Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dämpning av gnistan: CRISPR/Cas9 genom redigering i svagt elektrisk fisk

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60253
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Summary

Här presenteras ett protokoll för att producera och bakre CRISPR/Cas9 Genome knockout elektrisk fisk. Beskrivs i detalj är de nödvändiga molekylära biologi, avel och djurhållning krav för både en gymnotiform och en mormyrid, och injektion tekniker för att producera Cas9-inducerad indel F0 larver.

Abstract

Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur. Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent dragen i gymnotiforms och mormyrids, två arter-rika benfisk klader som producerar och upptäcka svaga elektriska fält och kallas svagt elektrisk fisk. Under 50 år sedan upptäckten att svagt elektrisk fisk använder el för att känna sin omgivning och kommunicera, en växande gemenskap av forskare har fått enorma insikter i utvecklingen av utveckling, system och kretsar neurovetenskap, cellulär fysiologi, ekologi, evolutionsbiologi och beteende. På senare tid har det skett en spridning av genomiska resurser för elektrisk fisk. Användningen av dessa resurser har redan underlättat viktiga insikter när det gäller sambandet mellan genotyp och fenotyp hos dessa arter. Ett stort hinder för att integrera genomik-data med fenotypiska data av svagt elektrisk fisk är en närvarande brist på funktionella genomik-verktyg. Vi rapporterar här ett fullständigt protokoll för att utföra CRISPR/Cas9 mutagenes som utnyttjar endogena DNA-reparationsmekanismer i svagt elektrisk fisk. Vi visar att detta protokoll är lika effektivt i både den mormyryd arten brienomyrus brachyistius och gymnotiform brachyhypopomus gauderio genom att använda CRISPR/Cas9 för att rikta indels och punktmutationer i den första exon av natrium kanal gen scn4aa. Med detta protokoll erhölls embryon från båda arterna och genotypades för att bekräfta att de förutspådda mutationerna i den första exon av natrium kanalen scn4aa var närvarande. Den knock-out framgång fenotyp bekräftades med inspelningar som visar minskade elektriska organ urladdnings amplituder jämfört med uninjected storlek matchade kontroller.

Introduction

Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Två linjer av benfisk fisk, artikel fiskar och Siluriformes, utvecklades elektromottagning parallellt, och fem linjer av fiskar (Gymnotiformes, mormyrids, och släktena astroscopus, Malapterurus och Synodontis) utvecklades elektrogenes parallellt. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur1,2,3.

Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent dragen i gymnotiforms och mormyrids, två artrika benfisk klader, som producerar och upptäcka svaga elektriska fält och kallas svagt elektrisk fisk. Under de 50 år sedan upptäckten att svagt elektrisk fisk använder elektricitet för att känna sin omgivning och kommunicera4, en växande gemenskap av forskare har fått enorma insikter i utvecklingen av utvecklingen1,5 ,6, system och kretsar neurovetenskap7,8,9,10, cellulär fysiologi11,12, ekologi och energetik13 ,14,15,16,17, beteende18,19och makro evolution3,20,21 .

På senare tid har det skett en spridning av genomiska, transkriptomiska och proteomiska resurser för elfisk1,22,23,24,25,26, 27,28. Användningen av dessa resurser har redan gett viktiga insikter om sambandet mellan genotyp och fenotyp hos dessa arter1,2,3,28,29 ,30. Ett stort hinder för att integrera genomik-data med fenotypiska data av svagt elektrisk fisk är en närvarande brist på funktionella genomiska verktyg31.

Ett sådant verktyg är den nyligen utvecklade klustrade regelbundet Interfördelade korta Palindromic repetitioner paras ihop med Cas9 Endonuklease (CRISPR/Cas9, CRISPR) teknik. CRISPR/Cas9 är ett genomredigeringsverktyg som har gått in i utbredd användning i både modell32,33,34 och icke-modellorganismer35,36,37 lika. CRISPR/Cas9-tekniken har utvecklats till en punkt där ett laboratorium som kan grundläggande molekylärbiologi enkelt ska kunna generera genspecifika sonder som kallas Short guide RNAs (sgRNAs), till en låg kostnad med en icke-kloningsmetod38. CRISPR har fördelar jämfört med andra knockout/knockdown strategier, såsom morpholinos39,40, transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens), och zink finger nukleaser (zfns), som är kostsamma och tidskrävande att generera för varje målgen.

CRISPR/Cas9-systemet fungerar för att skapa genknockouts genom att rikta in sig på en specifik region i arvsmassan, regisserad av sgRNA-sekvensen, och orsaka en dubbel-strandad rast. Den dubbelsträngade rasten upptäcks av cellen och utlöser endogena DNA-reparationsmekanismer företrädesvis med hjälp av den icke-homolog sammanfogning (NHEJ) vägen. Denna väg är mycket felbenägna: Under reparationsprocessen kommer DNA-molekylen ofta införliva infogningar eller borttagningar (indels) på den dubbelsträngade rastplatsen. Dessa indels kan resultera i en förlust av funktion på grund av antingen (1) förskjutningar i den öppna Läs ramen, (2) införande av en för tidig stopp kodon, eller (3) förskjutningar i den kritiska primära strukturen av genprodukten. I detta protokoll använder vi CRISPR/Cas9 redigering för att rikta punktmutationer i målgener med hjälp av NHEJ i svagt elektriska fiskarter. Även om det är enklare och effektivare än andra tekniker förväntas denna metod för mutagenes resultera i en rad fenotypiska svårighetsgrader i F0, som tillskrivs genetisk mosaik41,42,43 ,44.

Val av organismer
För att underlätta framtida studier av den jämförande genomik av svagt elektrisk fisk, måste en representativ art för både gymnotiforms och mormyrids för protokoll utveckling väljas. Efter diskussioner under 2016 Electric Fish möte i Montevideo, Uruguay, det var gemenskap konsensus att utnyttja arter som redan kunde föds upp i laboratoriet och som hade genomiska resurser tillgängliga. Den gymnotiform brachyhypopomus gauderio och mormyryd brienomyrus brachyistius valdes som arter som passar dessa kriterier. I båda arterna är naturliga ledtrådar för att framkalla och bibehålla avels förhållanden lätt att efterlikna i fångenskap. B. gauderio, en gymnotiform arter från Sydamerika, har fördelen av låga djurhållning krav: fisk kan hållas på relativt hög densitet i relativt små (4 L) tankar. B. gauderio har också en snabb generations omsättning under företags förhållanden. Under laboratorieförhållanden kan B. gauderio utvecklas från ägg till vuxen i ca 4 månader.

B. brachyistius, en art av mormyryd fisk från väst-Centralafrika, häckar lätt i fångenskap. B. brachyistius är lätt tillgänglig genom akvarium handel, har använts i många studier, och nu har ett antal genomiska resurser tillgängliga. Deras livscykel spänner över 1 − 3 år, beroende på laboratorieförhållanden. Djurhållnings kraven är något intensivare för denna art, vilket kräver måttligt stora tankar (50 − 100 L) på grund av deras aggression under avel.

Laboratorier som studerar andra arter av elektrisk fisk bör lätt kunna anpassa detta protokoll så länge som arten kan uppfödas, och encelliga embryon kan samlas in och fostras till vuxen ålder. Bostäder, larv uppfödning och provrörsbefruktning (IVF) priser kommer sannolikt att förändras med andra arter; Detta protokoll kan dock användas som utgångspunkt för avels försök i andra svagt elektriska fiskar.

