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Biology

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60253
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Abstract

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Es gibt einen bemerkenswerten Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetische Architektur teilen. Dies wird vielleicht am besten durch die zahlreichen konvergenten Merkmale von Gymnotiformen und Mormyriden veranschaulicht, zwei artenreichen Teleostklades, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und schwach elektrischer Fisch genannt werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität nutzen, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklung, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften gewonnen, Zellphysiologie, Ökologie, Evolutionsbiologie und Verhalten. In jüngerer Zeit hat es eine Vermehrung genomischer Ressourcen für elektrische Fische gegeben. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse in Bezug auf den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten ermöglicht. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten schwach elektrischer Fische ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools. Wir berichten hier über ein vollständiges Protokoll zur Durchführung der CRISPR/Cas9-Mutagenese, das endogene DNA-Reparaturmechanismen in schwach elektrischen Fischen nutzt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll sowohl bei der mormyriden Art Brienomyrus brachyistius als auch bei der Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio gleichermaßen wirksam ist, indem wir CRISPR/Cas9 verwenden, um Indels und Punktmutationen im ersten Exon des Natriumkanalgen scn4aa. Mit diesem Protokoll wurden Embryonen beider Arten gewonnen und genotypisiert, um zu bestätigen, dass die vorhergesagten Mutationen im ersten Exon des Natriumkanals Scn4aa vorhanden waren. Der Knock-out-Erfolg-Phänotyp wurde mit Aufnahmen bestätigt, die reduzierte elektrische Organentladungsamplituden im Vergleich zu nicht injizierten größenangepassten Kontrollen zeigten.

Introduction

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Zwei Linien von Teleostfischen, Osteoglossiformen und Siluriformen, entwickelten parallel den Elektroempfang und fünf Linien von Teleosten (Gymnotiformes, Mormyriden und die Gattungen Astroscopus, Malapterurus und Synodontis) Elektrogenese parallel entwickelt. Es gibt einen auffälligen Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetischeArchitektur1,2,3.

Dies lässt sich vielleicht am besten an den zahlreichen konvergenten Merkmalen von Gymnotiformen und Mormyriden, zwei artenreichen Teleostkladen, am besten, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und als schwach elektrische Fische bezeichnet werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität verwenden, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren4, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklunggewonnen 1,5 ,6, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften7,8,9,10, Zellphysiologie11,12, Ökologie und Energetik13 ,14,15,16,17, Verhalten18,19und Makroevolution3,20,21 .

In jüngerer Zeit gab es eine Vermehrung von genomischen, transkriptomischen und proteomischen Ressourcen für elektrische Fische1,22,23,24,25,26, 27,28. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten1,2,3,28,29 ,30. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten von schwach elektrischen Fischen ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools31.

Ein solches Tool ist die kürzlich entwickelte Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats gepaart mit Cas9 Endonuklease (CRISPR/Cas9, CRISPR) Technik. CRISPR/Cas9 ist ein Genom-Editing-Tool, das sowohl in Modell32,33,34 als auch in Nicht-Modellorganismen35,36,37 gleichermaßen weit verbreitet ist. Die CRISPR/Cas9-Technologie hat sich so weit entwickelt, dass ein Labor, das in der Lage ist, grundlegende Molekularbiologie zu verwenden, problemlos genspezifische Sonden, sogenannte Kurzguide-RNAs (sgRNAs), zu niedrigen Kosten mit einer Nicht-Klonmethode38erzeugen kann. CRISPR hat Vorteile gegenüber anderen Knockout/Knockdown-Strategien, wie Morpholinos39,40, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleases (TALENs) und Zinkfingernukleasen (ZFNs), die teuer und zeitaufwändig für jedes Zielgen zu generieren.

Das CRISPR/Cas9-System funktioniert, um Genknockouts zu erzeugen, indem es auf eine bestimmte Region des Genoms abzielt, die durch die sgRNA-Sequenz gesteuert wird, und einen doppelsträngigen Bruch verursacht. Der doppelsträngige Bruch wird von der Zelle nachgewiesen und löst endogene DNA-Reparaturmechanismen vorzugsweise über den nicht-homologen Endjoining (NHEJ) aus. Dieser Weg ist sehr fehleranfällig: Während des Reparaturprozesses wird das DNA-Molekül oft Insertionen oder Deletionen (Indels) an der doppelsträngigen Bruchstelle enthalten. Diese Indels können zu einem Funktionsverlust führen, entweder durch (1) Verschiebungen im offenen Leserahmen, (2) das Einfügen eines vorzeitigen Stop-Codons oder (3) Verschiebungen in der kritischen Primärstruktur des Genprodukts. In diesem Protokoll verwenden wir CRISPR/Cas9-Bearbeitung, um Punktmutationen in Zielgenen mit dem NHEJ in schwach elektrischen Fischarten zu zielen. Obwohl einfacher und effizienter als andere Techniken, wird diese Methode der Mutagenese voraussichtlich zu einer Reihe von phänotypischen Schweregraden in F0führen, die dem genetischenMosaik41,42,43 zugeschrieben wird. 44.

Auswahl von Organismen
Um zukünftige Studien zur vergleichenden Genomik schwach elektrischer Fische zu erleichtern, musste eine repräsentative Art für Gymnotiformen und Mormyriden für die Protokollentwicklung ausgewählt werden. Nach Diskussionen während des Electric Fish Meeting 2016 in Montevideo, Uruguay, gab es einen Konsens in der Gemeinschaft, Arten zu nutzen, die bereits im Labor gezüchtet werden konnten und über genomische Ressourcen verfügten. Die Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio und die mormyrid Brienomyrus brachyistius wurden als Arten ausgewählt, die diesen Kriterien entsprechen. Bei beiden Arten sind natürliche Hinweise zur Induzieren und Aufrechterhaltung der Brutbedingungen in Gefangenschaft leicht nachzuahmen. B. gauderio, eine Gymnotiforme-Art aus Südamerika, hat den Vorteil eines geringen Haltungsbedarfs: Fische können in relativ kleinen (4 L) Tanks mit relativ hoher Dichte gehalten werden. B. gauderio hat auch einen schnellen Generationenumsatz unter captiveBedingungen. Unter Laborbedingungen kann sich B. gauderio in ca. 4 Monaten vom Ei zum Erwachsenen entwickeln.

B. brachyistius, eine Art von mormyrid Fischen aus West-Zentralafrika, brütet leicht in Gefangenschaft. B. brachyistius ist leicht über den Aquarienhandel verfügbar, wurde in vielen Studien weit verbreitet und verfügt nun über eine Reihe von genomischen Ressourcen zur Verfügung. Ihr Lebenszyklus erstreckt sich je nach Laborbedingungen über 1 bis 3 Jahre. Die Anforderungen an die Haltung sind für diese Art etwas intensiver und erfordern aufgrund ihrer Aggression während der Zucht mäßig große Tanks (50-100 L).

Laboratorien, die andere Arten von elektroelektrischen Fischen untersuchen, sollten in der Lage sein, dieses Protokoll leicht anzupassen, solange die Art gezüchtet werden kann, und einzellige Embryonen können gesammelt und ins Erwachsenenalter gebracht werden. Die Wohnungs-, Larvenhaltungs- und In-vitro-Fertilisationsraten (IVF) werden sich wahrscheinlich mit anderen Arten ändern; Dieses Protokoll kann jedoch als Ausgangspunkt für Zuchtversuche in anderen schwach elektrischen Fischen verwendet werden.

Ein ideales Genziel für den Proof of Concept: scn4aa
Schwach elektrische mormyrid und gymnotiform Fische erzeugen elektrische Felder (Elektrogenese) durch das Entladen eines spezialisierten Organs, genannt das elektrische Organ. Elektrische Organentladungen (EODs) ergeben sich aus der gleichzeitigen Produktion von Aktionspotentialen in den elektrischen Organzellen, den sogenannten Elektrozyten. EODs werden von einer Reihe von Elektrorezeptoren in der Haut detektiert, um hochauflösende elektrische Bilder der Umgebung des Fisches zu erstellen45. Schwach elektrische Fische sind auch in der Lage, Merkmale der EOD-Wellenformen18 ihrer konspezifischen EOD sowie deren Entladungsraten46zu erkennen, so dass EODs zusätzlich als soziales Kommunikationssignal analog zu Vogelgezwitscher oder Frosch fungieren können. Vokalisationen47.

