Summary
在这里，提出了一个协议，以生产和后CRISPR/Cas9基因组敲除电鱼。详细列出了运动和生物形态所需的分子生物学、育种和饲养要求，以及生产 Cas9 诱导 Indel F0幼虫的注射技术。
Abstract
在脊椎动物的进化史上，电接收和电发生已经发生了变化。这些独立衍生的表型具有惊人的收敛性，它们有着共同的遗传结构。这也许最好的例证是健身房和莫米里德的众多收敛特征，这两种物种丰富的电镀层能够产生和检测弱电场，被称为弱电鱼。自从发现弱电鱼用电来感知周围环境和交流以来的50年里，越来越多的科学家对发展、系统和电路神经科学的演变有了巨大的见解，细胞生理学、生态学、进化生物学和行为学。最近，电鱼的基因组资源激增。这些资源的使用已经促进了对这些物种基因型和表型之间联系的重要见解。将基因组学数据与弱电鱼表型数据集成的一个主要障碍是目前缺乏功能基因组学工具。我们在这里报告一个完整的协议，执行CRISPR/Cas9诱变，利用内源性DNA修复机制在弱电鱼。我们证明，该协议在莫米里德物种布诺米鲁斯小虫和健身房，通过使用CRISPR/Cas9来靶向第一个外显子中的印贝和点突变，同样有效。钠通道基因scn4aa。使用该协议，从两个物种获得胚胎和基因型，以确认在钠通道scn4aa的第一个外向的预测突变存在。与未注射大小匹配的对照组相比，记录显示电器官放电振幅降低，证实了敲除成功的表型。
Introduction
在脊椎动物的进化史上，电接收和电发生已经发生了变化。两个谱系的远发鱼，骨状和硅状，平行地进化电接收，和五个谱系的远程（金体素，莫米里德，和属星体，马拉普特鲁鲁斯，和西诺多特斯）并联进化电发生。这些独立衍生的表型具有惊人的收敛性，它们共享着一个共同的遗传结构1，2，3。
这也许最好的例证是，健身房和莫米里德的众多收敛特征，这两个物种丰富的电镀层，产生和检测弱电场，被称为弱电鱼。在发现弱电鱼利用电来感知周围环境和交流的50年里，越来越多的科学家对发展的演变有了巨大的了解。 ，6， 系统和电路神经科学7，8，9，10，细胞生理学11，12，生态学和能量13，14，15，16，17，行为18，19，和宏观进化3，20，21.
最近，电鱼1、22、23、24、25、26的基因组、转录组和蛋白酶资源激增。 27，28.这些资源的使用已经产生了关于基因型和表型在这些物种1，2，3，28，29之间的联系的重要见解 ， 30.将基因组学数据与弱电鱼表型数据整合的一个主要障碍是目前缺乏功能基因组学工具31。
其中一个工具是最近开发的聚类定期间隔短帕林德罗次，与Cas9内分酶（CRISPR/Cas9，CRISPR）技术配对。CRISPR/Cas9是一种基因组编辑工具，在模型32、33、34和非模型生物体35、36、37中都广泛使用。CRISPR/Cas9技术已经发展到一个点，一个实验室能够基本分子生物学可以很容易地产生基因特异性的探针称为短导RNA（sgRNA），使用非克隆方法38低成本。CRISPR 比其他敲除/敲除策略具有优势，例如变形39、40、转录激活器样效应素核酸酶（TALEN）和锌指核酸酶（ZFN），这些策略成本高昂，为每个目标基因生成非常耗时。
CRISPR/Cas9 系统通过针对基因组的特定区域（由 sgRNA 序列引导）创建基因敲除，并造成双链断裂。细胞检测到双链断裂，并优先使用非同源端连接（NHEJ）路径触发内源性DNA修复机制。此通路极易出错：在修复过程中，DNA 分子通常会在双链断裂部位插入或删除（indels）。这些印子可能导致功能丧失，原因包括 （1） 打开阅读框架中的偏移，（2） 插入过早停止的芯子，或 （3） 基因产物的关键初级结构的偏移。在此协议中，我们使用CRISPR/Cas9编辑，在弱电鱼种中使用NHEJ来靶向目标基因的点突变。虽然比其他技术更简单、更有效，但这种诱变方法预计在F0中会产生一系列表型分裂，这归因于遗传马赛克41、42、43 ， 44.
有机物的选择
为了便于今后研究弱电鱼的比较基因组学，需要选择具有代表性的品种，用于植物体和摩尔米里德的礼仪开发。在乌拉圭蒙得维的亚举行的2016年电鱼会议上，经过讨论，社区达成共识，利用已在实验室中培育且有基因组资源的物种。健身房形式布拉奇希波姆高德里奥和莫米里德布里诺米鲁斯小球被选为符合这些标准的物种。在这两个物种中，诱导和维持繁殖条件的自然线索在圈养中很容易模仿。B. gauderio，一种来自南美洲的健身房品种，具有低饲养要求的优势：鱼可以在相对较小的（4L）水箱中保持相对较高的密度。在俘虏条件下，高德里奥也有快速的代际周转。在实验室条件下，B.高德里奥可以在4个月内从卵子发育到成人。
B. 小鱼，一种来自中西部非洲的莫米里德鱼，在圈养中繁殖容易。B. 近距离比乌斯通过水族馆贸易很容易获得，已被广泛用于许多研究，现在有一些基因组资源可用。其生命周期为 1⁄3 年，具体取决于实验室条件。对于该物种，养殖需求较为密集，由于在繁殖过程中受到攻击，需要中等大小的水箱（50–100 L）。
研究其他种类的电鱼的实验室应该能够轻松地适应这一协议，只要该物种可以繁殖，并且单细胞胚胎可以收集和饲养到成年。住房、幼虫饲养和体外受精（IVF）率可能会随着其他物种的变化而变化;然而，该协议可以作为其他弱电鱼繁殖尝试的起点。
概念验证的理想基因靶点：scn4aa
弱电虫和健美鱼通过释放一种称为电器官的专用器官产生电场（电发生）。电器官放电（EODs）是电细胞中称为电细胞同时产生作用电位的结果。EOD被皮肤中的电受体阵列检测到，以产生鱼类周围环境的高分辨率电图像45。弱电鱼还能够检测其共分物的EOD波形18及其放电速率46的特征，使EOD能够另外作为类似于鸟鸣或青蛙的社会通信信号发挥作用发声47.