Ett ideal gen mål för proof of Concept: scn4aa
Svagt elektrisk mormyryd och gymnotiform fisk generera elektriska fält (electrogenesis) genom att fullgöra ett specialiserat organ, som kallas elektriska organ. Elektriska organ utsläpp (EODs) resultat från samtidig produktion av åtgärder potentialer i de elektriska organ celler som kallas elektrocyter. EODs upptäcks av en rad Elektroreceptorer i huden för att skapa högupplösta elektriska bilder av fiskens omgivning45. Svagt elektrisk fisk är också kapabla att upptäcka funktioner i deras conspecifics EOD vågformer18 samt deras utsläpp av46, vilket gör att EODS att fungera dessutom som en social kommunikation signal analogt med fågelsång eller groda vocalizations47.

En huvudsaklig del av åtgärden potentiell generation i elektrocyter av både mormyryd och gymnotiform svagt elektrisk fisk är spännings-gated natrium kanal nav 1.42. Icke-elektriska fiskar uttrycka två paralogous genkopior, scn4aa och scn4ab, kodning för spännings-gated natrium Channel nav 1.430. I både gymnotiform och mormyryd svagt elektrisk fisk linjer, scn4aa har utvecklats snabbt och genomgått många aminosyran substitutioner som påverkar dess Kinetic egenskaper48. Viktigast av allt, scn4aa har blivit uppdelade i båda linjerna till den elektriska orgel2,3. Det relativt begränsade uttrycket av scn4aa till den elektriska orgeln, liksom dess nyckelroll i generering av EODS, gör det till ett idealiskt mål för CRISPR/Cas9 knockout experiment, eftersom det har minimal skadliga pleiotrop effekter. Eftersom svagt elektrisk fisk börjar urladdning deras larv elektriska organ 6 − 8 dagar efter befruktning (DPF), inriktning av scn4aa är idealiskt lämpad för snabb fenotypning efter embryo mikroinjektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Michigan State University.

1. Val av sgRNA-mål

Anmärkning: Ett protokoll ges för manuell utformning av sgRNAs i steg 1,1. Detta utnyttjades för scn4aa mål urval. Ett ytterligare protokoll ges för att underlätta denna process (steg 1,2) med hjälp av EFISHGENOMICS webbportal. Det rekommenderas att användare väljer protokoll 1,2, som innehåller flera automatiserade "kontroller" för att säkerställa framgång i utformningen av sgRNAs för anpassade mål.

  1. Design sgRNA mål.
    1. För att generera sgRNA guide oligos, är det bäst att rikta exon 1, eller andra 5 ' Exons. Den 5 ' UTR kan riktas; Det är dock bäst att inrikta sig på 5-kodningssekvens. Att använda genomisk information är att föredra, men det är möjligt att utveckla framgångsrika sgRNAs med hjälp av transkripome-data. Annoteringar av intron/exon gränser (genomiska data) eller exon/exon gränser är att föredra.
    2. Kandidat genomiska sekvenser från 1,1 söker efter förmodade målsekvenser som matchar mönstret 5 '-N (18)-NGG-3 '. Detta kan utföras automatiskt med hjälp av programvara för Desktop Sequence-analys, anpassade skript eller genom manuell inspektion av sekvenser.
    3. Sekvenser kan prioriteras med hjälp av metoden för Doench et al.49 för aktivitet på mål. Dessutom kan målsekvenser utvärderas av en BLAST-sökning mot Genomic/transcriptomic databaser för off-Target bindning.
    4. Se till att standard PCR-primers kan genereras som flanera målsekvensen. Primers bör vara minst 20 BP från vardera sidan av snittet plats (tre baser uppströms NGG sekvens). Helst bör PCR-produkten vara 150 − 200 baspar (BP).
    5. Design oligomerer uppfyller ovanstående kriterier med hjälp av nedanstående mall, som inkluderar en T7 promotor (5 ' av N18) och en kompletterande region (3 ' av n18) för glödgning till konstant Oligomer (1.1.6): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG-N18 -Gttttagagctagaaatagcaag-3 '
      Anmärkning: N18 -sekvensen inkluderar inte den NGG protospacer angränsande motiv (PAM) sekvens. Ta inte med detta i oligomeren.
    6. Beställ den konstanta oligomeren (tabell 1) som ska användas för att syntetisera alla sgrnas, oligomerer för sgRNA-mål (steg 1.1.5) och PCR-primers (steg 1.1.4) som standard avsaltade oligomerer från en oligonukleotidproduktionstjänst. Oligomerer och PCR-primers kan beställas som standard avsaltade oligomerer, ingen ytterligare rening är nödvändig.
  2. Utföra automatiserad design av sgRNA mål.
    1. Genom att använda genomisk data, Välj en målgen. Transkriptome data kan användas i stället när exon/intron gränser är kända. Mål kan identifieras med hjälp av EFISHGENOMICS portal (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu). Det ideala målet kommer att vara inom exon 1; men andra 5 "exoner och 5" UTR kan övervägas.
    2. När målsekvensen identifieras kan du läsa in det fritt tillgängliga EFISHGENOMICS CRISPR-webbverktyget (http://efishgenomics.integrativebiology.msu.edu/crispr_tool/). Detta webbverktyg använder en anpassad version av crispor algoritm för mål generation50,51.
    3. I rutan för steg 1anger du namnet på sekvensen och anger målets sekvens i lämplig ruta.
  3. Välj lämpligt arvsmassa som sekvensen härstammar från. För närvarande är genomisk data tillgänglig för b. brachyistius och b. gauderio. Genomsekvenser krävs inte för användning av detta verktyg, men är användbara för att bedöma potentiella oönskade off-Target effekter.
  4. Välj lämplig PAM. Den 20 BP-NGG PAM rekommenderas, men det finns flera ytterligare PAM motiv att välja mellan, beroende på Cas9 protein som används.
  5. En rapport kommer att genereras med placeringen av målsekvensen i genomet med föreslagna guidesekvenser. Välj tre mål med låg förväntad off-Target effekter, hög specificitet Poäng och hög effektivitet poäng. De högsta bedömnings guide sekvenserna markeras med grönt på vänster sida. Gula och röda markerade guidesekvenser bör undvikas, om möjligt.
  6. Genom att klicka på valda målsekvenser genererar en omfattande CRISPOR-rapport. Viktig information från dessa rapporter är för "T7 in vitro-uttryck från överlappande oligonukleotides". Från den här rapporten extraherar du följande information: rekommenderade sgRNA oligos, PCR-primers för målplatsen och en konstant Oligomer som kommer att användas för att syntetisera alla sgRNAs.
  7. Beställ de utvalda oligomererna (steg 1,6) från en oligonukleotidproduktionstjänst. Oligomerer och PCR-primers kan beställas som standard avsaltade oligomerer, ingen ytterligare rening är nödvändig.