Ein Hauptbestandteil der Wirkungspotentialerzeugung in den Elektrozyten von mormyrid und gymnotiform schwach elektrischen Fischen istder spannungsgebundene Natriumkanal NaV1.42 . Nicht-elektrische Teleosts exprimieren zwei paralogische Genkopien, Scn4aa und Scn4ab, die für den spannungsgebundenen Natriumkanal NaV1.430kodieren. In gymnotiform und mormyrid schwach elektrische Fischlinien, Scn4aa hat sich schnell entwickelt und untergezogen zahlreiche Aminosäuresubstitutionen, die seine kinetischen Eigenschaften beeinflussen48. Am wichtigsten ist, scn4aa hat sich in beiden Linien zum elektrischen Organ2,3. Die relativ eingeschränkte Expression von Scn4aa auf das elektrische Organ sowie seine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von EODs machen es zu einem idealen Ziel für CRISPR/Cas9-Knockout-Experimente, da es minimale schädliche pleiotrope Effekte hat. Da schwach elektrische Fische 6-8 Tage nach der Befruchtung (DPF) beginnen, ihre larvenelektrischen Organe zu entladen, eignet sich die Gezielte ungegheiten von Scn4aa ideal für die schnelle Phänotypisierung nach der Embryo-Mikroinjektion.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University genehmigt.

1. Auswahl von sgRNA-Zielen

HINWEIS: Für die manuelle Gestaltung von sgRNAs in Schritt 1.1 wird ein Protokoll bereitgestellt. Dies wurde für die scn4aa-Zielauswahl verwendet. Um diesen Prozess (Schritt 1.2) über das EFISHGENOMICS-Webportal zu erleichtern, wird ein zusätzliches Protokoll bereitgestellt. Es wird empfohlen, dass Benutzer Protokoll 1.2 auswählen, das mehrere automatisierte "Prüfungen" enthält, um den Erfolg beim Entwerfen von sgRNAs für benutzerdefinierte Ziele sicherzustellen.

  1. Entwerfen Sie sgRNA-Ziele.
    1. Für die Erzeugung von sgRNA-Führungsoligos ist es am besten, Exon 1 oder andere 5' Exons zu zielen. Die 5' UTR kann gezielt sein; Es ist jedoch am besten, die 5' Codierungssequenz zu zielen. Die Verwendung genomischer Informationen ist vorzuziehen, aber es ist möglich, erfolgreiche sgRNAs mit Transkriptomdaten zu entwickeln. Anmerkungen von Intron/Exon-Grenzen (genomische Daten) oder Exon-/Exongrenzen sind vorzuziehen.
    2. Die genomischen Kandidatensequenzen von 1.1 werden nach vermeintlichen Zielsequenzen durchsucht, die dem Muster 5'-N(18)-NGG-3' entsprechen. Dies kann automatisch mit Desktop-Sequenzanalysesoftware, benutzerdefinierten Skripten oder durch manuelle Scanprüfung von Sequenzen durchgeführt werden.
    3. Sequenzen können mit der Methode doench et al.49 für die On-Target-Aktivität priorisiert werden. Darüber hinaus können Zielsequenzen durch eine BLAST-Suche anhand genomischer/transkriptomischer Datenbanken für die Off-Target-Bindung ausgewertet werden.
    4. Stellen Sie sicher, dass Standard-PCR-Primer generiert werden können, die die Zielsequenz flankieren. Primer sollten mindestens 20 bp von beiden Seiten der Schnittstelle (drei Basen vor der NGG-Sequenz) sein. Idealerweise sollte das PCR-Produkt 150 bis 200 Basenpaare (bp) betragen.
    5. Design-Oligomere, die die oben genannten Kriterien erfüllen, unter Verwendung der folgenden Vorlage, die einen T7-Promotor (5' von N18) und eine komplementäre Region (3' von N18) zum Glühen zum konstanten Oligomer (1.1.6) umfasst: 5'-TAATACGACTCACTATAGG-N18 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'
      HINWEIS: Die N18-Sequenz enthält nicht die NGG-Protospacer-Benachbarte Motivsequenz (PAM). Nehmen Sie dies nicht in den Oligomer auf.
    6. Bestellen Sie den konstanten Oligomer (Tabelle 1), der zur Synthese aller sgRNAs, Oligomere für sgRNA-Ziele (Schritt 1.1.5) und PCR-Primer (Schritt 1.1.4) als Standard-Entsalzungsoligomere aus einem Oligonukleotid-Produktionsservice verwendet wird. Oligomere und PCR-Primer können als Standard-Entsalzungsoligomere bestellt werden, eine zusätzliche Reinigung ist nicht erforderlich.
  2. Führen Sie die automatisierte Konstruktion von sgRNA-Zielen durch.
    1. Wählen Sie mithilfe genomischer Daten ein Zielgen aus. Transkriptomdaten könnten stattdessen verwendet werden, wenn Exon-/Introngrenzen bekannt sind. Ziele können über das EFISHGENOMICS Portal (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu) identifiziert werden. Das ideale Ziel wird innerhalb von exon 1 sein; andere 5' Exons und die 5' UTR können jedoch in Betracht gezogen werden.
    2. Laden Sie nach der Identifizierung der Zielsequenz das frei verfügbare EFISHGENOMICS CRISPR Webtool (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). Dieses Web-Tool verwendet eine angepasste Version des CRISPOR-Algorithmus für die Zielgenerierung50,51.
    3. Geben Sie im Feld für Schritt 1den Namen der Sequenz ein und geben Sie die Sequenz des Ziels in das entsprechende Feld ein.
  3. Wählen Sie das entsprechende Genom aus, von dem die Sequenz stammt. Derzeit liegen genomische Daten für B. brachyistius und B. gauderiovor. Genomsequenzen sind für die Verwendung dieses Tools nicht erforderlich, sind aber nützlich bei der Bewertung potenzieller unerwünschter Off-Target-Effekte.
  4. Wählen Sie den entsprechenden PAM aus. Der 20 bp-NGG PAM wird empfohlen, obwohl je nach verwendetem Cas9-Protein mehrere zusätzliche PAM-Motive zur Auswahl stehen.
  5. Es wird ein Bericht mit der Position der Zielsequenz im Genom mit vorgeschlagenen Führungssequenzen generiert. Wählen Sie drei Ziele mit niedrigen vorhergesagten Off-Target-Effekten, hohen Spezifitätswerten und hohen Effizienzwerten aus. Die höchsten Bewertungsführungssequenzen werden auf der linken Seite grün hervorgehoben. Gelbe und rot hervorgehobene Führungssequenzen sollten möglichst vermieden werden.
  6. Ein Klick auf ausgewählte Zielsequenzen erzeugt einen umfassenden CRISPOR-Bericht. Die wichtigsten Informationen aus diesen Berichten sind für "T7 In-vitro-Expression aus sich überlappenden Oligonukleotiden". Extrahieren Sie aus diesem Bericht die folgenden Informationen: empfohlene sgRNA-Oligos, PCR-Primer für die Zielstelle und ein konstantes Oligomer, das zur Synthese aller sgRNAs verwendet wird.
  7. Bestellen Sie die ausgewählten Oligomere (Schritt 1.6) bei einem Oligonukleotid-Produktionsservice. Oligomere und PCR-Primer können als Standard-Entsalzungsoligomere bestellt werden, eine zusätzliche Reinigung ist nicht erforderlich.

