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Biology

स्पार्क को सिलिंग: कमजोर इलेक्ट्रिक मछली में CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60253
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Summary

यहाँ, एक प्रोटोकॉल का उत्पादन और CRISPR/Cas9 जीनोम नॉकआउट बिजली मछली के पीछे प्रस्तुत किया है. विस्तार से उल्लिखित दोनों एक gymnotiform और एक mormyrid के लिए आवश्यक आणविक जीव विज्ञान, प्रजनन, और पशुपालन आवश्यकताओं, और इंजेक्शन तकनीक Cas9 प्रेरित indel एफ0 लार्वा का उत्पादन कर रहे हैं.

Abstract

कशेरुकियों के विकासवादी इतिहास में विद्युत अभिग्रहण और विद्युतजनन बदल गया है। इन स्वतंत्र रूप से व्युत्पन्न phenotypes, जो एक आम आनुवंशिक वास्तुकला का हिस्सा में अभिसरण के एक हड़ताली डिग्री है. यह शायद सबसे अच्छा जिम्नोटिफॉर्म्स और mormyrids के कई अभिसरण सुविधाओं द्वारा उदाहरण है, दो प्रजातियों अमीर teleost clades कि उत्पादन और कमजोर बिजली के क्षेत्रों का पता लगाने और कमजोर बिजली मछली कहा जाता है. खोज के बाद से 50 वर्षों में है कि कमजोर बिजली मछली बिजली का उपयोग करने के लिए अपने परिवेश भावना और संवाद, वैज्ञानिकों की एक बढ़ती समुदाय के विकास में जबरदस्त अंतर्दृष्टि प्राप्त की है, सिस्टम और सर्किट तंत्रिका विज्ञान, सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान, पारिस्थितिकी, विकासवादी जीव विज्ञान, और व्यवहार. हाल ही में, वहाँ बिजली की मछली के लिए जीनोमिक संसाधनों का प्रसार किया गया है. इन संसाधनों का उपयोग पहले से ही इन प्रजातियों में जीनोटाइप और phenotype के बीच संबंध के साथ महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की सुविधा है. कमजोर बिजली मछली के phenotypic डेटा के साथ जीनोमिक्स डेटा को एकीकृत करने के लिए एक प्रमुख बाधा कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण ों की एक वर्तमान कमी है. हम यहाँ CRISPR/Cas9 mutagenesis कि कमजोर बिजली की मछली में अंतर्जात डीएनए मरम्मत तंत्र का इस्तेमाल प्रदर्शन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल रिपोर्ट. हम प्रदर्शित करते हैं कि इस प्रोटोकॉल दोनों mormyrid प्रजातियों Brienomyrus ब्रैकीइस्टियस और gymnotiform Brachyhypopomus gauderio में समान रूप से प्रभावी है CRISPR/Cas9 का उपयोग करके indels और बिंदु उत्परिवर्तनों को लक्षित करने के लिए के पहले exon सोडियम चैनल जीन scn4aa| इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, दोनों प्रजातियों के भ्रूण प्राप्त किए गए थे और यह पुष्टि करने के लिए जीनोटाइप किए गए थे कि सोडियम चैनल scn4aa के पहले एक्सऑन में अनुमानित उत्परिवर्तन मौजूद थे। नॉक आउट सफलता phenotype कम बिजली अंग निर्वहन आयाम दिखा रिकॉर्डिंग के साथ पुष्टि की थी जब इंजेक्शन आकार मिलान नियंत्रण की तुलना में.

Introduction

कशेरुकियों के विकासवादी इतिहास में विद्युत अभिग्रहण और विद्युतजनन बदल गया है। टेलीओस्ट मछली के दो वंश, ऑस्टियोग्लोसिफॉर्मीज और siluriformes, समानांतर में विद्युत ग्रहण विकसित, और teleosts के पांच वंश (जिमनोटीफॉर्मीज, mormyrids, और वंश एस्ट्रोस्कॉपस, Malpterurus, और Synodontis) समानांतर में विकसित इलेक्ट्रोजेनेसिस. इन स्वतंत्र रूप से व्युत्पन्न फीनोटाइप में अभिसरण की एक उल्लेखनीय डिग्री है , जो एक सामान्य आनुवंशिक वास्तुकला1,2,3का हिस्सा है .

यह शायद सबसे अच्छा जिम्नोटिफॉर्म्स और mormyrids, दो प्रजातियों अमीर teleost clades, जो उत्पादन और कमजोर बिजली के क्षेत्रों का पता लगाने और कमजोर बिजली मछली कहा जाता है के कई अभिसरण सुविधाओं द्वारा उदाहरण है. इस खोज के बाद से 50 वर्षों में कि कमजोर बिजली मछली बिजली का उपयोग करने के लिए अपने आसपास भावना औरसंवाद 4, वैज्ञानिकों के एक बढ़ते समुदाय के विकास में जबरदस्त अंतर्दृष्टि प्राप्त की है1,5 ,6, सिस्टम और सर्किट तंत्रिका विज्ञान7,8,9,10, सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान11,12, पारिस्थितिकी और ऊर्जावान13 ,14,15,16,17, व्यवहार18,19, और मैक्रोइवोल्शन3, 20,21 .

हाल ही में, बिजली की मछली1, 22 ,23,24,25,26के लिए जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटीओमिक संसाधनों का प्रसार हुआ है, 27,28. इन संसाधनों के उपयोग ने पहले ही इन प्रजातियों 1,2 ,3, 28,29में जीनोटाइप और फीनोटाइप के बीच संबंध के संबंध के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि का उत्पादन किया है ,30. कमजोर विद्युत ीय मछली के लक्षणाकृत आंकड़ों के साथ जीनोमिक्स डेटा को एकीकृत करने में एक प्रमुख बाधा कार्यात्मक जीनोमिक्सउपकरण31की वर्तमान कमी है .

ऐसा ही एक उपकरण है हाल ही में विकसित क्लस्टर्ड नियमित रूप से अंतराल लघु Palindromic दोहराता Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) तकनीक के साथ बनती है. CRISPR/Cas9 एक जीनोम संपादन उपकरण है कि दोनों मॉडल32,33,34 और गैर मॉडल जीव35,36,37 एक जैसे में व्यापक उपयोग में प्रवेश किया है. CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी एक बिंदु पर प्रगति की है जहां एक प्रयोगशाला बुनियादी आणविक जीव विज्ञान में सक्षम आसानी से जीन विशेष जांच उत्पन्न कर सकते हैं लघु गाइड RNAs (sgRNAs) कहा जाता है, एक कम कीमत पर एक गैर-क्लोनिंग विधि का उपयोग कर38. CRISPR अन्य नॉकआउट / knockdown रणनीतियों पर लाभ है, जैसे morpholinos39,40, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह effector nucleases (TALENs), और जस्ता उंगली nucleases ($FNs), जो महंगे हैं और समय लेने वाली हर लक्ष्य जीन के लिए उत्पन्न करने के लिए.

CRISPR/Cas9 प्रणाली जीनोम के एक विशिष्ट क्षेत्र को लक्षित करके जीन नॉकआउट बनाने के लिए कार्य करता है, sgRNA अनुक्रम द्वारा निर्देशित है, और एक डबल फैला ब्रेक के कारण. डबल-स्ट्रेंड ब्रेक सेल द्वारा पता लगाया जाता है और अंतर्जात डीएनए मरम्मत तंत्र को वरीयता से गैर-समजात अंत में शामिल होने (NHEJ) मार्ग का उपयोग कर के लिए ट्रिगर करता है। यह मार्ग अत्यधिक त्रुटि-प्रवण है: मरम्मत प्रक्रिया के दौरान, डीएनए अणु अक्सर डबल-स्लेड ब्रेक साइट पर सम्मिलन या विलोपन (इनडेल) को शामिल करेगा। इन indels या तो (1) खुले पढ़ने के फ्रेम में बदलाव के कारण समारोह की हानि में परिणाम कर सकते हैं, (2) एक समय से पहले रोक codon की प्रविष्टि, या (3) जीन उत्पाद की महत्वपूर्ण प्राथमिक संरचना में बदलाव. इस प्रोटोकॉल में, हम कमजोर विद्युत मछली प्रजातियों में एनएचईजे का उपयोग करके लक्ष्य जीनों में बिंदु उत्परिवर्तनों को लक्षित करने के लिए CRISPR/Cas9 संपादन का उपयोग करते हैं। जबकि सरल और अन्य तकनीकों की तुलना में अधिक कुशल, mutagenesis की इस विधि F0में phenotypic severities की एक श्रृंखला में परिणाम की उम्मीद है, जो आनुवंशिक मोज़ेकवाद के लिए जिम्मेदार ठहराया है41,42,43 ,44.

जीवों का चयन
कमजोर बिजली मछली के तुलनात्मक जीनोमिक्स पर भविष्य के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के प्रयोजनों के लिए, दोनों gymnotiforms और प्रोटोकॉल विकास के लिए mormyrids के लिए एक प्रतिनिधि प्रजातियों का चयन करने की जरूरत है. मोंटेवीडियो, उरुग्वे में 2016 इलेक्ट्रिक मछली बैठक के दौरान चर्चा के बाद, वहाँ पहले से ही प्रयोगशाला में पैदा किया जा सकता है कि प्रजातियों का उपयोग करने के लिए समुदाय आम सहमति थी और कहा कि जीनोमिक संसाधनों उपलब्ध था। जिम्नोटीफॉर्म ब्रैकीहाइपोपोमस गौडरियो और मोरियड ब्रिनोमिरस ब्रैकीइस्टियस को इन मानदंडों के अनुरूप प्रजातियों के रूप में चुना गया था। दोनों प्रजातियों में, प्रेरित करने के लिए और प्रजनन की स्थिति को बनाए रखने के लिए प्राकृतिक संकेतों कैद में नकल करने के लिए आसान कर रहे हैं. बी gauderio,दक्षिण अमेरिका से एक gymnotiform प्रजातियों, कम पशुपालन आवश्यकताओं का लाभ है: मछली अपेक्षाकृत छोटे (4 एल) टैंक में अपेक्षाकृत उच्च घनत्व पर रखा जा सकता है. बी गौड़ीओ भी बंदी परिस्थितियों में तेजी से पीढ़ी के कारोबारहै . प्रयोगशाला शर्तों के तहत, बी gauderio अंडे से वयस्क के बारे में 4 महीने में विकसित कर सकते हैं.