在莫米里德和健力酸弱电鱼的电细胞中，作用电势生成的主要成分是电压门钠通道NaV1.42。非电电电表达两个副基因副本，scn4aa和scn4ab，编码为电压门钠通道NaV1.430。在健身房和莫米里德弱电鱼系中，scn4aaa发展迅速，经历了许多氨基酸替代，影响其动力学特性48。最重要的是，scn4aaa在电器官2、3的两个谱系中都变得分门别类。scn4aa对电器官的表达相对受限，在EOD的产生中起着关键作用，使其成为CRISPR/Cas9敲除实验的理想目标，因为它具有最小的有害性多效效应。由于弱电鱼在受精后6-8天开始排出幼虫电器官（DPF），因此，scn4aa的靶向非常适合在胚胎显注后快速表示。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 选择sgRNA靶点
注：在步骤 1.1 中为 sgRNA 的手动设计提供了一个协议。这被用于scn4aa目标选择。提供了一个附加协议，以方便此过程（步骤 1.2）使用 EFISHGENOMICS Web 门户。建议用户选择协议 1.2，它具有几个自动"检查"功能，以确保成功为自定义目标设计 sgRNA。
- 设计 sgRNA 目标。
- 对于生成 sgRNA 导板寡核苷，最好以外子 1 或其他 5' 外大子为目标。5' UTR 可以作为目标;但是，最好以 5' 编码序列为目标。利用基因组信息是可取的，但有可能使用转录组数据开发成功的sgRNA。最好使用内创/外向边界（基因组数据）或外子/外向边界。
- 从1.1的候选基因组序列被搜索到与模式5'-N（18）-NGG-3'相匹配的假定目标序列。这可以通过桌面序列分析软件、自定义脚本或通过手动检查序列自动执行。
- 序列可以使用Doench等人49的方法对靶点活动进行优先级排序。此外，目标序列可以通过BLAST搜索对基因组/转录组数据库进行评估，以便进行非目标结合。
- 确保可以生成标准 PCR 引渣，使目标序列的侧翼侧侧。引基应至少从切割位点两侧（NGG 序列上游的三个碱基）提供 20 bp。理想情况下，PCR 产品应为 150-200 碱基对 （bp）。
- 使用以下模板设计符合上述标准的寡头，其中包括 T7 启动器（N18的 5'）和用于退火到恒定寡头（1.1.6）：5' - TAATACGACTCACATATATATG-N 18 的补充区域（N18的 3'）-GTT塔格塔格塔格塔格-3'
注：N18序列不包括 NGG 原垫器相邻图案 （PAM） 序列。请勿在寡头中包含此内容。 - 将用于合成所有sgRNA、用于sgRNA目标的寡聚物（步骤1.1.5）和PCR底漆（步骤1.1.4）作为寡核苷酸生产服务中的标准脱盐寡聚物排序。寡聚物和PCR引物可订购为标准脱盐寡聚物，无需额外纯化。
- 执行sgRNA目标的自动化设计。
- 使用基因组数据，选择目标基因。当已知外向/intron 边界时，可以使用转录组数据。可以使用 EFISHGENOMICS 门户 （http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu） 确定目标。理想目标将在外大1内;但是，可以考虑其他 5' 外大和 5' UTR。
- 确定目标序列后，加载可免费提供的 EFISHGENOMICS CRISPR Web 工具 （http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/）。此 Web 工具使用 CRISPOR 算法的自定义版本，用于目标第50、51。
- 在步骤 1的框中，输入序列的名称，并将目标序列输入到相应的框中。
- 选择序列派生的相应基因组。目前，基因组数据可供B.brachyisus和B.高德里奥使用。使用此工具不需要基因组序列，但可用于评估潜在的不需要的离目标效应。
- 选择相应的 PAM。建议使用 20 bp-NGG PAM，但根据所使用的 Cas9 蛋白质，有几个额外的 PAM 图案可供选择。
- 将生成一个报告，其中的目标序列在基因组中的位置与建议的引导序列。选择预测出目标效应低、特异性得分高、效率高的三个目标。得分最高的参考线在左侧以绿色突出显示。如果可能，应避免使用黄色和红色突出显示的引导序列。
- 单击选定的目标序列可生成全面的 CRISPOR 报告。这些报告的关键信息是"重叠寡核苷酸的T7体外表达"。从本报告中提取以下信息：推荐的sgRNA寡聚物、目标位点PCR引物以及用于合成所有sgRNA的恒定寡聚物。
- 从寡核苷酸生产服务中订购选定的寡聚物（步骤 1.6）。寡聚物和PCR引物可订购为标准脱盐寡聚物，无需额外纯化。
2. 生成 sgRNA
- PCR 管中的抗性寡聚物：添加 1 μL 的 100 μM 恒定寡聚物，1 μL 100 μM sgRNA 特异性寡聚物，以及 8 μL 无核酸酶 H2O
- 热循环器中的无核寡聚物具有以下程序：在 95°C 加热 5 分钟，在 -2 °C/s 下冷却至 85°C，在 0.1 °C/s 下冷却至 25°C，并在 4°C 下保持。
- 要生成 sgRNA 模板，从步骤 2.2 向退火寡聚物添加 2.5 μL 的 dNTP 混合物 （10 mM）、2 μL 10x 缓冲液、0.5 μL T4 DNA 聚合酶和 5 μL 无核酸酶 H2O。在12°C下孵育20分钟。