2. Generieren sie sgRNA

  1. Neal-Oligomere in der PCR-Röhre: Fügen Sie 1 l mit 100 -M konstantem Oligomer, 1 l von 100 -M sgRNA-spezifischem Oligomer und 8 l nukleasefreies H2O hinzu.
  2. Annealoligomere in einem Thermocycler mit folgendem Programm: bei 95 °C 5 min erhitzen, bei -2 °C/s auf 85 °C abkühlen, bei 0,1 °C/s auf 25 °C abkühlen und bei 4 °C halten.
  3. Um eine sgRNA-Vorlage zu erzeugen, fügen Sie den geglühten Oligomeren ab Schritt 2.2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2,5 L dNTP-Mix (10 mM), 2 l 10x Puffer, 0,5 l T4-DNA-Polymerase und 5 l nukleasefreiesH2O hinzu. 20 min bei 12 °C inkubieren.
  4. Reinigen Sie die Vorlage mit einer PCR-Bereinigungsspalte gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  5. Elute in 20–30 l. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um Konzentration und Reinheit zu schätzen. Die Vorlage sollte 100–200 ng/l und 1.8–1.9 A260/280sein.
  6. Überprüfen Sie dies über ein Agarose-Gel, indem Sie 1–5 l ausführen. Das dominante Band sollte 120 bp sein. Siehe Abbildung 1A für repräsentative Ergebnisse.
  7. Gel-verifizierte sgRNA-Schablone bei -20 °C (langfristig) oder 4 °C (kurzfristig, 1–4 Wochen) lagern.
  8. Transscribe sgRNA mit T7 RNA Transkriptionskit durch Zugabe zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr bei Raumtemperatur 8 l dNTP-Mix (gleiche Volumina von dA, dT, dG, dC), 2 l von 10x Puffer (Raumtemperatur), 2 l T7-RNA-Polymerase, 100-200 ng sgRNA-Vorlage , und nukleasefrei H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 20 l. Drehen Sie, um unten zu sammeln. 2–4 h bei 37 °C inkubieren.
  9. Fügen Sie 1 L DNase hinzu und brüten zusätzlich 15 min bei 37 °C.
    1. Bereinigen Sie sgRNA, indem Sie 1 l Glykogen, 30 l nukleasefrei H2O, 30 l 5 M Ammoniumacetat und 180 l von 100% EtOH zu transkribierten sgRNA hinzufügen. Gut mischen und mindestens 20 min bei -80 °C (bis gefroren) oder bei -20 °C über Nacht inkubieren. Zentrifuge bei 4 °C für 15 min bei maximaler Geschwindigkeit.
  10. Überstand entfernen und entsorgen, ohne das Pellet zu stören, und mit 1 ml RNase-frei 70% EtOH bei -20 °C gekühlt waschen. Drehen Sie weitere 5 min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C.
  11. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und trocknen Sie das Pellet 5 min.
  12. Resuspend ieren in 30 l nukleasefreiH2O und bestimmen Reinheit und Ausbeute mittels UV-Spektroskopie (Mindestausbeute von 200 ng/l).
  13. Überprüfen Sie das Vorhandensein von sgRNA auf einem RNase-freien Gel. Die sgRNA erscheint aufgrund der Sekundärstruktur zwischen 50 und 150 bp als zwei Bänder (Abbildung 1B).
  14. Aliquot in 3 l und bei -80 °C lagern.

3. Validieren Schneideffizienz in vitro

  1. Extrahieren Sie genomische DNA aus der Zielart mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit. Ventralflossenausschnitte können verwendet werden, ohne den Fisch opfern zu müssen, da das Gewebe regeneriert wird.
  2. Verstärken Sie die Ziel-DNA-Region mit den Primern, die wie in den Schritten 1.6 und 1.7 beschrieben sind, mit Standard-PCR. Überprüfen Sie das Produkt durch Gelelektrophorese. Es wird vorgeschlagen, aber nicht erforderlich, das Fragment zu sequenzieren, um sicherzustellen, dass die richtige Region verstärkt wird. Repräsentative Ergebnisse für die Scn4aa-Vorlage sind in Abbildung 2dargestellt.
  3. Bereinigen Sie das PCR-Fragment mit einem etablierten Labor- oder Firmenprotokoll.
  4. Bewahren Sie die verstärkte DNA bei -20 °C auf. Erwägen Sie, es in Aliquots zu trennen, um Frost-Tau-Zyklen zu reduzieren.
  5. Bestimmen Sie die erforderlichen Mengen und Volumes der einzelnen Komponenten. Erwägen Sie negative Kontrollen (mit Ausnahme von sgRNA oder Cas9) und eine positive Kontrolle (eine zuvor getestete sgRNA, die ihre Ziel-PCR-verstärkte DNA spaltet), sofern verfügbar, sowie eine Konzentrationsreihe der sgRNA.
  6. Richten Sie das anschließende Reaktionsgemisch in der angegebenen Reihenfolge in einem PCR-Rohr bei Raumtemperatur ein und fügen Sie das sgRNA- und Cas9-Protein zuletzt hinzu, um beste Ergebnisse zu erzielen: 50–100 ng des Ziel-DNA-PCR-Produkts, 1 l 10x Puffer 3, 1 l mit 10x BSA (0,1 g/ml) , 50–200 ng Cas9-Protein (1 mg/ml, 150 ng vorgeschlagen) und 30–200 ng sgRNA (100 ng vorgeschlagen).
    1. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 1 h und dann bei 65 °C für 10 min, um Cas9-Protein zu inaktivieren.
    2. Führen Sie die gesamte Probe mit einem 2%–3% Agarose-Gel (erwartete Bandgrößen zwischen 30–200 bp) zusammen mit positiven und negativen Kontrollen aus. Erfolgreiche Spaltung kann einige der PCR-Produkt zeigen, sondern wird auch zwei kleinere Bänder haben. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt.

4. Embryonen erhalten

HINWEIS: Die Gewinnung von Embryonen von schwach elektrischen Fischen kann eine Herausforderung sein. Eine sorgfältige Überwachung der Wasserqualität, ausreichende Zeit für die Fischpflege und regelmäßige Fütterung sind der Schlüssel zu einem erfolgreichen Zuchtprogramm. Fische müssen zunächst für mehrere Wochen für die Fortpflanzung konditioniert werden52, wie in Protokollschritt 4.1 beschrieben. Im Anschluss daran wird ein Protokoll zur Erweiterung der natürlichen Gametogenese (4.2) zur Anwendung im natürlichen Laichverhalten (4.3) vorgestellt, eine alternative kürzlich entwickelte In-vitro-Technik zur Gewinnung präzise getimten Embryonen (4.4). Protokoll 4.3 ist gleichermaßen wirksam für B. brachyistius und B. gauderio, und Protokoll 4.4 ist überlegen in B. gauderio.