बी ब्रैकीइस्टियस, पश्चिम-मध्य अफ्रीका से mormyrid मछली की एक प्रजाति, कैद में आसानी से नस्लों. बी ब्रैकीस्टियस मछलीघर व्यापार के माध्यम से आसानी से उपलब्ध है, व्यापक रूप से कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है, और अब जीनोमिक संसाधनों की एक संख्या उपलब्ध है. प्रयोगशाला की स्थितियों के आधार पर उनका जीवन चक्र 1 से 3 वर्ष तक फैला हुआ है। पशुपालन आवश्यकताओं इस प्रजाति के लिए कुछ अधिक गहन हैं, प्रजनन के दौरान उनकी आक्रामकता के कारण मध्यम आकार के टैंक (50 डिग्री 100 एल) की आवश्यकता होती है।

बिजली की मछली की अन्य प्रजातियों का अध्ययन प्रयोगशालाओं को आसानी से प्रजातियों नस्ल किया जा सकता है के रूप में लंबे समय के रूप में इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में सक्षम होना चाहिए, और एकल सेल भ्रूण एकत्र किया जा सकता है और वयस्कता में पाला. आवास, लार्वा पालन, और इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) दरों की संभावना अन्य प्रजातियों के साथ बदल जाएगा; हालांकि, इस प्रोटोकॉल अन्य कमजोर बिजली मछली में प्रजनन के प्रयास के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

अवधारणा के सबूत के लिए एक आदर्श जीन लक्ष्य: scn4aa
कमजोर बिजली mormyrid और gymnotiform मछली एक विशेष अंग का निर्वहन करके बिजली के क्षेत्रों (इलेक्ट्रोजेनेसिस) उत्पन्न, बिजली के अंग कहा जाता है. विद्युत अंग निर्वहन (EODs) विद्युत अंग कोशिकाओं में कार्रवाई क्षमता के एक साथ उत्पादन से परिणाम इलेक्ट्रोसाइट्स कहा जाता है. EODs त्वचा में electroceptors की एक सरणी द्वारा पता चला रहे हैं मछली के आसपास के उच्च संकल्प विद्युत छवियों को बनाने के लिए45. कमजोर बिजली की मछली भी उनके conspecifics 'ईओडी waveforms18 के रूप में अच्छी तरह से उनके निर्वहन दर46की सुविधाओं का पता लगाने में सक्षम हैं, EODs birdsong या मेंढक के अनुरूप एक सामाजिक संचार संकेत के रूप में अतिरिक्त कार्य करने के लिए अनुमति देता है स्वर47|

मोरमिरिड और जिमनोटीफॉर्म दोनों के इलेक्ट्रोसाइट्स में क्रिया क्षमता उत्पादन का एक मुख्य घटक कमजोर विद्युत मछली है वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनल NaV1.42. गैर-विद्युत teleosts दो paralogous जीन प्रतियां, scn4aa और scn4abव्यक्त करते हैं, वोल्टेज gated सोडियम चैनल NaV1.430के लिए कोडिंग . दोनों gymnotiform और mormyrid कमजोर बिजली मछली वंश में, scn4aa तेजी से विकसित किया गया है और कई एमिनो एसिड प्रतिस्थापन है कि इसकी गतिज गुण48को प्रभावित आया. सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि scn4aa दोनों वंशों में विद्युत अंग2,3 के लिए कम्पार्टमेंटल हो गयाहै. बिजली के अंग के लिए scn4aa की अपेक्षाकृत प्रतिबंधित अभिव्यक्ति, साथ ही EODs की पीढ़ी में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका, यह CRISPR/Cas9 नॉकआउट प्रयोगों के लिए एक आदर्श लक्ष्य बनाता है, क्योंकि यह कम से कम हानिकारक pleiotropic प्रभाव है. क्योंकि कमजोर बिजली की मछली उनके लार्वा बिजली के अंगों का निर्वहन शुरू 6 "8 दिन के बाद निषेचन (DPF), scn4aa का लक्ष्य ीकरण आदर्श भ्रूण microinctions के बाद तेजी से phenotyping के लिए उपयुक्त है.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. SgRNA लक्ष्य का चयन

नोट: एक प्रोटोकॉल चरण 1.1 में sgRNAs के मैनुअल डिजाइन के लिए प्रदान की जाती है. यह scn4aa लक्ष्य चयन के लिए उपयोग किया गया था. EFISHGENOMICS वेब पोर्टल का उपयोग करइस प्रक्रिया (चरण 1.2) को सुविधाजनक बनाने के लिए एक अतिरिक्त प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। यह सलाह दी जाती है कि उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल 1.2 का चयन करें, जो कस्टम लक्ष्यों के लिए sgRNAs डिजाइन करने में सफलता सुनिश्चित करने के लिए कई स्वचालित 'चेक' सुविधाएँ.

  1. डिजाइन sgRNA लक्ष्य.
    1. SgRNA गाइड oligos पैदा करने के लिए, यह सबसे अच्छा है exon लक्ष्य 1, या अन्य 5' exons. 5' UTR लक्षित किया जा सकता है; हालांकि, यह 5' कोडिंग अनुक्रम को लक्षित करने के लिए सबसे अच्छा है। जीनोमिक जानकारी का उपयोग बेहतर है, लेकिन यह transcriptome डेटा का उपयोग कर सफल sgRNAs विकसित करने के लिए संभव है. intron/exon सीमाओं (भूनीय डेटा) या exon/exon सीमाओं के एनोटेशन बेहतर है।
    2. 1.1 से उम्मीदवार जीनोमिक दृश्यों putative लक्ष्य दृश्यों कि पैटर्न 5'-एन(18)-NGG-3' से मेल के लिए खोज रहे हैं। यह स्वचालित रूप से डेस्कटॉप अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर, कस्टम लिपियों, या दृश्यों के मैनुअल निरीक्षण के माध्यम से का उपयोग कर किया जा सकता है.
    3. अनुक्रम पर लक्ष्य गतिविधि के लिए Doench एट अल49 की विधि का उपयोग कर प्राथमिकता दी जा सकती है. साथ ही, लक्ष्य अनुक्रम बंद-लक्ष्य बाइंडिंग के लिए जीनोमिक/ट्रांस्पोमिक डेटाबेस के विरुद्ध एक BLAST खोज द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।
    4. सुनिश्चित करें कि मानक PCR प्राइमर उत्पन्न किया जा सकता है कि लक्ष्य अनुक्रम पार्श्व. प्राइमर्स कट साइट के दोनों ओर से कम से कम 20 बीपी होना चाहिए (एनजीजी अनुक्रम के ऊपर तीन कुर्सियां)। आदर्श रूप में, PCR उत्पाद होना चाहिए 150"200 आधार जोड़े (bp).
    5. डिजाइन oligomers नीचे टेम्पलेट का उपयोग कर ऊपर मानदंडों को पूरा, जो एक T7 प्रमोटर (5 ' एन18के ) और एक पूरक क्षेत्र (3 ' N18के ) निरंतर ओलिगोमर (1.1.6): 5'-TAATACGACTATAGG-N18 के लिए annealing के लिए -GTTTAGCTAGAATAG-3'
      नोट: N18 अनुक्रम NGG प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) अनुक्रम शामिल नहीं है। इसे ओलिगोमर में शामिल न करें।
    6. आदेश निरंतर oligomer (तालिका 1) कि सभी sgRNAs संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, sgRNA लक्ष्य के लिए oligomers (कदम 1.1.5), और पीसीआर प्राइमर (कदम 1.1.4) मानक desalted oligomers के रूप में एक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड उत्पादन सेवा से. Oligomers और पीसीआर प्राइमर मानक desalted oligomers के रूप में आदेश दिया जा सकता है, कोई अतिरिक्त शुद्धि आवश्यक है.
  2. SgRNA लक्ष्यों की स्वचालित डिजाइन प्रदर्शन.
    1. जीनोमिक डेटा का उपयोग करके, एक लक्ष्य जीन का चयन करें. ट्रांसक्रिप्टम डेटा का उपयोग इसके स्थान पर किया जा सकता है जब एक्सऑन/इनट्रॉन सीमाओं को जाना जाता है। लक्ष्य EFISHGENOMICS पोर्टल (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu) का उपयोग करकी पहचान की जा सकती है। आदर्श लक्ष्य exon 1 के भीतर होगा; हालांकि, अन्य 5 ' exons और 5' UTR पर विचार किया जा सकता है.
    2. एक बार लक्ष्य अनुक्रम की पहचान की है, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध EFISHGENOMICS CRISPR वेब उपकरण (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/) लोड. इस वेब उपकरण लक्ष्य पीढ़ी50,51के लिए CRISPOR एल्गोरिथ्म के एक अनुकूलित संस्करण का उपयोग करता है.
    3. चरण 1के लिए बॉक्स में, अनुक्रम का नाम दर्ज करें और उपयुक्त बॉक्स में लक्ष्य के अनुक्रम दर्ज करें।
  3. उस उपयुक्त जीनोम का चयन करें जो अनुक्रम से प्राप्त होता है। वर्तमान में, जीनोमिक डेटा बी ब्रैकिइस्टियस और बी गौडरियोके लिए उपलब्ध है। जीनोम दृश्यों इस उपकरण के उपयोग के लिए आवश्यक नहीं हैं, लेकिन संभावित अवांछित ऑफ-लक्ष्य प्रभाव का आकलन करने में उपयोगी होते हैं।
  4. उपयुक्त PAM का चयन करें। 20 बीपी-एनजीजी पीएएम की सिफारिश की जाती है, हालांकि उपयोग किए गए Cas9 प्रोटीन के आधार पर चुनने के लिए कई अतिरिक्त पीएएम रूपांकनों हैं।
  5. सुझाए गए गाइड दृश्यों के साथ जीनोम में लक्ष्य अनुक्रम के स्थान के साथ एक रिपोर्ट तैयार की जाएगी। कम भविष्यवाणी बंद लक्ष्य प्रभाव, उच्च विशिष्टता स्कोर, और उच्च दक्षता स्कोर के साथ तीन लक्ष्यों का चयन करें। उच्चतम स्कोरिंग गाइड दृश्यों बाएं हाथ की ओर हरे रंग के साथ प्रकाश डाला जाता है। यदि संभव हो तो पीला और लाल हाइलाइट किए गए गाइड दृश्यों से बचा जाना चाहिए।
  6. चयनित लक्ष्य दृश्यों पर क्लिक करने से एक व्यापक CRISPOR रिपोर्ट उत्पन्न होती है. इन रिपोर्टों से महत्वपूर्ण जानकारी के लिए कर रहे हैं "T7 में इन विट्रो अभिव्यक्ति से ओवरलैपिंग ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स". इस रिपोर्ट से, निम्न जानकारी निकालें: सिफारिश की sgRNA oligos, लक्ष्य साइट के लिए पीसीआर प्राइमर, और सभी sgRNAs संश्लेषित करने के लिए उपयोग किया जाएगा एक निरंतर oligomer.
  7. एक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड उत्पादन सेवा से चयनित ओलिगोमर्स (चरण 1.6) का आदेश दें। Oligomers और पीसीआर प्राइमर मानक desalted oligomers के रूप में आदेश दिया जा सकता है, कोई अतिरिक्त शुद्धि आवश्यक है.