2. generera sgRNA

  1. Anneal oligomerer i PCR-röret: Tillsätt 1 μL 100 μM konstant Oligomer, 1 μL 100 μM sgRNA-specifik Oligomer och 8 μL nukleasfri H2O
  2. Anneal oligomerer i en termocyklern med följande program: Värm vid 95 ° c i 5 min, kyla till 85 ° c vid-2 ° c/s, kyla till 25 ° c vid 0,1 ° c/s, och håll vid 4 ° c.
  3. För att generera sgRNA-mall, tillsätt 2,5 μL dNTP-mix (10 mM), 2 μL 10X-buffert, 0,5 μL T4-DNA-polymeras och 5 μL nukleasfria H2O till glödgad oligomerer från steg 2,2. Inkubera i 20 minuter vid 12 ° c.
  4. Rena mallen med hjälp av en PCR-upprenningskolumn enligt tillverkarens instruktioner.
  5. Elute i 20 – 30 μL. Använd en spektrofotometer för att uppskatta koncentration och renhet. Mallen ska vara 100 – 200 ng/μL och 1,8 – 1,9 A260/280.
  6. Verifiera via en agaros gel genom att köra 1 – 5 μL. Det dominerande bandet bör vara 120 BP. Se figur 1a för representativa resultat.
  7. Lagra gel-verifierad sgRNA-mall vid-20 ° c (lång sikt) eller 4 ° c (kort sikt, 1 – 4 veckor).
  8. Transkribera sgRNA med T7 RNA transkription kit genom att lägga till en 1,5 mL microcentrifug tub vid rumstemperatur 8 μL dNTP-blandning (lika volymer av dA, dT, dG, dC), 2 μL 10X buffert (rumstemperatur), 2 μL T7 RNA-polymeras, 100 − 200 ng av sgRNA-mall , och nukleasfria H2O till en total volym på 20 μl. Snurra för att samla på botten. Inkubera i 2 – 4 timmar vid 37 ° c.
  9. Tillsätt 1 μL DNase och inkubera ytterligare 15 min vid 37 ° c.
    1. Rengör sgRNA genom att tillsätta 1 μL glykogen, 30 μL nukleasfri H2O, 30 μl 5 M ammoniumacetat och 180 μl 100% EtOH till transkriberade sgrna. Blanda väl och inkubera minst 20 min vid-80 ° c (till fryst) eller vid-20 ° c över natten. Centrifugera vid 4 ° c i 15 minuter med maximal hastighet.
  10. Ta bort och Kassera supernatanten utan att störa pelleten, och tvätta med 1 mL RNase-fri 70% EtOH kyld vid-20 ° c. Snurra ytterligare 5 min med max hastighet vid 4 ° c.
  11. Ta bort och Kassera supernatanten utan att störa pelleten, och lufttorka pelleten i 5 min.
  12. Omsuspendera i 30 μL nukleasfri H2O och bestäm renhet och avkastning med hjälp av UV-spektroskopi (minimiavkastning på 200 ng/μl).
  13. Kontrollera närvaron av sgRNA på en RNase-fri gel. SgRNA visas mellan 50 och 150 BP som två band på grund av den sekundära strukturen (figur 1b).
  14. Till 3 μL och förvara vid-80 ° c.

3. validera skär effektivitet in vitro

  1. Extrahera genomiskt DNA från målarterna med hjälp av en kommersiell DNA-extraktion kit. Ventral fin Urklipp kan användas utan att offra fisken, eftersom vävnaderna är regenererad.
  2. Förstärka mål-DNA-regionen med hjälp av de primers som utformats enligt beskrivningen i steg 1,6 och 1,7 med standard-PCR. Kontrollera produkten genom gel elektrofores. Sekvensering av fragmentet för att säkerställa att rätt region förstärks föreslås, men inte nödvändigt. Representativa resultat för scn4aa mallen visas i figur 2.
  3. Städa upp PCR-fragmentet med ett etablerat laboratorium eller företags protokoll.
  4. Förvara det amplifierade DNA vid-20 ° c. Överväg att separera den i alikvoter för att minska frys-Taw cykler.
  5. Bestäm de begärda beloppen och volymerna för varje komponent. Överväg att köra negativa kontroller (exklusive antingen sgRNA eller Cas9) och en positiv kontroll (en tidigare testad sgRNA som klyver sitt mål PCR-amplifierade DNA) om tillgängligt, samt en koncentrations serie av sgRNA.
  6. Ställ in reaktionsblandningen nedan i angiven ordning i ett PCR-rör vid rumstemperatur, och Lägg till sgRNA-och Cas9-proteinet sist för bästa resultat: 50 – 100 ng av Target DNA PCR-produkt, 1 μL 10X buffert 3, 1 μL 10X BSA (0,1 g/mL) , 50 – 200 ng av Cas9 protein (1 mg/mL, 150 ng föreslog), och 30 – 200 av ng sgRNA (100 ng föreslog).
    1. Inkubera reaktionen vid 37 ° c i 1 h och sedan vid 65 ° c i 10 min för att inaktivera Cas9 protein.
    2. Kör hela provet på en 2%-3% aguppstod gel (förväntade bandstorlekar mellan 30-200 BP) tillsammans med positiva och negativa kontroller. En lyckad klyvning kan visa en del av PCR-produkten men kommer även att ha två mindre band. Representativa resultat visas i figur 2.

4. erhållande av embryon

Anmärkning: Att få embryon av svagt elektrisk fisk kan vara utmanande. Noggrann övervakning av vattenkvaliteten, lämplig tid för fisk vård och regelbunden utfodring är nyckeln till ett framgångsrikt avelsprogram. Fisk måste först konditioneras i flera veckor för reproduktion52 som beskrivs i protokoll steg 4,1. Efter detta, ett protokoll som förstärker naturlig gametogenes (4,2) för användning i naturliga lekbeteende (4,3), en alternativ nyligen utvecklad in vitro-teknik för att få exakt tidsinställda embryon (4,4) presenteras. Protokoll 4,3 är lika effektivt för b. brachyistius och b. gauderio, och protokoll 4,4 är överlägsen i B. gauderio.