  1. Konditionierung
    1. Halten Sie B. brachyistius in Paaren/kleinen Gruppen (100–150 L-Tanks) oder in sehr großen Panzern (2 Männchen und 5–6 Weibchen in ca. 475 L-Tank), da sie unter Zuchtbedingungen sehr aggressiv werden. Es sollte mindestens 1–2 PVC-Rohre pro Fisch als Unterschlupf verwendet werden (Abbildung 3A,B).
    2. B. gauderio kann mit viel höherer Dichte aufgezogen werden. Halten Sie bis zu acht Personen in einem 100 L Tank (2 Männchen und 6 Weibchen). Es sollte mindestens 1 PVC-Rohr pro Fisch als Unterschlupf verwendet werden. Das Hinzufügen von verworrenen Garnen erhöht die Anreicherung und Verstecke. Fügen Sie 50 ml Zentrifugenrohre mit Löchern von 1 cm Durchmesser an die Oberseite des Tanks, damit Erwachsene auf natürliche Weise in die Rohre laichen können (Abbildung 3C).
    3. Füttern Sie während der Brutzeit täglich frische Schwarzwürmer, die mit gefrorenen Blutwürmern ergänzt werden. Die Nahrung kann auf Wunsch mit Vitaminen und Nahrungsergänzungsmitteln angereichert werden.
    4. Hausfische in der Regel in einer relativ hohen Leitfähigkeit (300–600 s), pH-ausgewogene Lösung. Während der Brutzeit, schrittweise senken Sie die Leitfähigkeit um mindestens die Hälfte im Laufe von 1-3 Wochen, um Gonadenrerosokzenz und Laichen zu induzieren. Geringere Leitfähigkeit durch tägliche Zugabe von Umkehrosmose (RO) Wasser, wobei die Aufmerksamkeit auf den pH-Wert bei niedriger Leitfähigkeit (pH <6) genau zu achten ist.
    5. Die Brutbedingungen können für ca. 3-5 Monate gehalten werden, wobei sich die Eiproduktion im Laufe der Zeit verjüngt. Nach dieser Zeit, rückkehre Fische langsam über 1-3 Wochen zu hoher Leitfähigkeit zurück. Halten Sie weitere 3 Monate bei hoher Leitfähigkeit, bevor Sie wieder Zuchtbedingungen ausgesetzt sind.
  2. Verwenden Sie Laichmittel (SGnRHa + Domperidon) Injektionen.
    1. Identifizieren Sie weibliche Fische in Zuchtbedingungen, die gravid erscheinen (Abbildung 4). In B. gauderio wird das Weibchen geschwollene Gonaden nur kaudal zum Schlot haben. B. brachyistius Weibchen haben geschwollene Bäuche und erscheinen tief körperbetont (Abbildung 4A). Männchen haben in der Regel kein Problem produzieren Spermien. Jedoch, größere Männchen werden aufgrund der größeren SpermienVolumen gesammelt bevorzugt.
      HINWEIS: Laichmittel ist ein kommerzieller Hormonmix, der die Reifung von Gameten erleichtert und das Laichen koordiniert. Wenn der Fisch in der Vergangenheit mit Laichmittel injiziert wurde, lassen Sie >4 Wochen Ruhe und reichlich Fütterung zwischen den Injektionen. Wir empfehlen, mindestens 2 Männchen und 4-5 Weibchen zu injizieren, um ein paar Gelege von Eiern und viel Sperma zu gewährleisten.
    2. Anästhesisieren Sie Fische in MS-222 (0,4 g/3 L) für ein paar Minuten, bis der Fisch nicht in der Lage ist, seine Haltung zu halten, ist unbeweglich, hat aber weiterhin eine operkuläre Bewegung (Stufe II53).
    3. Wiegen Sie die Fische (g), um die Laichmittelmenge zu berechnen( (0,5 l/g) + 0,5 l. Die zusätzlichen 0,5 -L-Konten sind für Pipettierfehler.
    4. Fügen Sie den Laichmittel zu 4x Puffervolumen (1x PBS oder DPBS) in einem PCR-Rohr hinzu und mischen Sie ihn gut. Die Lösung wird trüb. Es hilft, das Laichmittel auf Thermoplast zu verteilen und dann eine Pipette zu verwenden, um die berechnete Dosis zu messen. Das Laichmittel ist zähflüssig, also achten Sie darauf, die gesamte Dosis zu geben und vorsichtig mit Pipettieren zu sein.
    5. Pipette die Injektionslösung auf thermoplastische und ziehen Sie in eine Präzisionsglasspritze, luftblasenzu vermeiden. Wir empfehlen eine 28 G, 19–25 mm Lange, abgeschrägte Nadel.
    6. Injizieren Sie die Lösung in den dorsalen Rumpfmuskel mit einer glatten Rate. Lassen Sie die Nadel für 2-4 s sitzen und dann entfernen. Sofort Fisch in frisches Systemwasser zur Erholung geben.
    7. Nach ca. 24 h vorbereitung entose für die Entnahme von Embryonen (siehe 4.3 oder 4.4). Sammeln Sie alle notwendigen Materialien, einschließlich der notwendigkeit für die Einzelzell-Mikroinjektion (siehe Abschnitt 5).
  3. Erhalten Sie Embryonen durch natürliches Laichen.
    1. Haus Laichmittel injiziert Erwachsene (4.2) in einem großen 450 L Tanks. Die effektivsten Geschlechtsverhältnisse waren in der Regel 1–2 Männchen und 3–4 Weibchen mit ausreichenden Verstecken aus PVC-Rohren und dunklem Marmorsubstrat auf dem Tankboden, um den Eierkonsum zu verhindern. Marmor ist in der Regel wichtiger für B. brachyistius als B. gauderio, die es vorziehen, ihre klebrigen Eier in Spalten oder 50 ml Zentrifugenröhren wie oben beschrieben ablagern.
    2. Platzieren Sie Fische in einem umgekehrten Lichtkreislauf, um das nächtliche Laichen an die regulären Laborarbeitszeiten anzugleichen. Überwachen Sie Fische mithilfe eines standardgesteuerten Sicherheitssystems für Verbraucher mithilfe von Infrarotbeleuchtung, um Störungen von einem fernangeschlossenen PC zu minimieren (Abbildung 3).
    3. Die Fische laichen spontan während der dunklen Photoperiode ca. 24 h nach der Laichmittelinjektion.
    4. Wenn das Laichen beginnt, sammeln Sie Eier stündlich, während das Laichverhalten auftritt. Sammeln Sie in B. brachyistius Eier mit einem Siphon mit kleinem Durchmesser über einem feinen Baumwollnetz, um Schäden an den frisch laichenden Eiern zu minimieren. Sammeln Sie B. gauderio Eier aus 50 ml Zentrifugenrohren oder Tanksubstrat. Arbeiten Sie effizient mit minimalen Störungen beim Laichen von Fischen, indem Sie eine Stirnlampe mit einem roten Licht niedriger Intensität verwenden. Da die erste Spaltung etwa 1 h nach der Befruchtung (HPF) auftritt, eignet sich ein großer Teil der Eier für die Einzelzell-Mikroinjektion.
    5. Fahren Sie sofort zur Mikroinjektion fort (siehe Abschnitt 5).
  4. Squeeze Männchen für In-vitro-Fertilisation von B. gauderio.
    1. Bereiten Sie die Spermien-Extender-Lösung (SES) wie in The Zebrafish Book54beschrieben: 10 mM HEPES, 80 mM KCl, 45 mM NaCl, 45 mM Natriumacetat, 0,4 mM CaCl2und 0,2 mM MgCl2vor.
      1. Verwenden Sie ddH2O, um die Lautstärke zu erhöhen und den pH-Wert auf 7,7 mit 1 M NaOH einzustellen.
      2. Im Kühlschrank aufbewahren.
      3. Filtern Sie vor der Verwendung durch einen 0,22-mm-Filter.
    2. Anästhesisieren Sie Fische in MS-222 (0,4 g/3 L) für ein paar Minuten, bis der Fisch nicht in der Lage ist, seine Haltung zu halten, ist unbeweglich, hat aber weiterhin eine operkuläre Bewegung (Stufe II53). Legen Sie 500 L Aliquots von SES in Eis.
    3. Trockene Hände und Fisch gründlich, vor allem um den Kopf und Entlüftung. Legen Sie die ventrale Seite nach oben, vordernach links (für Rechtshänder) in einen Polystyrolschaum/Schwammhalter, der mit einem mit MS-222 getränkten, feuchten Papiertuch bedeckt ist. Der Kopf sollte so parallel wie möglich mit dem Tisch sein.
      HINWEIS: Die Schritte 4.4.4–4.4.6 sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, und die Fische sollten nur für 30–60 s aus dem Wasser sein.
    4. Wenden Sie Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich medial über die Gonaden in Richtung des Entlüftungsschachts quetscht. Die Fische können Abfälle vertreiben. Achten Sie darauf, die Entlüftung mit einem empfindlichen Aufgabenwisch zu reinigen, wenn Abfälle ausgestoßen werden. Sammeln Sie keine Abfälle mit Spermien. Je nach Größe des Männchens sind 10-60 l üblich.
    5. Mit einem Mikropipetter mit einer Spitze, sorgfältig sammeln Sie das Sperma, wie es aus dem Männchen in 50 L-Schritten gepresst wird. Setzen Sie Spermien direkt in 500 L Aliquots von SES auf Eis. Es kann hilfreich sein, einen anderen Forscher beim Sammeln von Spermien zu haben, während der andere drückt. Sperma sollte so schnell wie möglich verwendet werden, bleibt aber für mindestens 1 h lebensfähig.
    6. Unmittelbar nach dem Sammeln, fischin frisches Systemwasser zur Erholung geben. Die Fische sollten nur für 30-60 s aus dem Wasser sein.
  5. Pressweibchen zur In-vitro-Fertilisation von B. gauderiodrücken.
    1. Anästhesisieren Sie Fische in MS-222 (0,4 g/3 L) für ein paar Minuten, bis der Fisch nicht in der Lage ist, seine Haltung zu halten, ist unbeweglich, hat aber weiterhin eine operkuläre Bewegung (Stufe II53). Setzen Sie Das Polytetrafluorethenblech auf den Arbeitsplatz.
      HINWEIS: Die Abschnitte 4.5.1–4.5.5 sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, und die Fische sollten nur für 30–60 s aus dem Wasser sein.
    2. Trockene Hände, Werkzeuge, Polytetrafluorethenblech und Fische gründlich, vor allem um den Kopf und Entlüftung. Auf der Seite mit dem Kopf nach vorn (für Rechtshänder).
    3. Wenden Sie Druck in der kaudalen bis rostralen Richtung mit Licht, das sich medial über die Gonaden in Richtung des Entlüftungsschachts quetscht. Die Fische können Abfälle vertreiben. Achten Sie darauf, die Entlüftung mit einem empfindlichen Aufgabenwisch zu reinigen, wenn Abfälle ausgestoßen werden. Je nach Größe des Fisches sind 20 bis 150 Eier üblich. Mit einem polytetrafluorethenbeschichteten Spachtel/Werkzeug sammeln Sie sorgfältig Eier, wie sie aus der Kloake gepresst werden. Eier schnell in eine kleine Petrischale bewegen und bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Eier während dieses Prozesses trocken bleiben. Alternativ, nach dem Quetschen, berühren Sie die Eimasse an der Basis einer kleinen Petrischale oder auf das Polytetrafluorethenblatt, wie sie vom Weibchen ausgestoßen werden.
    4. Unmittelbar nach dem Sammeln, setzen Sie die Fische in frisches System Wasser für die Erholung.
  6. Durchführung der Eidüngung zur In-vitro-Fertilisation von B. gauderio.
    1. Fügen Sie 100 l gut gemischte Spermien in SES (siehe Schritt 4.4) direkt über die Eimasse hinzu.
    2. Fügen Sie 1 ml Systemwasser hinzu (gefiltert durch einen 0,22-m-Filter) und mischen Sie gut für 30–60 s.
    3. Fügen Sie ein zusätzliches 1-2 ml Systemwasser hinzu (lassen Sie etwas Platz in der Petrischale) und legen Sie es in den Inkubator. Rekordzeit der IVF auf Petrischale und bewegen Sie sich auf einen 29 °C Inkubator. Stellen Sie einen 50-minuten-Timer ein, um den Entwicklungsfortschritt zu überprüfen (z. B. Bildung der Einzelzelle am Tiermast, siehe Abbildung 6). Bereiten Sie während dieser Zeit Materialien für die Mikroinjektion vor.

5. Einzelzellige Mikroinjektion

  1. Ziehen Sie Mikroinjektionsnadeln vor Laichmittelinjektionen (Schritt 4.2) oder natürlichem Laichen (Schritt 4.3). Verwenden Sie eine Borosilikatglaskapillare mit einem Filament (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm Länge) und einem Nadelzieher, um Mikroinjektionsnadeln zu ziehen. Bereiten Sie 2–4 Nadeln pro geplanter Behandlungsinjektion vor.
    HINWEIS: Backloading-Nadeln mit einem Filament werden bevorzugt, da das Filament die Lösung zur Spitze leitet und Blasen eliminiert. Es können jedoch Nadeln ohne Filament verwendet werden, und die Frontloading sollte keinen Einfluss auf das Ergebnis haben. Die Nadel sollte eine lange, aber stabile Verjüngung haben. Verwenden Sie das Nadelziehen Programm mit den folgenden Spezifikationen als Ausgangspunkt: Hitze = 500; Ziehen = 70; Geschwindigkeit = 70; und Zeit = 100. Repräsentative Nadelmorphologien sind in Abbildung 5Adargestellt.
  2. Bereiten Sie Injektionslösung und bereiten Nadel.
    1. Fügen Sie 0,9 l sgRNA und 0,9 l Cas9-Enzym (1 mg/ml) zu 0,2 l von 10 % oder 100 % Phenolrot (für 1 % bzw. 10 % endgültige Phenol-Rotkonzentration) in einer PCR-Röhre hinzu. Mischen Sie gut und lassen Sie auf dem Eis sitzen 2-5 min, damit sgRNA und Cas9 komplex werden. Berechnen Sie die Endkonzentration von sgRNA, Cas9 und Phenolrot in der Injektionslösung.
      HINWEIS: Wenn es Probleme mit der Nadelverstopfung oder Schneideffizienz mit dem oben genannten Rezept gibt, kann es nützlich sein, eine 1x endkonzentrierte Salz-Puffer-Mischung zu verwenden, um Cas9 zu stabilisieren und Nadelverstopfung zu verhindern.
    2. Verwenden Sie eine Mikrolader-Pipettenspitze, um die 2 L Lösung in die Mikroinjektionsnadel zurückzuladen. Die Flüssigkeit so nah wie möglich an der Spitze vertreiben.
    3. Nadel in Mikromanipulator einladen und Druckeinstellungen einstellen (beginnen Sie mit 775 pi, 0,1 x 0,2 s und 8-12 pc).
    4. Verwenden Sie im Rahmen des Bereichs ein Paar feine Zangen, um die Nadelspitze in einem abgeschrägten Winkel zu brechen. Brechen Sie in Richtung, wo die Verjüngung der Nadel beginnt, Steifigkeit zu haben. Es ist am besten, näher an der Spitze zu brechen, die Größe der Injektionslösung zu testen und dann weiter zu brechen, wenn nötig. Die Bohrung der Nadel sollte so klein wie möglich bleiben, während eine starre Verjüngung beibehalten wird (Abbildung 5A).
    5. Verwenden Sie Mineralöl und ein Mikrometer, um die Größe der Injektionslösung zu messen. 1–2 nL wird in der Regel verwendet; 0,1 mm Durchmesser ist 0,5 nL.
    6. Passen Sie die Nadelspitze oder die Druckeinstellungen an, um ein Injektionsvolumen innerhalb der Spezifikationen zu erhalten.
  3. Identifizieren Sie sich entwickelnde Zygoten und bereiten Sie injektionsphase vor. Richten Sie die Injektionsphase ein. Nehmen Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm. Invertieren Sie den Boden und platzieren Sie unter der umgekehrten Oberseite. Legen Sie einen Glasmikroskopschlitten in die umgekehrte Oberseite. Je nachdem, wie Ihr Mikromanipulator an den Bereich montiert ist, kann die zusätzliche Höhe von der invertierten Basis nicht erforderlich sein.
    1. Schauen Sie sich die sich entwickelnden Eier an und identifizieren Sie vermutete befruchtete Zygoten 50–60 min nach IVF. Der Tierpol beginnt sich zu bilden und es wird einen Überschuss an kleinen Fetttröpfchen um die Eigelb/Tierzellschnittstelle geben (Abbildung 6).
    2. Sammeln Sie 10–20 Eier mit so wenig Wasser wie möglich mit einer Kunststoff-Transferpipette (schneiden Sie die Spitze leicht, damit Eier passieren) und legen Sie auf den Rand der Rutsche. Wasser wird unter der Rutsche böse sein und Eier gegen den Rand ziehen.
    3. Verwenden Sie eine empfindliche Aufgabe wischen und drücken Sie vorsichtig die Rutsche, um überschüssiges Wasser zu entfernen und lassen Sie die Eier fest am Rand der Rutsche haften. Es sollte gerade genug Wasser vorhanden sein, um die Eier feucht zu halten und dabei wenig stehende Feuchtigkeit zu erhalten, um die Eibewegung während der Injektion zu vermeiden.
  4. Direkt in einzelzelle injizieren.
    1. Richten Sie die Eier vertikal, senkrecht zur nahenden Nadel (Abbildung 5B), an der Folie aus.
    2. Positionieren Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator gegen den Chorion. In etwa einem Winkel von 45° die Nadel in die Chorion und dann in die Einzelzelle einfügen. Es kann hilfreich sein, die einzelne Zelle durch das Eigelb zu betreten. Das Verschieben sowohl der Injektionsstufe mit der freien Hand als auch des Mikromanipulators kann mehr Kontrolle über den Injektionsprozess bieten (Abbildung 5B).
    3. Injizieren Sie sgRNA/Cas9/phenolrote Lösung in die Einzelzelle. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig. Fahren Sie mit dem nächsten Ei fort und wiederholen Sie die Schritte 5.4.1–5.4.3, bis alle Eier injiziert sind.
    4. Entfernen Sie alle Eier, die während der Injektion mit feiner Zange gebrochen wurden. Verwenden Sie 0,22 m gefiltertes Systemwasser in einer Spritzflasche, um Eier vorsichtig aus der Injektionsstufe in eine neue Petrischale mit 100 mm Durchmesser zu entfernen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.3–5.4.6, bis alle Eier injiziert wurden oder sich bis zum Zweizellstadium entwickelt haben. Stellen Sie sicher, dass etwa 20 mutmaßlich befruchtete Eier als No-Injection-Kontrolle beiseite gelegt werden, um die Befruchtungsraten und den Injektionserfolg zu bestimmen. Für größere Gelege verwenden sie nicht injizierte Embryonen, die sich bis in die Zweizellstufe entwickelt haben, und für kleinere Gelege, die vermeintlich befruchtete Eier beiseite legen.
    6. Betrachten Sie außerdem eine sgRNA/Injektionskontrolle, indem Sie 15–25 Embryonen mit Cas9 injizieren, die mit einer sgRNA komplexiert sind, gegen ein Gen, das nicht im Genom vorhanden ist. Das GFP-Gen, das für Embryonen des wilden Typs empfohlen wird. Zeichnen Sie die Anzahl der Eier, Eltern, IVF-Zeit und Datum auf jeder Petrischale auf. SgRNA-Ziel oder -Etikett als nicht injiziert einschließen. Wechseln Sie zu einem 29 °C Inkubator.

6. Tierhaltung

  1. Pflege für die Eier.
    1. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Eizellen 4–6 h nach Injektionen.
    2. Erfassen Sie die Anzahl der toten Eier, sowie alle, die unbefruchtet sind. Die unbefruchteten Eier werden um das Acht-Zellen-Stadium herum verhaften und haben ein Rosettenmuster der Zellen am Tierpol (Abbildung 6). Je nach Anzahl der abgestorbenen Eier und Menge an Eiabfällen im Wasser, entfernen Sie mindestens 50%–80% des Wassers und ersetzen Sie es durch gefiltertes Systemwasser. Es kann hilfreich sein, den Boden der Petrischale zu schrubben, wenn sich ein Zellabfallfilm oder Biofilm bildet.
    3. Für die nächsten 2-3 Tage, überprüfen Sie Eier 1-2x täglich. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.2–6.1.3 jedes Mal, wenn die Eier kontrolliert werden.
    4. Nach 2 bis 3 Tagen schlüpfen die Larven. Entfernen Sie alle Eidärdgehäuse, während sie schlüpfen. SanfteS Pipettieren kann helfen, halb geschlüpfte Larven zu befreien.
  2. Pflege von Larven.
    1. Überprüfen Sie die Eier 1 x 2x täglich. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.2–6.1.3 jedes Mal, wenn die Larven überprüft werden.
    2. Von 6-14 DPF, Füttern Sie Essigaale zu den Larven. Ein leichter Überschuss an Nahrung ist gut, denn die Essigaale bleiben im Gericht am Leben. Fügen Sie bei jeder Kontrolle und Reinigung des Tellers Essigaale hinzu.
    3. Von 11–14 DPF, fügen Sie 5–10 frisch geschlüpfte Artemia pro Larven zusätzlich zu Essigaale. Während dieser Zeit werden die Larven lernen, die frei schwimmende Artemiazu essen.
    4. Bei 15 DPF Larven in Eierbecher (siehe Abschnitt 6.2.5) in einem Tank mit fließendem Wasser, Filtration und Belüftung bewegen. Es sollte nicht mehr als etwa 25 Embryonen pro Tasse sein. Eierbecher sind Plastikbecher mit einem Netz auf der Unterseite. Eine 100 mm Petrischale oben/unten kann auf der Unterseite der Eiertasse hinzugefügt werden, um zu verhindern, dass Lebensmittel durch das Netz fallen. Eierbecher ermöglichen es, die Fische aus Gründen der Wasserqualität in einer größeren Wassermenge unterzubringen und gleichzeitig diskrete Gruppen zu halten. Fügen Sie weiterhin sowohl Essigaale als auch 15 bis 30 frisch geschlüpfte Artemia pro Larven von den Tagen 15 bis 18 hinzu. Reinigen Sie Petri Schale Stück täglich und verwenden Sie eine Pipette, um Massen von toten Artemiazu entfernen.
    5. Von den Tagen 18 bis 30, füttern Nur frisch geschlüpft Artemia. Erhöhen Sie die Fütterungsmenge, wenn die Fische wachsen und wenn Schwanzbeißen gesehen wird.
    6. Nach ca. 30 Tagen, bewegen Sie Fische in 10 L (2,5 Gallonen) Tanks, etwa 25 Personen pro Tank. Stellen Sie sicher, dass es Filtration, Belüftung und Versteckplätze gibt. Betrachten Sie zylindrische Biofiltrationsmedien und PVC-Rohre mit kleinem Durchmesser.
    7. Füttern Sie frisch geschlüpfte Artemia und Schwarzwürmer von etwa 30 bis 45 Tagen. Standardreinigung und Wasserwechsel für den Tank (d. h. bei einem Wasserwechsel von mindestens 10 % bis 20 % pro 1 Woche).
    8. Füttern Sie nach 45 DPF nur Schwarzwürmer bis zu 60 DPF.
    9. Nach 60 DPF, verschieben Kohorten von etwa 15 Fischen in 40 L (10 Gallonen) Tanks und beginnen Erwachsenen Haltungsverfahren. Fügen Sie PVC-Rohre und ein Garn "Mop" (eine Masse von braunem Garn um einen Kork gebunden) für Verstecke(Abbildung 3C). Fische sollten sich nach etwa 3 bis 4 Monaten nach der Düngung der Brutgröße (10 bis 12 cm) nähern.

7. Ehemann für Erwachsene

  1. Füttern Sie Fische täglich mit genügend Schwarzwürmern, so dass bei der nächsten Fütterung eine kleine Menge Schwarzwürmer vorhanden sind. Diese ad libitum Fütterung ermöglicht maximales Wachstum.
  2. Ein paar Mal pro Woche kann es hilfreich sein, die Schwarzwurmfütterung mit Blutwürmern zu ergänzen.
  3. Reinigen Sie Tanks alle 2–4 Wochen mit einem Wasserwechsel von 20 bis 30 %. Wenn der Garnmop voller Biofilm/Algen wird, reiben Sie ihn unter RO-Wasser sauber.

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Representative Results

Die sgRNA-Zielstandorte wurden innerhalb von Exon 1 von Scn4aa sowohl in B. gauderio als auch in B. brachyistius identifiziert, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Die sgRNAs wurden wie in Abschnitt 2 beschrieben generiert. Nach erfolgreicher sgRNA-Auswahl und -Synthese (Abbildung 1) wurde die In-vitro-Spaltung getestet (Abbildung 2). Die sgRNAs, die In-vitro-Schneiden demonstrieren, wurden dann für einzellige Mikroinjektionen ausgewählt.

Erwachsene Fische wurden zur Fortpflanzung konditioniert (Abschnitt 4.1), dann mit einem Laichmittel injiziert (Abschnitt 4.2) und anschließendfürIVF gepresst, wie in Abschnitt 4.4 beschrieben, oder durften natürlich laichen (B. brachyistius) wie abschnitt 4.3 beschrieben. Diese Bemühungen ergaben einzellige Embryonen für die Mikroinjektion bei beiden Arten. Wie in Abschnitt 5 beschrieben, wurde in der Einzellphase 1,5-2,0 nL des scn4aa sgRNA/Cas9/phenol-roten Komplexes (65-190 ng/uL sgRNA, 450 ng/uL Cas9, 1%-10% phenolrot, Endkonzentrationen) injiziert. Eier aus der gleichen Kupplung wurden als nicht injizierte Steuerungen verwendet. Alle Embryonen wurden wie in Abschnitt 6 beschrieben gepflegt. Nach IVF wurden 40 %–90 % der Eier befruchtet, und 70 %–90 % der Embryonen überlebten nach der Injektion das Schlüpfen.

Etwa 75% der Fische überlebten 6-11 DPF und wurden dann phänotypisiert. Larval-Fische wurden in eine 35-mm-Petrischale gelegt, die in eine größere Schale mit Sylgard immobilisierten Ag/Cl-Aufnahmeelektroden eingebettet war (Abbildung 7A). Die Embryobewegung wurde mit 3% Agaroseformen, die mit Systemwasser hergestellt und geschnitten wurden, um den Embryo zu passen, eingeschränkt (Abbildung 7B). Die gleiche Aufnahmekammer wurde für beide Arten verwendet und die gleiche Agarose-Form wurde unter Artenvergleichen verwendet. Embryonen wurden für 60 s aufgezeichnet, was ausreicht, um Hunderte von EODs zu erfassen. Für den Vergleich wurden nicht eingefügte Steuerelemente mit Alter und Größe ausgewählt. Zu diesem Zeitpunkt weisen 10%–30% der überlebenden Embryonen eine reduzierte Amplitude-EOD auf. Embryonen mit einer Verringerung der EOD-Amplitude ohne offensichtliche morphologische Defekte und Kontrollnichtinjizierungen wurden für die DNA-Extraktion und die anschließende PCR der Scn4aa-Zielstelle verdaut. Es gab oft eine Reihe von Penetranz des Phänotyps, mit einigen Personen mit einer stärkeren Reduktion der EOD-Amplitude als andere.

Nach dem Aufräumen und Klonen der PCR wurden 30+ Klone aus jedem Embryo für die Sanger-Sequenzierung ausgewählt. CRISPR/Cas9 induzierte Mutationen wurden bei B. gauderio (Abbildung 8A,B) und B. brachyistius (Abbildung 9A,B) Personen mit starker EOD-Amplitudenreduktion identifiziert (Abbildung 8C und Abbildung 9C wobei nicht injizierte Kontrollen nur Referenzgenotypen hatten. Die Visualisierung der EOD-Amplitude zwischen bestätigten Mutanten ("CRISPR") und Alter/Größe, die nicht injiziert wurden, zeigte, dass sowohl Scn4aa mutant B. brachyistius (Abbildung 10A) als auch B. gauderio (Abbildung 10B) ) Embryonen hatten eine deutlich geringere EOD-Amplitude als Kontrollen (p < 2,2 x 10-16, Welch-Zwei-Probe-t-Test). CRISPR/Cas9 Targeting von Scn4aa war sowohl bei B. brachyistius als auch bei B. gauderio erfolgreich und implicate scn4aa in der Larven-/frühen Elektrozytenentladung bei beidenArten.

Figure 1
Abbildung 1: sgRNA-Vorlagensynthese und Transkription. (A) Gelbild der sgRNA-Vorlagensynthese. Die Bezeichnungen entsprechen verschiedenen sgRNAs für myod (MYO2, MYO1) und drei sgRNAs für scn4aa (S1-S3). Nach dem Glühen der Oligomere wird eine Vorlage von 120 bp erzeugt. (B) Gelbild der sgRNA-Transkription für drei sgRNAs für B. gauderio (bg2017) und zwei für B. brachyistius (bb2016, 2017). Die sgRNA erscheint aufgrund der sekundären Struktur als zwei Bänder und liegt zwischen 50 und 150 bp, wenn eine dsDNA-Leiter verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentatives Gelbild erfolgreicher (sg1) und erfolgloser (sg2) IN-vitro-CRISPR-Assays. Eine entsprechende Menge an Vorlage ohne CRISPR-Komponenten wird in der scn4aa-Spur angezeigt. Beachten Sie die doppelten Bänder in sg1, die zeigen, dass das Schneiden stattgefunden hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Zuchttank-Setups für schwach elektrische Fische. (A) Schematic des typischen Setups für die drahtlose Videoüberwachung des Laichverhaltens. Drei handelsübliche CCTV-Kameras (Swann, Inc.), die Infrarotlicht erzeugen können, sind auf die Oberseite des Wassers ausgerichtet und mit einem digitalen Videorecorder (DVR) verbunden. Video wird in Echtzeit auf das Laichverhalten in einem angrenzenden Raum von einem netzwerkverbundenen Computer (PC) überwacht. (B) Laichverhalten, das mit einem solchen Setup in B. brachyistiuserfasst wurde. (C) Ein typisches Zucht-Setup für B. gauderio mit PVC-Versteckrohren und Garnmops. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Zucht von Männchen und Weibchen. (A) B. brachyistius und (B) B. gauderio. Beide Arten sind sexuell dimorph und optisch leicht zu unterscheiden, wenn sie geschlechtsreif sind. Beide Weibchen sind auf diesen Fotos gravid und zeigen charakteristisch geschwollene Bäuche, die voll von reifen Eiern sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Mikroinjektion. (A) Glaskapillarnadelspitzen müssen gebrochen werden, um ein geeignetes Mikroinjektionsvolumen zu liefern. Die Spitze auf der linken Seite ist ungebrochen. Die mittleren und rechten Spitzen sind mit einer leicht abgewinkelten Abschrägung gebrochen, um die Ei-Chorion zu durchbohren. (B) Eier werden gegen eine Glasrutsche ausgekleidet (1%–10% Phenolrot ist als Tracer enthalten, um die Abgabe der Injektion zu visualisieren) und mit Glaskapillarnadeln injiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Entwicklungsstadien. (A) B. gauderio und (B) B. brachyistius. Alle Eier werden befruchtet angenommen und die Entwicklung wird auf 24 HPF überwacht. Zwischen 12 und 24 HPF-Embryonen sind in lebensfähigen Eiern sichtbar, ansonsten weisen Eier einen Abbau auf. Bei der Eiaktivierung, unabhängig von der Befruchtung, scheinen mehrere Divisionen stattfinden zu können. Unbefruchtete Eier weisen ungewöhnliche Dekolletémuster auf, die in befruchteten Eiern viel symmetrischer sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Foto der in dieser Studie verwendeten Larvenaufnahmekammer. (A) Die Elektroden sind in Sylguard eingebettet, erstrecken sich aber in die 35mm Schale, die einen Embryo enthält, der über eine 3% Agaroseform eingeschränkt ist. (B) Höherevergrößerung simonieren die eingeschränkte Bewegung des Embryos durch Agarose. Beachten Sie die Stücke von Agarose, die entfernt werden können, wenn der Embryo die Größe ändert. B. gauderio embryo ist gegenüber der positiven Elektrode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: CRISPR/Cas9 induzierte Mutationen in B. gauderio. (A) Zweiunddreißig Klonsequenzen aus der genomischen DNA von Cas9-induzierten Mutationen in einem einzelnen Scn4aa gezielt F0B. gauderio embryo (11 DPF). Die Referenzsequenz wird unterstrichen, wobei die sgRNA-Zielsite grau hervorgehoben, die Protospacer-benachbarte Motivfolge (PAM) rot hervorgehoben und die Cas9-Schnittstelle mit "|" markiert ist. Die Änderung von der erwarteten Wildtypsequenz wird angegeben, und die Anzahl der Klone für jede Sequenz wird in Klammern angegeben. (Abkürzungen: + = Einfügen, - = Löschen, n = Indel) Alle nicht-CRISPR zugeordneten Sequenzunterschiede werden fett formatiert. Abbildung nach Dematorischem Vorbild für Jao et al.60. (B) Aminosäuresequenz, die aus sequenzierten Klonen von scn4aa knockdown B. gauderio aus (A )vorhergesagt wird. Cas9-induzierte Veränderungen aus der Wildtypsequenz werden rot hervorgehoben und die Nukleotid-induzierte Änderungsnummer angegeben. (C) ZwanzigSekunden elektrische Aufnahmen von fünf größenangepassten Larven, alle aufgenommen 6 DPF in derselben Aufnahmekammer. Die Gain-Einstellungen sind für alle Ablaufverfolgungen identisch. Die spurenrot stammen von B. gauderio larven mit bestätigten Mutationen (ein Individuum in Abbildung 8A, B oben), Spuren in Schwarz stammen von nicht injizierten B. gauderio Larven. Insgesamt zeigte die CRISPR/Cas9-Bearbeitung von Scn4aa eine Reduktion der EOD-Amplitude, obwohl der Effekt heterogen war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: CRISPR/Cas9 induzierte Mutationen bei B. brachyistius. (A) Zweiundvierzig Klonsequenzen aus der genomischen DNA von Cas9-induzierten Mutationen in einem einzelnen Scn4aa gezielt F0B. brachyistius embryo (11 DPF). Die Referenzsequenz wird unterstrichen, wobei die sgRNA-Zielsite grau hervorgehoben, die Protospacer-benachbarte Motivfolge (PAM) rot hervorgehoben und die Cas9-Schnittstelle mit "|" markiert ist. Die Änderung von der erwarteten Wildtypsequenz wird angegeben, und die Anzahl der Klone für jede Sequenz wird in Klammern angegeben. (Abkürzungen: + = Einfügen, - = Löschen, n = Indel) Alle nicht-CRISPR zugeordneten Sequenzunterschiede werden fett formatiert. Abbildung nach Dematorischem Vorbild für Jao et al.60. (B) Aminosäuresequenz, die von sequenzierten Klonen von scn4aa knockdown B. brachyistius in (A )vorhergesagt wird. Cas9-induzierte Veränderungen aus der Wildtypsequenz werden rot hervorgehoben und die Nukleotid-induzierte Änderungsnummer angegeben. (C) Zehn Sekunden elektrische Aufnahmen von vier größenangepassten Larven, alle 10 DPF in derselben Aufnahmekammer aufgenommen. Die Gain-Einstellungen sind für alle Ablaufverfolgungen identisch. Spuren in Rot stammen von B. brachyistius larven mit bestätigten Mutationen (ein Individuum in A, B oben), Spuren in Schwarz sind von nicht injizierten B. brachyistius larven. Insgesamt zeigte die CRISPR/Cas9-Bearbeitung von Scn4aa eine Reduktion der EOD-Amplitude, obwohl der Effekt heterogen war. Invertierte EODs stammen von den Fischen, die während der Aufnahme die Orientierung ändern. Trotzdem ist kein Unterschied zwischen Versuchsfischen und Kontrollen erkennbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: Box-Plots mit einer durchschnittlichen EOD-Amplitude von CRISPR und nicht injizierten Größe/Alter übereinstimmenden Geschwistern. (A) EOD-Amplitude von B. brachyistius larven bei 10 DPF. Aufgenommen mit einem Gewinn von 100, CRISPR n = 56 EODs von zwei Individuen, nicht injiziert n = 114 EODs von drei Individuen. (B) EOD-Amplitude von B. gauderio Larven bei 6 DPF. Aufgenommen mit einem Gewinn von 500, CRISPR n = 34 EODs von zwei Individuen, nicht injiziert n = 148 EODs von drei Individuen. Die Amplitude von CRISPR-Fischen war deutlich geringer als die nicht injizierten Kontrollen (p < 2.2 x 10-16, Welch zwei-Probe-t-Test). Alle Personen wurden mit der in Abbildung 7beschriebenen Aufnahmekammer aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

beschreibung folge
Konstantes Oligomer 5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGC TATTTCTAGCTCTAAAAAC-3'
Ziel-Oligomer-Backbone (GG-N18, kein PAM) 5'-TAATACGACTCACTATAGG-N18-GTTTTAGAGCTAGAATAGCAAG-3'
Ziel-Oligomer-Backbone (N20, kein PAM) 5'-TAATACGACTCACTATAG-N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'
Brienomyrus brachyistius
scn4aa Bb sgRNA Target (N18, mit PAM): 5'-TCTTCCGCCCCTTCACACGG-3'
Scn4aa Bb sgRNA Oligomer (GG-N18): 5'-TAATACGACTCACTATAGG TCTTCCGCCCCTTCACCA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'
scn4aa Bb PCR Primer (218 bp)
Scn4aa_bb_exon1_F: 5'-ATGGCCGGCCTTCTCAATAA-3'
Scn4aa_bb_exon1_R: 5'-TCTTCCAGGGGAATATTCATAAACT-3'
Brachyhypopomus gauderio
Scn4aa Bg sgRNA Ziel (N17, mit PAM): 5'- CAAGAAGGATGTAGTGGAGG-3'
Scn4aa Bg sgRNA Oligomer (GG-N17): 5'-TAATACGACTCACTATAGG CAAGAAGGATGTAGTGG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'
Scn4aa Bg PCR Grundierungspaar (204 bp)
scn4aa_bg_exon1_F: 5'-CGCCTTGTCCCTCCTTCAG-3'
scn4aa_bg_exon1_R: 5'-ATCTTCAGGTGGCTCTCTAT-3'

Tabelle 1: Oligonukleotide, die für das Protokoll erforderlich sind.

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Discussion

Der phänoseische Reichtum schwach elektrischer Fische, zusammen mit einer kürzlichen Verbreitung von Genomressourcen, motiviert einen starken Bedarf an funktionellen Genomwerkzeugen im schwach elektrischen Fischmodell. Dieses System ist besonders attraktiv wegen der konvergenten Entwicklung zahlreicher phänotypischer Merkmale in parallelen Fischlinien, die leicht im Labor gehalten werden können.

Das hier beschriebene Protokoll zeigt die Wirksamkeit der CRISPR/Cas9-Technik in Linien schwach elektrischer Fische, die parallel Elektrogenese und Elektroempfang entwickelten, und stellt daher einen wichtigen Schritt für die vielversprechende Adressierung dieses Modells dar. zukünftige Arbeiten in der vergleichenden Genomik der phänotypischen Evolution.

Dieser einfache methodische Ansatz erfordert nur grundlegende molekularbiologische Fähigkeiten und Ausbildung, nach einer grundlegenden Annahme des Gagnon-Protokolls38, weit verbreitet für Zebrafische. Es ist erwähnenswert, dass es im Verlauf der Technologie mehr kommerzielle Kits für die sgRNA-Produktion sowie Unternehmen gibt, die RNAs synthetisieren können, wodurch dieses Protokoll für Laboratorien zugänglicher wird, denen es an molekularbiologischer Erfahrung und Ausrüstung mangelt. Wir stellen zunächst fest, dass die hohe Mutagenese-Effizienz eine direkte Phänotypisierung der injizierten Larven ermöglicht. Es scheint jedoch ein erhebliches Maß an phänotischem Mosaikismus zu geben, was nicht ungewöhnlich ist und mit der Literatur41,42,43,44übereinstimmt. In dieser Scn4aa-Studie zeigten beispielsweise einige Personen, die Mutationen trugen, viel größere Amplituden-EODs als andere, die vergleichsweise stumm waren(Abbildung 7, Abbildung 8). Es ist derzeit unklar, wie viele dieser Mutationen in die Keimbahn getragen werden. Unmittelbare zukünftige Anstrengungen werden darauf gerichtet sein, stabile mutierte Linien zu schaffen.

Die Nutzung des NHEJ-Pfades für Knockouts ist nur eine der wenigen möglichen Anwendungen der CRISPR/Cas9 Genbearbeitung: Die hier beschriebenen Methoden sind ein Sprungbrett für fortgeschrittenere Anwendungen55,56. Zukünftige Anstrengungen sollten darauf abzielen, gemeinsam injizierte DNA-Spender-Vorlagen mit dem sgRNA/Cas9-Komplex zu entwerfen. Diese einfache Änderung würde endogene vorlagenbasierte Reparaturmechanismen (d. h. homology directed repair, oder HDR) nutzen und präzise Knock-Ins ermöglichen. Obwohl HDR mit einer geringeren Effizienz als NHEJ-Ansätze auftritt, wurden Fortschritte bei der Steigerung der Wirksamkeit erzielt57,58. Diese geringere Effizienz erfordert Anstrengungen, um das Design der DNA-Spender-Vorlage/CRISPR/Cas9-Konstrukt zu optimieren, die endogene Reparaturmechanismen effizienter zu machen und die Embryoproduktion zu erhöhen (siehe unten). Wenn dieses Problem der Effizienz gelöst werden kann, könnten Knockins verwendet werden, um fluoreszierende Tags hinzuzufügen, eine mutierte Form des Genprodukts auszudrücken oder Promotor- oder Enhancersequenzen zu ändern.

Während die Molekularbiologie hinter dieser Technik ziemlich einfach ist, sind die Anforderungen an die Haltung erheblich, aber nicht unüberwindbar. B. gauderio sind weit verbreitet und brüten schnell genug für jedes Forschungsprogramm, um eine Kolonie in weniger als einem Jahr zu haben. Im Gegensatz dazu entwickeln sich B. brachyistius langsam, und anatomische Eigenheiten haben sich bisher als Versuche der IVF erwiesen. Andere, größere Arten, wie Campylomormyrus59, könnten diesem Ansatz förderlicher sein. Für B. brachyistiuswurden alle injizierten Embryonen unter Verwendung des natürlichen Laichansatzes gesammelt, der deutlich arbeitsintensiver ist. Künftige Bemühungen zur Steigerung der Effizienz bei B. brachyistius IVF werden eine höhere Ausbeute an Embryonen für die oben beschriebenen Effizienzprobleme ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren würdigen die heldenhaften Bemühungen von Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud und Hope Healey um Hilfe bei der Fischzucht, der Datensammlung und der frühen Protokollentwicklung. Wir möchten auch den drei Rezensenten für ihre Vorschläge zum Manuskript danken. Wir glauben, dass das Endprodukt von besserer Qualität ist, nachdem sie ihre Kommentare angesprochen haben. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der National Science Foundation #1644965 und #1455405 an JRG und die Stiftung Naturwissenschaften und Ingenieurforschung AN VLS finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 mg/mL RNA grade Glycogen Thermo Scientific R0551
50 bp DNA ladder NEB N3236L
Borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF100-58-10 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL PNA Biology CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector Fisher Scientific E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific 10289651
Hamilton syringe Fisher Scientific 14-824-654 referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe Fisher Scientific 06-666 referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
NEBuffer 3 NEB B7003S used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit NEB M0480L
Ovaprim Syndel USA https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm Fisher Scientific S37440 referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller WPI SU-P97 sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Reusable needle- requires customization Fisher Scientific 7803-02 Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase NEB M0203L Use with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated tools bonefolder.com T-SPATULA4PIECE referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

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References

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Biologie Ausgabe 152 CRISPR/Cas9 elektrischer Fisch Einzelzell-Mikroinjektion Scn4aa elektrische Organentladung Genommodifikation mormyrid gymnotiform
Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish
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Constantinou, S. J., Nguyen, L.,… More

Constantinou, S. J., Nguyen, L., Kirschbaum, F., Salazar, V. L., Gallant, J. R. Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (152), e60253, doi:10.3791/60253 (2019).

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