2. उत्पन्न sgRNA

  1. पीसीआर ट्यूब में एनेल ओलिगोमर: 100 डिग्री सेल्सियस के 1 डिग्री एल, 1 00 डिग्री सेल्सियस एसजीआरएनए विशिष्ट ओलिगोमर, और न्यूक्लेस-मुक्त एच2ओ के 8 डिग्री एल जोड़ें
  2. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ एक thermocycler में Anneal oligomers: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, -2 डिग्री सेल्सियस पर 85 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत, 0.1 डिग्री सेल्सियस पर 25 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  3. SgRNA टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए, डीएनटीपी मिश्रण (10 एमएम) के 2.5 डिग्री एल, 10x बफर के 2 डिग्री एल, टी 4 डीएनए पॉलिमरेज के 0.5 डिग्री एल, और 5 डिग्री एल nuclease मुक्त एच2ओ के कदम 2.2 से annealed oligomers के लिए जोड़ें। 12 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक PCR साफ़ स्तंभ का उपयोग कर के टेम्पलेट को शुद्ध करें।
  5. सन् 20-30 डिग्री सेल्सियस में एकाग्रता और शुद्धता का अनुमान लगाने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग कीजिए। टेम्पलेट 100-200 एनजी/जेडएल और 1.8-1-1-9 A260/280होना चाहिए।
  6. 1-5 डिग्री सेल्सियस चलाकर एक agarose जेल के माध्यम से सत्यापित करें. प्रमुख बैंड 120 बीपी होना चाहिए. प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्र 1A देखें.
  7. स्टोर जेल सत्यापित sgRNA टेम्पलेट पर -20 डिग्री सेल्सियस (लंबी अवधि) या 4 डिग्री सेल्सियस (अल्पकालिक, 1-4 सप्ताह).
  8. टी 7 आरएनए प्रतिलेखन किट का उपयोग करते हुए टी 7 आरएनए प्रतिलेखन किट का उपयोग करते हुए कमरे के तापमान 8 डिग्री सेल्सियस डीएनटीपी मिश्रण (डीए, डीटी, डीजी, डी सी के बराबर वॉल्यूम), 10x बफर (कमरे का तापमान), टी 7 पॉलिमरेज के 2 डिग्री एल, 100 डिग्री 200 एनजी एसजीआरए टेम्पलेट के बराबर मात्रा में। , और न्यूक्लेस-मुक्त H2O को 20 डिग्री सेल्सियस कुल आयतन। तल पर इकट्ठा करने के लिए स्पिन. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 ज के लिए इनक्यूबेट।
  9. DNase के 1 डिग्री एल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 15 मिनट इनक्यूबेट।
    1. स्लाइकोजन के 1 $L, न्यूक्लेस-मुक्त एच2ओ के 30 डिग्री एल, 5 एम अमोनियम एसीटेट के 30 डिग्री एल और 100% EtOH के 180 डिग्री एल को जोड़ने के द्वारा sgRNA को साफ करें। अच्छी तरह से मिलाएं और कम से कम 20 मिनट -80 डिग्री सेल्सियस पर (जब तक जमे हुए) या -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अधिकतम गति पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज।
  10. निकालें और गोली परेशान बिना supernatant त्यागें, और RNase मुक्त 70% EtOH -20 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा की 1 एमएल के साथ धो लें. अधिकतम गति पर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 5 मिनट स्पिन।
  11. निकालें और गोली परेशान किए बिना supernatant त्याग, और हवा सूखी गोली के लिए 5 मिनट.
  12. nuclease मुक्त एच2हे के 30 डिग्री एल में पुन: निलंबित और शुद्धता और यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर उपज का निर्धारण (न्यूनतम उपज 200 एनजी /
  13. एक RNase मुक्त जेल पर sgRNA की उपस्थिति की पुष्टि करें. एसजीआरए माध्यमिक संरचना के कारण दो बैंडों के रूप में 50 से 150 बीपी के बीच प्रकट होता है (चित्र 1ख) ।
  14. अलीकोट 3 डिग्री सेल्सियस में और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

3. विट्रो में काटने की क्षमता को मान्य करें

  1. एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर लक्ष्य प्रजातियों से जीनोमिक डीएनए निकालें। वेंट्रल फिन कतरनों मछली बलिदान करने के लिए बिना इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि ऊतकों पुनर्जीवित कर रहे हैं.
  2. मानक पीसीआर का उपयोग कर के रूप में वर्णित के रूप में डिजाइन प्राइमर का उपयोग कर लक्ष्य डीएनए क्षेत्र बढ़ाना. जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा उत्पाद की पुष्टि करें। उचित क्षेत्र को बढ़ाया जा रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए टुकड़ा अनुक्रमण का सुझाव दिया है, लेकिन आवश्यक नहीं है. Scn4aa टेम्पलेट के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2में दिखाए गए हैं।
  3. एक स्थापित प्रयोगशाला या कंपनी प्रोटोकॉल के साथ पीसीआर टुकड़ा साफ।
  4. प्रवर्धित डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फ्रीज-थॉव चक्र को कम करने के लिए इसे एलिकोट्स में अलग करने पर विचार करें।
  5. आवश्यक मात्रा और प्रत्येक घटक के वॉल्यूम निर्धारित करें। नकारात्मक नियंत्रण चलाने पर विचार करें (या तो sgRNA या Cas9 को छोड़कर) और एक सकारात्मक नियंत्रण (एक पहले से परीक्षण sgRNA कि अपने लक्ष्य पीसीआर प्रवर्धित डीएनए cleaves) यदि उपलब्ध है, साथ ही sgRNA की एक एकाग्रता श्रृंखला.
  6. कमरे के तापमान पर एक पीसीआर ट्यूब में निर्दिष्ट क्रम में नीचे प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें, सबसे अच्छा परिणाम के लिए पिछले sgRNA और Cas9 प्रोटीन जोड़ने: लक्ष्य डीएनए पीसीआर उत्पाद के 50-100 एनजी, 10x बफर 3 के 1 $L, 10x बीएसए के 1 $L (0.1 ग्राम / , 50-200 एनजी Cas9 प्रोटीन (1 mg/mL, 150 एनजी का सुझाव दिया), और एनजी sgRNA के 30-200 (100 एनजी का सुझाव दिया).
    1. 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें और फिर 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर Cas9 प्रोटीन निष्क्रिय करें।
    2. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ एक 2%-3% agarose जेल पर पूरे नमूना चलाने के लिए (के बीच अपेक्षित बैंड आकार 30-200 bp)। सफल दरार पीसीआर उत्पाद के कुछ दिखा सकते हैं, लेकिन यह भी दो छोटे बैंड होगा. प्रतिनिधि परिणाम चित्र 2 में दिखाए जातेहैं।

4. भ्रूण प्राप्त करना

नोट: कमजोर बिजली की मछली के भ्रूण प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है. पानी की गुणवत्ता की सावधानी से निगरानी, मछली की देखभाल के लिए पर्याप्त समय है, और नियमित रूप से खिला एक सफल प्रजनन कार्यक्रम के लिए महत्वपूर्ण हैं. मछली पहले प्रजनन के लिए कई हफ्तों के लिए वातानुकूलित होना चाहिए52 प्रोटोकॉल चरण 4.1 में वर्णित के रूप में. इस के बाद, प्राकृतिक अंडे व्यवहार में उपयोग के लिए प्राकृतिक gametogenesis (4.2) को बढ़ाने के एक प्रोटोकॉल (4.3), ठीक समय पर भ्रूण प्राप्त करने के लिए इन विट्रो तकनीक में हाल ही में विकसित एक विकल्प प्रस्तुत कर रहे हैं (4.4) प्रस्तुत कर रहे हैं. प्रोटोकॉल 4.3 बी ब्रैकिइस्टियस और बी गौडेरियोके लिए समान रूप से प्रभावी है , और प्रोटोकॉल 4.4 बी गौडरियोमें बेहतर है .

