要な場合があります。これには、研究者が各種の活発な繁殖のタイミングを知らされ、場合によっては異なる方法論や管理方法を適用して、採用への影響を軽減する必要があります。生物の侵略的なグループとして、生殖習慣を研究するための標準化された非致命的なアプローチを確立し、最新の科学コミュニティに情報を提供するためにデータをコンパイルし、視覚化するためのプラットフォームを提供することが最も重要です。利用可能な情報。この研究は、予防措置を取ることを確実にするためのステップバイステップのプロトコルを提供し、ギルの内容は、適切にサンプリングされ、メスのイガイから評価することができます。このプロトコルは、致命的および非致命的な効果についてテストされ、研究者や管理者が責任を持ってこの方法論を実装できるようにしました。また、一般に公開されているユーザーフレンドリーなダッシュボードで、グラビティ情報のコンパイルを容易にする一連のデータベース管理ツールとアプリケーションも開発しました。疫学、グロチディア形態学、生命史、系統遺伝学、伝播、および転座に関する研究は、淡水イガイのすべての種に対する時間重力情報のこのリポジトリに利益をもたらし、利用することができます。
この研究は、いくつかの種の生殖習慣の以前の研究の発見を支持するだけでなく、他の種に関する新しい情報を明らかにしました。V.vibexはV.リエノサよりも少ない数で収集されたが、重力データに基づいて2つの間に類似点を見出すことができる。ヴィロサの両方の種は、一年の大部分の間に完全に発達したグロチディアを、冬のブローダーとして特徴づけるようです。これは、他のビロサ種43、44、45に関する以前の研究と一致しています。この研究の結果は、H.オーストラリスが10月から6月にかけて重症で発見できることを示唆している。以前に発表された研究は、4月、3月から6月46日、47年6月までの4ヶ月間の重力期間を持つ同種のH.アルティリスを同定した。この知見は、以前に考えられていたよりも長い重力期間を示し、一般的にH.オーストラリスを過冬のブローダーとしてグループ化する。連邦で保護された種として、H.アルティリスとH.オーストラリスの様々なブローディング期間は、生殖活動中に集団をより良く保護するための経営決定に影響を与える可能性があります。エリプティオ・プーラタは、5月と6月にEGGでグラビアが発見されただけで、非常に短いブローディング期間24、48、49を有する頻脈種としての特性に対応する。 50.このプロトコルを使用してElliptio種のデータがコンパイルされているので、グロチディアは年のうち数ヶ月しか見つからないため、特定の陰気な開発段階が標的にされた場合、詳細な情報はフィールドの取り組みをより効率的に行うことができます。サンプルサイズが小さい他の種からの推論は限られていますが、データがデータベースにコンパイルされるにつれて、サンプルサイズが大きいほど、追加のイガイ種の生殖習慣に関する洞察が与えられます。
手続き上のコメント
淡水イガイとそのグロチジアは、人為的ストレスに敏感であることが知られている10,35.重力検査中、ムール貝弁は開きにくく、不注意にバルブを開くと意図しない害を引き起こし、ストレスや死亡率を引き起こす可能性があります。いくつかの壊れやすい種(例えば、アノドンタ、レプトデア、ウッターバックリアなどの種)と小さいサイズの個体は、簡単に壊れ、裂くことができる非常に壊れやすい殻と弱い付加筋肉を持っている可能性があります。取り扱いが責任を持って慎重に行われていない場合、ギルサンプリングはストレッサーと見なすことができます。以前の研究では、生殖活動中のムール貝の取り扱いと空中暴露は、エラ内容物34の早期放出を含む様々な生理的ストレスを引き起こす可能性があることを発見した。しかしながら、ここで説明する同様の方法論を利用した研究では、ギルサンプリング中に重力性の雌イガイを取り扱うことがわかったが、現在の雄鶏を中断したり、短期および長期のブローディング種16の両方で早期放出を引き起こさなかった。さらに、無菌注射器は、複数の個人のエラを穿刺する際に意図しない感染やクロス汚染を防ぐために、このプロトコル中に使用する必要があります。さらに、グロチジアは壊れやすく、雄鶏は成熟し、ストレスを受けることができますが、追放されません。健康状態の悪い成熟したグロチジアは、塩試験に反応する個体の数が少ない35をもたらす可能性がある。DG(T)とFDG(T)を区別する場合は、サンプルサイズが大きい塩分試験を行い、本研究で提供される説明を用いてDGとFDGグロチジアの区別を慎重に識別するために観察に注意を書き留めます。適切なケアを受けると、この手順によって引き起こされる最小限のストレスは、女性のムール貝が自然にグロチディアをうろつき続け、人口の募集への影響を減らすことを可能にすることができます。
追加のデータは、データベースを補完し、淡水イガイの生殖習慣のための広いコンテキストを提供するために記録することができます。いくつかの種(例えば、フスコニアの種)は、グロチディア51の発達段階に基づいて異なる色のエラを持つことが観察されている。女性の最初の重力チェック中に、将来の調査を可能にするために、報告されたデータにギルの色の説明が含まれる場合があります。また、プロトコルのこの時点で、研究者は、2つの外側のエラ(子宮内枝)、2つの内側のエラ(内皮)、またはすべての4つのエラ(四面体)17で、陰性の雌が陰性グロチジアを発見したかどうかに注意することができます。この情報はFMGAに追加され、調査された種ごとのブローディングに関するデータギャップを埋めるのに役立ちます。環境条件、特に水温は、様々な緯度範囲での種の重力状態とタイミングをより包括的に観察するために、フィールドに収集および記録することができます。研究は、温度、光周期、流量、食品の入手可能性などの環境パラメータが淡水イガイ52、53、54、55の生殖イベントを誘発する可能性があることを示しています。、56.彼らは重力に影響を与える生体要因に関する将来の研究を促進するために提出され、データベースに追加のフィールドを追加することができます.我々の研究の後にモデル化された捕獲マーク再キャプチャの修正はまた、研究者が特定のイガイの生殖習慣を監視し、年間複数のひなに関する情報を明らかにすることを可能にするこのプロトコルに追加することができます。
FMGA の情報の正確さは、ソースによって異なります。例えば、淡水イガイの誤同定は、種57を区別することを困難にする同様の外部特性を有する多くの種のために一般的である。誤認された個体のエラサンプルは、種の生え続ける期間に混乱と虚偽の情報を作成する可能性があります。ギルサンプルを撮影する場合は、写真は両方のバルブ(個人が生きていない場合)、右弁の外側、およびアンボ(2つのバルブが接続するヒンジ)の内側を撮影し、デスクトップサイトまたはモバイルアプリケーションを介して重力データで提出する必要があります。ギル内容の写真も歓迎します。提出フォーム内にはドロップダウンメニューがあり、コレクターは種の同定に関する信頼度を示します。レコードが検証される前に、コレクターの識別を妥当な分布などに対してチェックする際に、この情報が考慮されます。Unionidaeの種における特異的形態的変動の程度が高いため、組織サンプルの提出が奨励され、分子同定を容易にするために必要な場合があります。
今後の影響
非致死的な方法として、このプロトコルは、一般的な種と不死化種の両方に適用することができる。侵略された種の重力カレンダーは、種が生殖活動している期間に関する情報を提供することにより、絶滅危惧種の法律と回復計画に関与する保全管理者を支援することができます。危険な種を管理する州および連邦機関は、種が脆弱で再生されていない時間の許可の割り当てをより良く助言することができ、さらにはムール貝が完全に発達したグロチディアをむちで焼いている時に宿主魚の収穫を制限することができます。さらに、フィールド調査では、非生殖期間中に種をターゲットにして、採用プロセスへの影響を最小限に抑えることができます。公的にアクセス可能なデータベースFMGAは、研究者や管理者が任意の標的淡水イガイ種に関する重要な生殖情報を取得するためのツールを提供します。また、このデータベースはデータギャップを強調し、種特有のブローディングパターンに関するさらなる研究を奨励します。種の生殖パターンを理解することで、適切な経営判断が可能と考えられるので、今後の淡水ムール貝の研究、保全、回収を促進することを期待しています。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、米国魚類野生生物局と米国地質調査所の資金源に感謝したいと思います。フィールドクルーとデータ収集を組織し、ローレン・パターソンとクリス・アンダーソンと共に、データベース開発に貴重な貢献をしたアンドリュー・ハートツォグとサンドラ・パーシフルに感謝します。また、シェリー・ボスティック、マーク・カントレル、サハレ・ケースボルト、ジョーダン・ホルコム、ハワード・ジェルクス、ゲイリー・マホン、ジョン・マクレオド、カイル・ムーン、ケイラ・モーニングスター、エマ・ピストル、マット・ロウ、チャニング・セントを含むフィールドと研究室で助けてくれたすべての人に感謝したいと思います。オービンとジム・ウィリアムズ貿易、会社、または製品名の使用は、説明的な目的のみを目的としており、米国政府による承認を意味するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL snap cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5510 | Snap cap tubes are important in the field so the loose screw cap is not lost. |
| 20 G needle on 10 mL disposable syringe | Exelint International | 26255 | sterile 10 mL disposable syringe with needle Model: 10ml Luer Lock Tip W/20G X 1 1/2" |
| Dissecting Microscope | any | any | |
| Marking Pen | Fisher Scientific | 13-379-4 | This is what we used but any marker that can write on small plastic tubes will do. This one is fairly ethanol and water proof. |
| Molecular grade ethanol | any | any | Needed if preserving gill contents. Non-denatured 95% is needed for genetic work, 70% is needed for SEM imaging work. |
| Paper | any | any | Needed to record information on samples collected. |
| Pen/pencil | any | any | If in the field, better to write on waterproof paper with pencil so it doesn't smear. If in the museum/lab, any writing utensil is fine. |
| Petri dish | DWK Life Sciences (Kimble) | 23000-9050 | This is what we used but any petri dish available is fine. It is nicer to have the taller walls in case too much water is used. |
| Sodium Chloride | any | any | Needed for NaCl test for reactive glochidia. Preserved samples do not need this. |
| Speculum | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
| Sterile water | any | any | Added to gill samples to be evaluated for reactivity within 24 hours of collection. |
| Super glue | Gorilla | Gorilla super glue gel | Used to apply tags and only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
| Tags | Hallprint | FPN 8x4 | Only needed if conducting a capture-mark-recapture study. |
| Transfer Pipet | Thermo Scientific Samco | 225 | This is what we use but any transfer pipet or squirt bottle is applicable. |
| Tweezers | any | any | Needed to move crystals of NaCl for salt test. Preserved samples do not need this. |
| Waterproof paper | RainWriter | any | Only needed if conducting work in the field. This allows you to record information on each individual gill contents are extracted from. |
| Wooden pick | any | any | Only needed if you want help opening the valves of a live mussel. |
References
- Williams, J. D., Warren, M. L., Cummings, K. S., Harris, J. L., Neves, R. J. Conservation status of freshwater mussels of the United States and Canada. Fisheries. 18 (9), 6-22 (1993).
- Lopes-Lima, M., et al. Conservation status of freshwater mussels in Europe: state of the art and future challenges. Biological Reviews. 92 (1), 572-607 (2017).
- Zieritz, A., et al. Diversity, biogeography and conservation of freshwater mussels (Bivalvia: Unionida) in East and Southeast Asia. Hydrobiologia. 810 (1), 29-44 (2018).
- Haag, W. R., Williams, J. D. Biodiversity on the brink: an assessment of conservation strategies for North American freshwater mussels. Hydrobiologia. 735 (1), 45-60 (2014).
- Ferreira-Rodríguez, N., et al. Research priorities for freshwater mussel conservation assessment. Biological Conservation. 231, 77-87 (2019).
- Graf, D. L., Cummings, K. S. Review of the systematics and global diversity of freshwater mussel species (Bivalvia: Unionoida). Journal of Molluscan Studies. 73 (4), 291-314 (2007).
- Lydeard, C., Cummings, K. Freshwater mollusks of the world: a distribution atlas. , Johns Hopkins University Press. Baltimore, MD. (2019).
- Wächtler, K., Dreher-Mansur, M. C., Richter, T. Larval types and early postlarval biology in naiads (Unionoida). Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. Bauer, G., Wächtler, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 93-125 (2001).
- Dudgeon, D., et al. Freshwater biodiversity: importance, threats, status and conservation challenges. Biological Reviews. 81 (2), 163-182 (2006).
- Downing, J. A., Van Meter, P., Woolnough, D. A. Suspects and evidence: a review of the causes of extirpation and decline in freshwater mussels. Animal biodiversity and Conservation. 33 (2), 151-185 (2010).
- Vaughn, C. C. Ecosystem services provided by freshwater mussels. Hydrobiologia. 810 (1), 15-27 (2018).
- Aldridge, D. C., Fayle, T. M., Jackson, N. Freshwater mussel abundance predicts biodiversity in UK lowland rivers. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 17 (6), 554-564 (2007).
- Barnhart, M. C., Haag, W. R., Roston, W. N. Adaptations to host infection and larval parasitism in Unionoida. Journal of the North American Benthological Society. 27 (2), 370-394 (2008).
- Saha, S., Layzer, J. B. Evaluation of a nonlethal technique for determining sex of freshwater mussels. Journal of the North American Benthological Society. 27 (1), 84-89 (2008).
- Tsakiris, E. T., Randklev, C. R., Conway, K. W. Effectiveness of a nonlethal method to quantify gamete production in freshwater mussels. Freshwater Science. 35 (3), 958-973 (2016).
- Gascho, L., Andrew, M., Stoeckel, J. A. Multi-stage disruption of freshwater mussel reproduction by high suspended solids in short-and long-term brooders. Freshwater Biology. 61 (2), 229-238 (2016).
- Bauer, G., Wächtler, K. Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. , Springer Science and Business Media. Berlin, Germany. (2012).
- Ortmann, A. E. Notes upon the families and genera of the najades. Annals of the Carnegie Museum. 8 (2), 222 (1912).
- Heard, W. H. Sexuality and other aspects of reproduction in Anodonta (Pelecypoda: Unionidae). Malacologia. 15, 81-103 (1975).
- Heard, W. H. Brooding patterns in freshwater mussels. Malacological Review. 7, Supplement 7: Bivalvia 105-121 (1998).
- Watters, G. T., O'Dee, S. H. Glochidial release as a function of water temperature: beyond bradyticty and tachyticty. Proceedings of the Conservation, Captive Care, and Propagation of Freshwater Mussels Symposium. , 135-140 (1998).
- Parker, R. S., Hackney, C. T., Vidrine, M. F. Ecology and Reproductive Strategy of a South Louisiana Freshwater Mussel, Glebula Rotundata (Lamarck) (Unionidae: Lampsilini). Freshwater Invertebrate Biology. 3 (2), 53-58 (1984).
- Jones, H. A., Simpson, R. D., Humphrey, C. L. The reproductive cycles and glochidia of fresh-water mussels (Bivalvia: Hyriidae) of the Macleay River, Northern New South Wales, Australia. Malacologia. 27 (1), 185-202 (1986).
- Price, J. E., Eads, C. B. Brooding patterns in three freshwater mussels of the genus Elliptio in the Broad River in South Carolina. American Malacological Bulletin. 29 (1), 121-126 (2011).
- Haag, W. R., Staton, J. L. Variation in fecundity and other reproductive traits in freshwater mussels. Freshwater Biology. 48 (12), 2118-2130 (2003).
- Soler, J., Wantzen, K. M., Jugé, P., Araujo, R. Brooding and glochidia release in Margaritifera auricularia (Spengler, 1793) (Unionoida: Margaritiferidae). Journal of Molluscan Studies. 84 (2), 182-189 (2018).
- Smith, D. G. Notes on the biology of Margaritifera margaritifera margaritifera (Lin.) in Central Massachusetts. American Midland Naturalist. , 252-256 (1976).
- O'Brien, C., Nez, D., Wolf, D., Box, J. B. Reproductive biology of Anodonta californiensis, Gonidea angulata, and Margaritifera falcata (Bivalvia: Unionoida) in the Middle Fork John Day River, Oregon. Northwest Science. 87 (1), 59-73 (2013).
- Haag, W. R., Warren, M. L. Host fishes and reproductive biology of 6 freshwater mussel species from the Mobile Basin, USA. Journal of the North American Benthological Society. 16 (3), 576-585 (1997).
- O'Dee, S. H., Watters, G. T. New or confirmed host identifications for ten freshwater mussels. Proceedings of the Conservation, Captive Care, and Propagation of Freshwater Mussels Symposium. , 77-82 (1998).
- Johnson, N. A., McLeod, J. M., Holcomb, J., Rowe, M., Williams, J. D. Early life history and spatiotemporal changes in distribution of the rediscovered Suwannee moccasinshell Medionidus walkeri (Bivalvia: Unionidae). Endangered Species Research. 31, 163-175 (2016).
- McLeod, J. M., Jelks, H. L., Pursifull, S., Johnson, N. A. Characterizing the early life history of an imperiled freshwater mussel (Ptychobranchus jonesi) with host-fish determination and fecundity estimation. Freshwater Science. 36 (2), 338-350 (2017).
- Carlson, S., Lawrence, A., Blalock-Herod, H., McCafferty, K., Abbott, S. Freshwater mussel survey protocol for the Southeastern Atlantic Slope and Northeastern Gulf drainages in Florida and Georgia. US Fish and Wildlife Service, Ecological Services and Fisheries Resources Offices and Georgia Department of Transportation, Office of Environment and Location. , Atlanta, Georgia. (2008).
- Waller, D. L., Rach, J. J., Cope, G. W., Miller, G. A. Effects of handling and aerial exposure on the survival of unionid mussels. Journal of Freshwater Ecology. 10 (3), 199-207 (1995).
- Fritts, A. K., et al. Assessment of toxicity test endpoints for freshwater mussel larvae (glochidia). Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (1), 199-207 (2014).
- Christian, A. D., Monroe, E. M., Asher, A. M., Loutsch, J. M., Berg, D. J. Methods of DNA extraction and PCR amplification for individual freshwater mussel (Bivalvia: Unionidae) glochidia, with the first report of multiple paternity in these organisms. Molecular Ecology Notes. 7 (4), 570-573 (2007).
- Henley, W. F., Grobler, P. J., Neves, R. J. Non-invasive method to obtain DNA from freshwater mussels (Bivalvia: Unionidae). Journal of Shellfish Research. 25 (3), 975-978 (2006).
- ESRI. ArcGIS Desktop 10.6.1.9270. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2017).
- ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Survey123 Field Application for ArcGIS 3.3.64. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
- ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Survey123 Connect for ArcGIS 3.3.51. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
- ESRI. ArcGIS Online. ESRI Geospatial Cloud: Operations Dashboard for ArcGIS. Environmental Systems Research Institute (ESRI). , (2019).
- Johnson, N. A., Beaver, C. E. Empirical data supporting a non-lethal method for characterizing the reproductive status and larval development of freshwater mussels (Bivalvia: Unionida). U.S. Geological Survey data release. , (2019).
- Ortmann, A. E. A monograph of the naides of Pennsylvania. Memoirs of the Carnegie Museum. 8, (1919).
- Posey, W. R. Life History and Population Biology of the State Special Concern Ouachita Creekshell, Villosa arkansasensis (I. Lea 1862). Arkansas Game and Fish Commission. , (2007).
- Asher, A. M., Christian, A. D. Population characteristics of the mussel Villosa iris (Lea) (rainbow shell) in the Spring River watershed, Arkansas. Southeastern Naturalist. 11 (2), 219-239 (2012).
- Haag, W. R., Warren, M. L., Shillingsford, M. Host fishes and host-attracting behavior of Lampsilis altilis and Villosa vibex (Bivalvia: Unionidae). The American Midland Naturalist. 141 (1), 149-158 (1999).
- Roe, K. J., Hartfield, P. D. Ham,iota a new genus of freshwater mussel (Bivalvia: Unionidae) from the Gulf of Mexico drainages of the southeastern United States. Nautilus-Sanibel. 119 (1), 1-10 (2005).
- Williams, J. D., Butler, R. S., Warren, G. L., Johnson, N. A. Freshwater mussels of Florida. , University of Alabama Press. Tuscaloosa, AL. (2014).
- Jirka, K. J., Neves, R. J. Reproductive biology of four species of freshwater mussels (Molluscs: Unionidae) in the New River, Virginia and West Virginia. Journal of Freshwater Ecology. 7 (1), 35-44 (1992).
- Watters, G. T., O'Dee, S. H., Chordas, S. Patterns of vertical migration in freshwater mussels (Bivalvia: Unionoida). Journal of Freshwater Ecology. 16 (4), 541-549 (2001).
- Richardson, F., Martínez, P. Anodonta propagation studies: determination of mussel sexual maturity and Glochidia release agents. Proceedings of the Gulf and Caribbean Fisheries Institute. 48, 535-538 (2004).
- Heinricher, J. R., Layzer, J. B. Reproduction by individuals of a nonreproducing population of Megalonaias nervosa (Mollusca: Unionidae) following translocation. The American Midland Naturalist. 141 (1), 140-148 (1999).
- Watters, G. T., O'Dee, S. H. Glochidia of the freshwater mussel Lampsilis overwintering on fish hosts. Journal of Molluscan Studies. 65 (4), 453-459 (1999).
- Hastie, L. C., Young, M. R. Timing of spawning and glochidial release in Scottish freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera) populations. Freshwater Biology. 48 (12), 2107-2117 (2003).
- Galbraith, H. S., Vaughn, C. C. Temperature and food interact to influence gamete development in freshwater mussels. Hydrobiologia. 636 (1), 35-47 (2009).
- Kobayashi, O., Kondo, T. Reproductive ecology of the freshwater pearl mussel Margaritifera togakushiensis (Bivalvia: Margaritiferidae) in Japan. Venus (Japan). 67 (3-4), 189-197 (2009).
- Shea, C. P., Peterson, J. T., Wisniewski, J. M., Johnson, N. A. Misidentification of freshwater mussel species (Bivalvia: Unionidae): contributing factors, management implications, and potential solutions. Journal of the North American Benthological Society. 30 (2), 446-458 (2011).