  1. Konditionering
    1. Håll B. brachyistius i par/små grupper (100 – 150 L tankar) eller i mycket stora tankar (2 hanar och 5 – 6 honor i cirka 475 L tank), eftersom de blir mycket aggressiva under häcknings förhållanden. Det bör finnas minst 1 – 2 PVC-rör per fisk som ska användas som skydd (figur 3a,B).
    2. B. gauderio kan uppfödda i mycket högre densitet. Håll upp till åtta personer i en 100 L-tank (2 hanar och 6 honor). Det bör finnas minst 1 PVC-rör per fisk som ska användas som skydd. Lägga trassliga garn ökar berikning och gömställen. Tillsätt 50 mL centrifugrör med 1 cm diameter hål borrade i dem till toppen av tanken så att vuxna kan leka naturligt i rören (figur 3c).
    3. Under häckningssäsongen, matar fisk dagligen färska blackworms kompletteras med frysta blodmaskar. Maten kan berikas med vitaminer och kosttillskott, om så önskas.
    4. Hus fisk normalt i en relativt hög ledningsförmåga (300-600 μS), pH-balanserad lösning. Under häckningssäsongen, gradvis sänka ledningsförmågan med minst hälften under loppet av 1-3 veckor för att inducera gonad utbrott och lek. Lägre ledningsförmåga genom dagliga tillägg av omvänd osmos (RO) vatten, hålla noggrann uppmärksamhet på pH när ledningsförmågan är låg (pH < 6).
    5. Avels förhållanden kan hållas i cirka 3 − 5 månader med äggproduktion avsmalnande över tiden. Efter denna tid, tillbaka fisken till hög ledningsförmåga långsamt under 1 – 3 veckor. Behåll ytterligare 3 månader vid hög ledningsförmåga innan de utsätts för häcknings förhållanden igen.
  2. Använd lekande medel (SGnRHa + domperidon) injektioner.
    1. Identifiera kvinnlig fisk i avels förhållanden som verkar dräktig (figur 4). I B. gauderio den kvinnliga kommer att ha svullna gonader bara caudal till ventilen. B. brachyistius honor kommer att ha svullna magar och verkar djupt arbetsföra (figur 4a). Hanar har i allmänhet inte en fråga som producerar spermier. Emellertid, större hanar är att föredra på grund av den större spermier volym samlas in.
      Anmärkning: Lekande agent är en kommersiell hormon blandning som underlättar mognad av könsceller och koordinater lek. Om fisken har injicerats med lekande medel i det förflutna, möjliggöra > 4 veckors vila och riklig utfodring mellan injektioner. Vi föreslår att injicera minst 2 hanar och 4 – 5 Honor för att säkerställa några klor av ägg och massor av spermier.
    2. Anesthetize fisk i MS-222 (0,4 g/3 L) för ett par minuter, tills fisken inte kan hålla sin hållning, är orörlig, men fortsätter att ha operulär rörelse (etapp II53).
    3. Väg fisken (g) för beräkning av lek agens mängd, (0,5 μL/g) + 0,5 μL. De extra 0,5 μL står för pipettering av fel.
    4. Tillsätt lek medlet till 4x volymer buffert (1x PBS eller DPBS) i ett PCR-rör och blanda väl. Lösningen blir grumlig. Den hjälper till att fördela lek medlet på termoplastiskt och sedan använda en pipett för att mäta den beräknade dosen. Lek medlet är trögflytande, så se till att fördela hela dosen och var försiktig med pipettering.
    5. Pipettera injektionslösningen på termoplast och dra in en precisions glasspruta, Undvik luftbubblor. Vi rekommenderar en 28 G, 19 – 25 mm lång, avfasad nål.
    6. Injicera lösningen i den dorsala stammen muskeln i en jämn takt. Låt nålen sitta i 2 – 4 s och sedan ta bort. Omedelbart sätta fisk i färskt system vatten för återhämtning.
    7. Efter cirka 24 timmar Förbered för insamling av embryon (se 4,3 eller 4,4). Samla alla nödvändiga material, inklusive vad som behövs för encellig mikroinjektion (se avsnitt 5).
  3. Få embryon genom naturlig lek.
    1. Hus lekande agent-injiceras vuxna (4,2) i en stor 450 L tankar. De mest effektiva köns kvoterna har typiskt varit 1 – 2 hanar och 3 – 4 honor med adekvata gömställen gjorda av PVC-rör, och mörkt marmor substrat på tankens botten för att förhindra ägg konsumtion. Kulor är oftast viktigare för b. brachyistius än b. gauderio, som föredrar att deponera sina klibbiga ägg i skrevor eller 50 ml Centrifugera rör som beskrivs ovan.
    2. Placera fisken i en omvänd ljus cykel för att matcha nattliga lek till ordinarie labb arbetstid. Med hjälp av en off-the-shelf konsument kvalitet säkerhetssystem, övervaka fisk med infraröd belysning för att minimera störningar från en fjärransluten dator (figur 3).
    3. Fisken kommer spontant leka under den mörka fotoperioden cirka 24 h efter att lek agenten injektion.
    4. När leken börjar, samla ägg varje timme medan lek beteendet inträffar. I B. brachyistius, samla ägg med hjälp av en liten diameter sifon över ett fint nät bomulls nät för att minimera skador på de nyligen lekte ägg. Samla B. gauderio ägg från 50 ml Centrifugera rör eller tank substrat. Arbeta effektivt med minimala störningar i lek fisken genom att använda en strålkastare med låg intensitet rött ljus. Som första klyvning inträffar cirka 1 h post fertilisering (HPF), en stor del av äggen kommer att vara lämplig för Single cell mikroinjektion.
    5. Fortsätt omedelbart till mikroinjektion (se avsnitt 5).
  4. Pressa hanar för in vitro-fertilisering av B. gauderio.
    1. Förbered spermier Extender lösning (SES) som beskrivs i Zebrafish bok54: 10 mm hepes, 80 mm kcl, 45 mm nacl, 45 mm natriumacetat, 0,4 mm CaCl2, och 0,2 mm mgcl2.
      1. Använd ddH2O för att tillföra volym och justera pH till 7,7 med 1 M NaOH.
      2. Förvara i kylskåp.
      3. Filtrera genom ett 0,22 μm filter före användning.
    2. Anesthetize fisk i MS-222 (0,4 g/3 L) för ett par minuter, tills fisken inte kan hålla sin hållning, är orörlig, men fortsätter att ha operulär rörelse (etapp II53). Placera 500 μL alikvoter av SES i is.
    3. Torra händer och fiskar grundligt, särskilt runt huvudet och ventilera. Placera ventrala sida upp, främre till vänster (för högerhänta individer) i en polystyren skum/svamp innehavaren täckt i en MS-222 blötläggas, fuktig pappershandduk. Huvudet bör vara lika parallellt med bordet som möjligt.
      Anmärkning: Steg 4.4.4 – 4.4.6 ska göras så snabbt som möjligt och fisken får endast vara ur vatten i 30 – 60 s.
    4. Applicera tryck i caudal till rostralt riktning med ljus klämma medialt över gonaderna mot ventilen. Fisken kan utvisa avfall. Var noga med att rengöra ventilen med en delikat uppgift torka om något avfall utvisas. Samla inte upp avfall med spermier. Beroende på hanens storlek är 10-60 μL vanligt.
    5. Med hjälp av en micropipetter med ett tips, noggrant samla spermier som det pressas från hanen i 50 μL steg. Placera spermier direkt i 500 μL alikvoter av SES på is. Det kan vara bra att ha en annan forskare hjälpa till att samla spermier medan den andra pressar. Sperma bör användas så snart som möjligt, men är fortfarande lönsamt i minst 1 h.
    6. Omedelbart efter insamling, sätta fisk i färskt system vatten för återhämtning. Fisken ska endast vara ur vatten i 30 – 60 s.
  5. Pressa Honor för in vitro fertilisering av B. gauderio.
    1. Anesthetize fisk i MS-222 (0,4 g/3 L) för ett par minuter, tills fisken inte kan hålla sin hållning, är orörlig, men fortsätter att ha operulär rörelse (etapp II53). Placera polytetrafluoroethene blad på arbetsstationen.
      Anmärkning: Avsnitten 4.5.1 – 4.5.5 bör göras så snabbt som möjligt och fisken får endast vara ur vatten i 30 – 60 s.
    2. Torra händer, verktyg, polytetrafluoroethene blad, och fisk grundligt, särskilt runt huvudet och Vent. Placera på sidan med huvudet vänd främre (för högerhänta individer).
    3. Applicera tryck i caudal till rostralt riktning med ljus klämma medialt över gonaderna mot ventilen. Fisken kan utvisa avfall. Var noga med att rengöra ventilen med en delikat uppgift torka om något avfall utvisas. Beroende på fiskens storlek är 20 – 150 ägg vanliga. Med hjälp av en polytetrafluoroethene belagda spatel/verktyg noggrant samla ägg som de pressas från cloaca. Snabbt flytta ägg till en liten petriskål och täck. Se till att äggen förblir torra under denna process. Alternativt, efter att klämma, röra äggmassan till basen av en liten petriskål eller till polytetrafluoroethene arket som de utvisas från honan.
    4. Omedelbart efter insamling, sätta fisken i färskt system vatten för återhämtning.
  6. Utför ägg befruktning för in vitro fertilisering av B. gauderio.
    1. Tillsätt 100 μL av väl blandade spermier i SES (se steg 4,4) direkt över äggmassan.
    2. Tillsätt 1 mL system vatten (filtrerat genom ett 0,22 μm filter) och blanda väl i 30 – 60 s.
    3. Tillsätt ett extra 1 – 2 mL system vatten (lämna lite utrymme i petriskål) och placera i inkubator. Rekordtid för IVF på petriskål och flytta till en 29 ° c inkubator. Ställ in en 50 min timer för att kontrollera utvecklingen av utveckling (t. ex. bildandet av en enda cell vid djur stolpen, se figur 6). Under denna tid, förbereda material för mikroinjektion.