- 根据制造商的说明，使用 PCR 清理列纯化模板。
- 在20~30μL中洗升。使用分光光度计估计浓度和纯度。模板应为 100*200 纳克/μL 和 1.8*1.9 A260/280。
- 通过运行 1⁄5 μL 通过胶凝剂验证。主导频段应为 120 bp。有关代表性结果，请参阅图 1A。
- 将凝胶验证的sgRNA模板储存在-20°C（长期）或4°C（短期，1⁄4周）。
- 使用T7 RNA转录试剂盒，在室温8μL dNTP混合物（dA、dT、dG、dC、dC等体积）、2μL10x缓冲液（室温）、2μL T7 RNA聚合酶、100~200 ngssrna模板下加入1.5 mL微离心管和无核酸酶的H2O到20μL的总体积。旋转以在底部收集。在37°C下孵育2⁄4小时。
-
加入1μL的DNase，在37°C下再孵育15分钟。
- 通过加入1μL的糖原、30μL的无核酸酶H2O、30μL的5M醋酸铵和180μL的100%EtOH到转录的sgRNA来清除sgRNA。混合良好，在-80°C（直到冷冻）或-20°C过夜孵育至少20分钟。以最高速度在 4°C 下离心 15 分钟。
- 去除和丢弃上清液，而不干扰颗粒，并在-20°C下用1mL的无RNase 70%EtOH冷冻洗涤。在 4 °C 下以最大速度再旋转 5 分钟。
- 在不干扰颗粒的情况下取出并丢弃上清液，并风干颗粒 5 分钟。
- 在30 μL无核酸酶H2O中重新悬浮，并使用紫外线光谱确定纯度和产量（最低收率为200纳克/μL）。
- 验证无RNase凝胶上是否存在sgRNA。由于二次结构（图1B），sgRNA以两个波段出现在50至150 bp之间。
- 等位到3μL，储存在-80°C。
3. 在Vitro中验证切割效率
- 使用商业DNA提取试剂盒从目标物种中提取基因组DNA。文心鳍剪可以不用牺牲鱼，因为组织是再生的。
- 使用标准PCR使用步骤1.6和1.7中所述的引种，放大目标DNA区域。通过凝胶电泳验证产品。建议对片段进行测序，以确保对适当的区域进行放大，但没有必要。scn4aaa模板的代表性结果如图2所示。
- 使用已建立的实验室或公司协议清理 PCR 片段。
- 将扩增的DNA储存在-20°C。考虑将其分离为等分，以减少冻融周期。
- 确定每个组件所需的数量和数量。考虑运行阴性对照（不包括sgRNA或Cas9）和阳性对照（先前测试的sgRNA，可将其目标PCR扩增DNA）以及sgRNA的浓度系列。
-
在室温下按指定顺序在PCR管中设置以下反应混合物，在室温下加入sgRNA和Cas9蛋白，最终获得最佳效果：目标DNA PCR产物50-100 ng，1μL10x缓冲液3，1μL10x BSA（0.1 g/mL），50-200 ng 的 Cas9 蛋白质（建议 1 毫克/mL，150 纳克），30–200 纳克 sgRNA（建议 100 ng）。
- 在37°C下孵育反应1小时，然后在65°C孵育10分钟，使Cas9蛋白灭活。
- 在 2%~3% 的甘蔗凝胶（预期带大小在 30-200 bp 之间）以及正负对照下运行整个样品。成功的裂解可能显示一些PCR产品，但也将有两个较小的带。代表性结果如图2所示。
4. 获得胚胎
注：获得弱电鱼的胚胎可能具有挑战性。仔细监测水质、充足的鱼类护理时间和定期喂养是成功繁殖计划的关键。如协议步骤 4.1 所述，鱼必须先为繁殖提供几个星期的条件。在此之后，提出了一种增强自然发育（4.2）用于自然产卵行为（4.3）的协议，这是最近开发的一种用于获得精确时间胚胎（4.4）的体外技术。协议4.3对B.tchyistius和B.高德里奥同样有效，协议4.4在B.高德里奥中是优越的。
- 调节
- 在夫妇/小团体（100~150 L储罐）或非常大的水箱（约475升罐中2只雄性和5-6只雌性）中保持B.胸状体，因为它们在繁殖条件下变得非常具有攻击性。每条鱼至少应有1⁄2个PVC管作为避难所（图3A，B）。
- 高德里奥的饲养密度要高得多。在 100 L 水箱中最多保留 8 个人（2 名男性和 6 名女性）。每条鱼至少应该有1个PVC管作为避难所。添加缠绕纱线可增加富集和隐藏点。将50 mL的离心管与1厘米直径的孔钻到罐的顶部，让成年人自然生成到管（图3C）。
- 在繁殖季节，饲料鱼每天新鲜黑虫补充冷冻血虫。如果需要，食物可以富含维生素和补充剂。
- 室内鱼通常以相对较高的导电性（300~600μS），pH平衡溶液。在繁殖季节，在1~3周内，逐渐降低电导率至少一半，从而诱导腺再发和产卵。通过每天添加反渗透 （RO） 水降低电导率，在电导率低时密切注意 pH 值（pH <6）。
- 繁殖条件可以保持约3~5个月，卵生产逐渐减少。在此时间之后，在 1⁄3 周内缓慢返回高导电性。在再次暴露于育种条件之前，在高导电性下再保持 3 个月。
- 使用产卵剂（斯格尼亚 + 多佩里酮）注射。
- 识别在繁殖条件下出现肉汁的雌鱼（图4）。在B.高德里奥，女性将有肿胀的戈托，只是向通风口。B. 小腹女会有肿胀的肚子，并出现深体 （图 4A）。男性通常没有产生精子的问题。然而，较大的男性是首选，因为收集的精子量较大。
注：产卵剂是一种商业激素混合物，促进配子的成熟和协调产卵。如果鱼过去曾注射过产卵剂，则允许在注射之间休息4周，并充分喂食。我们建议至少注射2名男性和4-5名女性，以确保一些卵子和大量的精子。 - 麻醉鱼在MS-222（0.4 g/3 L）几分钟，直到鱼不能保持其姿势，是不动的，但继续有操作运动（阶段II53）。
- 称量鱼（g）以计算产卵剂量，（0.5 μL/g） = 0.5 μL。额外的 0.5 μL 可说明移液错误。
- 将生成剂添加到 PCR 管中的 4x 缓冲液（1x PBS 或 DPBS）中，并混合均匀。解决方案将变得多云。它有助于将产卵剂分配到热塑性塑料上，然后使用移液器测量计算的剂量。产卵剂是粘性的，所以一定要分配整个剂量，并小心移液。
- 将注射溶液移至热塑性塑料上，并放入精密玻璃注射器中，避免气泡。我们建议使用 28 G、19~25 mm 长度的带刺针。
- 以平滑的速度将溶液注射到背肌中。让针头坐2⁄4s，然后取出。立即将鱼放入淡水中进行回收。
- 准备收集胚胎约24小时后（见4.3或4.4）。收集所有必要的材料，包括单细胞微注射所需的材料（参见第5节）。
- 识别在繁殖条件下出现肉汁的雌鱼（图4）。在B.高德里奥，女性将有肿胀的戈托，只是向通风口。B. 小腹女会有肿胀的肚子，并出现深体 （图 4A）。男性通常没有产生精子的问题。然而，较大的男性是首选，因为收集的精子量较大。
- 通过自然产卵获得胚胎。
- 房子产卵剂注入成人 （4.2） 在一个大的 450 L 坦克.最有效的性别比例通常是1⁄2男和3⁄4名女性，它们有足够的藏匿处，由PVC管制成，在罐底有深色大理石基板，以防止鸡蛋消费。大理石通常比B.高德里奥更重要，后者喜欢将粘鸡蛋沉积在缝隙或50 mL离心管中，如上所述。
- 将鱼置于反向光循环中，使夜间产卵与常规实验室工作时间相匹配。使用现成的消费者级安全系统，使用红外照明监控鱼类，以尽量减少来自远程连接 PC 的干扰（图 3）。
- 鱼将在产卵剂注射后约24小时的黑暗光周期内自发产卵。
- 当产卵开始时，在产卵行为发生时每小时收集鸡蛋。在B. 胸罩中，使用小直径虹吸管在细棉网上收集鸡蛋，以尽量减少对新鲜产卵的卵子的损害。从 50 mL 离心管或罐基板中收集高迪里奥蛋。使用具有低强度红灯的头灯，高效工作，对产卵鱼的干扰最小。由于第一次裂解发生在受精后约1小时（HPF），大量卵子将适合单细胞显微注射。
- 立即进行显微注射（见第 5 节）。
- 挤压雄性进行B.高德里奥体外受精。
- 准备精子扩展液（SES），如斑马鱼书54所述：10mM HEPES，80 mM KCl，45 mM NaCl，45 mM醋酸钠，0.4 mM CaCl2和0.2 mM MgCl2。
- 使用 ddH2O 可调节音量，并使用 1 M NaOH 将 pHH 调整为 7.7。
- 存放在冰箱里。
- 使用前，可通过 0.22 μm 过滤器进行过滤。
- 麻醉鱼在MS-222（0.4 g/3 L）几分钟，直到鱼不能保持其姿势，是不动的，但继续有操作运动（阶段II53）。将 500 μL SES 等分放入冰中。
- 彻底干手和鱼，特别是在头部和通风口周围。将腹腔侧向上放置，左前（右手）放在聚苯乙烯泡沫/海绵支架中，覆盖在 MS-222 浸泡的湿纸巾中。头部应尽可能与表平行。
注：步骤 4.4.4_4.4.6 应尽快完成，并且鱼只能出水 30-60 s。 - 在牛圈中向玫瑰方向施加压力，光线在风口向气孔上均匀挤压。鱼可以排出废物。如果任何废物被排出，请小心用精细的任务擦拭清洁通风口。不要用精子收集废物。根据公份的大小，10-60 μL 是常见的。
- 使用带尖端的微管器，小心地收集精子，因为它被挤压从男性50μL增量。将精子直接放入冰上500μL等分的SES中。它可以帮助另一个研究人员帮助收集精子，而其他挤压。精子应尽快使用，但至少1小时仍然可行。
- 收集后，立即将鱼放入新鲜的系统水中进行回收。鱼只应在30-60岁出水。
- 准备精子扩展液（SES），如斑马鱼书54所述：10mM HEPES，80 mM KCl，45 mM NaCl，45 mM醋酸钠，0.4 mM CaCl2和0.2 mM MgCl2。
- 挤压女性进行B.高德里奥体外受精。
- 麻醉鱼在MS-222（0.4 g/3 L）几分钟，直到鱼不能保持其姿势，是不动的，但继续有操作运动（阶段II53）。将聚四氟乙烯片放在工作站上。
注：第 4.5.1~4.5.5 节应尽快完成，并且鱼只能出水 30-60 s。 - 干手、工具、聚四氟乙烯片和鱼彻底，特别是在头部和通风口周围。侧与头朝前（右撇子个人）。
- 在牛圈中向玫瑰方向施加压力，光线在风口向气孔上均匀挤压。鱼可以排出废物。如果任何废物被排出，请小心用精细的任务擦拭清洁通风口。根据鱼的大小，20-150个鸡蛋是常见的。使用聚四氟乙烯涂层铲子/工具小心收集鸡蛋，因为他们被挤压从氯卡。快速将鸡蛋移到小培养皿和盖上。在此过程中，确保鸡蛋保持干燥。或者，挤压后，将鸡蛋质量触摸到小培养皿的底座或聚四氟乙烯片，因为它们从雌性中排出。
- 收集后，立即将鱼放入新鲜的系统水中进行回收。
- 麻醉鱼在MS-222（0.4 g/3 L）几分钟，直到鱼不能保持其姿势，是不动的，但继续有操作运动（阶段II53）。将聚四氟乙烯片放在工作站上。
- 对B.高德里奥进行卵子受精。
- 在SES中直接在卵子质量上添加100μL的混血精（参见步骤4.4）。
- 加入 1 mL 的系统水（通过 0.22 μm 过滤器过滤），并混合 30-60 s。
- 添加额外的 1⁄2 mL 系统水（在培养皿中留出一些空间）并放入培养箱中。在培养皿上记录IVF的时间，并移动到29°C培养箱。设置一个 50 分钟的计时器来检查发育进度（例如，在动物极点形成单个细胞，参见图 6）。在此期间，准备用于显微注射的材料。
5. 单细胞微注射
- 在产卵剂注射（步骤 4.2）或自然产卵（步骤 4.3）之前拉显微注射针。使用带细丝（O.D. 1.0 mm，I.D. 0.58 mm，10 cm 长）的硼硅酸盐玻璃毛细管和针拉器拉显显微注射针。每计划进行治疗注射准备2⁄4针。
注：最好使用灯丝回装针头，因为灯丝将溶液向尖端倾斜并消除气泡。然而，可以使用没有灯丝的针头，前重装不应对结果产生影响。针应该有一个长，但坚固的拉长。使用具有以下规格的拔针程序作为起点：热 = 500;拉力 = 70;速度 = 70;时间 = 100。代表性针形图5A所示。 - 准备注射液和准备针头。
- 在PCR管中加入0.9 μL的sgRNA和0.9 μL的Cas9酶（1mg/mL）至0.2μL的10%或100%苯酚红（分别为1%和10%最终苯酚红浓度）。混合好，让坐冰上2⁄5分钟，让sgRNA和Cas9复杂。计算注射溶液中sgRNA、Cas9和苯酚红的最终浓度。
注：如果使用上述配方，针堵塞或切割效率有问题，使用 1x 最终浓度盐/缓冲液混合物来稳定 Cas9 并防止针头堵塞可能很有用。 - 使用微装载机移液器尖端将 2 μL 溶液回加载到显微注射针中。将液体尽可能靠近尖端。
- 将针头加载到微操作器中并设置压力设置（从 775 p i、0.1+0.2 s 和 8-12 pc开始）。
- 在范围下，使用一对细钳以斜角折断针尖。断裂到针的条带开始有刚度的地方。最好在靠近尖端的地方休息，测试注射溶液的大小，然后在必要时进一步断裂。针孔应保持尽可能小，同时保持刚性的拉子（图5A）。
- 使用矿物油和千分尺测量注射溶液的大小。通常使用 1⁄2 nL;0.1 毫米直径为 0.5 nL。
- 调整针头或压力设置，使注射量在规格范围内。
- 在PCR管中加入0.9 μL的sgRNA和0.9 μL的Cas9酶（1mg/mL）至0.2μL的10%或100%苯酚红（分别为1%和10%最终苯酚红浓度）。混合好，让坐冰上2⁄5分钟，让sgRNA和Cas9复杂。计算注射溶液中sgRNA、Cas9和苯酚红的最终浓度。
- 识别发育的酶，并准备注射阶段。设置喷射阶段。拿一个直径100毫米的培养皿。反转底部并放置在倒置顶部下方。将玻璃显微镜幻灯片放在倒置顶部。根据将微操作器安装到示波器的范围，可能不需要从倒置底座添加高度。
- 观察发育中的卵子，在IVF后50-60分钟识别假定的受精酶。动物杆将开始形成，在蛋黄/动物细胞界面周围会有多余的小脂肪滴（图6）。
- 用塑料转移移液器收集10-20个鸡蛋，用尽可能少的水收集（稍微切掉尖端，让鸡蛋通过），然后放在滑道的边缘。水在滑梯下是邪恶的，把鸡蛋拉到边缘。
- 使用精细的任务擦拭并轻轻按压滑轨以去除多余的水，让鸡蛋牢固地粘附在滑道边缘。应该有足够的水，以保持鸡蛋湿润，同时保持很少的站立水分，以避免注射期间鸡蛋运动。
- 直接注射到单个细胞中。
- 将鸡蛋垂直地对准滑轨，垂直于接近的针头（图5B）。
- 使用微操作器，将针放在胆囊上。以大约 45° 角，将针头插入胆囊，然后插入单个细胞。通过蛋黄进入单个细胞会很有帮助。用自由手和微操作器移动注射阶段，可以提供更多的对注射过程的控制（图5B）。
- 将sgRNA/Cas9/酚红色溶液注射到单细胞中。小心地取下针头。继续下一个卵子，重复步骤5.4.1~5.4.3，直到注射所有卵子。
- 用细钳去除注射过程中碎的鸡蛋。在喷瓶中使用 0.22 μm 的过滤系统水，将鸡蛋从注射阶段轻轻取出，放入新的直径为 100 mm 的培养皿中。
- 重复步骤5.3.3~5.4.6，直到所有卵子都注射或发育到双细胞阶段。确保留出大约20个假定受精卵作为无注射控制，以确定受精率和注射成功。对于较大的离合器，使用已发育到双细胞阶段的未注射胚胎，以及用于留出假定受精卵的较小离合器。
- 此外，考虑sgRNA/注射控制，通过注射15-25个胚胎与Cas9复合与sgRNA对基因不存在的基因组。推荐用于野生型胚胎的GFP基因。记录每个培养皿上的卵子数量、父母、IVF 时间和日期。包括 sgRNA 目标或标签作为未注射。移动到 29 °C 培养箱。
6. 畜牧业
-
照顾鸡蛋。
- 注射后检查鸡蛋的生存能力4~6小时。
- 记录死蛋的数量，以及任何未受精的卵子数量。未受精的卵子会围绕八细胞阶段进行阻扣，并在动物杆处有细胞的玫瑰花纹（图6）。根据死蛋的数量和水中的蛋碎片数量，至少去除50%~80%的水，用过滤过的系统水代替。如果形成细胞碎片膜或生物膜，擦洗培养皿底部会很有帮助。
- 在接下来的2~3天里，每天检查鸡蛋1~2次。每次检查鸡蛋时，重复步骤 6.1.2~6.1.3。
- 2~3天后幼虫将孵化。在蛋壳孵化时取出它们。温和的移液可以帮助释放半孵化的幼虫。
-
照顾幼虫。
- 每天检查鸡蛋1⁄2次。每次检查幼虫时，重复步骤 6.1.2~6.1.3。
- 从 6-14 DPF，喂醋鳗到幼虫。食物稍微过剩是有好处的，因为醋鳗在盘子里会存活下来。每次检查和清洁盘子时，加入醋鳗。
- 从 11–14 DPF 起，除了醋鳗之外，每个幼虫添加 5~10 只刚孵化的Artemia。在此期间，幼虫将学会吃自由游泳艺术血症。
- 在 15 DPF 时，将幼虫移到装有流动水、过滤和曝气的水箱中（参见第 6.2.5 节）。每杯的胚胎不应超过25个。蛋杯是塑料杯，底部有网状网。一个100毫米的培养皿顶部/底部可以添加到蛋杯的底部，以帮助阻止食物从网眼下降。出于水质原因，蛋杯允许鱼在更大的体积水中存放，同时保持离散的组。从15-18日起，继续添加醋鳗和15~30只刚孵化的阿特血症。每天清洁培养皿，并使用移液器去除大量死亡的Artemia。
- 从18-30天起，只喂食刚孵化的Artemia。增加喂食量，因为鱼生长，如果尾巴咬人。
- 大约 30 天后，将鱼移到 10 L （2.5 加仑） 的水箱中，每个水箱大约 25 人。确保有过滤、曝气和藏匿处。考虑圆柱形生物过滤介质和小直径 PVC 管。
- 从大约30-45天起喂养刚孵化的动脉血症和黑虫。保持水箱的标准清洁和改水（即每周至少更换 10%~20%水）。
- 在 +45 DPF 后，仅喂食黑虫，直到 +60 DPF。
- 在 +60 DPF 后，将大约 15 条鱼的队列移动到 40 L（10 加仑）水箱，并开始成人饲养程序。添加PVC管和纱线"mop"（一团棕色纱线绑在软木塞周围）用于隐藏的地方（图3C）。受精后约3~4个月后，鱼类应接近繁殖尺寸（10~12厘米）。
7. 成人畜牧业
- 每天用足够的黑虫喂鱼，这样在下一次喂食时就有少量的黑虫。这种自由喂养允许最大的生长。
- 每周几次，它可以帮助补充黑虫喂养与血虫。
- 每 2⁄4 周清洁一次储罐，换水率为 20%-30%。如果纱拖把充满生物膜/藻类，在RO水下擦干净。
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Representative Results
sgRNA靶点位于B.gauderio和B.b.brachyisus的scn4aa的外量1内，如第1节所述。sgRNA 的生成情况如下，如第 2 节所述。在成功选择和合成sgRNA（图1）后，对体外裂解进行了测试（图2）。然后选择在体外切割的sgRNA进行单细胞显微注射。
成年鱼被以繁殖为条件（第4.1节），然后注射产卵剂（第4.2节），然后挤压（B.gauderio）进行IVF，如第4.4节所述，或允许自然产卵（B.b.b.b.b.b.b.b.tius），如第4.4节所述。第 4.3 节中所述。这些努力产生了单细胞胚胎，用于两个物种的显微注射。如第5节所述，在单细胞阶段注射scn4aa sgRNA/Cas9/酚类红色复合物的1.5~2.0 nL（65-190纳克/uL sgRNA，450纳克/uL Cas9，1%~10%酚类红，最终浓度）。同一离合器的鸡蛋被用作未注入的控制装置。所有胚胎都得到第6节所述的护理。继试管婴儿后，40%-90%的卵子受精，70%~90%的胚胎存活至注射后孵化。
约75%的鱼存活到6-11 DPF，然后表型。拉瓦尔鱼被放置在一个35毫米的培养皿嵌入一个更大的菜与西尔加德固定Ag/Cl记录电极（图7A）。胚胎运动被限制使用3%的甘蔗模型与系统水制成，并切割适合胚胎（图7B）。两个物种都使用相同的记录室，在物种比较中使用相同的甘蔗霉菌。胚胎被记录为60，这足以捕获数百个EOD。选择了年龄和大小匹配的未注入控件进行比较。此时，10%-30%的存活胚胎的振幅EOD降低。胚胎显示减少EOD振幅，没有明显的形态缺陷和控制未注射的整个胚胎被消化DNA提取和随后的PCR的scn4aa目标位点。现象型通常存在一系列渗透，有些个体的EOD振幅比其他人有更强的降低。
在PCR清理和克隆后，从每个胚胎中挑选出30多个克隆进行桑格测序。CRISPR/Cas9诱导突变在B.高德里奥（图8A，B）和B.胸（图9A，B）个体中被识别为具有强烈EOD振幅降低（图8C和图9C），分别），其中未注入的对照只有参考基因型。确认突变体（"CRISPR"）与年龄/大小匹配未注入对照之间的EOD振幅可视化表明，scn4aaa突变体B.brachyisus（图10A）和B.gauderio（图10B）） 胚胎的EOD振幅明显低于对照组（p <2.2 x10-16，韦尔奇双样本t-测试）。CRISPR/Cas9针对scn4aa在B.brachyistius和B.高德里奥和暗示scn4aa在幼虫/早期电细胞放电在这两个物种中都取得了成功。
图1：sgRNA模板合成和转录。（A） sgRNA模板合成的凝胶图像.标签对应于不同sgRNA的myod（MYO2，MYO1）和三个sgRNA为scn4aaa（S1+S3）。退火后，将生成 ±120 bp 模板。（B） 为B. gauderio （bg2017） 和 2 个b. brachyistius （bb2016， 2017） 的 sgRNA 转录的凝胶图像。由于二次结构，sgRNA将显示为两个带，使用dsDNA阶梯时将介于50-150bp之间。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：成功（sg1）和不成功（sg2）体外CRISPR测定的代表性凝胶图像。在 scn4aa 通道中显示一个等效数量的模板，没有 CRISPR 组件。请注意 sg1 中显示已发生切割的重复带。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：弱电鱼的养殖罐设置。（A） 生成行为无线视频监控的典型设置的架构。三个市售的闭路电视摄像机（Swann， Inc.）能够生产红外光，它们瞄准了水的顶部，并连接到数字录像机（DVR）。实时监控视频，以从网络连接的计算机 （PC） 监控相邻房间中的生成行为。（B） 用这种设置捕获的生成行为在B. tchyistius中捕获。（C）一种典型的育种设置，用于聚氯乙烯隐藏管和纱线拖把。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：繁殖雄性与雌性。（A） B. 小贝和（B）高德里奥.这两种物种都是性畸形的，在性成熟时很容易在视觉上区分。两位女性在这些照片中都很肉汁，表现出典型的肿胀的肚子，里面装满了成熟的鸡蛋。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：微注射。（A） 玻璃毛细管针尖必须破碎，才能提供适当的显微注射体积.左边的提示是不间断的。中间和右侧的尖端被一个稍微倾斜的斜面折断，以刺穿蛋鸡。（B） 鸡蛋在玻璃滑梯上衬里（1%~10%苯酚红色作为示踪剂，以可视化注射的输送），并注射玻璃毛细管针。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：发展阶段。（A）高德里奥和 （B） B. 布奇西乌斯.所有卵子均假定受精，发育监测到24 HPF。12-24个HPF胚胎在活卵中可见，否则卵子会表现出降解。无论受精如何，在卵子激活上似乎都会发生几个分裂。未受精的卵子表现出不寻常的裂解模式，在受精卵中更对称。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：本研究中使用的幼虫记录室照片。（A） 电极嵌入 Sylguard 中，但延伸到包含通过 3% agarose 霉菌限制的胚胎的 35mm 盘中。（B） 更高的放大倍率图像，突出由于角突起而受胚胎限制的运动。注意当胚胎改变大小时可以去除的甘蔗片。B. 高迪里奥胚胎面向正极。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：CRISPR/Cas9诱导突变在B.高德里奥。（A） 在单个scn4aa靶向 F0B. 高迪欧胚胎 （11 DPF） 中，来自 Cas9 诱导突变的基因组 DNA 的 32 个克隆序列。参考序列下划线，sgRNA 目标位点以灰色突出显示，原间隔器相邻主题 （PAM） 序列以红色突出显示，Cas9 切割位点标有"|"。给出了预期野生类型序列的变化，并在括号中给出了每个序列的克隆数。（缩写： = 插入， - * 删除， * * * indel）任何非 CRISPR 关联的序列差异都加粗。图为以Jao等人60为模型。（B） 氨基酸序列预测从scn4aa的序列克隆从 （A.来自野生类型序列的Cas9诱导变化以红色突出显示，给出核苷酸引起的变化数。（C） 来自五个大小匹配幼虫的二十二次电录，均在同一录音室中录制了6个DPF。所有跟踪的增益设置都相同。红色痕迹来自B.高德里奥幼虫，具有确认突变（上图8A，B所示为一人），黑色痕迹来自未注射的B.高德里奥幼虫。总体而言，CRISPR/Cas9编辑scn4aa显示EOD振幅下降，尽管效果是异构的。请点击此处查看此图的较大版本。
图9：CRISPR/Cas9诱导突变在B.小白症。（A） 在单个scn4aa靶向 F0B. 胸骨胚胎 （11 DPF） 中，Cas9 诱导突变的基因组DNA中的 42 个克隆序列。参考序列下划线，sgRNA 目标位点以灰色突出显示，原间隔器相邻主题 （PAM） 序列以红色突出显示，Cas9 切割位点标有"|"。给出了预期野生类型序列的变化，并在括号中给出了每个序列的克隆数。（缩写： = 插入， - * 删除， * * * indel）任何非 CRISPR 关联的序列差异都加粗。图为以Jao等人60为模型。（B）从scn4aa敲除B.小贝西乌斯（A ）的测序克隆中预测的氨基酸序列。来自野生类型序列的Cas9诱导变化以红色突出显示，并给出核苷酸诱导的变化数。（C） 来自四个大小匹配幼虫的十秒电录音，均在同一记录室中记录 10 DPF。所有跟踪的增益设置都相同。红色痕迹来自B.小虫，有确认突变（以上A、B所示为一人），黑色痕迹来自未注射的B.小虫。总体而言，CRISPR/Cas9编辑scn4aa显示EOD振幅下降，尽管效果是异构的。倒置的 EOD 来自记录期间鱼类改变方向。尽管如此，实验鱼和对照组之间还是没有明显的区别。请点击此处查看此图的较大版本。
图 10：CRISPR 平均 EOD 振幅和未注入大小/年龄匹配的同级的框图。（A） 在 10 DPF 处的B. 小虫的 EOD 振幅.记录增益为 100，CRISPR n = 来自两个人的 56 EOD，三个人的未注入 n = 114 EOD。（B） 在 6 DPF 处的B. 高德里奥幼虫的 EOD 振幅.CRISPR n = 2 人 34 EOD，未注入 n = 3 个人的 148 EOD。CRISPR鱼的振幅明显小于未注射的对照组（p <2.2 x10-16，韦尔奇双样本t-测试）。所有个人都用图7中描述的记录室进行记录。请点击此处查看此图的较大版本。
| 描述 | 序列 | |
| 恒定寡头 | 5' - AAAAGCACCGACACACACAAAAAC-3' | |
| 目标寡聚主干（GG-N18，无 PAM） | 5' - 塔塔格塔塔格-N18-GTT塔格塔格塔格-3' | |
| 目标寡聚主干（N20，无 PAM） | 5' - TAATACGACTACTAAAAAT-N20-GTTTTAGAAAAAAAG-3' | |
| 布蕾诺米鲁斯·布奇西乌斯 | ||
| scn4aa bb sgRNA 靶点 （N18，带 PAM）： | 5' - TTTCCGCCCCCACCACGG-3' | |
| Scn4aa bb sgRNA 寡聚物 （GG-N18）： | 5' - TAATACGATCACATATAGTTCCCCCTATAGTTAGAAAAAAAAG-3' | |
| scn4aa Bb PCR 底漆 （218 bp） | ||
| Scn4aa_bb_exon1_F： | 5' - ATGGCCGCCTCTCAATA-3' | |
| Scn4aa_bb_exon1_R： | 5' - TCTCCCGGATATATATATATATATAACT-3' | |
| 布拉希希波穆斯·高德里奥 | ||
| Scn4aa Bg sgRNA 靶点 （N17，带 PAM）： | 5'- CAAGAGGATGGGG-3' | |
| Scn4aa Bg sgRNA 寡聚物 （GG-N17）： | 5' - 塔塔格塔格·阿加加格格格格格格格格格格·塔格塔格塔格塔格-3' | |
| Scn4aa Bg PCR 底漆对 （204 bp） | ||
| scn4aa_bg_exon1_F： | 5'-CGCCTCTCTCTCTCTCT-3' | |
| scn4aa_bg_exon1_R： | 5'-ATCTCTGCTCTCTCTCT-3' | |
表1：协议所需的橄榄核苷酸。
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Discussion
弱电鱼的表型丰富性，加上最近基因组学资源的扩散，激发了弱电鱼模型中对功能基因组工具的强烈需求。该系统特别有吸引力，因为鱼类平行谱系中许多型特征的收敛进化，这些特征很容易保存在实验室中。
此处描述的协议演示了 CRISPR/Cas9 技术在同时进化电成和电接收的弱电鱼谱系中的有效性，因此代表了该模型承诺解决的一个重要步骤表型进化的比较基因组学的未来工作。
这种简单的方法方法只需要基本的分子生物学技能和训练，在基本采用Gagnon协议38，广泛用于斑马鱼。值得注意的是，随着技术的进步，有更多的商业套件用于sgRNA生产，以及公司可以合成指导RNA，使缺乏分子生物学经验和设备的实验室更容易获得该协议。我们首先注意到，高诱变效率允许直接对注射幼虫进行附型。然而，似乎有相当程度的型画马赛克主义，这是不常见的，并与文献41，42，43，44。例如，在scn4aa研究中，一些携带突变的个体表现出比相对沉默的其他人大得多的振幅EOD（图7，图8）。目前还不清楚有多少这些突变被带入生殖系。今后立即的努力将着眼于建立稳定的突变线。
利用NHEJ路径进行敲除只是CRISPR/Cas9基因编辑的几个潜在应用之一：这里概述的方法是更高级应用的垫脚石55，56。今后的努力应旨在设计与sgRNA/Cas9复合物共同注入的DNA供体模板。这种简单的修改将利用基于模板的内源性修复机制（即同源定向修复或 HDR），并允许精确的敲击。虽然HDR的发生效率低于NHEJ方法，但已取得进展，以提高其有效性57，58。这种较低的效率将需要努力优化DNA供体模板/CRISPR/Cas9结构的设计，提高内源修复机制的效率，并增加胚胎生产（见下文）。如果这个效率问题可以解决，可以使用敲丁来添加荧光标记，表达基因产物的突变形式，或改变促进剂或增强剂序列。
虽然这种技术背后的分子生物学是相当直接的，畜牧业的要求是实质性的，但不是不可逾越的。B. 高德里奥是广泛可用和繁殖足够快，任何研究项目有一个殖民地在一年。相比之下，B. tchyistius发育缓慢，解剖学特征已证明试管婴儿的尝试迄今没有成功。其他较大的物种，如坎皮洛莫米鲁斯59可能更有利于这种方法。对于B.brachyisus来说，所有注射的胚胎都是利用自然产卵方法收集的，这种人工密集程度要大得多。今后努力提高B.b.b.小试管婴儿的效率，将使胚胎产量提高，用于上述效率问题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢莫妮卡·卢卡斯、凯瑟琳·肖、瑞安·泰勒、贾里德·汤普森、妮可·罗比乔和霍普·希利在鱼类养殖、数据收集和早期协议开发方面所付出的英勇努力。我们还要感谢三位审评员对手稿的建议。我们相信，在发表他们的意见后，最终产品的质量会更好。这项工作由美国国家科学基金会#1644965和#1455405资助，并资助了自然科学和工程研究理事会向VLS提供DG赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10x NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
References
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