  1. कंडीशनिंग
    1. जोड़ों में बी ब्रैकिइस्टियस रखें / छोटे समूहों (100-150 एल टैंक) या बहुत बड़े टैंक में (2 पुरुषों और 5-6 लगभग 475 एल टैंक में महिलाओं), के रूप में वे प्रजनन की स्थिति के तहत बहुत आक्रामक हो जाते हैं. आश्रय के रूप में उपयोग की जाने वाली प्रति मछली में कम से कम 1-2 पीवीसी ट्यूब होनी चाहिए (चित्र 3क,ठ) .
    2. बी gauderio बहुत अधिक घनत्व पर पाला जा सकता है. एक 100 एल टैंक (2 पुरुषों और 6 महिलाओं) में आठ व्यक्तियों को रखें. आश्रय के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्रति मछली कम से कम 1 पीवीसी ट्यूब होना चाहिए। पेचीदा यार्न जोड़ना संवर्धन और छुपा स्पॉट बढ़ जाती है. 1 सेमी व्यास छेद के साथ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब जोड़ें टैंक के शीर्ष करने के लिए उन्हें drilled वयस्कों ट्यूबों में स्वाभाविक रूप से अंडे के लिए अनुमति देने के लिए (चित्र 3C) .
    3. प्रजनन के मौसम के दौरान, मछली दैनिक ताजा blackworms जमे हुए bloodworms के साथ पूरक फ़ीड. भोजन विटामिन और पूरक आहार के साथ समृद्ध किया जा सकता है, अगर वांछित.
    4. घर मछली सामान्य रूप से एक अपेक्षाकृत उच्च चालकता में (300-600 $S), पीएच संतुलित समाधान. प्रजनन के मौसम के दौरान, धीरे-धीरे 1-3 सप्ताह के दौरान कम से कम आधे से चालकता को कम करने के लिए gonad recrudscence और अंडे पैदा करने के लिए प्रेरित. रिवर्स असमस (आरओ) पानी के दैनिक परिवर्धन द्वारा कम चालकता, पीएच के करीब ध्यान रखते हुए जब चालकता कम है (pH और lt;6).
    5. प्रजनन की स्थिति के बारे में 3 डिग्री 5 महीने के लिए रखा जा सकता है अंडे का उत्पादन समय के साथ बंद पतला. इस समय के बाद, उच्च चालकता के लिए मछली वापस धीरे धीरे 1-3 सप्ताह से अधिक. फिर से प्रजनन की स्थिति के संपर्क में होने से पहले उच्च चालकता में एक और 3 महीने रखें.
  2. अंडे देने वाले एजेंट (SGnRHa + Domperidone) इंजेक्शन का उपयोग करें।
    1. प्रजनन स्थितियों में मादा मछलियों की पहचान करें जो ग्रेविड दिखाई देती हैं (चित्र 4)। बी gauderio में महिला सूजन gonads बस वेंट के लिए caudal होगा. बी ब्रैकीइसियस मादाएं में सूजन वाली बेलियां होती हैं और गहरे शरीर दिखाई देती हैं (चित्र 4क) नर आम तौर पर शुक्राणु उत्पादन एक मुद्दा नहीं है. हालांकि, एकत्र किए गए बड़े शुक्राणु ओंक की मात्रा के कारण बड़े पुरुषों को प्राथमिकता दी जाती है।
      नोट: Spawning एजेंट एक वाणिज्यिक हार्मोन मिश्रण है कि युग्मकों की परिपक्वता की सुविधा है और अंडे देने निर्देशांक. यदि मछली अतीत में अंडे एजेंट के साथ इंजेक्शन दिया गया है, के लिए अनुमति देते हैं और आराम के 4 सप्ताह और इंजेक्शन के बीच पर्याप्त खिला. हम अंडे और शुक्राणु के बहुत सारे के कुछ चंगुल सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 2 पुरुषों और 4-5 महिलाओं इंजेक्शन का सुझाव देते हैं।
    2. एमएस-222 (0.4 g/3 L) में कुछ मिनट के लिए मछली Anesthetize मछली, जब तक मछली अपनी मुद्रा रखने में सक्षम नहीं है, स्थिर है, लेकिन नेत्र आंदोलन है जारी है (चरण द्वितीय53).
    3. अंडे देने वाले एजेंट राशि की गणना करने के लिए मछली (छ) का वजन करें, (0.5 डिग्री सेल्सियस) + 0ण्5 डिग्री सेल्सियस। अतिरिक्त 0.5 $L पाइपिंग त्रुटियों के लिए खातों.
    4. एक पीसीआर ट्यूब में बफर (1x पीबीएस या DPBS) के 4x संस्करणों के लिए अंडे एजेंट जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण. समाधान बादल हो जाएगा। यह थर्माप्लास्टिक पर अंडे देने वाले एजेंट को वितरित करने में मदद करता है और फिर गणना की गई खुराक को मापने के लिए एक पिपेट का उपयोग करता है। अंडे देने वाला एजेंट चिपचिपा है, इसलिए पूरी खुराक को वितरित करना सुनिश्चित करें और पाइपिंग के साथ सावधान रहें।
    5. थर्माप्लास्टिक पर इंजेक्शन समाधान पिपेट और एक सटीक ग्लास सिरिंज में आकर्षित, हवा के बुलबुले से बचने। हम अनुशंसा करते हैं एक 28 जी, 19-25 मिमी लंबाई, beveled सुई.
    6. समाधान को एक चिकनी दर पर पृष्ठीय ट्रंक मांसपेशी में इंजेक्ट करें। सुई 2-4 s के लिए बैठते हैं और फिर हटा दें. तुरंत वसूली के लिए ताजा प्रणाली के पानी में मछली डाल दिया.
    7. लगभग 24 ज के बाद भ्रूण के संग्रह के लिए तैयार (देखें 4.3 या 4.4). क्या एकल सेल microinctions के लिए आवश्यक है सहित सभी आवश्यक सामग्री इकट्ठा (अनुभाग 5 देखें).
  3. प्राकृतिक अंडे के माध्यम से भ्रूण प्राप्त करें।
    1. घर अंडे एजेंट इंजेक्शन वयस्कों (4.2) एक बड़े 450 एल टैंक में. सबसे प्रभावी लिंग अनुपात आम तौर पर किया गया है 1-2 पुरुषों और 3-4 पर्याप्त छुपा पीवीसी ट्यूबों से बने स्थानों के साथ महिलाओं, और अंडे की खपत को रोकने के लिए टैंक तल पर अंधेरे संगमरमर सब्सट्रेट. पत्थर आम तौर पर बी gauderioकी तुलना में बी ब्रैकीस्टियस के लिए अधिक महत्वपूर्ण हैं, जो दरारों में अपने चिपचिपा अंडे जमा करने के लिए पसंद करते हैं या 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के रूप में ऊपर वर्णित.
    2. नियमित रूप से प्रयोगशाला काम के घंटे के लिए रात के समय अंडे मैच के लिए एक रिवर्स प्रकाश चक्र में मछली रखें। एक बंद-the-शेल्फ उपभोक्ता ग्रेड सुरक्षा प्रणाली का उपयोग करना, अवरक्त रोशनी का उपयोग कर मछली की निगरानी के लिए एक दूर से जुड़े पीसी से अशांति को कम करने के लिए (चित्र 3).
    3. मछली स्वतः अंधेरे photoperiod के दौरान अंडे लगभग 24 एच अंडे एजेंट इंजेक्शन के बाद होगा.
    4. जब अंडे देना शुरू होता है, अंडे प्रति घंटा इकट्ठा जबकि अंडे व्यवहार होता है. बी ब्रैकीइस्टियस में, ताजा अंडे को नुकसान को कम करने के लिए एक ठीक कपास जाल पर एक छोटे व्यास साइफन का उपयोग कर अंडे इकट्ठा। 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब या टैंक सब्सट्रेट से बी gauderio अंडे ले लीजिए। कम तीव्रता लाल बत्ती के साथ एक सिर दीपक का उपयोग करके मछली पैदा करने के लिए कम से कम अशांति के साथ कुशलता से काम करते हैं। के रूप में पहली दरार लगभग होता है 1 एच पोस्ट निषेचन (HPF), अंडे का एक बड़ा हिस्सा एकल सेल माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयुक्त होगा.
    5. माइक्रोइंजेक्शन के लिए तुरंत आगे बढ़ें (अनुभाग 5 देखें)।
  4. बी gauderioके इन विट्रो निषेचन के लिए पुरुषों निचोड़ |
    1. जेब्राफ़िश बुक54में वर्णित शुक्राणु विस्तारक समाधान (एसईएस) तैयार करें : 10 एमएम हैप्स, 80 एमएम केसीएल, 45 एमएम नैक्ल, 45 एमएम सोडियम एसीटेट, 0.4 एम एम सी एल2, और 0.2 एमएमसीएल एमजी2.
      1. मात्रा में लाने के लिए और 1 M NaOH के साथ 7.7 करने के लिए पीएच समायोजित करने के लिए ddH2हे का उपयोग करें।
      2. फ्रिज में स्टोर.
      3. उपयोग करने से पहले 0.22 डिग्री फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें.
    2. एमएस-222 (0.4 g/3 L) में कुछ मिनट के लिए मछली Anesthetize मछली, जब तक मछली अपनी मुद्रा रखने में सक्षम नहीं है, स्थिर है, लेकिन नेत्र आंदोलन है जारी है (चरण द्वितीय53). SES के 500 $L alicots बर्फ में रखें.
    3. सूखी हाथ और मछली अच्छी तरह से, विशेष रूप से सिर और वेंट के आसपास. एक MS-222 भिगो, नम कागज तौलिया में कवर एक polystyrene फोम में (दाएं हाथ व्यक्तियों के लिए) बाईं ओर पूर्वकाल प्लेस. सिर के रूप में संभव के रूप में तालिका के साथ समानांतर होना चाहिए.
      नोट: चरण 4.4.4.4.4.6 जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए, और मछली केवल 30-60 s के लिए पानी से बाहर होना चाहिए.
    4. वेंट की ओर गोनाड्स पर हल्के निचोड़ ने मीडिया को निचोड़ने के साथ रोस्ट्रल दिशा में पुच्छल में दबाव लागू करें। मछली कचरे को निष्कासित कर सकती है। किसी भी कचरे को निष्कासित किया जाता है, तो एक नाजुक कार्य पोंछ के साथ वेंट साफ करने के लिए सावधान रहें। शुक्राणु के साथ अपशिष्ट इकट्ठा न करें। पुरुष के आकार के आधार पर, 10-60 डिग्री सेल्सियस आम है।
    5. एक टिप के साथ एक micropipetter का उपयोग करना, ध्यान से शुक्राणु इकट्ठा के रूप में यह 50 डिग्री एल वेतन वृद्धि में पुरुष से निचोड़ा है. शुक्राणु को बर्फ पर एसईएस के 500 डिग्री सेल्सियस में सीधे रखें। यह एक और शोधकर्ता शुक्राणु इकट्ठा करने में सहायता करने के लिए उपयोगी हो सकता है, जबकि अन्य निचोड़. शुक्राणु के रूप में जल्द से जल्द इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन कम से कम 1 एच के लिए व्यवहार्य रहता है.
    6. इकट्ठा करने के तुरंत बाद, वसूली के लिए ताजा प्रणाली के पानी में मछली डाल दिया। मछली केवल 30-60 s के लिए पानी से बाहर होना चाहिए.
  5. बी gauderioके इन विट्रो निषेचन के लिए महिलाओं निचोड़ |
    1. एमएस-222 (0.4 g/3 L) में कुछ मिनट के लिए मछली Anesthetize मछली, जब तक मछली अपनी मुद्रा रखने में सक्षम नहीं है, स्थिर है, लेकिन नेत्र आंदोलन है जारी है (चरण द्वितीय53). कार्य केंद्र पर पॉलीट्राट्राफ्लोरोएथीन शीट रखें।
      नोट: 4.5.1-4.5.5 जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए और मछली केवल 30-60 s के लिए पानी से बाहर होना चाहिए.
    2. सूखे हाथ, उपकरण, polytetrafluoroethene चादर, और मछली अच्छी तरह से, विशेष रूप से सिर और वेंट के आसपास. सिर के साथ पक्ष पर रखें पूर्वकाल का सामना करना पड़ (दाएं हाथ व्यक्तियों के लिए).
    3. वेंट की ओर गोनाड्स पर हल्के निचोड़ ने मीडिया को निचोड़ने के साथ रोस्ट्रल दिशा में पुच्छल में दबाव लागू करें। मछली कचरे को निष्कासित कर सकती है। किसी भी कचरे को निष्कासित किया जाता है, तो एक नाजुक कार्य पोंछ के साथ वेंट साफ करने के लिए सावधान रहें। मछली के आकार के आधार पर, 20-150 अंडे आम है. एक पॉलीटेट्राफ्लुओरोथीन लेपित स्पैटुला/उपकरण का उपयोग करके सावधानी से अंडे इकट्ठा करते हैं क्योंकि वे क्लोका से निचोड़े जाते हैं। जल्दी से एक छोटे पेट्री पकवान और कवर करने के लिए अंडे ले जाएँ। सुनिश्चित करें कि इस प्रक्रिया के दौरान अंडे सूखे रहते हैं। वैकल्पिक रूप से, निचोड़ ने अंडे को एक छोटे पेट्री डिश के आधार पर या पॉलीटेट्राफ्लोरोएथीन शीट को स्पर्श करें क्योंकि उन्हें महिला से निष्कासित किया जाता है।
    4. इकट्ठा करने के तुरंत बाद, वसूली के लिए ताजा प्रणाली के पानी में मछली डाल दिया।
  6. बी gauderioके इन विट्रो निषेचन के लिए अंडे निषेचन प्रदर्शन करते हैं।
    1. SES में अच्छी तरह से मिश्रित शुक्राणु के 100 $L जोड़ें (कदम 4.4) सीधे अंडे द्रव्यमान पर देखें.
    2. प्रणाली के पानी के 1 एमएल जोड़ें (एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर) और अच्छी तरह से 30-60 s के लिए मिश्रण.
    3. एक अतिरिक्त 1-2 एमएल प्रणाली पानी जोड़ें (पेट्री डिश में कुछ जगह छोड़) और इनक्यूबेटर में जगह है. पेट्री डिश पर आईवीएफ का रिकॉर्ड समय और एक 29 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए कदम। विकास की प्रगति की जांच करने के लिए 50 मिनट का टाइमर निर्धारित करें (उदा., पशु ध्रुव पर एकल कोशिका का निर्माण, चित्र 6देखें)। इस समय के दौरान, माइक्रोइंजेक्शन के लिए सामग्री तैयार करते हैं।

5. सिंगल सेल माइक्रोइंजेक्शन

  1. एजेंट इंजेक्शन पैदा करने से पहले माइक्रोइंजेक्शन सुई खींचें (चरण 4.2) या प्राकृतिक अंडे (चरण 4.3)। एक फिलामेंट (O.D. 1.0 मिमी, आईडी 0.58 मिमी, 10 सेमी लंबाई) और माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को खींचने के लिए एक सुई खींचने के साथ एक बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका का उपयोग करें। योजना बनाई उपचार इंजेक्शन प्रति 2-4 सुइयों तैयार करें।
    नोट: एक फिलामेंट के साथ सुइयों को पीछे हटना पसंद किया जाता है, क्योंकि फिलामेंट टिप की ओर समाधान को हिलाता है और बुलबुले को समाप्त करता है। हालांकि, एक फिलामेंट के बिना सुइयों का इस्तेमाल किया जा सकता है और frontloading परिणाम पर कोई प्रभाव नहीं होना चाहिए। सुई एक लंबी है, लेकिन मजबूत टेपर होना चाहिए. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में निम्नलिखित विनिर्देशों के साथ सुई खींच कार्यक्रम का प्रयोग करें: गर्मी $ 500; खींचो $ 70; वेग $ 70; और समय $ 100. प्रतिनिधि सुई रूपचित्र चित्र 5कमें दर्शाया गया है।
  2. इंजेक्शन समाधान तैयार करें और सुई तैयार करें।
    1. एक पीसीआर ट्यूब में 0.9 डिग्री सेल्सियस एसजीआरएनए और 0.9 डिग्री सेल्सियस Cas9 एंजाइम (1 mg/mL) को 10% या 100% फीनोल लाल (1% और 10% अंतिम फीनोल लाल सांद्रता के लिए) जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और बर्फ पर बैठते हैं 2 "5 मिनट sgRNA और Cas9 जटिल करने के लिए अनुमति देते हैं. इंजेक्शन समाधान में SgRNA, Cas9, और फिनोल लाल के अंतिम एकाग्रता की गणना.
      नोट: यदि ऊपर नुस्खा का उपयोग सुई clogging या काटने दक्षता के साथ मुद्दों रहे हैं, यह Cas9 को स्थिर करने और सुई clogging को रोकने के लिए एक 1x अंतिम एकाग्रता नमक /
    2. माइक्रोइंजेक्शन सुई में समाधान के 2 डिग्री सेल्सियस को बैकलोड करने के लिए माइक्रोलोडर पिपेट टिप का उपयोग करें। संभव के रूप में टिप के करीब के रूप में तरल निष्कासित.
    3. माइक्रोमैनिप्युलेटर में सुई लोड करें और दाब सेटिंग्स सेट करें (775 चi, 0ण्1-0ण्2 s तथा 8-12 चग) से प्रारंभ करें।
    4. दायरे के तहत, एक beveled कोण पर सुई टिप को तोड़ने के लिए ठीक forceps की एक जोड़ी का उपयोग करें. जहां सुई के टेपर कठोरता के लिए शुरू होता है की ओर तोड़. यह टिप के करीब तोड़ने के लिए सबसे अच्छा है, इंजेक्शन समाधान के आकार का परीक्षण और फिर यदि आवश्यक हो तो आगे तोड़. एक कठोर टेपर को बनाए रखते हुए सुई का बोर यथासंभव छोटा रहना चाहिए (चित्र 5क)
    5. इंजेक्शन समाधान के आकार को मापने के लिए खनिज तेल और एक माइक्रोमीटर का उपयोग करें। 1-2 एनएल का आमतौर पर उपयोग किया जाता है; 0.1 मिमी व्यास 0.5 एनएल है।
    6. विनिर्देशों के भीतर एक इंजेक्शन मात्रा पाने के लिए सुई टिप या दबाव सेटिंग्स समायोजित करें।
  3. युग्मनज विकसित करने की पहचान करें और इंजेक्शन चरण तैयार करें। इंजेक्शन चरण सेट करें। एक 100 मिमी व्यास पेट्री पकवान ले लो. उलटा शीर्ष के नीचे और जगह उलटा. उल्टे शीर्ष के भीतर एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें। कैसे अपने micromanipulator क्षेत्र के लिए घुड़सवार है पर निर्भर करता है, उल्टे आधार से जोड़ा ऊंचाई अनावश्यक हो सकता है.
    1. विकासशील अंडों को देखिए और आईवीएफ के बाद अनुमानित निषेचित युग्मनज 50-60 मिनट की पहचान करें। पशु ध्रुव बनना शुरू हो जाएगा और जर्दी/पशु कोशिका इंटरफ़ेस के चारों ओर छोटी वसा की बूंदों की अधिकता होगी (चित्र 6)।
    2. एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipette का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में कम पानी के साथ 10-20 अंडे ले लीजिए (थोड़ा टिप कटौती अंडे पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए) और स्लाइड के किनारे पर जगह है. पानी स्लाइड के नीचे दुष्ट हो जाएगा और किनारे के खिलाफ अंडे खींच।
    3. एक नाजुक कार्य पोंछ का प्रयोग करें और धीरे अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए स्लाइड दबाएँ और अंडे मजबूती से स्लाइड के किनारे का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं। इंजेक्शन के दौरान अंडे की आवाजाही से बचने के लिए थोड़ा खड़े नमी बनाए रखते हुए अंडे को नम रखने के लिए पर्याप्त पानी होना चाहिए।
  4. सीधे एकल कक्ष में इंजेक्शन.
    1. अंडों को स्लाइड के विरुद्ध लंबवत संरेखित करें, जो निकट की सुई के लंबवत हैं (चित्र 5ठ)।
    2. micromanipulator का उपयोग करना, chorion के खिलाफ सुई की स्थिति. मोटे तौर पर एक 45 डिग्री कोण पर, chorion में सुई डालने, और फिर एकल सेल में. यह जर्दी के माध्यम से एकल सेल में प्रवेश करने के लिए उपयोगी हो सकता है। मुक्त हाथ और micromanipulator के साथ दोनों इंजेक्शन चरण ले जाने इंजेक्शन प्रक्रिया पर अधिक नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं (चित्र 5B) .
    3. sgRNA/Cas9/phenol लाल समाधान को एकल कोशिका में इंजेक्ट करें। ध्यान से सुई को हटा दें। अगले अंडे के लिए आगे बढ़ें और सभी अंडे इंजेक्शन हैं जब तक 5.4.1-5.4.3 चरणों को दोहराएँ.
    4. ठीक संदंश के साथ इंजेक्शन के दौरान टूटे हुए किसी भी अंडे को निकालें। धीरे एक नया 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में इंजेक्शन चरण से अंडे को दूर करने के लिए एक धार की बोतल में फ़िल्टर ्ड प्रणाली पानी के 0.22 डिग्री का प्रयोग करें।
    5. 5.3.3-5.4.6 जब तक सभी अंडे इंजेक्ट किए गए हैं या दो-कोशिका अवस्था में विकसित नहीं हुए हैं, तब तक चरण 5.3.3-5.4.6 दोहराएँ. निषेचन दरों और इंजेक्शन की सफलता का निर्धारण करने के लिए एक नहीं इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में लगभग 20 माना निषेचित अंडे अलग सेट करने के लिए सुनिश्चित करें. बड़े क्लच के लिए दो कोशिका चरण में विकसित किए गए इंजेक्शन वाले भ्रूणों का उपयोग करें, और छोटे क्लच के लिए अनुमानित निषेचित अंडे निर्धारित किए गए हैं।
    6. इसके अतिरिक्त, एक sgRNA /इंजेक्शन नियंत्रण पर विचार 15-25 Cas9 के साथ भ्रूण एक जीन है कि जीनोम में मौजूद नहीं है के खिलाफ एक sgRNA के साथ जटिल. GFP जीन जंगली प्रकार भ्रूण के लिए सिफारिश की. अंडे की संख्या रिकॉर्ड, माता पिता, आईवीएफ समय, और प्रत्येक पेट्री पकवान पर तारीख. sgRNA लक्ष्य या लेबल को अनइंजेक्ट के रूप में शामिल करें. 29 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर जाएं।

6. पशुपालन

  1. अंडे के लिए देखभाल.
    1. इंजेक्शन के बाद अंडे की व्यवहार्यता 4-6 ज की जाँच करें।
    2. मृत अंडे की संख्या रिकॉर्ड, साथ ही किसी भी है कि unfertilized हैं. अनिषेचित अंडे आठ-कोशिका अवस्था के चारों ओर गिरेंगे और पशु ध्रुव पर कोशिकाओं का गुलाब का पैटर्न होगा (चित्र 6) मृत अंडे और पानी में अंडे के मलबे की मात्रा की संख्या पर निर्भर करता है, पानी के कम से कम 50%-80% को हटाने और फ़िल्टर ्ड प्रणाली के पानी के साथ बदलें. यह पेट्री डिश के नीचे साफ़ करने के लिए उपयोगी हो सकता है अगर एक सेलुलर मलबे फिल्म या biofilm रूपों.
    3. अगले 2-3 दिनों के लिए, अंडे की जाँच करें 1-2x दैनिक. अंडे की जाँच किए जाने पर चरण 6.1.2-6.1.3 दोहराएँ।
    4. 2 डिग्री 3 दिनों के बाद लार्वा निकल जाएगा। सभी अंडे casings निकालें के रूप में वे अंडे. कोमल पाइपिंग आधे-अधूरे लार्वा को मुक्त करने में मदद कर सकती है।
  2. लार्वा की देखभाल करें।
    1. अंडे की जाँच करें 1 "2x दैनिक. लार्वा की जांच के समय चरण 6.1.1.6.1.3 दोहराएँ.
    2. 6-14 डीपीएफ से, लार्वा को सिरका ईल खिलाएं। भोजन की एक मामूली अधिक अच्छा है, क्योंकि सिरका eels पकवान में जीवित रहेगा. हर बार जब डिश की जाँच की और साफ सिरका eels जोड़ें.
    3. 11-14 डीपीएफ से, सिरका ईल्स के अलावा 5-10 ताजा पैदा हुए आर्टेमिया प्रति लार्वा जोड़ें। इस समय के दौरान लार्वा मुक्त तैराकी आर्टीमियाखाने के लिए सीखना होगा .
    4. 15 DPF में, अंडे के कप के लिए लार्वा ले जाएँ (धारा 6.2.5 देखें) बहते पानी, निस्पंदन, और वातन के साथ एक टैंक में। प्रति कप लगभग 25 भ्रूण से अधिक नहीं होना चाहिए। अंडे के कप नीचे एक जाल जाल के साथ प्लास्टिक के कप हैं। एक 100 मिमी पेट्री डिश ऊपर / नीचे अंडे कप के नीचे करने के लिए मदद करने के लिए जाल के माध्यम से गिरने से भोजन को रोकने के लिए जोड़ा जा सकता है. अंडा कप मछली पानी की गुणवत्ता के कारणों के लिए पानी की एक बड़ी मात्रा में रखे जा करने के लिए अनुमति देते हैं, जबकि असतत समूहों को बनाए रखने. 15-18 दिनों से सिरका ईल और 15-30 ताजा अंडे से पैदा हुए आर्टेमिया दोनों को जोड़ना जारी रखें। साफ पेट्री पकवान टुकड़ा दैनिक और मृत Artemiaकी जनता को दूर करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें .
    5. दिन 18-30 से, केवल ताजा पैदा की Artemiaफ़ीड . मछली बढ़ने के रूप में खिला राशि में वृद्धि और अगर पूंछ काटने देखा जाता है.
    6. लगभग 30 दिनों के बाद, 10 एल (2.5 गैलन) टैंक, टैंक प्रति लगभग 25 व्यक्तियों के लिए मछली ले जाएँ. सुनिश्चित करें कि वहाँ निस्पंदन, वातन, और छुपाने के लिए स्थानों है। बेलनाकार biofiltration मीडिया और छोटे व्यास पीवीसी ट्यूबों पर विचार करें.
    7. लगभग 30-45 दिनों के बाद से ताजा पैदा हुए आर्टेमिया और ब्लैकवार्म को खिलाएं। टैंक के लिए मानक सफाई और पानी में परिवर्तन बनाए रखें (यानी, प्रति 1 सप्ताह में कम से कम $ 10%-20% पानी में परिवर्तन)।
    8. $ 45 डीपीएफ के बाद, $ 60 डीपीएफ तक केवल ब्लैकवार्म फ़ीड करें।
    9. $ 60 डीपीएफ के बाद, लगभग 15 मछली के साथियों को 40 एल (10 गैलन) टैंक में ले जाएँ और वयस्क पशुपालन प्रक्रियाशुरू करें। पीवीसी ट्यूब और एक यार्न "मोप" (भूरे रंग के धागे का एक द्रव्यमान एक कॉर्क के चारों ओर एक साथ बंधे) स्थानों को छुपाने के लिए जोड़ें (चित्र 3C)। मछली प्रजनन आकार के करीब होना चाहिए (10 डिग्री 12 सेमी) लगभग 3 के बाद 4 महीने निषेचन के बाद.

7. वयस्क पशुपालन

  1. मछली को प्रतिदिन पर्याप्त ब्लैकवार्म के साथ खिलाएं ताकि अगले भोजन में थोड़ी मात्रा में ब्लैकवार्म मौजूद हों। इस विज्ञापन libitum खिला अधिकतम विकास की अनुमति देता है.
  2. सप्ताह में कई बार, यह bloodworms के साथ खिला ब्लैकवार्म पूरक करने के लिए सहायक हो सकता है.
  3. स्वच्छ टैंक एक 20%-30% पानी परिवर्तन के साथ हर 2-4 सप्ताह. यदि यार्न मोप बायोफिल्म/एगाज से भरा हो जाता है, तो इसे आरओ पानी के नीचे साफ कर लें।

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Representative Results

SgRNA लक्ष्य साइटों दोनों बी gauderio और बी brachyistius में scn4aa के exon 1 के भीतर की पहचान की गई के रूप में धारा 1 में वर्णित. sgRNAs धारा 2 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किए गए थे। सफल sgRNA चयन और संश्लेषण के बाद (चित्र 1), इन विट्रो दरार का परीक्षण किया गया था (चित्र 2) . इनविट्रो काटने में प्रदर्शन करने वाले sgRNAs तो एकल सेल microinsinctions के लिए चुना गया.

वयस्क मछली प्रजनन के लिए वातानुकूलित थे (धारा 4.1), तो एक अंडे एजेंट के साथ इंजेक्शन (धारा 4.2) और बाद में निचोड़ा (बी gauderio) आईवीएफ के लिए के रूप में धारा 4.4 में वर्णित या स्वाभाविक रूप से अंडे की अनुमति दी(बी ब्रैकिइस्टियस) के रूप में धारा 4.3 में वर्णित है. इन प्रयासों से दोनों प्रजातियों में माइक्रोइंजेक्शन के लिए एकल कोशिका भ्रूण मिले। के रूप में धारा 5 में वर्णित, 1.5 "2.0 nL scn4a sgRNA/Cas9/phenol लाल परिसर (65-190 ng/uL sgRNA, 450 ng/uL Cas9, 1% 10% फीनोल लाल, अंतिम सांद्रता) एक-सेल चरण में इंजेक्ट किया गया था। एक ही क्लच से अंडे uninsisisathesiअधिकार नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. सभी भ्रूणों की देखभाल धारा 6 में वर्णित के रूप में की गई थी। आईवीएफ के बाद, 40%-90% अंडे निषेचित थे, और 70%-90% भ्रूण इंजेक्शन के बाद से निकलने से बच गए।

मछली के बारे में 75% 6 -11 DPF के लिए बच गया और फिर phenotyped थे. Larval मछली एक 35 मिमी पेट्री डिश में रखा गया था Sylgard स्थिर एजी के साथ एक बड़ा पकवान में एम्बेडेड/ भ्रूण आंदोलन प्रणाली के पानी के साथ बनाया 3% agarose मोल्ड का उपयोग कर प्रतिबंधित किया गया था और भ्रूण फिट करने के लिए कटौती (चित्र 7 B) . एक ही रिकॉर्डिंग कक्ष दोनों प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक ही agarose मोल्ड प्रजातियों की तुलना के बीच इस्तेमाल किया गया था। भ्रूण 60 s, जो EODs के सैकड़ों पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त है के लिए दर्ज किए गए थे. तुलना के लिए आयु और आकार-मिलान किए गए बिना इंजेक्शन किए गए नियंत्रणों का चयन किया गया. इस समय बिंदु पर, जीवित भ्रूण के 10%-30% एक कम आयाम ईओडी दिखा. कोई स्पष्ट रूपात्मक दोष के साथ ईओडी आयाम में कमी प्रदर्शित भ्रूण और नियंत्रण uninsed पूरे भ्रूण डीएनए निष्कर्षण और scn4aa लक्ष्य साइट के बाद पीसीआर के लिए पचा रहे थे. वहाँ अक्सर phenotype के penetrance की एक श्रृंखला थी, कुछ व्यक्तियों के साथ दूसरों की तुलना में ईओडी आयाम में एक मजबूत कमी होने.

पीसीआर को साफ करने और क्लोनिंग के बाद, प्रत्येक भ्रूण से 30 + क्लोन Sanger अनुक्रमण के लिए चुना गया. CRISPR/Cas9 प्रेरित उत्परिवर्तनों की पहचान B. gauderio (चित्र 8A,B) और B. ब्रैकिइस्टियस (चित्र 9A,बी) में मजबूत ईओडी आयाम में कमी वाले व्यक्तियों की पहचान की गई (चित्र 8C और चित्र 9C ) , क्रमशः), जहां uninsisiब किए गए नियंत्रण केवल संदर्भ जीनोटाइप था. पुष्टि की म्यूटेंट के बीच ईओडी आयाम का दृश्य ("CRISPR") और उम्र / आकार मिलान uninsiding नियंत्रण का प्रदर्शन किया है कि दोनों scn4a उत्परिवर्ती बी ब्रैकीस्टियस (चित्र 10A) और बी gauderio (चित्र 10B ) भ्रूण नियंत्रण की तुलना में काफी कम ईओडी आयाम था (पी एंड एलटी; 2.2 x 10-16, वेल्च दो नमूना टी परीक्षण). SCN4aa के CRISPR/Cas9 लक्ष्यीकरण दोनों बी ब्रैकीइस्टियस और बी gauderio और दोनों प्रजातियों में लार्वा / प्रारंभिक इलेक्ट्रोसाइट निर्वहन में scn4aa implicate में सफल रहा था.

Figure 1
चित्र 1: SgRNA टेम्पलेट संश्लेषण और प्रतिलेखन. (ए) SgRNA टेम्पलेट संश्लेषण की जेल छवि. लेबल myod के लिए अलग sgRNAs के अनुरूप (MYO2, MYO1) और scn4aa के लिए तीन sgRNAs (S1$S3). oligomers annealing के बाद, एक $ 120 बीपी टेम्पलेट का उत्पादन किया है. (बी ) बी gauderio (bg2017) के लिए तीन sgRNA के लिए sgRNA प्रतिलेखन की जेल छवि और बी ब्रैकिइस्टियस (bb2016, 2017) के लिए दो. SgRNA माध्यमिक संरचना के कारण दो बैंड के रूप में दिखाई देगा और एक dsDNA सीढ़ी का उपयोग करते समय 50 डिग्री 150 बीपी के बीच होगा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सफल के प्रतिनिधि जेल छवि (sg1) और असफल (sg2) इन विट्रो CRISPR assays. CRISPR घटकों के बिना टेम्पलेट के बराबर राशि scn4aa लेन में दिखाया गया है। sg1 में डुप्लिकेट बैंड जो दिखाते हैं कि काटने हुई है नोट करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कमजोर बिजली मछली के लिए प्रजनन टैंक setups. (A) अंडे देने वाले व्यवहार के वायरलेस वीडियो निगरानी के लिए विशिष्ट सेटअप के Schematic. तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीसीटीवी कैमरों (स्वान, इंक) अवरक्त प्रकाश का उत्पादन करने में सक्षम पानी के शीर्ष पर उद्देश्य से कर रहे हैं और एक डिजिटल वीडियो रिकॉर्डर (DVR) से जुड़े. वीडियो एक नेटवर्क से जुड़े कंप्यूटर (पीसी) से एक आसन्न कमरे में व्यवहार पैदा करने के लिए वास्तविक समय में नजर रखी है. (ख) बी ब्रैकीइस्टियसमें इस तरह के सेटअप के साथ पकड़े गए स्पोनिंग व्यवहार . (सी)पीवीसी छुपा ट्यूब और यार्न mops के साथ बी gauderio के लिए एक विशिष्ट प्रजनन सेटअप. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रजनन पुरुषों और महिलाओं. (A ) बी ब्रैकिइस्टियस और (बी) बी. दोनों प्रजातियों यौन द्विरूपी और आसानी से नेत्रहीन प्रतिष्ठित जब यौन परिपक्व हैं. दोनों महिलाओं को इन तस्वीरों में gravid हैं, विशेषता सूजन bellies कि परिपक्व अंडे से भरे हुए हैं प्रदर्शन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: माइक्रोइंजेक्शन। (ए) ग्लास केशिका सुई युक्तियाँ एक उपयुक्त माइक्रोइंजेक्शन मात्रा देने के लिए टूट जाना चाहिए। बाईं ओर की नोक अटूट है। मध्य और सही सुझाव अंडे chorion छेद करने के लिए एक थोड़ा angled bevel के साथ टूट रहे हैं. (बी) अंडे कांच की स्लाइड (1%-10% फीनॉल लाल को इंजेक्शन की डिलीवरी की कल्पना करने के लिए ट्रेसर के रूप में शामिल किया जाता है) और कांच की केशिका सुइयों के साथ इंजेक्ट किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: विकासात्मक चरण. (A) B. गौड़ीरियो और (B) B. ब्रैकीइस्टियस. सभी अंडे निषेचित मान लिया जाता है और विकास 24 HPF के लिए नजर रखी है. 12 के बीच HPF भ्रूण व्यवहार्य अंडे में दिखाई दे रहे हैं, अन्यथा अंडे गिरावट प्रदर्शित करते हैं. कई डिवीजनों अंडे सक्रियण पर जगह लेने के लिए दिखाई देते हैं, निषेचन की परवाह किए बिना. अनिषेचित अंडे दरार के असामान्य पैटर्न प्रदर्शित करते हैं जो निषेचित अंडों में अधिक सममित होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: इस अध्ययन में प्रयुक्त लार्वा अभिलेखन कक्ष का फोटोग्राफ। (ए) इलेक्ट्रोड सिलगार्ड के भीतर एम्बेडेड हैं, लेकिन 35 मिमी पकवान में विस्तार एक भ्रूण एक 3% agarose मोल्ड के माध्यम से प्रतिबंधित युक्त. (ख)उच्च आवर्धन छवि जो अग्रोस के कारण भ्रूण की प्रतिबंधित गति को उजागर करता है। agarose के टुकड़े है कि भ्रूण के आकार में परिवर्तन के रूप में हटाया जा सकता है ध्यान दें. बी gauderio भ्रूण सकारात्मक इलेक्ट्रोड का सामना करना पड़ रहा है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: CRISPR/Cas9 प्रेरित उत्परिवर्तनों में B. gauderio| (क)एक एकल scn4aa लक्षित एफ0बी गौड़ीरियो भ्रूण (11 डीपीएफ) में Cas9 प्रेरित उत्परिवर्तनों के जीनोमिक डीएनए से बत्तीस क्लोन अनुक्रम। संदर्भ अनुक्रम sgRNA लक्ष्य ग्रे में प्रकाश डाला साइट के साथ रेखांकित किया है, प्रोटोस्पेसर संलग्न आकृति (PAM) अनुक्रम लाल रंग में प्रकाश डाला, और Cas9 कट साइट के साथ चिह्नित "$". अपेक्षित वाइल्ड प्रकार अनुक्रम से परिवर्तन दिया जाता है और प्रत्येक अनुक्रम के लिए क्लोन की संख्या कोष्ठक में दिया जाता है। (संक्षिप्तीकरण: + $ प्रविष्टि, - [ विलोपन, ] $ indel) किसी भी गैर-CRISPR संबद्ध अनुक्रम भिन्नताओं बोल्ड कर रहे हैं. चित्रा Jao एट अल60के बाद मॉडलिंग की . (ख) एमिनो अम्ल अनुक्रम , scn4aa दस्तक के अनुक्रम क्लोन से भविष्यवाणी की B. gauderio से (ए) जंगली प्रकार अनुक्रम से Cas9 प्रेरित परिवर्तन लाल रंग में प्रकाश डाला और न्यूक्लिओटाइड प्रेरित परिवर्तन संख्या दिया जाता है. (ग)पांच आकार के लार्वा से बीस सेकंड की विद्युत रिकॉर्डिंग, सभी ने एक ही रिकॉर्डिंग कक्ष में 6 डीपीएफ दर्ज किए। लाभ सेटिंग्स सभी निशान के लिए समान हैं. लाल रंग में निशान बी gauderio लार्वा की पुष्टि उत्परिवर्तनों के साथ कर रहे हैं (एक व्यक्ति चित्र 8Aमें दिखाया गया , बी ऊपर), काले रंग में निशान uninsed बी gauderio लार्वा से कर रहे हैं. कुल मिलाकर, Scn4aa के CRISPR/Cas9 संपादन ईओडी आयाम में कमी से पता चला, हालांकि प्रभाव विषम था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: CRISPR/Cas9 प्रेरित उत्परिवर्तनों में B. ब्रैकिइस्टियस| (ए) एक एकल scn4a a targeted F0B. ब्रैकिइस्टियस भ्रूण (11 डीपीएफ) में Cas9 प्रेरित उत्परिवर्तनों के जीनोमिक डीएनए से चालीस-दो क्लोन अनुक्रम। संदर्भ अनुक्रम sgRNA लक्ष्य ग्रे में प्रकाश डाला साइट के साथ रेखांकित किया है, प्रोटोस्पेसर संलग्न आकृति (PAM) अनुक्रम लाल रंग में प्रकाश डाला, और Cas9 कट साइट के साथ चिह्नित "$". अपेक्षित वाइल्ड प्रकार अनुक्रम से परिवर्तन दिया जाता है और प्रत्येक अनुक्रम के लिए क्लोन की संख्या कोष्ठक में दिया जाता है। (संक्षिप्तीकरण: + $ प्रविष्टि, - [ विलोपन, ] $ indel) किसी भी गैर-CRISPR संबद्ध अनुक्रम भिन्नताओं बोल्ड कर रहे हैं. चित्रा Jao एट अल60के बाद मॉडलिंग की . (ख) एमिनो अम्ल अनुक्रम में scn4aa दस्तक से क्लोन से भविष्यवाणी की B. ब्रैकिइस्टियस में (ए) जंगली प्रकार अनुक्रम से Cas9 प्रेरित परिवर्तन लाल रंग में प्रकाश डाला और न्यूक्लिओटाइड प्रेरित परिवर्तन संख्या दिया जाता है. (ग)चार आकार के लार्वा से दस सेकंड विद्युत रिकॉर्डिंग, सभी ने एक ही रिकॉर्डिंग कक्ष में 10 डीपीएफ दर्ज किए। लाभ सेटिंग्स सभी निशान के लिए समान हैं. लाल रंग में निशान बी ब्रैकिइस्टियस लार्वा से हैं जिनमें पुष्टि उत्परिवर्तन (ऊपर ए, बी में दिखाए गए एक व्यक्ति), काले रंग में निशान बिना इंजेक्शन बी ब्रैकिइस्टियस लार्वा से हैं। कुल मिलाकर, Scn4aa के CRISPR/Cas9 संपादन ईओडी आयाम में कमी से पता चला, हालांकि प्रभाव विषम था. उल्टे EODs रिकॉर्डिंग के दौरान मछली बदलने अभिविन्यास से कर रहे हैं. इस के बावजूद प्रयोगात्मक मछली और नियंत्रण के बीच कोई अंतर स्पष्ट है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: CRISPR के औसत ईओडी आयाम के बॉक्स भूखंडों और uninsddsd आकार / (क)10 डीपीएफ में बी ब्रैकीस्टियस लार्वा का ईओडी आयाम। 100 के लाभ के साथ दर्ज की गई, CRISPR n - 56 दो व्यक्तियों से EODs, तीन व्यक्तियों से इंजेक्शन n $ 114 EODs. (बी)6 डीपीएफ में बी गौड़ीरियो लार्वा का ईओडी आयाम। 500 के लाभ के साथ दर्ज की गई, CRISPR n - 34 दो व्यक्तियों से EODs, तीन व्यक्तियों से इंजेक्शन n $ 148 EODs. CRISPR मछली की आयाम काफी unइंजेक्ट नियंत्रण की तुलना में कम था (पी एंड एलटी; 2.2 x 10-16, वेल्च दो नमूना टी परीक्षण). सभी व्यक्तियों को चित्र 7में वर्णित अभिलेखकक्ष के साथ अभिलिखित किया गया था . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विवरण अनुक्रम
लगातार ओलिगोमर 5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTCAGATGATGATAGCCTATTTGC TATTTCCTACTAAAC-3'
लक्ष्य ओलिगोमर रीढ़ की हड्डी (GG-N18, कोई पीएएम) 5'-ताताकागैक्टाग-N18-GTTTAGCTAGAATAGCAAG-3'
लक्ष्य ओलिगोमर रीढ़ की हड्डी (N20, कोई पीएएम) 5'-ताताकककककग-न 20-गटटगगटगग-3'
ब्रिनोमायरस ब्रैकीइस्टियस
scn4a a bb sgRNA लक्ष्य (N18, PAM के साथ): 5'-टीसीटीसीसीसीसीसीसीसीएसीसीएसीसीजी-3'
Scn4aa बी बी एस जी आर एन ए ओलिगोमर (GG-N18): 5'-टाटाकागैक्टाग टीसीसीटीसीसीसीसीसीटीसीटीसीटीसीच्या गटात गटगटागाटाग-3'
scn4aa बी बी पीसीआर प्राइमर (218 bp)
Scn4aa[bb]exon1]F: 5'-एटीजीजीसीसीसीटीसीटीसीएए-3'
Scn4aa[bb]exon1]R: 5'-टीसीटीसीसीएजीजीएटाटाकाटाएक्ट-3'
ब्रैकीहाइपोपोमस गौडेरियो
Scn4aa Bg sgRNA लक्ष्य (N17, PAM के साथ): 5'- कागागागटगग-3'
Scn4aa Bg sgRNA ओलिगोमर (GG-N17): 5'-ताताकगकककककगटगगगटग गटटगगटगगग-3'
Scn4aa Bg PCR प्राइमर जोड़ी (204 bp)
scn4aa[bg]exon1]F: 5'-सीजीसीसीटीजीटीसीसीसीटीसीएजी-3'
scn4aa[bg]exon1]R: 5'-ATCTTCAGGTGGCTCCAT-3'

तालिका 1: प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक Oligonucleotides.

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Discussion

कमजोर बिजली मछली की phenotypic समृद्धि, जीनोमिक्स संसाधनों के हाल ही में प्रसार के साथ, कमजोर बिजली मछली मॉडल में कार्यात्मक जीनोमिक उपकरणों के लिए एक मजबूत जरूरत को प्रेरित करती है. यह प्रणाली विशेष रूप से मछली के समानांतर वंश में कई phenotypic लक्षण के अभिसरण विकास की वजह से आकर्षक है, जो आसानी से प्रयोगशाला में रखा जाता है.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल कमजोर बिजली की मछली है कि समानांतर में electrogenesis और इलेक्ट्रोरिसेप्शन विकसित की lineages में CRISPR/Cas9 तकनीक की प्रभावकारिता को दर्शाता है, और इसलिए इस मॉडल के वादे को संबोधित करने के लिए एक बड़ा कदम का प्रतिनिधित्व करता है फीनोटाइपिक विकास के तुलनात्मक जीनोमिक्स में भविष्य में काम.

इस सरल methodological दृष्टिकोण केवल बुनियादी आणविक जीव विज्ञान कौशल और प्रशिक्षण की आवश्यकता है, Gagnon प्रोटोकॉल38की एक बुनियादी गोद लेने के बाद, व्यापक रूप से जेब्राफ़िश के लिए इस्तेमाल किया. यह ध्यान देने योग्य है कि प्रौद्योगिकी की प्रगति के रूप में, वहाँ sgRNA उत्पादन के लिए और अधिक वाणिज्यिक किट के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कंपनियों है कि गाइड आरएनए संश्लेषित कर सकते हैं, इस प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं कि आणविक जीव विज्ञान अनुभव और उपकरणों की कमी के लिए और अधिक सुलभ बना रही है. हम पहले ध्यान दें कि उच्च mutagenesis दक्षता इंजेक्शन लार्वा के प्रत्यक्ष phenotyping की अनुमति देता है. तथापि, फीनोटाइपिक मोज़ेकवाद का एक पर्याप्त डिग्री प्रतीत होता है , जो असामान्य नहीं है और साहित्य41,42,43,44के अनुरूप है . उदाहरण के लिए, इस scn4aa अध्ययन में, उत्परिवर्तनों को ले जाने वाले कुछ व्यक्तियों ने अपेक्षाकृत मूक थे जो अन्य लोगों की तुलना में बहुत बड़े आयाम EODs का प्रदर्शन किया (चित्र 7, चित्र 8)। वर्तमान में यह स्पष्ट नहीं है कि इनमें से कितने उत्परिवर्तनों को जर्मलाइन में ले जाया जाता है। तत्काल भविष्य के प्रयासों स्थिर उत्परिवर्ती लाइनों बनाने पर निर्देशित किया जाएगा.

नॉकआउट के लिए NHEJ मार्ग का उपयोग केवल CRISPR/Cas9 जीन संपादन के कई संभावित अनुप्रयोगों में से एक है: तरीकों यहाँ उल्लिखित अधिक उन्नत अनुप्रयोगों के लिए एक कदम पत्थर हैं55,56. भविष्य के प्रयासों का उद्देश्य sgRNA/Cas9 परिसर के साथ सह-इंजेक्शन डीएनए दाता टेम्पलेट्स को डिजाइन करना होना चाहिए। यह सरल संशोधन अंतर्जात टेम्पलेट-आधारित मरम्मत तंत्र (यानी, होमियोलॉजी निर्देशित मरम्मत, या HDR) का लाभ उठाना होगा और सटीक नॉक-इन की अनुमति देगा। हालांकि HDR NHEJ दृष्टिकोण की तुलना में एक कम दक्षता पर होता है, प्रगति के लिए अपनी प्रभावकारिता57,58बढ़ाने के लिए किया गया है . इस कम दक्षता के लिए डीएनए दाता टेम्पलेट/CRISPR/Cas9 निर्माण के डिजाइन को अनुकूलित करने, अंतर्जात मरम्मत तंत्र को अधिक कुशल बनाने, और भ्रूण उत्पादन में वृद्धि करने के प्रयासों की आवश्यकता होगी (नीचे देखें)। यदि दक्षता के इस मुद्दे को हल किया जा सकता है, knockins फ्लोरोसेंट टैग जोड़ने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जीन उत्पाद का एक उत्परिवर्तित रूप व्यक्त, या प्रमोटर या बढ़ाने दृश्यों को बदलने.

जबकि इस तकनीक के पीछे आणविक जीव विज्ञान काफी सरल है, पशुपालन आवश्यकताओं पर्याप्त हैं, लेकिन दुर्गम नहीं. बी gauderio व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और किसी भी अनुसंधान कार्यक्रम के लिए काफी तेजी से नस्ल के लिए एक साल के तहत में एक कॉलोनी है. इसके विपरीत, बी ब्रैकीस्टियस धीरे-धीरे विकसित होता है, और शारीरिक विशेषताओं आईवीएफ में प्रयास इस प्रकार अब तक असफल साबित हुए हैं। अन्य, बड़ी प्रजातियों, जैसे कैम्पीलोमोर्मर्मस59 इस दृष्टिकोण के लिए अधिक अनुकूल हो सकता है। बी ब्रैकीइस्टियसके लिए, सभी इंजेक्शन भ्रूण प्राकृतिक अंडे दृष्टिकोण है, जो काफी अधिक श्रम गहन है का उपयोग एकत्र किए गए थे। भविष्य के प्रयासों बी ब्रैकीइस्टियस आईवीएफ में दक्षता बढ़ाने के लिए ऊपर वर्णित दक्षता मुद्दों के लिए भ्रूण की एक उच्च उपज के लिए अनुमति देगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों मोनिका लुकास, कैथरीन शॉ, रयान टेलर, जारेड थॉम्पसन, निकोल Robichaud, और आशा है कि Healey मछली पालन, डेटा संग्रह, और जल्दी प्रोटोकॉल विकास के साथ मदद के लिए वीर प्रयासों को स्वीकार करते हैं. हम पांडुलिपि के लिए अपने सुझावों के लिए तीन समीक्षकों को भी धन्यवाद देना चाहूंगा। हमें विश्वास है कि अंतिम उत्पाद उनकी टिप्पणी को संबोधित करने के बाद बेहतर गुणवत्ता का हो. इस काम के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन #1644965 और जेआरजी के लिए #1455405 से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद वीएलएस के लिए डीजी अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 mg/mL RNA grade Glycogen Thermo Scientific R0551
50 bp DNA ladder NEB N3236L
Borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF100-58-10 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL PNA Biology CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector Fisher Scientific E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific 10289651
Hamilton syringe Fisher Scientific 14-824-654 referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe Fisher Scientific 06-666 referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
NEBuffer 3 NEB B7003S used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit NEB M0480L
Ovaprim Syndel USA https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm Fisher Scientific S37440 referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller WPI SU-P97 sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Reusable needle- requires customization Fisher Scientific 7803-02 Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase NEB M0203L Use with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated tools bonefolder.com T-SPATULA4PIECE referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

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References

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Constantinou, S. J., Nguyen, L., Kirschbaum, F., Salazar, V. L., Gallant, J. R. Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (152), e60253, doi:10.3791/60253 (2019).

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