5. mikroinjektion med en cell

  1. Dra mikroinjektionsnålar före lekande medel injektioner (steg 4,2) eller naturlig lek (steg 4,3). Använd en kapillär av borosilikatglas med en glöd tråds (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,58 mm, 10 cm längd) och en nåldragare för att dra mikroinjektionsnålar. Förbered 2 – 4 nålar per planerad behandlings injektion.
    Anmärkning: Backloading nålar med en glödtråden är att föredra, eftersom glödtråden vekar lösningen mot spetsen och eliminerar bubblor. Injektionsnålar utan glödtråd kan dock användas och hands tilldelning får inte påverka utfallet. Nålen bör ha en lång, men robust Kona. Använd nåldragnings programmet med följande specifikationer som utgångspunkt: värme = 500; Dra = 70; Hastighet = 70; och tid = 100. Representativa nålmorfologier visas i figur 5a.
  2. Förbered injektionslösningen och Förbered nålen.
    1. Tillsätt 0,9 μL sgRNA och 0,9 μL Cas9-enzym (1 mg/mL) till 0,2 μL av 10% eller 100% fenolrött (för 1% respektive 10% slutlig fenolröd koncentration) i ett PCR-rör. Blanda väl och låt sitta på is 2 − 5 min för att ge sgRNA och Cas9 till komplexa. Beräkna den slutliga koncentrationen av sgRNA, Cas9 och fenolrött i injektionslösningen.
      Anmärkning: Om det finns problem med nål igensättning eller skära effektivitet med hjälp av ovanstående recept, kan det vara bra att använda en 1x slutlig koncentration salt/buffert mix för att stabilisera Cas9 och förhindra nål igensättning.
    2. Använd en pipettspets i microloader för att backa in 2 μL lösning i mikroinjektionsnålen. Utvisa vätskan så nära spetsen som möjligt.
    3. Ladda nålen till micromanipulator och Ställ in tryck inställningar (börja med 775 pi, 0,1 − 0,2 s och 8-12 pc).
    4. Under omfattningen, Använd ett par fina pintippar att bryta nålen spetsen på en avfasade vinkel. Bryt mot där avsmalningen av nålen börjar ha styvhet. Det är bäst att bryta närmare spetsen, testa storleken på injektionslösningen och sedan bryta ytterligare om det behövs. Nålhylsan bör förbli så liten som möjligt samtidigt som en styv Kona bibehålls (figur 5a).
    5. Använd mineralolja och en mikrometer för att mäta storleken på injektionslösningen. 1 – 2 nL används vanligtvis; 0,1 mm diameter är 0,5 nL.
    6. Justera nålspetsen eller Tryckinställningarna för att få en injektionsvolym inom specifikationerna.
  3. Identifiera utveckla zygoter och förbereda injektion skede. Ställ in injektions stadiet. Ta en 100 mm i diameter petriskål. Vänd ner och placera under den inverterade toppen. Placera ett glas Mikroskop bild i den inverterade toppen. Beroende på hur din micromanipulator är monterad på räckvidden, kan den extra höjden från den inverterade basen vara onödig.
    1. Titta på utveckla ägg och identifiera förmodade befruktade zygoter 50 – 60 min efter IVF. Den djurpol kommer att börja bildas och det kommer att finnas ett överskott av små fett droppar runt äggula/djur cell Interface (figur 6).
    2. Samla 10 – 20 ägg med så lite vatten som möjligt med hjälp av en plastöverföringspipett (skär spetsen något för att tillåta ägg att passera) och placera på kanten av bilden. Vatten kommer att vara ond under bilden och dra ägg mot kanten.
    3. Använd en delikat uppgift torka och tryck försiktigt på bilden för att ta bort överflödigt vatten och låta äggen att stadigt följa kanten av bilden. Det bör finnas precis tillräckligt med vatten för att hålla äggen fuktiga och samtidigt bibehålla lite stående fukt för att undvika ägg rörelse under injektion.
  4. Injicera direkt i en enda cell.
    1. Rikta äggen mot bilden vertikalt, vinkelrätt mot den annalkande nålen (Figur 5b).
    2. Med hjälp av micromanipulatorn placerar du nålen mot chorion. Vid ungefär en 45 ° vinkel, sätt in nålen i chorion, och sedan i den enda cellen. Det kan vara bra att komma in i en enda cell genom äggulan. Att flytta både injektions stadiet med den fria handen och micromanipulatorn kan ge mer kontroll över injektionsprocessen (Figur 5b).
    3. Injicera sgRNA/Cas9/Phenol Red Solution i den enda cellen. Ta försiktigt bort injektionsnålen. Fortsätt till nästa egg och upprepa steg 5.4.1 – 5.4.3 tills alla ägg har injicerats.
    4. Avlägsna eventuella ägg som bryts under injektionen med fina pinknålar. Använd 0,22 μm filtrerat system vatten i en spruta flaska för att försiktigt ta bort ägg från injektions stadiet till en ny 100 mm diameter petriskål.
    5. Upprepa steg 5.3.3 – 5.4.6 tills alla ägg har injicerats eller utvecklats till tvåcellsledet. Se till att avsätta cirka 20 förmodade befruktade ägg som en no-injektion kontroll för att bestämma fertilisering priser och injektion framgång. För större kopplingar använda oinjicerade embryon som har utvecklats till två celler skede, och för mindre kopplingar avsätta förmodade befruktade ägg.
    6. Överväg dessutom en sgrna/injektion kontroll genom att injicera 15 – 25 embryon med Cas9 komplex med en sgrna mot en gen som inte finns i genomet. Den GFP-gen som rekommenderas för vildtyp embryon. Registrera antalet ägg, föräldrar, IVF tid och datum på varje petriskål. Inkludera sgRNA Target eller Label som uninjected. Gå till en inkubator på 29 ° c.

6. djurhållning

  1. Ta hand om äggen.
    1. Kontrollera ägg viabilitet 4 – 6 h följande injektioner.
    2. Registrera antalet döda ägg, liksom alla som är obefruktad. De obefruktade äggen kommer att arrestera runt åtta-cells scenen och har en rosett mönster av cellerna vid djur stolpen (figur 6). Beroende på antalet döda ägg och mängden ägg skräp i vattnet, ta bort minst 50% – 80% av vattnet och Ersätt med filtrerat system vatten. Det kan vara bra att skrubba botten av petriskål om en cellulär skräp film eller biofilm former.
    3. För nästa 2 – 3 dagar, kontrollera ägg 1 – 2x dagligen. Upprepa steg 6.1.2 – 6.1.3 varje gång äggen kontrolleras.
    4. Efter 2 − 3 dagar kläcks larverna. Ta bort alla ägg höljen som de kläcks. Skonsam pipettering kan hjälpa till att frigöra halvkläckta larver.
  2. Vård av larver.
    1. Kontrollera ägg 1 − 2x dagligen. Upprepa steg 6.1.2 – 6.1.3 varje gång larverna kontrolleras.
    2. Från 6 – 14 DPF, foder vinäger ål till larverna. Ett litet överskott av mat är bra, eftersom vinäger ål kommer att förbli levande i skålen. Lägg vinäger ål varje gång skålen kontrolleras och rengöras.
    3. Från 11 – 14 DPF, tillsätt 5 – 10 nykläckta Artemia per larver i tillägg till ättika. Under denna tid kommer larverna att lära sig att äta gratis simning Artemia.
    4. Vid 15 DPF, flytta larver till äggkoppar (se avsnitt 6.2.5) i en tank med rinnande vatten, filtrering och luftning. Det bör inte finnas mer än cirka 25 embryon per kopp. Äggkoppar är plastkoppar med en mesh nät på botten. En 100 mm petriskål topp/botten kan läggas till botten av ägget koppen att hjälpa till att stoppa maten från att falla genom nätet. Äggkoppar tillåta fisken att inhysas i en större volym av vatten av vattenkvalitet skäl, samtidigt som diskreta grupper. Fortsätt att lägga till både vinäger ål och 15 − 30 nykläckta Artemia per larver från dag 15 – 18. Rengör petriskål dagligen och Använd en pipett för att ta bort massor av döda Artemia.
    5. Från dag 18 – 30, foder endast nykläckt Artemia. Öka utfodringen mängden som fisken växer och om svansbitning ses.
    6. Efter cirka 30 dagar, flytta fisk till 10 L (2,5 gallon) tankar, cirka 25 individer per tank. Se till att det finns filtrering, luftning, och platser för att gömma. Överväg cylindriska bio filtrerings medier och PVC-rör med liten diameter.
    7. Mata nykläckt Artemia och blackworms från cirka 30 – 45 dagar framåt. Underhåll standard rengöring och vatten förändringar för tanken (dvs. minst ~ 10%-20% vatten förändring per 1 vecka).
    8. Efter ~ 45 DPF, feed endast blackworms tills ~ 60 DPF.
    9. Efter ~ 60 DPF, flytta kohorter på cirka 15 fisk till 40 L (10 gallon) tankar och börja vuxen skötsel förfaranden. Tillsätt PVC-rör och ett garn "mopp" (en massa brunt garn bundet tillsammans runt en kork) för gömställen (figur 3c). Fisken bör närma sig avel storleksanpassar (10 − 12 cm) efter ungefärligt 3 − 4 månader posta befruktning.

7. vuxen uppfödning

  1. Mata fisk dagligen med tillräckligt med blackworms så att en liten mängd av blackworms är närvarande vid nästa utfodring. Denna AD libitum utfodring ger maximal tillväxt.
  2. Några gånger i veckan, det kan vara bra att komplettera blackworm utfodring med bloodworms.
  3. Rengör tankarna varje 2 – 4 veckor med en 20% – 30% vatten förändring. Om garn moppen blir full av bio film/alger, gnugga den ren under RO vatten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SgRNA målplatser identifierades inom exon 1 av scn4aa i både b. gauderio och b. brachyistius som beskrivs i avsnitt 1. SgRNAs genererades enligt beskrivningen i avsnitt 2. Efter lyckad sgRNA-markering och-syntes (figur 1) testades in vitro-klyvning (figur 2). SgRNAs som demonstrerar in vitro-skärning valdes sedan ut för encellig mikroinjektioner.

Vuxna fiskar var konditionerade för reproduktion (avsnitt 4,1), injiceras sedan med en lekande medel (avsnitt 4,2) och därefter pressas (b. gauderio) för IVF som beskrivs i avsnitt 4,4 eller tillåtet att leka naturligt (b. brachyistius) som beskrivs i avsnitt 4,3. Dessa insatser gav Single cell embryon för mikroinjektion i båda arterna. Som beskrivs i avsnitt 5, 1.5 − 2.0 nl i scn4aa sgrna/Cas9/fenol Red Complex (65-190 ng/UL sgrna, 450 ng/UL Cas9, 1% − 10% fenolröd, slutliga koncentrationer) injicerades i encells stadiet. Ägg från samma koppling användes som icke injicerade kontroller. Alla embryon vårdas enligt beskrivningen i avsnitt 6. Efter IVF, 40%-90% av äggen gödslades, och 70%-90% av embryon överlevde till kläckning efter injektion.

Omkring 75% av fisken överlevde till 6 − 11 DPF och var sedan fenotypad. Larv fisk placerades i en 35 mm petriskål inbäddad i en större skål med Sylgard immobiliserade AG/cl inspelnings elektroder (figur 7a). Embryorörelsen begränsades med 3% aguppkom formar med system vatten och skär för att passa embryot (figur 7b). Samma inspelnings kammare användes för båda arterna och samma aguppstod mögel användes bland Art jämförelser. Embryon registrerades för 60 s, vilket är tillräckligt för att fånga hundratals EODs. Ålders-och storleks matchade oinjicerade kontroller valdes ut för jämförelse. Vid denna tidpunkt, 10% – 30% av överlevande embryon visar en reducerad amplitud EOD. Embryon som uppvisar en reduktion av EOD-amplitud utan uppenbara morfologiska defekter och kontroll av oinjicerade hela embryon har smält för DNA-extraktion och efterföljande PCR för scn4aa -målplatsen. Det fanns ofta en rad penetrans av fenotyp, med vissa individer som har en starkare minskning av EOD amplitud än andra.

Efter PCR-sanering och kloning valdes 30 + kloner från varje embryo till Sanger-sekvensering. CRISPR/Cas9 inducerad mutationer identifierades i B. gauderio (figur 8a,b) och b. brachyistius (figur 9a,b) individer med stark EOD amplitud minskning (figur 8c och figur 9c ), där icke injicerade kontroller endast hade referens genotyper. Visualisering av EOD-amplitud mellan bekräftade mutanter ("CRISPR") och ålder/storlek matchade icke injicerade kontroller visade att både scn4aa Mutant B. brachyistius (figur 10a) och b. gauderio (figur 10b ) embryona hade betydligt lägre eodamplitud än kontroller (p < 2,2 x 10-16, Welch två-prov t-test). CRISPR/Cas9 inriktning av scn4aa var framgångsrik i både b. brachyistius och b. gauderio och impla scn4aa i larv/tidig elektrocytutsläpp i båda arterna.

Figure 1
Figur 1: sgRNA-mall syntes och transkription. (A) gel bild av sgRNA mall syntes. Etiketterna motsvarar olika sgRNAs för MyoD (MYO2, MYO1) och tre sgrnas för scn4aa (S1 − S3). Efter glödgning av oligomererna, en ~ 120 BP mall produceras. B) gel bild av sgRNA-transkription för tre sgRNAs för b. gauderio (bg2017) och två för b. brachyistius (bb2016, 2017). Den sgRNA kommer att visas som två band på grund av sekundär struktur och kommer att vara mellan 50 − 150 BP när du använder en dsDNA stege. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativ gel bild av framgångsrika (SG1) och misslyckade (SG2) in vitro-CRISPR-analyser. En motsvarande mängd mall utan CRISPR-komponenter visas i scn4aa Lane. Notera de dubbla banden i SG1 som visar att styckning har inträffat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: avel tank inställningar för svagt elektrisk fisk. (A) Schematisk av den typiska installationen för trådlös videoövervakning av lekbeteende. Tre kommersiellt tillgängliga CCTV-kameror (Swann, Inc.) som kan producera infrarött ljus riktar sig till toppen av vattnet och ansluten till en digital videobandspelare (DVR). Video övervakas i realtid för lekbeteende i ett angränsande rum från en nätverksansluten dator (PC). B) lekbeteende som fångats med en sådan inställning i B. brachyistius. Cen typisk avels inställning för B. gauderio med PVC-bestycknings rör och garn moppar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: uppfödning av hanar och honor. A) b. brachyistius och b . gauderio. Båda arterna är sexuellt dimorfiska och lätt att urskilja visuellt när de är sexuellt mogna. Båda honor är dräktiga i dessa bilder, uppvisar karakteristiskt svullna magar som är fulla av mogna ägg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: mikroinjektion. A) glas kapillärnålspetsar måste brytas för att ge en lämplig mikroinjektionsvolym. Spetsen till vänster är obruten. Mitten och höger tips är trasiga med en lätt vinklad avfasning att tränga igenom ägget chorion. (B) äggen är fodrade mot en glas rutschbana (1% – 10% fenolrött ingår som en spårämne för att visualisera leveransen av injektionen) och injiceras med glas kapillärnålar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: utvecklingsstadier. A) b. gauderio och (b) b. brachyistius. Alla ägg antas vara befruktade och utvecklingen övervakas till 24 HPF. Mellan 12 − 24 HPF-embryon syns i livskraftiga ägg, annars uppvisar äggen nedbrytning. Flera divisioner verkar äga rum på ägg aktivering, oavsett befruktning. Obefruktad ägg uppvisar ovanliga mönster av klyvning som är mycket mer symmetriska i befruktade ägg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: fotografi av larv inspelnings kammare som används i denna studie. (A) elektroderna är inbäddade i sylguard men sträcker sig in i 35mm skålen som innehåller ett embryo begränsas via en 3% aguppkommit mögel. (B) högre förstorings bild som belyser den begränsade rörligheten för embryot på grund av Agros. Notera de bitar av Agreste som kan tas bort som embryot ändrar storlek. B. gauderio embryo står inför den positiva elektroden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: CRISPR/Cas9 inducerade mutationer i B. gauderio. (A) 32 klonsekvenser från genomiskt DNA av Cas9-inducerade mutationer i en enda scn4aa riktad F0B. gauderio embryo (11 DPF). Referenssekvens är understruken med sgRNA Target plats markerad i grått, protospacer-angränsande motiv (PAM) sekvens markerade i rött, och Cas9 cut plats märkt med "|". Förändringen från den förväntade Wild-typsekvensen ges och antalet kloner för varje sekvens anges inom parentes. (Förkortningar: + = insättning,-= radering, ± = indel) Alla icke-CRISPR tillhörande sekvens olikheterna är fetade. Figur modellerad efter Jao et al.60. B) aminosyresekvensen förutspådde från sekvenserade kloner av Scn4aa knockdown B. gauderio från (a). Cas9-inducerad förändringar från Wild typ sekvensen är markerade i rött och nukleotid-inducerad ändra nummer ges. C) tjugosekunders elektriska inspelningar från fem storleks matchade larver, alla inspelade 6 DPF i samma inspelnings kammare. Förstärknings inställningarna är identiska för alla spår. Spår i rött är från b. gauderio larver med bekräftade mutationer (en individ som visas i figur 8a, B ovan), spår i svart är från uninjected b. gauderio larver. Sammantaget visade CRISPR/Cas9 redigering av scn4aa en minskning av EOD amplitud, även om effekten var heterogena. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: CRISPR/Cas9 inducerade mutationer i B. brachyistius. (A) 42 klonsekvenser från genomisk DNA av Cas9-inducerad mutationer i en enda scn4aa riktade F0B. brachyistius embryo (11 DPF). Referenssekvens är understruken med sgRNA Target plats markerad i grått, protospacer-angränsande motiv (PAM) sekvens markerade i rött, och Cas9 cut plats märkt med "|". Förändringen från den förväntade Wild-typsekvensen ges och antalet kloner för varje sekvens anges inom parentes. (Förkortningar: + = insättning,-= radering, ± = indel) Alla icke-CRISPR tillhörande sekvens olikheterna är fetade. Figur modellerad efter Jao et al.60. B) aminosyresekvensen förutspådde från sekvenserade kloner från Scn4aa knockdown B. brachyistius i a. Cas9-inducerad förändringar från Wild typ sekvensen är markerade i rött och nukleotid inducerad förändring nummer ges. Ctio andra elektriska inspelningar från fyra storleks matchade larver, alla inspelade 10 DPF i samma inspelnings kammare. Förstärknings inställningarna är identiska för alla spår. Spår i rött är från b. brachyistius larver med bekräftade mutationer (en individ som visas i A, B ovan), spår i svart är från uninjected b. brachyistius larver. Sammantaget visade CRISPR/Cas9 redigering av scn4aa en minskning av EOD amplitud, även om effekten var heterogena. Inverterade Eoder är från fisken som ändrar orientering under inspelningen. Ingen skillnad är märkbar mellan experimentell fisk och kontroller trots detta. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: Box diagram av genomsnittlig EOD amplitud av CRISPR och uninjected storlek/ålder matchade syskon. (A) EOD amplitud av B. brachyistius LARVER vid 10 DPF. Inspelad med en vinst på 100, CRISPR n = 56 EODs från två individer, uninjected n = 114 EODs från tre individer. B) EOD-amplitud för B. gauderio -LARVER vid 6 DPF. Inspelad med en vinst på 500, CRISPR n = 34 EODs från två individer, uninjected n = 148 EODs från tre individer. Amplituden av CRISPR-fisk var signifikant mindre än icke injicerade kontroller (p < 2,2 x 10-16, Welch två-prov t-test). Alla individer spelades in med inspelnings kammaren som beskrivs i figur 7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Beskrivning Sekvens
Konstant Oligomer 5 '-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGC TATTTCTAGCTCTAAAAC-3 '
Målet Oligomer ryggraden (GG-N18, ingen PAM) 5 '-TAATACGACTCACTATAGG-N18-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Mål oligomerryggraden (N20, ingen PAM) 5 '-TAATACGACTCACTATAG-N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Mer från brienomyrus brachyistius
scn4aa BB sgRNA Target (N18, med PAM): 5 '-TCTTCCGCCCCTTCACCACGG-3 '
Scn4aa BB sgRNA Oligomer (GG-N18): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG TCTTCCGCCCCTTCACCA GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
scn4aa BB PCR primer (218 BP)
Scn4aa_bb_exon1_F: 5 '-ATGGCCGGCCTTCTCAATAA-3 '
Scn4aa_bb_exon1_R: 5 '-TCTTCCAGGGGAATATTCATAAACT-3 '
Mer från brachyhypopomus gauderio
Scn4aa BG sgRNA Target (N17, med PAM): 5 '-CAAGAAGGATGTAGTGGAGG-3 '
Scn4aa BG sgRNA Oligomer (GG-N17): 5 '-TAATACGACTCACTATAGG CAAGAAGGATGTAGTGG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3 '
Scn4aa BG PCR primer par (204 BP)
scn4aa_bg_exon1_F: 5 '-CGCCTTGTCCCTCCTTCAG-3 '
scn4aa_bg_exon1_R: 5 '-ATCTTCAGGTGGCTCTCCAT-3 '

Tabell 1: oligonukleotider som är nödvändiga för protokollet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den fenotypiska rikedomen av svagt elektrisk fisk, tillsammans med en ny spridning av genomik resurser, motiverar ett starkt behov av funktionella genomiska verktyg i svagt elektrisk fisk modell. Detta system är särskilt attraktivt på grund av den konvergent utvecklingen av många fenotypiska drag i parallella linjer av fisk, som lätt hålls i laboratoriet.

Det protokoll som beskrivs här visar effekten av CRISPR/Cas9 teknik i linjer av svagt elektrisk fisk som utvecklats electrogenesis och elektroreception parallellt, och därför utgör ett stort steg för denna modells löfte adressering framtida arbete i komparativ genomik av fenotypisk evolution.

Denna enkla metodologiska metod kräver endast grundläggande molekylärbiologisk kompetens och utbildning, efter ett grundläggande antagande av Gagnon-protokollet38, som används flitigt för zebrafisk. Det är värt att notera att när tekniken fortskrider, det finns fler kommersiella kit för sgRNA produktion samt företag som kan syntetisera guide RNAs, vilket gör detta protokoll mer tillgänglig för laboratorier som saknar molekylär biologi erfarenhet och utrustning. Vi noterar först att hög mutagenes effektivitet möjliggör direkt fenotypning av injicerade larver. Det verkar dock finnas en betydande grad av fenotypisk mosaik, vilket inte är ovanligt och överensstämmer med litteraturen41,42,43,44. Till exempel, i denna scn4aa studie, vissa individer som transporterar mutationer uppvisade mycket större amplitud EODS än andra som var jämförelsevis tysta (figur 7, figur 8). Det är för närvarande oklart hur många av dessa mutationer som transporteras in i germline. Omedelbara framtida insatser kommer att inriktas på att skapa stabila Mutant linjer.

Utnyttja nhej vägen för Knockouts är bara en av flera potentiella tillämpningar av CRISPR/Cas9 genredigering: de metoder som beskrivs här är en språngbräda för mer avancerade tillämpningar55,56. Framtida insatser bör syfta till att designa Co-injiceras DNA-givare mallar med sgRNA/Cas9 Complex. Denna enkla modifiering skulle utnyttja endogena mall-baserade reparationsmekanismer (dvs, homologi riktad reparation, eller HDR) och tillåta exakta knock-ins. Även om HDR sker med lägre verkningsgrad än nhej-metoder, har framsteg gjorts för att öka dess effekt57,58. Denna lägre effektivitet kommer att kräva insatser för att optimera utformningen av DNA-donatormallen/CRISPR/Cas9-konstruktionen, göra de endogena reparationsmekanismerna effektivare och öka embryoproduktionen (se nedan). Om detta effektivitetsproblem kan lösas, kan knockins utnyttjas för att lägga till fluorescerande taggar, uttrycka en muterad form av genprodukten, eller ändra promotorn eller förstärkare sekvenser.

Medan molekylärbiologi bakom denna teknik är ganska enkelt, är uppfödnings kraven betydande, men inte oöverstigliga. B. gauderio är allmänt tillgängliga och föder snabbt nog för alla forskningsprogram att ha en koloni på under ett år. Däremot B. brachyistius utvecklas långsamt, och anatomiska egenheter har visat försök till IVF hittills misslyckats. Andra, större arter, såsom Campylomormyrus59 kan vara mer gynnsam för detta tillvägagångssätt. För B. brachyistiussamlades alla injicerade embryon in med hjälp av den naturliga lek metoden, som är betydligt mer arbetsintensiv. Framtida insatser för att öka effektiviteten i B. brachyistius IVF kommer att möjliggöra en högre avkastning av embryon för de effektivitetsfrågor som beskrivs ovan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner heroiska insatser av Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, och Hope Healey för hjälp med fisk hållning, datainsamling, och tidiga protokoll utveckling. Vi vill också tacka de tre granskarna för deras förslag till manuskriptet. Vi anser att slutprodukten är av bättre kvalitet efter att ha adressera deras kommentarer. Detta arbete finansierades genom stöd från National Science Foundation #1644965 och #1455405 till JRG, och Naturvetenskaps-och Ingenjörsvetenskaps rådet DG Grant till VLS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 mg/mL RNA grade Glycogen Thermo Scientific R0551
50 bp DNA ladder NEB N3236L
Borosilicate glass capillary with filament Sutter Instrument BF100-58-10 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL PNA Biology CP01
Dneasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69506
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector Fisher Scientific E5252000021
Eppendorf Microloader Pipette Tips Fisher Scientific 10289651
Hamilton syringe Fisher Scientific 14-824-654 referred to as "precision glass syringe" in the protocol
Kimwipe Fisher Scientific 06-666 referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription Kit Invitrogen AM1334
NEBuffer 3 NEB B7003S used for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kit NEB M0480L
Ovaprim Syndel USA https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html referred to as "spawning agent" in the protocol
Parafilm Fisher Scientific S37440 referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette puller WPI SU-P97 sutter brand
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Reusable needle- requires customization Fisher Scientific 7803-02 Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymerase NEB M0203L Use with the 10x NEB buffer that is included
Teflon coated tools bonefolder.com T-SPATULA4PIECE referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system--twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, Pt 10 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, Pt 6 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, Pt 11 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
  29. Futuyma, Evolution. Third Edition. , Sinauer Associates Inc. (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist's Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G. Encyclopedia of Animal Behavior. Breed, M. D., Moore, J. 1, Academic Press. 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A. Encyclopedia of Neuroscience. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. , Springer. 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , Univ. of Oregon Press. (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 3 Pt B 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).

Tags

Biologi CRISPR/Cas9 elektrisk fisk encellig mikroinjektion scn4aa elektriskt organ urladdning arvsmassa modifiering mormyrid gymnotiform
Dämpning av gnistan: CRISPR/Cas9 genom redigering i svagt elektrisk fisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Constantinou, S. J., Nguyen, L.,… More

Constantinou, S. J., Nguyen, L., Kirschbaum, F., Salazar, V. L., Gallant, J. R. Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish. J. Vis. Exp. (152), e60253, doi:10.3791/60253 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter