Summary
هنا نقدم طريقه لتحديد المتغيرات الجديدة من e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا التي بيوتينيلات الببتيد الهدف محدده. يصف البروتوكول بناء البلازميد للعرض البكتيرية من الببتيد الهدف ، وتوليد مكتبه البيرا ، واختيار وتوصيف المتغيرات البيرا.
Abstract
البيوتين هو تعديل جذاب بعد الانتقالية للبروتينات التي توفر علامة قويه للعزل والكشف عن البروتين. الانزيميه الحيوية من قبل e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هي محدده للغاية ويسمح للبيئة البروتينات المستهدفة في بيئتهم الاصليه. ومع ذلك ، فان الاستخدام الحالي للحيوية بوساطة البيرا يتطلب وجود الببتيد متقبل الاصطناعية (AP) في البروتين المستهدف. لذلك ، يقتصر تطبيقه علي البروتينات التي تم هندستها لاحتواء AP. والغرض من هذا البروتوكول هو استخدام العرض البكتيري من الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف غير المعدلة لتحديد المتغيرات البيرا التي بيوتينيلات الببتيد. ويستند هذا النظام علي البلازميد واحد الذي يسمح للتعبير المشترك من المتغيرات البيرا إلى جانب سقالة للعرض الببتيد علي سطح البكتيريا. ويصف البروتوكول اجراء مفصلا لادراج الببتيد الهدف في سقالة العرض ، وإنشاء مكتبه البيرا ، واختيار المتغيرات الفعلية البيرا والتوصيف الاولي للمتغيرات البيرا المعزولة. ويوفر الأسلوب نظام اختيار فعاله للغاية لعزل المتغيرات البيرا الرواية التي يمكن استخدامها للتطور الموجهة المزيد من البروتينات البيوتين البروتينية التي تعكر البروتين الأصلي في الحلول المعقدة.
Introduction
بيوينيليشن من البروتين يخلق علامة قويه لعزله تقارب والكشف عنها. الانزيميه البروتين بيوتينييشن هو تعديل ما بعد الانتقالية محدده للغاية محفزه من قبل الاربطه البيوتين البروتين. و e. القولونية البيوتين-البروتين يغاز البيرا هو محدده للغاية والحيوية covalylates فقط عدد محدود من البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي في بقايا ليسين محدده1. ويتم حاليا تسخير مزايا البيره الحيوية المحفزة عن طريق دمج البروتين المستهدف مع الاصطناعية الصغيرة 15-الامينيه-حمض البيوتين متقبل (AP) الذي هو فعال بيوتينيلاتيد2 ويسمح لتحديدا عاليا و كفاءه في الجسم الحيوي وفي المختبر الحيوي من خلال التعبير المشترك أو أضافه البيرا3،4،5. علي الرغم من ان في الجسم الخارجي وفي المختبر البيره يحفز البيوتين-بروتين الربط هو استراتيجية جذابة لوضع العلامات ، ويقتصر تطبيقه علي العينات التي تحتوي علي البروتينات AP-تنصهر. والغرض من هذا الأسلوب هو تطوير المسوخ الجديدة من البروتينات البيوتين البروتيني التي بشكل انتقائي البروتينات غير المعدلة الاصليه ، التالي توسيع عدد التطبيقات التي يمكن استخدامها في استراتيجية الانزيميه الحيوية.
يمكن ان تتطور وظيفة البروتين من خلال جولات تكراريه من طفرة الجينات ، واختيار ، وتضخيم المتغيرات الجينات مع الوظيفة المطلوبة. استراتيجية اختيار قويه وفعاله أمر حاسم بالنسبة للتطور الموجهة ويتم اختيار النشاط البيوتين البروتين يغاز بسهوله بسبب الربط القوي بين البيوتين والسسترافالدين و homologs6. تكنولوجيات العرض phage تسمح لاختيار phage التي تعرض الببتيدات بيوتينيلاتيد7,8. وبما ان تضخيم الزوائد المعزولة يتطلب عدوي من المضيف البكتيري ، الا ان الاختيار الفاجي مع العقديات يخلق اختناقا في ان الربط العالي التقارب من البيوتين إلى العقديات لا رجعه فيه تقريبا في ظل عدم الفصل الظروف. لضمان ربط عكسها من phages الحيوية ، واستخدمت avidins موحودي مع تقارب اقل مما ادي إلى الإثراء ~ 10 اضعاف متواضعة7. طورنا مؤخرا طريقه عرض بكتيرية لعزل متغيرات البيرا الجديدة التي تلغي الحاجة إلى التملص من مصفوفة التقارب التالي تزيل اختناقا من أنظمه اختيار البيرا السابقة9. في الواقع ، لدينا نظام عرض البكتيرية يسمح لإثراء > 1 ، 000 ، 000 اضعاف من استنساخ النشطة في خطوه اختيار واحده9، التالي توفير نظام اختيار فعال للتطور الموجهة من المتغيرات البيرا الرواية.
لدينا نظام العرض البكتيري يتكون من اثنين من المكونات ، البيرا مع C-المحطة 6xHis العلامة والبروتين سقالة التي تسمح لعرض سطح الببتيد الهدف. استخدمنا البروتين سقالة معززه دائري الغشاء الخارجي البروتين X (eCPX) منذ عرض فعال من الببتيدات يمكن ملاحظتها في كل من N-و C-تيرميني10،11. الانصهار من الهدف الببتيد تسلسل إلى ال [ك-تيرمينوس] من [اكpx] يضمن [بيوينيلايشن] من جراثيم عبر عن نشطه [بيرا] [فرينت]. البكتيريا تسمح للاختيار العقديات فعاله كما الببتيد بيوتينيلاتيد يعرض الآن علي السطح (الشكل 1ا).
والغرض من هذا الأسلوب هو لتحديد المتغيرات الجديدة من البيرا التي بيوتينيلات الببتيد متواليات الموجودة في البروتينات الاصليه. يتم ترميز النظام من قبل الجينات الموجودة علي البلازميد pbad-البيرا-ecpx-AP ، الذي يحتوي علي مروج العربية المحرض السيطرة علي البيرا (arabad) ، ومروج T7 السيطرة ecpx9 (الشكل 1ب). يصف هذا البروتوكول الاجراء المفصل ل 1) دمج الببتيد المستمدة من البروتين المستهدف في C-الطرفية من eCPX ، 2) إنشاء مكتبه الداخلية من البيرا عن طريق الخطا المعرضة PCR ، 3) مجموعه من البكتيريا الملزمة العقديات من قبل فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MAC) ، 4) التحديد الكمي لإثراء البكتيريا ، و 5) التوصيف الاولي لمستنسخات معزولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ادراج التسلسل التسلسلي الترميز الببتيد في pBAD البيرا-eCPX-AP
ملاحظه: لتحديد المتغيرات البيرا التي تعكر البروتين الهدف الأصلي, تبدا من خلال تحديد تسلسل الببتيد الأحماض الامينيه 15 في تسلسل البروتينات الاساسيه التي تحتوي علي واحد علي الأقل ليسين (K) بقايا.
- انتقل إلى مجموعه التلاعب بالتسلسل12.
- لصق تسلسل الببتيد الأحماض الامينيه 15 المحددة في مربع الإدخال في شكل FASTA واضغط علي إرسال.
- حدد وانسخ الترجمة العكسية النيوكليوتيد 45 من تسلسل الببتيد.
- تحميل ملف GenBank ل pBAD-البيره-eCPX-AP من http://n2t.net/addgene:121907.
- تحميل الملف في محرر البلازميد (علي سبيل المثال ، القردة) و ، في نافذه ميزه ، حدد تسلسل AP المعينة "avitag (TM)".
- انقر بزر الماوس الأيمن فوق تسلسل AP المميز في اطار تسلسل الحمض النووي وحدد لصق Rev-Com في القائمة السياقية.
ملاحظه: تسلسل ترميز eCPX في الاتجاه المعاكس ، التالي ينبغي لصق تسلسل الترميز الببتيد كتكملة عكسية. - انقر بزر الماوس الأيمن فوق التسلسل المميز وحدد ميزه جديده.
- أضف اسما وصفيا للتسلسل المدرج واضغط OK.
- حدد حفظ باسم في القائمة ملف لحفظ الملف المعدل.
- تصميم التمهيدي إلى الامام لتشمل آخر 30 النيوتيودس من المكمل العكسي للتسلسل الترميز الببتيد وأضافه سلسله نوكليوتيد ربط البلازميد (3 '-gcggccgcctgc-5 ') إلى نهايته 5 '.
- تصميم التمهيدي العكسي لتشمل أول 30 النيوتيودس من المكمل العكسي للتسلسل الترميز الببتيد وأضافه سلسله نوكليوتيد الملزمة البلازميد (3 '-cttaagtaatgtttaaacgaattcgatc-5 ') إلى نهايته 5 '.
- اعداد رد فعل PCR 20 μL في أنبوب PCR رقيقه الجدران عن طريق أضافه الكواشف المدرجة في الجدول 1.
- نقل الأنبوب إلى الدورية الحرارية وأداء PCR باستخدام برنامج مع التجريد الاوليه في 98 درجه مئوية لمده 30 ثانيه ، 30 دورات من [15 ق في 98 درجه مئوية ، 15 ثانيه في 60 درجه مئوية و 3 دقائق في 72 درجه مئوية] ، تمديد النهائي لمده 2 دقيقه في 72 درجه مئوية وعقد في 4 ° c.
- تشغيل 5 μL من رد فعل PCR علي 1 ٪ هلام اجنشا لتاكيد التضخيم من المنتجات PCR ~ 6 كيلوبايت.
ملاحظه: إذا لم يتم ملاحظه المنتج PCR ، تحسين حاله PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - أضافه 1 μL من DpnI إلى تفاعل PCR واحتضان ل 1 ح في 37 درجه مئوية
- تحويل المختصة e. القولونية مع 2 Μl من dpni هضم رد فعل PCR ولوحه علي المرق المضاد للسرطان (LB)/أمبير لوحات. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- تطعيم 5 مل رطل يحتوي علي 100 ميكروغرام/مل من الامبيسلين مع مستعمره واحده. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
ملاحظه: فمن المستحسن لاختبار ما لا يقل عن 6 مستعمرات. - جعل المخزونات تجميد 850 μL من كل ثقافة بين عشيه وضحيها عن طريق أضافه الجلسرين إلى تركيز نهائي من 15 ٪ إلى الثقافة. يخزن عند-80 درجه مئوية.
- استخراج الحمض النووي البلازميد من الثقافة المتبقية مل 4 من قبل الاعداديه مصغره الحمض النووي مجموعه استخراج.
- تاكيد الادراج الصحيح للتسلسل الترميز الببتيد بواسطة تسلسل الحمض النووي باستخدام T7 التمهيدي الطرفي (GCTAGTTATTGCTCGG).
2-إنشاء مكتبه لبيرا
ملاحظه: يتم إنشاء مكتبه البيره الاوليه (الشكل 1c، الخطوة 1) بواسطة PCR المعرضة للخطا. الطرق الأخرى لإنشاء مكتبه الكائن الخاص البيرا من المحتمل ان تعمل أيضا.
- توليف مكبرات الصوت متحولة مع البيرا-6xHis إلى الامام (ATGAAGGATAACACCGTGCC) وعكس (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) الإشعال باستخدام 1 نانوغرام من pBAD-البيرا-eCPX مع تسلسل الببتيد الهدف (أعدت وأكد في الخطوة 1.20) كقالب و 35 PCR دورات مع درجه حرارة الصلب من 60 درجه مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تشغيل 5 μL من رد فعل التضخيم علي 1 ٪ هلام اجنشا للتحقق من تضخيم 984 bp PCR المنتج.
- تنقيه المنتج PCR من المتبقية 45 μL من رد فعل التضخيم باستخدام مجموعه تنقيه PCR التجارية واستخدام مقياس الطيف الطيفي لكميه العائد الحمض النووي.
ملاحظه: تنقيه من رد فعل تضخيم واحد 45 μL تنتج عموما ما يكفي من الغلة (> 250 نانوغرام). - اعداد رد فعل عينه في أنبوب PCR رقيقه الجدران عن طريق أضافه الكواشف المدرجة في الجدول 2.
- نقل خليط التفاعل إلى الدورية الحرارية وتشغيل PCR مع مكبرات الصوت متحولة أعدت في الخطوة 2.3 باستخدام المعلمات التالية: 1 دقيقه في 95 درجه مئوية و 25 دورات من 50 s في 95 درجه مئوية ، 50 s في 60 درجه مئوية و 12 دقيقه في 68 درجه مئوية. تخزين رد الفعل في 4 درجه مئوية.
- أضف 1 μL من انزيم تقييد DpnI مباشره إلى تفاعل التضخيم واخلط برفق.
- تدور أسفل خليط التفاعل واحتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية.
- تحويل T7 اكسبرس lysY/Iq المختصة e. كولاي الخلايا مع 2 μl من رد فعل dpni.
- تطعيم 100 مل رطل يحتوي علي 100 ميكروغرام/مل الامبيسيلين مع الخلايا المتحولة واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
- جعل الأسهم الفريزر مع 10 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها في LB مع 15 ٪ الجلسرين وتخزين في-80 درجه مئوية.
3. اختيار البكتيريا التعبير عن الببتيد بيوتينيلاتيد
ملاحظه: ويغطي هذا الجزء من البروتوكول الخطوة 2-5 من الشكل 1جيم. ومن المستحسن جدا ان نهج الاختيار هو الاعداد باستخدام pBAD-البيره-eCPX-AP و pBAD-البيرا-eCPX-AP (K10A) كضوابط ايجابيه وسلبيه.
- تطعيم 100 مل من LB تحتوي علي 1 ٪ الجلوكوز و 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين مع 1 مل من مكتبه البيرا واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
- تطعيم 5 مل من LB يحتوي علي 1% الجلوكوز و 100 ميكروغرام/مل امبيسيلين مع 100 μL من الثقافة بين عشيه وضحيها.
- احتضان لمده 2 ح و 30 دقيقه حتى تصل الثقافة600 OD من حوالي 0.5.
- للحث علي التعبير eCPX والبيرا مع 0.2 ٪ ث/v L-arabinose ، 100 μM ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) و 100 μM البيوتين ويهز الثقافة في 200 rpm ل 1 ح في 37 درجه مئوية.
- الطرد المركزي الثقافة لمده 10 دقيقه في 5,000 x g وأزاله supernatant.
- أعاده تعليق الخلايا في 1 مل من الجليد الباردة تلفزيوني والطرد المركزي في 5,000 x g لمده 5 دقائق.
- تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 400 μl من الجليد الباردة وتخزين الخلايا علي الجليد.
- أزاله 10 μL من الخلايا المعاد تعليقها وتخزينها علي الجليد في أنبوب 1.5 mL المسمي "الإدخال".
- غسل 20 μL من الخرز المغناطيسي العقديات في 1 مل من الجليد الباردة ووضع الأنبوب في اعلي مقعد الجسيمات المغناطيسية الفاصل قبل أزاله بعناية supernatant.
- أعاده تعليق الخرز المغناطيسي العقديات في 20 μL من الجليد الباردة تلفزيوني ونقل إلى 390 μL من الخلايا المعاد تعليقها من الخطوة 3.8.
- اخلطه برفق بالأنابيب ثم حضن لمده 30 دقيقه عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظه: لا دوامه لان هذا قد lyse الخلايا. وغالبا ما لوحظ تراكم الخرز مع وفره عاليه من البكتيريا التي تعرض الببتيد بيوتينيلاتيد. - وضع عمود مع المجالات المغنطيسية في فاصل الجسيمات المغناطيسية ويغسل مع 5 مل من الجليد الباردة تلفزيوني.
- نقل الخلايا والخرز المغناطيسي العقديات إلى العمود المرفق في الفاصل.
- مره واحده في خزان العمود فارغه ، أضافه 500 μL من الجليد الباردة تلفزيوني وتكرار حتى تم غسلها العمود مع حجم إجمالي من 5 مل من الجليد الباردة.
- أزاله العمود من الفاصل ووضعه في أنبوب 1.5 mL.
- ماصه 1 مل من الجليد الباردة تلفزيوني علي العمود و الوت الخلايا المسمية مغناطيسيا عن طريق تطبيق المكبس الموردة مع العمود.
- نقل أنبوب 1.5 mL إلى فاصل اعلي مقاعد البدلاء وغسل الخلية المسمي مغناطيسيا مع 1 مل من الجليد الباردة تلفزيوني.
- أعاده التعليق برفق الخلايا المسمية مغناطيسيا في 1 مل من الجليد الباردة التلفزيونية قبل أزاله وتخزين 10 μL من أعاده التعليق في أنبوب 1.5 mL المسمي "الإخراج".
- تطعيم 100 مل من LB تحتوي علي 1 ٪ الجلوكوز و 100 ميكروغرام/مل الامبيسيلين مع الخلايا المسمية مغناطيسيا واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
- في اليوم التالي ، استخدم 10 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها لجعل الأسهم الفريزر مع الخلايا في LB مع 15 ٪ الجلسرين وتخزين في-80 درجه مئوية و 1 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها للجولة القادمة من الاختيار ، اي الخطوة 3.2.
ملاحظه: عموما ، يوصي ب3-5 جولات من الاختيار لإثراء البكتيريا الملزمة العقديات.
4. القياس الكمي للتخصيب
ملاحظه: يتم اجراء القياس الكمي للبكتيريا الحية في عينات "الإدخال" و "الإخراج" بعد كل جولة اختيار عن طريق الطلاء من التخفيفات التسلسلية من العينات والعد اللاحق لوحدات تشكيل مستعمره (CFUs).
- أضافه 990 μL الجليد الباردة إلى المدخلات (من الخطوة 3.8) والإخراج (من الخطوة 3.18) عينات وتسميه أنابيب "المدخلات 10-2" و "الناتج 10-2" ، علي التوالي.
- جعل المخففات التسلسلية 10 اضعاف من "المدخلات 10-2" و "الإخراج 10-2" عينات في الجليد الباردة بالثلج حتى التخفيف النهائي من 10-10 يتم التوصل في عينه الإدخال و 10-4 في عينه الإخراج.
- لوحه 100 μL من العينات من "الإدخال 10-6" ، "الإدخال 10-8" ، "الإدخال 10-10" ، "الإخراج 10-2" ، "الإخراج 10-3" و "الناتج 10-4" علي لوحات LB/أمبير واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- عد عدد المستعمرات علي لوحات مع مستعمرات مفصوله بوضوح. اضرب عدد المستعمرات بعامل التخفيف للحصول علي عدد التركيز البكتيري/100 μL.
- حساب إجمالي عدد البكتيريا في عينات الإدخال والإخراج عن طريق ضرب تركيز الخلية مع الإدخال (400 μL) وحجم الإخراج (1 مل) ، علي التوالي ، وتقدير الإثراء عن طريق تقسيم المخرجات مع عدد خلايا الإدخال.
ملاحظه: وينبغي ان يكون الإثراء الكبير مرئيا بعد جولات الاختيار 3-5
5-توصيف خيار البيرا المختار
ملاحظه: ويمكن القيام بهذا التوصيف بعد اختيار الأنواع المختلفة من مكتبه البيرا الاولي ؛ ومع ذلك, المتغيرات البيرا عموما لديها نشاط منخفض نحو الببتيد. ولذلك ، يمكن أيضا اجراء جولة اضافيه من الطفرة والاختيار قبل التوصيف. عاده ، يتم عزل 10 استنساخ من جولة الاختيار النهائي لمزيد من التوصيف.
- تطعيم 5 مل رطل يحتوي علي 100 ميكروغرام/مل من الامبيسلين مع المستنسخين المختارين من جولة الاختيار النهائية. الاضافه إلى ذلك ، تطعيم 5 مل LB تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين مع T7 اكسبرس lysY/Iq e. القولونية تحولت مع Pbad البيرا-ECPX-AP ، والتي سيتم استخدامها كعنصر تحكم إيجابي للطخه الغربية الموصوفة أدناه.
- احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة.
- جعل المخزونات تجميد 850 μL من كل ثقافة بين عشيه وضحيها عن طريق أضافه الجلسرين إلى تركيز نهائي من 15 ٪ إلى الثقافة. يخزن عند-80 درجه مئوية.
- تطعيم 5 مل من LB تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل امبيسيلين مع 100 μL من الثقافة بين عشيه وضحيها واحتضان في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 200 دوره في الدقيقة لمده 2 ساعة.
- استخراج الحمض النووي البلازميد من ثقافة 4 مل المتبقية من قبل s تجاريا مصغره الاعداديه الحمض النووي مجموعه استخراج. أداء تسلسل الحمض النووي في الاتجاهين الامامي والمعاكس من المتغيرات البيرا مع pBAD (ATGCCATAGكاتكتاتتاتسي) و Ptrتشيس rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) الإشعال.
- أضافه 0.2 ٪ w/v L-arabinose و 100 μM IPTG و 100 μM البيوتين إلى الثقافات من الخطوة 5.4 ويهز الثقافة في 200 دوره في الدقيقة ل 1 ح في 37 درجه مئوية للحث علي التعبير عن eCPX والبيرة المتغيرات.
- نقل 65 μL من الثقافة إلى 1.5 mL الأنابيب التي تحتوي علي 25 μL من عينه المخزن المؤقت التحميل و 10 μL من وكيل الحد.
- احتضان في 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
- تحميل العينة (بما في ذلك السيطرة الايجابيه) علي 12 ٪ SDS-بولياكرياميد هلام مع علامة حجم وأداء الكهربائي هلام في 200 V لمده 45 دقيقه تقريبا حتى يتم فصل العصابات القياسية 20 ، 25 و 37 كده بوضوح.
- الإفراج عن هلام من الكاسيت وتجميع ساندويتش لتنقيط من هلام علي غشاء PVDF.
- الكهربائية في 35 V لمده 2 ح علي الجليد.
- أزاله غشاء PVDF واحتضان في حجب العازلة [الخدمات التلفزيونية العامة ، 0.05 ٪ توين-20 ، 3 ٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم] لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الاهتزاز.
- اعداد محلول البيوتين-الكشف عن طريق تمييع العقديات الدين 1:1000 في PBST.
ملاحظه: يحتوي المخزن المؤقت الحظر علي البيوتين ولذلك يجب عدم استخدامه كمخزن مؤقت لتخفيف العقديات. - تجاهل العازلة حجب ، وغسل الغشاء بسرعة في PBST [التلفزيونية ، 0.05 ٪ توين-20] وأضافه محلول البيوتين الكشف. احتضان لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الاهتزاز.
- تجاهل محلول البيوتين-الكشف وغسل الغشاء جيدا في PBST لمده 5 دقائق مرتين و 10 دقيقه مره واحده مع اهتزاز لطيف في درجه حرارة الغرفة.
- تجاهل PBST ، أضافه 2 مل ECL مزيج واحتضان لمده 1 دقيقه مع الاهتزاز.
- تجفيف الغشاء بسرعة علي ورقه الانسجه وتطوير الصورة علي فيلم الاشعه السينية أو في نظام التصوير هلام الرقمية.
ملاحظه: في الممر المحمل بالسيطرة الايجابيه ، يجب ان تكون نطاقات التفاعل بين العقديات المميزة مرئية بوضوح: 30 كيلو من البروتين الذي أعرب عنه اندوجينوسلي و ~ 22 كده eCXP-AP الفرقة. إذا كانت المستعمرات 10 المحددة يمكن ان تعكر الحيوية الببتيد المعروضة ، يجب ان تكون الفرقة في ~ 22 كده مرئية. وكثافة هذه النطاقات اقل عموما من السيطرة الايجابيه ، التالي قد تتطلب فترات تعرض أطول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وصمه عار الغربية من pBAD-البيره-eCPX-AP التعبير عن البكتيريا تنتج ~ 22 [كده] العقديات-رد فعل الفرقة متسقة مع الوزن الجزيئي لل eCPX (الشكل 2ا). وعلي عكس البيرا-6xHis, كان eCPX-AP الحيوية موجودة في كل من الثقافات غير المستحثة والمستحثة (الشكل 2ا) بسبب درجه صغيره من نشاط المروج T7 حتى في الثقافات غير المستحثة والتعكر اللاحقة من AP من قبل البيرا الذاتية. في البيرا-eCPX-AP (K10A) التعبير عن الثقافات ، لم يتم الكشف عن الفرقة eCPX الحيوية (الشكل 2ا). الحيوية السطحية القوية في eCPX-AP التعبير عن البكتيريا يسبب التراكم عند أضافه الخرز المغناطيسي العقديات وتشكيل بيليه في الجزء السفلي من أنبوب (الشكل 2ب). وفي بكتيريا التعبير eCPX-AP (K10A) ، لم يلاحظ تراكم الحصى العقدي وتساقط الامطار (الشكل 2ب). تحليل من الراسب من ال [سترفيدين] [بولداون], يعرض واضحة [22-كد] [سترفيدين-رد] و [انتي-6 اكس] فرقه في العينات من [اكpx-ف] ثقافات, غير ان لا [اكpx-أب] (K10A) ثقافات (شكل 2[ك]). المثل ، كان عدد البكتيريا المنضمة إلى الخرز العقديات اعلي بكثير في eCPX-AP من الثقافات eCPX-AP (K10A) (الشكل 2د).
لتحديد للمتغيرات البيرا التي تعكر الهدف الببتيد ، تم دمج تسلسل الحمض النووي في C-الطرفية من eCPX من قبل PCR باستخدام الإشعال مصممه في الخطوة 1.10 و 1.11. ويرد مثال علي الإشعال المصممة لإدماج سلسله الببتيد المستمدة منالوحدةالفرعية α من القناةNa + الظهاريه (Enac) في الشكل 3ا. بعد PCR ، تم تحليل قسامه 5-μl من قبل الاغاروز هلام الكهربائي والفرقة واضحة وقويه في ~ 5900 bp لوحظ (الشكل 3ب).
بعد جيل من مكتبه الطفرة البيره ، تم البدء في اختيار المتغيرات البيره النشطة. وكان من المتوقع انخفاض درجه من العقديات المرتبطة مقابل البكتيريا المدخلات بعد جولة الاختيار الاولي. ومع ذلك ، بعد 2الثانية والثالثة الاختيار جولات الإثراء الواضح لوحظ في درجه العقديات البكتيريا المرتبطة الرقم 4ا). وإذا لم يتم الكشف عن تخصيب واضح (الشكل 4ب) ، فانه يدل علي فشل المتغيرات البيرا في التعكر الحيوي الببتيد ، التالي ينبغي اختبار تسلسل الببتيد آخر.
بعد الجولة النهائية الاختيار ، وتتميز 10 استنساخ الغربية التنقيط لقدرتها علي بيوفيتينيلات الببتيد المعروضة (الشكل 4ج). في السيطرة الايجابيه (اي AP) ، ~ 22 كانت الفرقة المقابلة لل eCPX-AP الحيوية لوحظ في لطخه الغربية سبرت مع العقديات الدين-الاستجابة (الشكل 4ج). وفي النسخ المستنسخة التي تم اختبارها ، كانت الفرقة في حجم مماثل تدل علي التعكر الحيوي لل الببتيد المعروضة المنصهرة إلى eCPX (الشكل 4ج). وكانت كثافة النطاقات ~ 22 ده كده اقل من كثافة النطاق eCPX-AP في السيطرة الايجابيه ، مما يشير إلى انخفاض نشاط المتغيرات البيرا المعزولة. يمكن لاستنساخ معزولة ، لذلك ، ان تستخدم كقالب لجولة أخرى من الطفرات والاختيار ، والغلة استنساخ نشطه للغاية. وتشير النطاقات الاضافيه إلى ان المستنسخين المعزولين لم يكونوا محددين باتجاه الببتيد المعروض وان أهدافا اضافيه كانت أيضا حيوية (الشكل 4ج).
| كاشف | الحجم (μL) |
| 5x رد فعل العازلة | 4 |
| 10 مم dNTP | 0.4 |
| 10 μM التمهيدي إلى الامام | 1 |
| 10 μM التمهيدي العكسي | 1 |
| pBAD-البيره-eCPX-AP | متغير (~ 25 نانوغرام) |
| بوليميجين عالي الدقة | 0.20 |
| المياه الخالية من النيوداز | إلى 20 |
الجدول 1: الكواشف PCR. قد تختلف وحدات ووحدات التخزين بين الشركات المصنعة.
| كاشف | الحجم (μL) |
| 2x مزيج الانزيم | 25 |
| pBAD-البيره-eCPX-AP مع تسلسل الببتيد الهدف * | متغير (~ 50 ng) |
| متحولة [ميجريمر] | 250 نانوغرام |
| المخزن المؤقت | 3 |
| المياه الخالية من النيوداز | إلى 50 |
الجدول 2: الكواشف PCR المعرضة للخطا. قد تختلف وحدات ووحدات التخزين بين الشركات المصنعة. * أعدت في الفرع 1 من البروتوكول.
الشكل 1: نظام عرض البكتيريا لاختيار البيرا. (ا) استند النظام إلى التعبير المشترك عن مكونين: البيرا و ecpx تنصهر مع الببتيد متقبل (AP). يتم نقل eCPX إلى السطح ، وإذا كان البديل البيرا بيوتينيلات AP ، يتم عرض البيوتين (الأحمر B) المرفقة علي eCPX-AP علي السطح. (ب) وقد تم التعبير عن النظام من البلازما pbad-البيرا-ECPX-ap ، حيث يتم التحكم في العبارة البيرا من قبل المروج العربية المحرض والتعبير ECPX-ap يحركها المروج T7. (ج) بعد جيل من مكتبه متحولة عشوائيا من المتغيرات البيرا (الخطوة 1) ، والبيرة والتعبير ecpx-AP كان مستحثا (الخطوة 2). تم احتضان البكتيريا مع كاشف التقارب (الخطوة 3) ، تم التخلص من البكتيريا غير المنضمة (الخطوة 4) وتم تضخيم البكتيريا المختارة (الخطوة 5). وقد تم تعديل هذا الرقم من Granhøj et al.9الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية من اختيار النموذج مع Pbad-بيرا-ecpx-Ap و Pbad-بيرا-ecpx-ap (K10A). (ا) بالتنقيط الغربي ، لوحظ ان البكتيريا المضادة للجراثيم في البكتريا غير المستحثة والمستحثة ، في حين انه لم يتم الكشف عن اي تعكره من ECPX-AP (K10A) حتى بعد تحريض البيرا. تم الكشف عن التعبير البيرا من قبل المضادة-6xHis أجسام. * يشير إلى بروتين غير محدده التفاعل العقديات عندما كان مستحثا البيرا. (ب) الثقافات البكتيرية مع التعبير المستحث من البيرا و ECPX-AP التجميعية بسرعة بعد أضافه الخرز العقديات المغناطيسية (السهم) ، في حين لم يلاحظ اي تجميع في البكتيريا AP (K10A). (ج) كانت البيرا موجودة في البكتيريا التي تعبر عن ecpx-Ap و ECPX-AP (K10A) قبل الهبوط (الإدخال) ، ولكن البيرا فقط في ECPX-ap التعبير عن البكتيريا تم سحبها من قبل العقديات. في اتفاق, (د) وعجلت البكتيريا قابله للحياة فعاله في ecpx-ap, ولكن ليس ecpx-AP (K10A), التعبير عن البكتيريا. وقد تم تعديل هذا الرقم من Granhøj et al.9الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصميم التمهيدي ودمج تسلسل الترميز الببتيد الهدف في Pbad-البيرا-ECPX-AP بواسطة PCR. (ا) مثال علي تصميم الإشعال المستخدم لادراج سلسله الببتيد المشتقة من αENaC في المحطة C من ecpx. يتم عرض البيوتين قبول يسين باللون الأحمر. وكان تسلسل الببتيد الهدف العكسي ترجم إلى الحمض النووي ، وتم تصميم الإشعال إلى الامام والعكس من خلال ضمان ~ 15 التداخل الأساسي بين الإشعال. (ب) الممثل الكهربائي لهلام الجل من PCR مع pbad-البيرا-ECPX-AP كقالب والإشعال محدده ل α ، β ، و γ-enac المشتقة الببتيد متواليات ، علي التوالي. وكان منتج الحمض النووي واضحة وقويه في ~ 5900 bp مؤشرا علي PCR ناجحه. "M" يشير إلى خط العلامة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية من اختيار وتوصيف البكتيريا التي تظهر الببتيدات. البكتيريا عرض الببتيد المستمدة من (ا) وأظهرت tagrfp إثراء واضحا بعد 3 جولات الاختيار ، في حين ان الببتيد المستمدة من (b) egfp أظهرت اي إثراء البكتيريا المتجهة العقديات حتى بعد 4 جولات الاختيار. (ج) تم اختبار 10 استنساخ من البكتيريا التي تظهر الببتيد من γenac من خلال 5 جولات الاختيار لقدرتها علي بيوفيتينيلات γenac الببتيد. وأظهرت جميع المستنسخين 10 الفرقة العقديات-رد فعل متسقة مع حجم eCPX-AP ، مشيرا إلى ان استنساخ معزولة تحتوي علي المتغيرات البيرا التي تعكر الحيوية الببتيد المعروضة. ولوحظت أيضا عصابات التفاعل الاضافيه ، مما يشير إلى ان البروتينات الأخرى ، إلى جانب الببتيد المعروضة ، كانت أيضا بيوتينيلاتيد. * يشير إلى المحلية e. القولونية البروتين بيوتينيلاتيد بواسطة البيرا. وقد تم تعديل هذا الرقم من Granhøj et al.9الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اما بالنسبة لجميع طرق الاختيار ، فان صرامة خطوات الغسيل ذات اهميه قصوى. وبما ان البكتيريا لا تحتاج إلى التملص من الخرز قبل تضخيم المستنسخين المختارين ، يمكن استخدام الربط العالي بين البيوتين والسسترافيدين بدلا من استخدام avidins التقارب الأقل ، كما فعلت سابقا مع نظام عرض بالعاثيه ، الانتقاء من [بيرا] [فرينت]7,8. وهذا يضمن ان يتم اختيار استنساخ نادره وان يتم التخلص من البكتيريا غير الحيوية. ميزه أخرى لاستخدام العرض البكتيري ، بالمقارنة مع عرض بالعاثيه ، هو ان العرض البكتيري هو الكمية11 ، التالي ، يسمح لاختيار البكتيريا علي أساس النشاط الانزيمي.
في البروتوكول ، ونحن تستخدم أجهزه ماكينتوش لتحديد للبكتيريا إنشاء نظام اختيار ثنائي علي أساس وجود أو غياب البيوتين علي السطح. ومع ذلك ، باستخدام الكمية الخلية المنشطة الفرز ، بدلا من ذلك ، ينبغي ان يكون من الممكن لتحديد للبكتيريا التي تعبر عن المتغيرات الأكثر نشاطا من البيرا. هذا سيكون مهمة في التطوير مقبله من الرواية [بيرا] [فرينت] بما ان هو سيسمح انتقاء فعاله ل ال أكثر نشطه [بيرا] [فرينت].
لدينا ، حتى الآن ، وتستخدم عرض البكتيريا من 14 الببتيدات مختلفه ، ومن تلك ، أنتجت 13 إثراء واضح9، مشيرا إلى ان نظام الاختيار لدينا يوفر طريقه قويه لتحديد للمتغيرات البيرا الرواية. في الاعداد الحالي, لقد اختبرنا فقط اختيار المتغيرات البيرا التي تنشط نحو 15-الأحماض الامينيه الببتيدات و, التالي اخترنا بشكل تفضيلي للمتغيرات البيرا التي تنشط نحو التسلسل الأساسي للبروتين المستهدف. ومع ذلك ، يمكن ان يدفن يسين المستهدفة داخل هيكل 3D من البروتين أو لا يمكن الوصول اليها بطريقه أخرى لبيرا ، والتي تسفر عن المتغيرات البيرا التي ليست نشطه ضد البروتين المستهدف. والحل المحتمل هو لعرض جزء أكبر من البروتين علي eCPX. سقالة eCPX متعددة الاستخدامات فيما يتعلق العرض الببتيد11; ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما إذا كان يمكن عرض البروتينات أكبر.
استخدمنا نظام الاختيار لعزل البديل البيرا الذي بيوتينيلات الأصلي TagRFP9. اختبار البيرا البديل علي وجه التحديد التعكر الحيوي TagRFP علي الجيب المستهدفة ، ولكن كان نشاط متغير معزولة منخفضه9. ولذلك ، ينبغي القيام بجولات أخرى من التطور الموجه لتحسين نشاطها. الببتيد الهدف في المحطة C-من TagRFP ، حيث التشابه الهيكلي بين الببتيد المعروضة ومنطقه البروتين هو أكثر احتمالا. تحليل المعلوماتية الحيوية لجميع البروتينات البشرية والماوس ويبين ان ~ 75 ٪ من البروتينات تحتوي علي واحد أو أكثر من يسين داخل الأحماض الامينيه الاولي و/أو الاخيره 309. وهكذا ، فان نظام عرض البكتيريا من الببتيدات يمكن ان تستخدم لعزل المتغيرات البيره النشطة نحو جزء كبير من البروتينات الاصليه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويشكر المؤلفان محمد عبد السيد احمد علي المساعدة الفنية الخبيرة. وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مؤسسه لوندبيك ، ومؤسسه نوفو نورديسك ، وجمعيه الكلي الدانمركية ، ومؤسسه اياسي اوغ اجنار دانييلسن ، ومؤسسه A.P. مولر للنهوض بالعلوم الطبية ، وكود واياديث اريكسون مؤسسه ميموريال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
