Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60253
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.

Abstract

Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen. Dit wordt misschien het best geïllustreerd door de talrijke convergente kenmerken van gymnotiforms en mormyrids, twee soortenrijke schip-clades die zwakke elektrische velden produceren en detecteren en zwak elektrische vissen worden genoemd. In de 50 jaar sinds de ontdekking dat zwak elektrische vissen elektriciteit gebruiken om hun omgeving te voelen en te communiceren, heeft een groeiende Gemeenschap van wetenschappers enorme inzichten opgedaan in de evolutie van ontwikkeling, systemen en circuits neurowetenschappen, cellulaire fysiologie, ecologie, evolutionaire biologie, en gedrag. Meer recentelijk is er een wildgroei van genomische middelen voor elektrische vissen. Het gebruik van deze middelen heeft al belangrijke inzichten vergemakkelijkt met betrekking tot het verband tussen genotype en fenotype bij deze soorten. Een belangrijk obstakel voor de integratie van genomics-gegevens met fenotypische gegevens van zwak-elektrische vissen is een aanwezig gebrek aan functionele genomics-instrumenten. We rapporteren hier een volledig protocol voor het uitvoeren van CRISPR/Cas9-mutagenese die gebruik maakt van endogene DNA-herstelmechanismen in zwak elektrische vissen. We tonen aan dat dit protocol even effectief is in zowel de mormyrid-soort Brienomyrus Brachyistius als de gymnotiform Brachyhypopomus GAUDERIO door crispr/Cas9 te gebruiken om indels en puntmutaties te richten in de eerste Exon van de natrium kanaal gen scn4aa. Met dit protocol werden embryo's van beide soorten verkregen en gegenotypeerd om te bevestigen dat de voorspelde mutaties in de eerste Exon van het natrium kanaal scn4aa aanwezig waren. Het knock-out succes fenotype werd bevestigd met opnames met verminderde elektrische orgel ontlading amplituden in vergelijking met ongeinjecteerde grootte-gematchte controles.

Introduction

Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Twee lijnen van schip vis, Osteoglossiformes en Siluriformes, evolueerde electroreception parallel, en vijf lijnen van teleosts (Gymnotiformes, mormyrids, en de geslachten astroscopus, Malapterurus en Synodontis) evolueerde elektro genese parallel. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen1,2,3.

Dit wordt misschien het best geïllustreerd door de talrijke convergente kenmerken van gymnotiforms en mormyrids, twee soortenrijke schip-clades, die zwakke elektrische velden produceren en detecteren en zwak elektrische vissen worden genoemd. In de 50 jaar sinds de ontdekking dat zwak elektrische vissen elektriciteit gebruiken om hun omgeving te voelen en4te communiceren, heeft een groeiende Gemeenschap van wetenschappers enorme inzichten opgedaan in de evolutie van ontwikkeling1,5 ,6, systemen en circuits neurowetenschappen7,8,9,10, cellulaire fysiologie11,12, ecologie en energetica13 ,14,15,16,17, gedrag18,19en macro-evolutie3,20,21 .

Meer recentelijk is er een proliferatie van genomische, transcriptomische en proteomische middelen voor elektrische vissen1,22,23,24,25,26, 27,28. Het gebruik van deze middelen heeft al belangrijke inzichten opgeleverd met betrekking tot het verband tussen genotype en fenotype bij deze soorten1,2,3,28,29 ,30. Een belangrijk obstakel voor de integratie van genomics-gegevens met fenotypische gegevens van zwak-elektrische vissen is een aanwezig gebrek aan functionele genomics-tools31.

Een dergelijk hulpmiddel is de recent ontwikkelde geclusterd regelmatig Intergespreide korte palindroom herhalingen gecombineerd met Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) techniek. Crispr/Cas9 is een genoom editing tool die wijdverbreid gebruik is ingevoerd in zowel model32,33,34 en niet-model organismen35,36,37 alike. CRISPR/Cas9 technologie heeft zich ontwikkeld tot een punt waar een laboratorium dat in staat is tot moleculaire biologie gemakkelijk genspecifieke sondes kan genereren, genaamd Short Guide RNAs (sgRNAs), tegen lage kosten met behulp van een niet-kloon methode38. Crispr heeft voordelen ten opzichte van andere knock-out/knockdown-strategieën, zoals morpholinos39,40, transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (Talens) en zink vinger nucleasen (zfns), die kostbaar zijn en tijdrovend om te genereren voor elk doel gen.

Het CRISPR/Cas9 systeem functioneert om genen knock-outs te maken door een specifieke regio van het genoom te targeten, geregisseerd door de sgRNA-reeks, en waardoor een dubbel-stranded pauze ontstaat. De dubbel-stranded breuk wordt gedetecteerd door de cel en activeert endogene DNA reparatie mechanismen bij voorkeur met behulp van de niet-Homologous end aansluiten (NHEJ) traject. Dit traject is zeer foutgevoelig: tijdens het herstelproces zal het DNA-molecuul vaak inserties of verwijderingen (indels) op de dubbel-streng break site opnemen. Deze indels kunnen resulteren in een verlies van functie door ofwel (1) verschuivingen in het open Lees frame, (2) inbrengen van een voortijdige stop codon, of (3) verschuivingen in de kritische primaire structuur van het genproduct. In dit Protocol maken we gebruik van CRISPR/Cas9 Editing om puntmutaties in doel genen te targeten met behulp van de NHEJ in zwak-elektrische vissoorten. Hoewel deze methode van mutagenese eenvoudiger en efficiënter is dan andere technieken, wordt naar verwachting een bereik van fenotypische ernstcategorieën in F0veroorzaakt, dat wordt toegeschreven aan genetisch mosaicisme41,42,43 ,44.

Selectie van organismen
Met het oog op de vergemakkelijking van toekomstige studies naar de vergelijkende genomica van zwak-elektrische vissen, moest een representatieve soort voor zowel gymnotie-en mormyrids voor protocol ontwikkeling worden geselecteerd. Na besprekingen tijdens de 2016 elektrische vissen bijeenkomst in Montevideo, Uruguay, was er consensus in de Gemeenschap om soorten te gebruiken die al in het laboratorium konden worden gefokt en die genomische middelen beschikbaar hadden. De gymnotiform Brachyhypopomus gauderio en de mormyrid Brienomyrus Brachyistius werden geselecteerd als soorten die aan deze criteria voldoen. Bij beide soorten zijn natuurlijke aanwijzingen voor het opwekken en handhaven van fokomstandigheden gemakkelijk in gevangenschap te nabootsen. B. gauderio, een gymnotie soort uit Zuid-Amerika, heeft het voordeel van lage veehouderij eisen: vis kan worden gehouden op relatief hoge dichtheid in relatief kleine (4 L) tanks. B. gauderio heeft ook een snelle generatie omzet onder interne omstandigheden. Onder laboratoriumomstandigheden kan B. gauderio in ongeveer 4 maanden van ei tot volwassen ontwikkelen.

B. Brachyistius, een soort van mormyrid vis uit West-Centraal Afrika, rassen gemakkelijk in gevangenschap. B. Brachyistius is direct beschikbaar via de aquarium handel, is op grote schaal gebruikt in vele studies, en heeft nu een aantal genomische middelen beschikbaar. Hun levenscyclus overspant 1 − 3 jaar, afhankelijk van de laboratoriumcondities. De behoeften van de veehouderij zijn iets intensiever voor deze soort, waarbij een matig grote tank (50 − 100 L) nodig is vanwege hun agressie tijdens de fokkerij.

Laboratoria die andere soorten elektrische vissen bestuderen, moeten dit protocol gemakkelijk kunnen aanpassen zolang de soorten kunnen worden gefokt, en eencellige embryo's kunnen worden verzameld en gekweekt in de volwassenheid. De tarieven voor huisvesting, larvale veehouderij en in-vitro fertilisatie (IVF) zullen waarschijnlijk veranderen met andere soorten; Dit protocol kan echter worden gebruikt als uitgangspunt voor fokpogingen in andere zwak-elektrische vissen.

Een ideale genen target voor proof of concept: scn4aa
Zwak elektrische mormyrid en gymnotiform vis genereren elektrische velden (elektro genese) door het ontladen van een gespecialiseerd orgel, genaamd de elektrische orgel. Elektrische orgel lozingen (Eod's) resulteren uit de gelijktijdige productie van actie potentialen in de elektrische orgel cellen genaamd elektro cyten. Eod's worden gedetecteerd door een reeks electroreceptors in de huid om hoge-resolutie elektrische beelden van de omgeving van de vis te creëren45. Zwak elektrische vissen zijn ook in staat om kenmerken van hun condetails te detecteren ' EOD golfvormen18 en hun afvoer snelheden46, waardoor eod's aanvullend kunnen functioneren als een sociaal communicatiesignaal analoog aan Bird Song of kikker vocaliisaties47.

Een belangrijk onderdeel van de actie potentiële generatie in de elektro cyten van zowel mormyrid als gymnotiform zwak elektrische vissen is de spanning-gated natrium kanaal NaV 1.42. Niet-elektrische teleosts uitdrukken twee paralogous gen-kopieën, scn4aa en scn4ab, codering voor de voltage-gated natrium kanaal NAV 1.430. In zowel gymnotiform en mormyrid zwak elektrische vissen kilometerstanden, scn4aa geëvolueerd snel en ondergaan talrijke aminozuursubstituties die invloed hebben op de kinetische eigenschappen48. Het allerbelangrijkste is dat scn4aa in beide lijn lijnen is compartimenaliseerd tot het elektrische orgel2,3. De relatief beperkte uitdrukking van scn4aa aan het elektrische orgel, evenals zijn sleutelrol in de generatie van eod's, maakt het een ideaal doelwit voor crispr/Cas9 knock-out experimenten, omdat het minimale schadelijke pleiotrope effecten heeft. Omdat zwak elektrische vissen beginnen met het ontladen van hun larvale elektrische orgels 6 − 8 dagen na bevruchting (DPF), is targeting van scn4aa uitermate geschikt voor snelle fenotypen na embryo-micro injectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Michigan State University.

1. sgRNA-doelen selecteren

Opmerking: Een protocol is beschikbaar voorhand matig ontwerp van sgRNAs in stap 1,1. Dit werd gebruikt voor scn4aa doelselectie. Er is een aanvullend protocol ter vergemakkelijking van dit proces (stap 1,2) met behulp van de EFISHGENOMICS webportaal. Het is aangeraden dat gebruikers Protocol 1,2 selecteren, dat verschillende geautomatiseerde ' checks ' bevat om te zorgen voor succes bij het ontwerpen van sgRNAs voor aangepaste doelen.

  1. Ontwerp sgRNA-doelstellingen.
    1. Voor het genereren van sgRNA Guide oligos, is het het beste om Exon 1 of andere 5 ' exonen te targeten. De 5 ' UTR kan worden gericht; het is echter het beste om de 5 ' Codeer volgorde te targeten. Het gebruik van genomische informatie verdient de voorkeur, maar het is mogelijk om succesvolle Sgrna's te ontwikkelen met behulp van transcriptome data. Annotaties van INTRON/Exon-grenzen (genomische gegevens) of Exon/Exon-grenzen hebben de voorkeur.
    2. Kandidaat genomische sequenties van 1,1 worden gezocht naar vermoedelijke target sequenties die overeenkomen met het patroon 5 '-N (18)-NGG-3 '. Dit kan automatisch worden uitgevoerd met behulp van Desktop sequentieanalyse software, aangepaste scripts, of via handmatige inspectie van sequenties.
    3. Sequenties kunnen worden geprioriteerde met behulp van de methode van Doench et al.49 voor on-target activiteit. Bovendien kunnen doel reeksen worden geëvalueerd door een BLAST-zoekopdracht tegen genomic/Transcriptomic-databases voor niet-doelbinding.
    4. Zorg ervoor dat standaard PCR-primers kunnen worden gegenereerd die de doel volgorde flankeren. Primers moeten ten minste 20 BP van beide zijden van de cut-site zijn (drie basissen stroomopwaarts van de NGG-reeks). Idealiter moet het PCR-product 150 − 200 base pairs (BP) zijn.
    5. Ontwerp-oligomeren die voldoen aan de bovenstaande criteria met behulp van het onderstaande template, met een T7 Promoter (5 ' van N18) en een complementaire regio (3 ' van n18) voor het gloeien naar het constant oligomeren (1.1.6): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG-N18 -Gttttagagctagaaatagcaag-3 '
      Opmerking: De N18 -sequentie omvat niet de sequentie van de NGG protospacer AANGRENZEND motief (PAM). Neem dit niet op in het Oligomeer.
    6. Bestel het constant oligomeren (tabel 1) dat zal worden gebruikt voor het synthetiseren van alle sgrna's, oligomeren voor sgRNA-doelwitten (stap 1.1.5) en PCR-primers (stap 1.1.4) als standaard ontdesalted oligomeren van een oligonucleotide productiedienst. Oligomeren en PCR-primers kunnen worden besteld als standaard ontluchtingsoligomeren, er is geen extra zuivering nodig.
  2. Voer geautomatiseerd ontwerp van sgRNA-doelen uit.
    1. Met genomische gegevens selecteert u een doel-gen. Transcriptome gegevens kunnen worden gebruikt in plaats daarvan wanneer Exon/intron grenzen bekend zijn. Doelen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de EFISHGENOMICS portaal (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). Het ideale doelwit zal binnen Exon 1 zijn; echter, andere 5 ' exonen en de 5 ' UTR kunnen worden overwogen.
    2. Zodra de doel volgorde is geïdentificeerd, laadt u de vrij beschikbare EFISHGENOMICS CRISPR Web Tool (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). Deze webtool gebruikt een aangepaste versie van het crispor-algoritme voor de doel generatie50,51.
    3. Voer in het vak voor stap 1de naam van de reeks in en voer de volgorde van het doel in het desbetreffende vak in.
  3. Selecteer het juiste genoom waarvan de reeks afkomstig is. Momenteel zijn genomische gegevens beschikbaar voor b. Brachyistius en b. gauderio. Genoomsequenties zijn niet vereist voor het gebruik van deze tool, maar zijn nuttig bij het beoordelen van potentiële ongewenste off-target effecten.
  4. Selecteer de juiste PAM. De 20 BP-NGG PAM wordt aanbevolen, maar er zijn verschillende extra PAM-motieven om uit te kiezen, afhankelijk van het Cas9-eiwit dat wordt gebruikt.
  5. Er wordt een rapport gegenereerd met de locatie van de doel volgorde in het genoom met de voorgestelde geleidersequenties. Selecteer drie doelen met lage voorspelde off-target effecten, hoge specificiteits scores en hoge efficiëntie scores. De hoogste score gids sequenties worden gemarkeerd met groen aan de linkerkant. Gele en rode gemarkeerde geleidersequenties moeten, indien mogelijk, worden vermeden.
  6. Als u op geselecteerde doel reeksen klikt, wordt een uitgebreid CRISPOR-rapport gegenereerd. Belangrijke informatie uit deze rapporten is voor "T7 in vitro expressie van overlappende oligonucleotiden". Uit dit rapport, Extraheer de volgende informatie: aanbevolen sgRNA oligos, PCR-primers voor de doelsite, en een constante oligomeren die zal worden gebruikt voor het synthetiseren van alle Sgrna's.
  7. Bestel de geselecteerde oligomeren (stap 1,6) uit een productie service van oligonucleotide. Oligomeren en PCR-primers kunnen worden besteld als standaard ontluchtingsoligomeren, er is geen extra zuivering nodig.

2. Genereer sgRNA

  1. Anneal oligomeren in PCR-buis: Voeg 1 μL van 100 μM constant oligomer, 1 μL 100 μM sgRNA specifiek Oligomeer en 8 μL Nuclease-vrije H2O
  2. Anneal oligomeren in een Thermocycler met het volgende programma: Verwarm bij 95 °C gedurende 5 minuten, koel tot 85 °C bij-2 °C/s, koel tot 25 °C bij 0,1 °C/s en houd bij 4 °C.
  3. Om sgRNA-sjabloon te genereren, voegt u 2,5 μL dNTP-mix (10 mM), 2 μL 10x-buffer, 0,5 μL T4-DNA-polymerase en 5 μL Nuclease-vrije H2O toe aan de gegloeide oligomeren uit stap 2,2. Inincuberen gedurende 20 minuten bij 12 °C.
  4. Reinig de sjabloon met behulp van een kolom voor het opschonen van PCR volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Elute in 20 – 30 μL. gebruik een spectrofotometer om de concentratie en zuiverheid te schatten. De sjabloon moet 100 – 200 ng/μL en 1,8 – 1,9 A260/280zijn.
  6. Controleer via een agarose-gel met 1 – 5 μL. De dominante band moet 120 BP zijn. Zie afbeelding 1a voor representatieve resultaten.
  7. Store gel-geverifieerd sgRNA-sjabloon bij-20 °C (lange termijn) of 4 °C (korte termijn, 1 – 4 weken).
  8. Transcribe sgRNA met T7 RNA transcriptie Kit door toevoeging aan een micro centrifugebuis 1,5 mL bij kamertemperatuur 8 μL dNTP mix (gelijke volumes van dA, dT, dG, dC), 2 μL van 10 x buffer (kamertemperatuur), 2 μL T7 RNA polymerase, 100 − 200 ng van sgRNA template en Nuclease vrij H2O tot een totaal volume van 20 μL. Spin te verzamelen aan de onderkant. Inincuberen voor 2 – 4 uur bij 37 °C.
  9. Voeg 1 μL DNase toe en inincuberen 15 minuten extra bij 37 °C.
    1. Reinig sgRNA door toevoeging van 1 μL glycogeen, 30 μL Nuclease-vrij H2O, 30 μl van 5 M ammoniumacetaat en 180 μL 100% EtOH om sgrna te transcribeerd. Meng goed en incuberen ten minste 20 min bij-80 °C (tot bevroren) of bij-20 °C 's nachts. Centrifugeer bij 4 °C gedurende 15 minuten bij maximale snelheid.
  10. Verwijder en gooi supernatant weg zonder de pellet te storen en was met 1 mL RNase-vrij 70% EtOH gekoeld bij-20 °C. Draai een extra 5 min bij maximale snelheid bij 4 °C.
  11. Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en lucht-droog de pellet gedurende 5 minuten.
  12. Respendeer in 30 μL Nuclease vrije H2O en bepaal de zuiverheid en de opbrengst met UV-spectroscopie (minimale opbrengst van 200 ng/μL).
  13. Controleer de aanwezigheid van sgRNA op een RNase-vrije gel. De sgRNA verschijnt tussen 50 en 150 BP als twee bands als gevolg van de secundaire structuur (Figuur 1b).
  14. In 3 μL en bewaren bij-80 °C.

3. Valideer de Snijefficiëntie in vitro

  1. Extract genomisch DNA van de doelsoort met behulp van een commerciële DNA-extractie Kit. Ventrale fin-knipsels kunnen worden gebruikt zonder de vis op te offeren, omdat de weefsels worden geregenereerd.
  2. Versterk de doel-DNA-regio met behulp van de primers ontworpen zoals beschreven in de stappen 1,6 en 1,7 met behulp van standaard PCR. Controleer het product door middel van gel elektroforese. Het fragment sequentiëren om ervoor te zorgen dat de juiste regio wordt versterkt wordt gesuggereerd, maar niet noodzakelijk. Representatieve resultaten voor de sjabloon scn4aa worden weergegeven in afbeelding 2.
  3. Reinig het PCR-fragment met een gevestigd laboratorium of bedrijfs protocol.
  4. Bewaar het versterkte DNA bij-20 °C. Overweeg het te scheiden in aliquots om vries dooi cycli te verminderen.
  5. Bepaal de vereiste hoeveelheden en volumes van elk onderdeel. Overweeg om negatieve controles uit te voeren (met uitzondering van sgrna of Cas9) en een positieve controle (een eerder geteste sgrna die zijn doel PCR-versterkt DNA Slaid), indien beschikbaar, evenals een concentratiereeks van de sgrna.
  6. Stel het reactiemengsel hieronder in de gespecificeerde volgorde in een PCR-buisje bij kamertemperatuur in, voeg het sgRNA-en Cas9-eiwit toe voor de beste resultaten: 50 – 100 ng van het doel-DNA-PCR-product, 1 μL 10x-buffer 3, 1 μL van 10 x BSA (0,1 g/mL) , 50 – 200 ng van Cas9 eiwit (1 mg/mL, 150 ng gesuggereerd), en 30 – 200 van ng sgRNA (100 ng gesuggereerd).
    1. Inbroed de reactie bij 37 °C gedurende 1 uur en vervolgens bij 65 °C gedurende 10 minuten om Cas9 eiwitten te deactiveren.
    2. Voer het volledige monster op een 2% – 3% agarose gel (verwachte band groottes tussen 30 – 200 BP) samen met positieve en negatieve controles. Een succesvol decolleté kan een deel van het PCR-product vertonen, maar zal ook twee kleinere banden hebben. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 2.

4. embryo's verkrijgen

Opmerking: Het verkrijgen van embryo's van zwak elektrische vissen kan een uitdaging zijn. Zorgvuldige controle van de waterkwaliteit, voldoende tijd voor de verzorging van de vis, en regelmatige voeding zijn de sleutel tot een succesvol fokprogramma. Vis moet eerst worden geconditioneerd voor enkele weken voor reproductie52 zoals beschreven in protocol stap 4,1. Na dit, een protocol dat de natuurlijke Gametogenese (4,2) voor gebruik in natuurlijke paai gedrag (4,3), een alternatieve recent ontwikkelde in vitro techniek voor het verkrijgen van nauwkeurig getimede embryo's (4,4) worden gepresenteerd. Protocol 4,3 is even effectief voor b. Brachyistius en b. gauderio, en Protocol 4,4 is superieur in b. gauderio.

  1. Conditionering
    1. Houd B. Brachyistius in koppels/kleine groepen (100 – 150 L tanks) of in zeer grote tanks (2 mannetjes en 5 – 6 vrouwtjes in ongeveer 475 L tank), als ze zeer agressief onder fokcondities worden. Er moeten ten minste 1 – 2 PVC-buizen per vis worden gebruikt als schuilplaats (Figuur 3a,B).
    2. B. gauderio kan worden gekweekt met een veel hogere dichtheid. Houd maximaal acht personen in een tank van 100 L (2 mannetjes en 6 vrouwtjes). Er moet ten minste 1 PVC-buis per vis worden gebruikt als schuilplaats. Het toevoegen van verwarde garens verhoogt de verrijking en schuilplaatsen. Voeg 50 mL centrifugebuizen toe met gaten van 1 cm diameter die in hen zijn geboord naar de bovenkant van de tank, zodat volwassenen van nature in de buisjes kunnen spawnen (figuur 3c).
    3. Tijdens het broedseizoen, voeden vis dagelijks verse wormen aangevuld met bevroren bloed wormen. Het eten kan worden verrijkt met vitaminen en supplementen, indien gewenst.
    4. Huis vis normaal in een relatief hoge geleidbaarheid (300 – 600 μS), pH evenwichtige oplossing. Tijdens het broedseizoen, geleidelijk verlagen van de geleidbaarheid door ten minste de helft in de loop van 1 – 3 weken voor het opwekken van gonaden recidief en paaien. Lagere geleidbaarheid door dagelijkse toevoegingen van omgekeerde osmose (RO) water, met aandacht voor pH bij lage geleidbaarheid (pH < 6).
    5. Fokcondities kunnen ongeveer 3 − 5 maanden worden bewaard, waarbij de eierproductie in de loop van de tijd afloopt. Na deze tijd, terug vissen naar hoge geleidbaarheid langzaam over 1 – 3 weken. Houd nog 3 maanden bij een hoge geleiding voordat u weer aan de fokcondities wordt blootgesteld.
  2. Gebruik paai middel (SGnRHa + domperidon) injecties.
    1. Identificeer vrouwelijke vissen in foktoestanden die zwangere lijken (Figuur 4). In B. gauderio zal de vrouw gezwollen gonaden net caudal naar de vent. B. Brachyistius vrouwtjes zullen gezwollen buiken hebben en verschijnen diep volle (figuur 4a). Mannetjes hebben over het algemeen geen probleem met het produceren van sperma. Echter, grotere mannetjes hebben de voorkeur als gevolg van de grotere sperma volume verzameld.
      Opmerking: Paai agent is een commerciële hormoon mix die rijping van gameten vergemakkelijkt en coördineert spawnend. Als de vis in het verleden is geïnjecteerd met paai middel, laat dan > 4 weken rust en voldoende voeding tussen injecties toe. We raden het injecteren van ten minste 2 mannetjes en 4 – 5 vrouwtjes om te zorgen voor een paar klauwen van eieren en veel sperma.
    2. Anesthetiseren vis in MS-222 (0,4 g/3 L) voor een paar minuten, totdat de vis niet in staat is om zijn houding te behouden, is immobiel, maar blijft hebben operculaire beweging (fase II53).
    3. Weeg de vis (g) af om het paai middel bedrag te berekenen (0,5 μL/g) + 0,5 μL. De extra 0,5 μL is geschikt voor Pipetteer fouten.
    4. Voeg de paai agent toe aan 4x buffer volumes (1x PBS of DPBS) in een PCR-buis en meng goed. De oplossing zal troebel worden. Het helpt om de paai agent op thermoplast af te maken en vervolgens een pipet te gebruiken om de berekende dosis te meten. Het paai middel is visceus, dus zorg ervoor dat u de volledige dosis uitlevert en voorzichtig bent met pipetteren.
    5. Pipetteer de injectie oplossing op thermoplast en trek in een precisie glazen spuit, Vermijd luchtbellen. Wij raden een 28 G, 19 – 25 mm lengte, afgeschuurd naald.
    6. Injecteer de oplossing in de rugromp spier met een soepele snelheid. Laat de naald 2 – 4 s zitten en verwijder. Zet vis onmiddellijk in vers systeemwater voor herstel.
    7. Na ongeveer 24 uur bereiden voor de inzameling van embryo's (zie 4,3 of 4,4). Verzamel alle benodigde materialen, inclusief wat nodig is voor eencellige micro injectie (zie rubriek 5).
  3. Embryo's verkrijgen door natuurlijke paai.
    1. Huis paai agent-geïnjecteerd volwassenen (4,2) in een grote 450 L tanks. De meest effectieve geslachts verhoudingen zijn meestal 1 – 2 mannetjes en 3 – 4 vrouwtjes met adequate schuilplaatsen gemaakt van PVC buizen, en donker marmer substraat op de tankbodem om te voorkomen dat Eier consumptie. Knikkers zijn meestal belangrijker voor b. Brachyistius dan b. gauderio, die de voorkeur geven aan het deponeren van hun kleverige eieren in spleten of 50 ml centrifugebuizen zoals hierboven beschreven.
    2. Plaats de vis in een omgekeerde licht cyclus om de nachtelijke paai te matchen met reguliere labwerkuren. Gebruik een off-the-shelf beveiligingssysteem voor consumenten en bewaak vis met infrarood verlichting om verstoring van een op afstand aangesloten PC te minimaliseren (Figuur 3).
    3. De vis zal spontaan spawnen tijdens de donkere fotoperiode ongeveer 24 uur na de paai agent injectie.
    4. Wanneer het paaien begint, verzamel dan elk uur eieren terwijl het paai gedrag plaatsvindt. In B. Brachyistius, verzamel eieren met behulp van een sifon met een kleine diameter over een fijn gaas om schade aan de vers gespawnde eieren te minimaliseren. Verzamel B. gauderio eieren van 50 ml centrifugebuizen of tank substraat. Werk efficiënt met een minimale verstoring van de paai vissen door een hoofdlamp te gebruiken met een rood licht met lage intensiteit. Als eerste decolleté vindt plaats ongeveer 1 h post bevruchting (HPF), een groot deel van de eieren zal geschikt zijn voor één cel Microinjection.
    5. Ga onmiddellijk naar micro injectie (zie rubriek 5).
  4. Knijp mannetjes voor in vitro fertilisatie van B. gauderio.
    1. Bereid de sperma Extender oplossing (SES) zoals beschreven in de zebravis boek54: 10 mm hepes, 80 mm kcl, 45 mm nacl, 45 mm Natriumacetaat, 0,4 mm CACL2, en 0,2 mm MgCl2.
      1. Gebruik ddH2O om naar volume te brengen en de pH op 7,7 aan te passen met 1 M NaOH.
      2. Bewaren in de koelkast.
      3. Filter door een 0,22 μm filter voor gebruik.
    2. Anesthetiseren vis in MS-222 (0,4 g/3 L) voor een paar minuten, totdat de vis niet in staat is om zijn houding te behouden, is immobiel, maar blijft hebben operculaire beweging (fase II53). Plaats 500 μL aliquots van SES in ijs.
    3. Droge handen en vis grondig, vooral rond het hoofd en de vent. Plaats ventrale kant omhoog, voorste naar links (voor rechtshandige individuen) in een piepschuim/spons houder bedekt met een MS-222 geweekte, vochtige papieren handdoek. Het hoofd moet zo parallel met de tafel mogelijk.
      Opmerking: Stappen 4.4.4 – 4.4.6 moet zo snel mogelijk worden gedaan, en de vis mag alleen uit water voor 30 – 60 s.
    4. Breng de druk in het caudal aan op rostrale migratoire richting met licht knijpen via de gonaden naar de vent. De vis kan afval verdrijven. Zorg ervoor dat de vent schoon te maken met een delicate taak wissen als er afval wordt uitgezet. Verzamel geen afval met sperma. Afhankelijk van de grootte van het mannetje is 10-60 μL gebruikelijk.
    5. Gebruik een micropipetter met een tip om het sperma voorzichtig te verzamelen, omdat het van het mannetje wordt geperst in stappen van 50 μL. Plaats het sperma direct in 500 μL aliquots van SES op ijs. Het kan nuttig zijn om een andere onderzoeker helpen bij het verzamelen van sperma, terwijl de andere knijpt. Sperma moet zo snel mogelijk worden gebruikt, maar blijft levensvatbaar voor ten minste 1 h.
    6. Onmiddellijk na het verzamelen, zet vis in vers systeemwater voor herstel. De vis mag slechts 30 – 60 s uit het water zijn.
  5. Knijp vrouwtjes voor in vitro fertilisatie van B. gauderio.
    1. Anesthetiseren vis in MS-222 (0,4 g/3 L) voor een paar minuten, totdat de vis niet in staat is om zijn houding te behouden, is immobiel, maar blijft hebben operculaire beweging (fase II53). Plaats polytetrafluoretheen blad op het werkstation.
      Opmerking: De paragrafen 4.5.1 – 4.5.5 moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd en de vis mag slechts 30 – 60 s uit het water zijn.
    2. Droge handen, gereedschap, polytetrafluoretheen blad en vis grondig, vooral rond het hoofd en de vent. Plaats aan de zijkant met hoofd gericht voorste (voor rechtshandige individuen).
    3. Breng de druk in het caudal aan op rostrale migratoire richting met licht knijpen via de gonaden naar de vent. De vis kan afval verdrijven. Zorg ervoor dat de vent schoon te maken met een delicate taak wissen als er afval wordt uitgezet. Afhankelijk van de grootte van de vis, is 20 – 150 eieren gebruikelijk. Met behulp van een polytetrafluoretheen gecoate spatel/gereedschap zorgvuldig verzamelen eieren als ze worden geperst uit de cloaca. Verplaats eieren snel naar een klein Petri schaaltje en dek af. Zorg ervoor dat de eieren droog blijven tijdens dit proces. Als alternatief, na knijpen, raak de Eier massa aan de basis van een kleine Petri schaal of op het polytetrafluoretheen blad als ze worden uitgezet uit het vrouwtje.
    4. Onmiddellijk na het verzamelen, zet de vis in vers systeemwater voor herstel.
  6. Voer Eier bevruchting uit voor in vitro fertilisatie van B. gauderio.
    1. Voeg 100 μL goed gemengd sperma toe in SES (zie stap 4,4) direct over de eimassa.
    2. Voeg 1 mL systeemwater toe (gefilterd door een 0,22 μm filter) en meng goed voor 30 – 60 s.
    3. Voeg een extra 1 – 2 mL systeemwater toe (laat wat ruimte in de Petri schaal) en plaats in de incubator. Record tijd van IVF op Petri schaaltje en ga naar een incubator van 29 °C. Stel een timer van 50 minuten in om de voortgang van de ontwikkeling te controleren (bijv. de vorming van de ene cel op de dieren paal, Zie Figuur 6). Gedurende deze tijd, bereid materialen voor micro injectie.

5. eencellige micro injectie

  1. Trek micro injectienaalden voorafgaand aan paai agent injecties (stap 4,2) of natuurlijke paaien (stap 4,3). Gebruik een borosilicaatglas capillair met een filament (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm lengte) en een naald trekker om micro injectienaalden te trekken. Bereid 2 – 4 naalden per geplande behandelings injectie.
    Opmerking: Backloading naalden met een filament hebben de voorkeur, omdat het filament de oplossing naar de punt wikt en bubbels elimineert. Naalden zonder gloeidraad kunnen echter worden gebruikt en frontloading mag geen effect hebben op de uitkomst. De naald moet een lange, maar stevige taper hebben. Gebruik het naald Trek programma met de volgende specificaties als uitgangspunt: Heat = 500; Pull = 70; Velocity = 70; en tijd = 100. Representatieve naald morfologieën worden weergegeven in figuur 5a.
  2. Bereid de injectie oplossing voor en bereid de naald voor.
    1. Voeg 0,9 μL sgRNA en 0,9 μL Cas9 enzym (1 mg/mL) toe aan 0,2 μL van 10% of 100% fenolrood (voor respectievelijk 1% en 10% uiteindelijke fenol rode concentratie) in een PCR-buis. Meng goed en laat op ijs 2 − 5 minuten zitten om sgRNA en Cas9 te laten complex. Bereken de uiteindelijke concentratie van sgRNA, Cas9 en fenolrood in de injectie oplossing.
      Opmerking: Als er problemen zijn met het verstopping van de naald of het snijden van de efficiëntie met behulp van het bovenstaande recept, kan het nuttig zijn om een 1x eindconcentratie zout/buffer mix te gebruiken om Cas9 te stabiliseren en te voorkomen dat de naald verstopt is.
    2. Gebruik een pipetpunt met micro lader om de 2 μL oplossing in de micro injectienaald te laden. Verwijder de vloeistof zo dicht mogelijk bij de punt.
    3. Laad de naald in de micromanipulator en stel de drukinstellingen in (begin met 775 pi, 0,1 − 0,2 s en 8-12 pc).
    4. Gebruik onder het toepassingsgebied een paar fijne tang om de punt van de naald in een schuine hoek te breken. Breken naar waar de taper van de naald begint te hebben stijfheid. Het is het beste om dichter bij de tip te breken, de grootte van de injectie oplossing te testen en indien nodig verder te breken. Het gat van de naald moet zo klein mogelijk blijven met behoud van een stijve taper (figuur 5a).
    5. Gebruik minerale olie en een micrometer om de grootte van de injectie oplossing te meten. 1 – 2 nL wordt gewoonlijk gebruikt; 0,1 mm diameter is 0,5 nL.
    6. Pas de naaldpunt-of drukinstellingen aan om een injectievolume binnen de specificaties te krijgen.
  3. Identificeer de ontwikkeling van zygotes en bereid de injectie fase voor. Stel de injectie fase in. Neem een 100 mm diameter Petri schaal. Keer de onderkant om en plaats onder de omgekeerde bovenkant. Plaats een glazen Microscoop glijbaan in de omgekeerde top. Afhankelijk van hoe uw micro manipulator op het bereik is gemonteerd, kan de extra hoogte van de omgekeerde basis overbodig zijn.
    1. Kijk naar de ontwikkelende eieren en Identificeer vermoedelijke bevruchte zygoten 50 – 60 minuten na IVF. De dieren stok zal beginnen te vormen en er zal een overmaat aan kleine vetdruppels rond de dooier/dierlijke celinterface (Figuur 6) zijn.
    2. Verzamel 10 – 20 eieren met zo weinig mogelijk water met behulp van een plastic Transfer Pipet (snijd de tip iets om eieren te laten passeren) en plaats deze op de rand van de glijbaan. Water zal goddeloos zijn onder de glijbaan en trek eieren tegen de rand.
    3. Gebruik een delicate taak veeg en druk voorzichtig op de schuif om overtollig water te verwijderen en laat de eieren stevig aan de rand van de glijbaan hechten. Er moet net genoeg water zijn om de eieren vochtig te houden met behoud van weinig staande vocht om de Eier beweging tijdens de injectie te voorkomen.
  4. Injecteer direct in een enkele cel.
    1. Lijn de eieren verticaal af, loodrecht op de naderende naald (Figuur 5b).
    2. Plaats de naald met behulp van de micromanipulator tegen de chorion. In ongeveer een hoek van 45 ° plaatst u de naald in de chorion en vervolgens in de enkele cel. Het kan handig zijn om de enkele cel via de dooier in te voeren. Het verplaatsen van zowel de injectie fase met de vrije hand als de micro Manipulator kan meer controle geven over het injectie proces (Figuur 5b).
    3. Injecteer sgRNA/Cas9/fenol rode oplossing in de enkele cel. Verwijder voorzichtig de naald. Ga verder naar het volgende ei en herhaal stap 5.4.1 – 5.4.3 totdat alle eitjes geïnjecteerd zijn.
    4. Verwijder alle eieren die gebroken zijn tijdens de injectie met een fijne Tang. Gebruik 0,22 μm gefilterd systeemwater in een spuitfles om eieren van de injectie fase voorzichtig te verwijderen in een nieuwe Petri schaal van 100 mm diameter.
    5. Herhaal stap 5.3.3 – 5.4.6 totdat alle eieren zijn geïnjecteerd of zijn ontwikkeld tot de twee-cel fase. Zorg ervoor dat u ongeveer 20 veronderstelde bevruchte eitjes opzij zet als een no-Injection controle om de bevruchting en het succes van de injectie te bepalen. Gebruik voor grotere klauwen ongespoten embryo's die zijn ontwikkeld voor de twee-celfase, en voor kleinere koppelingen worden veronderstelde bevruchte eieren vernietigd.
    6. Overweeg bovendien een sgRNA/injectie controle door 15 – 25 embryo's te injecteren met Cas9 die is gecompletieerd met een sgRNA tegen een gen dat niet aanwezig is in het genoom. Het GFP-gen wordt aanbevolen voor wild type embryo's. Noteer het aantal eieren, ouders, IVF-tijd en datum op elke Petri schaal. Neem sgRNA target of label op als ongespoten. Ga naar een incubator van 29 °C.

6. veehouderij

  1. Zorg voor de eieren.
    1. Controleer de levensvatbaarheid van eieren 4 – 6 h na injecties.
    2. Noteer het aantal dode eieren, evenals alle die onbevruchte zijn. De onbevruchte eieren worden in de fase van de acht cellen gearresteerd en hebben een rozet patroon van de cellen op de dieren paal (Figuur 6). Afhankelijk van het aantal dode eieren en de hoeveelheid ei puin in het water, verwijder ten minste 50% – 80% van het water en vervang met gefilterd systeemwater. Het kan handig zijn om de bodem van de Petri schaal te scrubben als een cellulaire puin film of biofilm vormt.
    3. Voor de volgende 2 – 3 dagen, check eieren 1 – 2x per dag. Herhaal stap 6.1.2 – 6.1.3 telkens wanneer de eieren worden gecontroleerd.
    4. Na 2 − 3 dagen zal de larven uitkomen. Verwijder alle Eier omhulsels als ze uitkomen. Zachte pipetteren kan helpen om half-uitgekomen larven vrij te maken.
  2. Verzorging voor larven.
    1. Controleer eieren 1 − 2x per dag. Herhaal stap 6.1.2 – 6.1.3 telkens wanneer de larven worden gecontroleerd.
    2. Van 6 – 14 DPF, voer azijn paling aan de larven. Een lichte overmaat van voedsel is goed, omdat de azijn paling zal levend blijven in het gerecht. Voeg azijn alen toe telkens wanneer het gerecht wordt gecontroleerd en gereinigd.
    3. Van 11 – 14 DPF, toevoegen 5 – 10 vers uitgekomen Artemia per larven naast azijn alen. Gedurende deze tijd zal de larven leren om het gratis zwemmen Artemiate eten.
    4. Bij 15 DPF, verplaats larven naar Eier bekers (zie paragraaf 6.2.5) in een tank met stromend water, filtratie en beluchting. Er mogen niet meer dan ongeveer 25 embryo's per kopje worden. Eierdopjes zijn plastic bekers met een mesh-gaas op de bodem. Een 100 mm Petri schaal top/bottom kan aan de onderkant van de Egg Cup worden toegevoegd om te helpen voorkomen dat voedsel door het gaas valt. Met Eier bekers kan de vis in een grotere hoeveelheid water worden ondergebracht om redenen van waterkwaliteit, met behoud van discrete groepen. Doorgaan met het toevoegen van beide azijn alen en 15 − 30 vers uitgekomen Artemia per larven van dagen 15 – 18. Reinig het Petri schaaltje dagelijks en gebruik een pipet om massa's dode Artemiate verwijderen.
    5. Vanaf dagen 18 – 30, feed alleen vers uitgekomen Artemia. Verhoog de hoeveelheid voer als de vissen groeien en als Staartbijten wordt gezien.
    6. Na ongeveer 30 dagen, verplaats vis naar 10 L (2,5 gallon) tanks, ongeveer 25 personen per tank. Zorg ervoor dat er filtratie, beluchting en plaatsen om te verbergen. Overweeg cilindrische biofiltratie media en PVC-buizen met kleine diameter.
    7. Voer vanaf ongeveer 30 – 45 dagen vers uitgekomen Artemia en Black Worms. Onderhoud standaard reiniging en water veranderingen voor de tank (d.w.z. minimaal ~ 10% – 20% water verandering per 1 week).
    8. Na ~ 45 DPF, feed alleen zwarte wormen tot ~ 60 DPF.
    9. Na ~ 60 DPF, verplaats cohorten van ongeveer 15 vissen naar 40 L (10 gallon) tanks en begin volwassen veehouderij procedures. Voeg PVC buizen en een garen "MOP" (een massa bruin garen samen gebonden rond een kurk) voor schuilplaatsen (figuur 3c). Vissen moeten na ongeveer 3 − 4 maanden na de bevruchting de kweek grootte (10 − 12 cm) naderen.

7. volwassen veehouderij

  1. Voer dagelijks vis met voldoende zwarte wormen zodat een kleine hoeveelheid zwarte wormen aanwezig zijn bij de volgende voeding. Deze ad libitum voeding zorgt voor maximale groei.
  2. Een paar keer per week kan het nuttig zijn om de zwart worm voeding aan te vullen met bloed wormen.
  3. Reinig tanks elke 2 – 4 weken met een 20% – 30% water wissel. Als het garen MOP vol biofilm/algen wordt, wrijf het dan schoon onder RO-water.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De doellocaties van sgRNA werden geïdentificeerd binnen Exon 1 van scn4aa in zowel b. gauderio als b. Brachyistius , zoals beschreven in punt 1. De Sgrna's werden gegenereerd zoals beschreven in paragraaf 2. Na succesvolle sgRNA selectie en synthese (Figuur 1) werd in vitro decolleté getest (Figuur 2). De sgRNAs die in vitro snijden demonstreerden werd vervolgens geselecteerd voor micro injecties met één cel.

Volwassen vis was geconditioneerd voor reproductie (punt 4,1), vervolgens geïnjecteerd met een paai middel (punt 4,2) en vervolgens geperst (b. gauderio) voor IVF zoals beschreven in sectie 4,4 of toegestaan om op natuurlijke wijze te spawnen (b. Brachyistius) als beschreven in paragraaf 4,3. Deze inspanningen leverden eencellige embryo's voor micro injectie op in beide soorten. Zoals beschreven in rubriek 5, 1.5 − 2.0 nL van het scn4aa Sgrna/Cas9/fenolrood complex (65-190 ng/ul sgrna, 450 ng/ul Cas9, 1% − 10% fenolrood, eindconcentraties) werd geïnjecteerd in de ééncelfase. Eieren van dezelfde koppeling werden gebruikt als ongespoten bedieningselementen. Alle embryo's werden verzorgd zoals beschreven in rubriek 6. Na IVF werd 40% – 90% van de eieren bevruchte en werd 70% – 90% van de embryo's overleefd om na de injectie te broed.

Ongeveer 75% van de vissen overleefde tot 6 − 11 DPF en werden vervolgens fenogetypte. Larvale vissen werden geplaatst in een 35 mm Petri schaaltje ingebed in een grotere schaal met Sylgard geïmmobiliseerde AG/cl opname elektroden (figuur 7A). Embryonale beweging werd beperkt met behulp van 3% agarose-mallen gemaakt met systeemwater en gesneden om het embryo te passen (figuur 7b). Dezelfde opname kamer werd gebruikt voor beide soorten en dezelfde agarose mal werd gebruikt bij vergelijkingen van soorten. Embryo's werden geregistreerd voor 60 s, wat volstaat om honderden Eod's vast te leggen. De niet-geïnjecteerde controles op leeftijd en grootte werden geselecteerd ter vergelijking. Op dit moment, 10% – 30% van de overgebleven embryo's vertonen een verminderde amplitude EOD. Embryo's met een afname van de EOD-amplitude zonder duidelijke morfologische defecten en controle van ongespoten hele embryo's werden verteerd voor DNA-extractie en daaropvolgende PCR van de scn4aa target site. Er was vaak een bereik van penetrantie van het fenotype, met sommige individuen met een sterkere reductie in EOD amplitude dan anderen.

Na het opruimen en klonen van PCR werden 30 + klonen van elk embryo geselecteerd voor Sanger-sequencing. CRISPR/Cas9 geïnduceerde mutaties werden geïdentificeerd in B. gauderio (figuur 8a,b) en b. Brachyistius (figuur 9a,b) personen met een sterke EOD-amplitude reductie (figuur 8c en figuur 9C , waarbij niet-geïnjecteerde controles alleen referentie genotypes hadden. Visualisatie van EOD amplitude tussen bevestigde mutanten ("CRISPR") en de leeftijd/grootte overeenkomende ongespoten controles toonden aan dat zowel scn4aa Mutant B. Brachyistius (figuur 10A) en B. gauderio (figuur 10b ) embryo ' s hadden een significant lagere EOD amplitude dan de controles (p < 2,2 x 10-16, Welch twee-monster t-test). CRISPR/Cas9 targeting van scn4aa was succesvol in zowel b. Brachyistius als b. gauderio en impliceren scn4aa in de larvale/vroege elektrocyten ontlading in beide soorten.

Figure 1
Figuur 1: sgRNA template synthese en transcriptie. A) gelbeeld van de sgRNA-sjabloon synthese. Labels corresponderen met verschillende Sgrna's voor myod (MYO2, MYO1) en drie sgrna's voor scn4aa (S1 − S3). Na het gloeien van de oligomeren, een ~ 120 BP sjabloon wordt geproduceerd. B) gelbeeld van sgRNA-transcriptie voor drie Sgrna's voor b. gauderio (bg2017) en twee voor b. Brachyistius (bb2016, 2017). De sgRNA zal verschijnen als twee bands als gevolg van de secundaire structuur en zal tussen 50 − 150 BP zijn bij het gebruik van een dsDNA ladder. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: representatief gelbeeld van succesvolle (SG1) en mislukte (SSO) in vitro CRISPR assays. Een equivalente hoeveelheid sjabloon zonder CRISPR componenten wordt weergegeven in de scn4aa Lane. Noteer de dubbele banden in SG1 die aantonen dat het knippen heeft plaatsgevonden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: kweek tank opstellingen voor zwak elektrische vissen. (A) Schematische voorstelling van de typische opstelling voor draadloze videobewaking van paai gedrag. Drie in de handel verkrijgbare CCTV-camera's (Swann, Inc.) die geschikt zijn voor de productie van infraroodlicht zijn gericht op de bovenkant van het water en aangesloten op een digitale video recorder (DVR). Video wordt in real-time bewaakt voor paai gedrag in een aangrenzende kamer vanaf een computer met netwerkverbinding (PC). (B) paai gedrag gevangen genomen met een dergelijke opstelling in B. Brachyistius. C) een typische kweek opstelling voor B. gauderio met PVC-onderhuiverende buizen en garen Mops. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: fokken van mannetjes en vrouwtjes. A) b. Brachyistius en b . gauderio. Beide soorten zijn seksueel dimorfe en gemakkelijk onderscheiden visueel wanneer seksueel volwassen. Beide vrouwtjes zijn zwangere in deze Foto's, exposeren karakteristieke gezwollen buiken die vol zitten van rijpe eieren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: micro injectie. A) de glazen capillaire naald uiteinden moeten worden gebroken om een geschikt microinjectievolume te leveren. De tip aan de linkerkant is niet gebroken. De middelste en rechter uiteinden zijn gebroken met een enigszins schuine schuine kant om het ei chorion door te boren. B) eieren zijn bekleed tegen een glazen glijbaan (1% – 10% fenolrood is opgenomen als een Tracer om de afgifte van de injectie te visualiseren) en geïnjecteerd met glazen capillaire naalden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: ontwikkelingsstadia. A) b. gauderio en (b) b. Brachyistius. Alle eieren worden verondersteld bevruchte en ontwikkeling wordt bewaakt tot 24 HPF. Tussen 12 − 24 HPF embryo's zijn zichtbaar in levensvatbare eieren, anders vertonen eieren afbraak. Er lijken verschillende divisies te zijn op de activering van eieren, ongeacht de bevruchting. Onbevruchte eieren vertonen ongewone patronen van decolleté die veel meer symmetrisch zijn in bevruchte eieren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: foto van de in deze studie gebruikte larvale opname kamer. A) de elektroden zijn ingebed in sylguard maar strekken zich uit tot de 35mm schaal met een embryo dat is beperkt via een 3% agarose mal. B) een hogere vergrotings afbeelding die de beperkte beweging van het embryo als gevolg van agarose benadrukt. Noteer de stukjes agarose die kunnen worden verwijderd naarmate het embryo de grootte verandert. B. gauderio embryo wordt geconfronteerd met de positieve elektrode. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: CRISPR/Cas9 geïnduceerde mutaties in B. gauderio. A) 32 kloon sequenties van genomisch DNA van Cas9-geïnduceerde mutaties in één scn4aa gericht F0B. gauderio embryo (11 DPF). De referentie sequentie wordt onderstreept met de in het grijs gemarkeerde sgRNA-doelsite, de sequentie van het protospacer-aangrenzend motief (PAM) gemarkeerd in het rood, en de Cas9 cut site gemarkeerd met "|". De verandering van de verwachte wild type sequentie wordt gegeven en het aantal klonen voor elke sequentie wordt gegeven tussen haakjes. (Afkortingen: + = inbrengen,-= deletie, ± = Indel) Alle niet-CRISPR geassocieerde sequentie disgelijkenissen zijn vetgevet. Figuur gemodelleerd naar Jao et al.60. B) aminozuursequentie die wordt voorspeld door gesequentieerde klonen van Scn4aa knockdown B. gauderio van (a). Cas9-geïnduceerde veranderingen van de wild type sequentie worden rood gemarkeerd en het nucleotide-geïnduceerde wijzigingsnummer wordt gegeven. C) tweeëntwintigste elektrische opnames van vijf op elkaar afgestemde larven, alle opgenomen 6 DPF in dezelfde opname kamer. Versterkingsinstellingen zijn identiek voor alle traceringen. Sporen in het rood zijn van b. gauderio larven met bevestigde mutaties (één individu weergegeven in figuur 8a, B hierboven), sporen in zwart zijn van ongespoten b. gauderio larven. Over het algemeen toonde CRISPR/Cas9 editing van scn4aa een afname van de EOD-amplitude, hoewel het effect heterogeen was. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: door CRISPR/Cas9 geïnduceerde mutaties in B. Brachyistius. A) 42 kloon sequenties van genomisch DNA van Cas9-geïnduceerde mutaties in één scn4aa gericht F0B. BRACHYISTIUS embryo (11 DPF). De referentie sequentie wordt onderstreept met de in het grijs gemarkeerde sgRNA-doelsite, de sequentie van het protospacer-aangrenzend motief (PAM) gemarkeerd in het rood, en de Cas9 cut site gemarkeerd met "|". De verandering van de verwachte wild type sequentie wordt gegeven en het aantal klonen voor elke sequentie wordt gegeven tussen haakjes. (Afkortingen: + = inbrengen,-= deletie, ± = Indel) Alle niet-CRISPR geassocieerde sequentie disgelijkenissen zijn vetgevet. Figuur gemodelleerd naar Jao et al.60. B) aminozuursequentie die wordt voorspeld door gesequentieerde klonen uit Scn4aa knockdown B. Brachyistius in (a). Cas9-geïnduceerde veranderingen van de wild type sequentie worden rood gemarkeerd en het nucleotide geïnduceerde wijzigingsnummer wordt gegeven. C) tien tweede elektrische opnames van vier op elkaar afgestemde larven, allemaal 10 DPF in dezelfde opname kamer opgenomen. Versterkingsinstellingen zijn identiek voor alle traceringen. Sporen in het rood zijn van b. Brachyistius larven met bevestigde mutaties (één individu getoond in A, B hierboven), sporen in het zwart zijn van ongespoten b. Brachyistius larven. Over het algemeen toonde CRISPR/Cas9 editing van scn4aa een afname van de EOD-amplitude, hoewel het effect heterogeen was. Omgekeerde Eod's komen van de vis veranderende oriëntatie tijdens de opname. Er is desondanks geen verschil tussen experimentele vissen en controles. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 10
Afbeelding 10: doos plots van gemiddelde EOD amplitude van CRISPR en ongespoten grootte/leeftijd overeenkomende broers en zussen. A) EOD-amplitude van B. Brachyistius larven bij 10 DPF. Opgenomen met een winst van 100, CRISPR n = 56 EODs van twee individuen, ongespoten n = 114 Eod's van drie individuen. B) EOD-amplitude van B. gauderio larven bij 6 DPF. Opgenomen met een winst van 500, CRISPR n = 34 EODs van twee individuen, ongespoten n = 148 Eod's van drie individuen. Amplitude van CRISPR Fish was significant minder dan ongespoten controles (p < 2,2 x 10-16, Welch twee-monster t-test). Alle personen werden opgenomen met de in Figuur 7beschreven opname kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Beschrijving Volgorde
Constant oligomeren 5 '-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGC TATTTCTAGCTCTAAAAC-3 '
Doel oligomeren backbone (GG-N18, geen PAM) 5 '-TAATACGACTCACTATAGG-N18-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Target oligomeren backbone (N20, geen PAM) 5 '-TAATACGACTCACTATAG-N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Brienomyrus Brachyistius
scn4aa BB sgRNA target (N18, met PAM): 5 '-TCTTCCGCCCCTTCACCACGG-3 '
Scn4aa BB sgRNA oligomeren (GG-N18): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG TCTTCCGCCCCTTCACCA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
scn4aa BB PCR primer (218 BP)
Scn4aa_bb_exon1_F: 5 '-ATGGCCGGCCTTCTCAATAA-3 '
Scn4aa_bb_exon1_R: 5 '-TCTTCCAGGGGAATATTCATAAACT-3 '
Brachyhypopomus gauderio
Scn4aa BG sgRNA target (N17, met PAM): 5 '-CAAGAAGGATGTAGTGGAGG-3 '
Scn4aa BG sgRNA oligomeren (GG-N17): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG CAAGAAGGATGTAGTGG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Scn4aa BG PCR-primer paar (204 BP)
scn4aa_bg_exon1_F: 5 '-CGCCTTGTCCCTCCTTCAG-3 '
scn4aa_bg_exon1_R: 5 '-ATCTTCAGGTGGCTCTCCAT-3 '

Tabel 1: oligonucleotiden die nodig zijn voor het protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De fenotypische rijkdom van zwak elektrische vissen, samen met een recente proliferatie van genomics bronnen, motiveert een sterke behoefte aan functionele genomische gereedschappen in het zwak elektrische vismodel. Dit systeem is bijzonder aantrekkelijk vanwege de convergente evolutie van talrijke fenotypische eigenschappen in parallelle lijn afstanden van vissen, die gemakkelijk in het laboratorium worden bewaard.

Het hier beschreven protocol demonstreert de werkzaamheid van de CRISPR/Cas9 techniek in de lijn van zwak elektrische vissen die elektro genese en electroreceptie parallel ontwikkelden, en vormt daarom een belangrijke stap voor de belofte van dit model toekomstig werk in vergelijkende genomica van fenotypische evolutie.

Deze eenvoudige methodologische aanpak vereist alleen elementaire moleculaire biologie vaardigheden en training, na een basis aanneming van de Gagnon protocol38, op grote schaal gebruikt voor zebravis. Het is vermeldenswaard dat naarmate de technologie vordert, er zijn meer commerciële Kits voor sgRNA productie, evenals bedrijven die kunnen synthetiseren gids Rna's, waardoor dit protocol toegankelijker voor laboratoria die gebrek aan moleculaire biologie ervaring en apparatuur. We merken eerst op dat de hoge mutagenese efficiëntie direct fenotypen van geïnjecteerde larven mogelijk maakt. Er lijkt echter een aanzienlijke mate van fenotypische mosaïsme te zijn, wat niet ongewoon is en consistent is met de literatuur41,42,43,44. Bijvoorbeeld, in deze scn4aa studie, sommige individuen het dragen van mutaties tentoongesteld veel grotere amplitude EODS dan andere die relatief stil waren (Figuur 7, Figuur 8). Het is momenteel onduidelijk hoeveel van deze mutaties in de germline worden meegenomen. Onmiddellijke toekomstige inspanningen zullen worden gericht op het creëren van stabiele Mutant lijnen.

Het gebruik van de nhej-route voor Knockouts is slechts een van de verschillende mogelijke toepassingen van crispr/Cas9 genbewerking: de hier beschreven methoden zijn een opstap voor geavanceerdere toepassingen55,56. Toekomstige inspanningen moeten gericht zijn op het ontwerpen van gezamenlijk geïnjecteerde DNA-donor sjablonen met het sgRNA/Cas9-complex. Deze eenvoudige wijziging zou gebruikmaken van endogene template-gebaseerde reparatie mechanismen (dat wil zeggen, homologie gerichte reparatie, of HDR) en precieze knock-ins toestaan. Hoewel HDR optreedt op een lager rendement dan nhej benaderingen, is vooruitgang gemaakt om de werkzaamheid te verhogen57,58. Deze lagere efficiëntie vergt inspanningen om het ontwerp van de DNA-donor sjabloon/CRISPR/Cas9 construct te optimaliseren, de endogene reparatie mechanismen efficiënter te maken en de embryoproductie te verhogen (zie hieronder). Als dit probleem van de efficiëntie kan worden opgelost, knockins kan worden gebruikt om fluorescerende tags toe te voegen, een gemuleerde vorm van het genproduct te uiten, of verander Promoter of versterker sequenties.

Hoewel de moleculaire biologie achter deze techniek vrij eenvoudig is, zijn de eisen van de veehouderij substantieel, maar niet onoverkomelijk. B. gauderio zijn op grote schaal beschikbaar en fokken snel genoeg voor elk onderzoeksprogramma om een kolonie te hebben in minder dan een jaar. Daarentegen, B. Brachyistius ontwikkelt langzaam, en anatomische eigenaardigheden hebben bewezen pogingen bij IVF tot dusver tevergeefs. Andere, grotere soorten, zoals Campylomormyrus59 kan meer bevorderlijk zijn voor deze aanpak. Voor B. Brachyistiuswerden alle geïnjecteerde embryo's verzameld met behulp van de natuurlijke paai aanpak, die aanzienlijk meer arbeidsintensief is. Toekomstige inspanningen om de efficiëntie in B. Brachyistius IVF te verhogen, zullen een hogere opbrengst van embryo's mogelijk maken voor de hierboven beschreven efficiëntie problemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen de heroïsche inspanningen van Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, en Hope Healey voor hulp bij het verzamelen van vis, gegevensverzameling en vroege Protocol ontwikkeling. We willen ook de drie reviewers bedanken voor hun suggesties voor het manuscript. Wij geloven dat het eindproduct van betere kwaliteit is na het aanpakken van hun opmerkingen. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Science Foundation #1644965 en #1455405 aan JRG, en de natuurwetenschappen en Engineering Research Council DG subsidie aan VLS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 mg/mL RNA grade Glycogen Thermo Scientific R0551
50 bp DNA ladder NEB N3236L
Borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF100-58-10 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL PNA Biology CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector Fisher Scientific E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific 10289651
Hamilton syringe Fisher Scientific 14-824-654 referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe Fisher Scientific 06-666 referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
NEBuffer 3 NEB B7003S used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit NEB M0480L
Ovaprim Syndel USA https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm Fisher Scientific S37440 referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller WPI SU-P97 sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Reusable needle- requires customization Fisher Scientific 7803-02 Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase NEB M0203L Use with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated tools bonefolder.com T-SPATULA4PIECE referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system--twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, Pt 10 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, Pt 6 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, Pt 11 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
  29. Futuyma, Evolution. Third Edition. , Sinauer Associates Inc. (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist's Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G. Encyclopedia of Animal Behavior. Breed, M. D., Moore, J. 1, Academic Press. 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. , Springer. 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , Univ. of Oregon Press. (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 3 Pt B 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).

Tags

Biologie probleem 152 CRISPR/Cas9 elektrische vis eencellige Microinjection scn4aa elektrische orgel afscheiding genoom modificatie mormyrid gymnotiform
Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Constantinou, S. J., Nguyen, L.,… More

Constantinou, S. J., Nguyen, L., Kirschbaum, F., Salazar, V. L., Gallant, J. R. Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (152), e60253, doi:10.3791/60253 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter