Summary
Здесь мы представляем метод, чтобы выбрать для новых вариантов E. coli биотин-протеин лигаза BirA, что биотинилаты конкретной цели пептид. Протокол описывает конструкцию плазмида для бактериального отображения целевого пептида, генерацию библиотеки BirA, выбор и характеристику вариантов BirA.
Abstract
Биотин является привлекательной посттрансляционной модификацией белков, которая обеспечивает мощный тег для изоляции и обнаружения белка. Энзиматическая биоинжиниляция e. coli биотина-белка ligase BirA является весьма специфической и позволяет биотинилацию целевых белков в их родной среде; однако, текущее использование BirA опосредоченной биотиниляции требует присутствия синтетического пептида приемного (AP) в целевом белке. Таким образом, его применение ограничивается белками, которые были разработаны, чтобы содержать AP. Цель настоящего протокола заключается в использовании бактериального отображения пептида, полученного из неизмененного белка-мишени, для выбора вариантов BirA, которые биотинилатируют пептид. Система основана на одной плазмиде, которая позволяет совместно выражать варианты BirA вместе с эшафотом для пептидного дисплея на бактериальной поверхности. Протокол описывает детальную процедуру включения целевого пептида в эшафот дисплея, создание библиотеки BirA, выбор активных вариантов BirA и первоначальную характеристику изолированных вариантов BirA. Метод обеспечивает высокоэффективную систему отбора для изоляции новых вариантов BirA, которые могут быть использованы для дальнейшей направленной эволюции биотин-белковых лигазов, которые биотинилат родной белок в сложных растворах.
Introduction
Биотинилация белка создает мощный тег для его изоляции сродства и обнаружения. Биотинилация ферментативного белка является весьма специфической посттрансляционной модификацией, катализированной биотин-белковыми лигазами. E. coli биотин-протеина лигаза BirA является чрезвычайно специфическим и ковалентно биотинилатов только ограниченное количество естественных белков на конкретных остатков лизина1. Преимущества катализированной биотиниляции BirA в настоящее время используются путем сплавления целевого белка с небольшим синтетическим 15-аминокислотным биотином пептида (AP), который эффективно биоинтиниляции2 и позволяет высокоспецифические и эффективное in vivo и in vitro биотинилация путем совместного выражения или добавления BirA3,4,5. Хотя in vivo и in vitro BirA катализируют сяврин-белковую перевязку является привлекательной стратегией маркировки, ее применение ограничено образцами, содержащими слитые AP белки. Целью этого метода является разработка новых мутантов биотин-белковых лигазов, которые избирательно биотинилат местные неизмененные белки и, тем самым, расширяют количество применений, в которых может быть использована ферментативная стратегия биоинжиниляции.
Белковая функция может развиваться с помощью итеративных раундов генной мутации, выделения и усиления вариантов генов с желаемой функцией. Сильная и эффективная стратегия отбора имеет решающее значение для направленной эволюции и биотин-протеиновой лигазной активности легко подобрана из-за сильной связывания между биотином и стрептавидином и его омологами6. Технологии фаги позволяют подбирать фаги, которые отображают биотинилатные пептиды7,8. Поскольку усиление изолированных фагов требует заражения бактериального хозяина, однако, выбор фага стрептавидинсоздает узкое место в том, что высокородность связывания биотина стрептавидин практически необратимым под не-денатурация Условия. Для обеспечения обратимого связывания биотининатированных фагов использовались мономерные алдины с более низким сродством, что привело к скромному обогащениюв10 раз. Недавно мы разработали метод бактериального дисплея для изоляции новых вариантов BirA, который устраняет необходимость в elution из матрицы сродства и тем самым удаляет узкое место из предыдущих систем отбора BirA9. В самом деле, наша бактериальная система отображения позволяет для 1000000 раз обогащение активных клонов в одном шаге отбора9, таким образом, обеспечивая эффективную систему отбора для направленной эволюции романа BirA вариантов.
Наша бактериальная система отображения состоит из двух компонентов, BirA с C-терминал 6xHis тег и эшафот белка, что позволяет для поверхности отображения целевого пептида. Мы использовали эшафот белка расширения круговой пермутированный наружной мембраны белка X (eCPX), так как эффективное отображение пептидов можно наблюдать как на N- и C-терминини10,11. Слияние целевой пептидной последовательности с C-термином eCPX обеспечивает биотинилацию бактерий, выражающих активные варианты BirA. Бактерии позволяют для эффективного выбора стрептавидина, как биотинилаповый пептид теперь отображается на поверхности(Рисунок 1a).
Цель юаней – отобрать для новых вариантов BirA, которые биотинилатируют пептидные последовательности, присутствующие в местных белках. Система кодируется генами, присутствующими на плазмидном pBAD-BirA-eCPX-AP, который содержит арабинос-индуцированный промоутер, контролирующий BirA (araBAD), и промоутер T7, контролирующий eCPX9 (Рисунок 1b). Настоящий протокол описывает детальную процедуру для 1) включения пептида, полученного из целевого белка, в C-терминал eCPX, 2) создание мутационной библиотеки BirA по подверженным ошибкам ПЦР, 3) выбор стрептавидиновых бактерий сортировка клеток с магнитным активированным (MACS), 4) количественная оценка обогащения бактерий и 5) первоначальная характеристика изолированных клонов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Вставка пептидкодирования секвенирования последовательности в pBAD BirA-eCPX-AP
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выбрать для BirA варианты, которые биотинилат родной белка цели, начните с определения 15-аминокислоты пептид последовательности в белках первичной последовательности, которая содержит по крайней мере один лизин (K) остаток.
- Перейти к последовательности манипуляции Suite12.
- Вставьте определены 15 аминокислот пептид последовательности в входного окна в формате FASTA и нажмите Отправить.
- Выберите и скопируйте 45 нуклеотидный обратный перевод пептидной последовательности.
- Скачать файл GenBank для pBAD-BirA-eCPX-AP с http://n2t.net/addgene:121907.
- Загрузите файл в плазмидный редактор (например, ApE) и, в окне функции, выберите последовательность AP, обозначенную "AviTag(TM)".
- Нажмите правой кнопкой выделенной последовательности AP в окне последовательности ДНК и выберите Paste Rev-Com в контекстном меню.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность кодирования eCPX находится в обратном направлении, и последовательность пептидного кодирования должна, следовательно, быть вставлена в качестве обратного дополнения. - Нажмите правой кнопкой выделенной последовательности и выберите новую функцию.
- Добавьте описательное название вставленной последовательности и нажмите OK.
- Выберите Сохранить Как в меню файла, чтобы сохранить измененный файл.
- Дизайн вперед грунтовка включить последние 30 нуклеотидов обратного дополнения пептид кодирования последовательности и добавить плазмид связывания нуклеотидной последовательности (3'-GCGGCCGCCTGC-5') к его 5 'конец.
- Разработать обратный грунт, чтобы включить первые 30 нуклеотидов обратного дополнения пептид кодирования последовательности и добавить плазмид связывания нуклеотидной последовательности (3'- CTTAAGTAATGTTAACGAATTTGAG-5') до его 5' конца.
- Назначь 20-л ПЦР реакции в тонкостенной трубке ПЦР, добавив реагенты, перечисленные в таблице 1.
- Перенесите трубку на тепловой цикл и выполните ПЦР с помощью программы с первоначальным денатурированием при 98 градусах по Цельсию в течение 30 с, 30 циклов в 15 с при 98 градусах По Цельсию, 15 с при 60 градусах Цельсия и 3 мин при 72 градусах по Цельсию, окончательное расширение на 2 мин при 72 градусах по Цельсию и удерживайте при 4 градусах По Цельсия.
- Запустите 5 qL реакции ПЦР на 1% агарозный гель, чтобы подтвердить усиление продукта ПЦР за 6 кБ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если продукт ПЦР не соблюдается, оптимизируйте состояние ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Протокол можно приложить здесь. - Добавьте 1 зл DpnI к реакции ПЦР и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия
- Преобразуйте компетентную кишечную палочку с 2 Л DpnI переваренной реакцией ПЦР и пластиной на лисогенном бульоне (LB)/Amp пластинах. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Прививать 5 мл ЛБ, содержащий 100 мкг/мл ампициллин с одной колонией. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверить не менее 6 колоний. - Сделать заморозить запасы 850 л каждой ночной культуры, добавив глицерол до окончательной концентрации 15% к культуре. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
- Извлеките плазмидную ДНК из оставшейся культуры 4 мл с помощью комплекта для экстракции ДНК.
- Подтвердите правильную вставку последовательности пептидного кодирования с помощью секвенирования ДНК с помощью грунтовки Терминала T7 (GCTAGTTTTGCTCAGCGG).
2. Поколение библиотеки Бира
ПРИМЕЧАНИЕ: Начальная мутационная библиотека BirA(рисунок 1c,шаг 1) создается пЦР, подверженной ошибкам. Другие методы для создания бирА мутационной библиотеки, вероятно, также будет работать.
- Синтезировать мутант мегакофры с BirA-6xHis вперед (ATGAAGGATAACGTGCC) и обратной (TCAATGATGATGATGATGTTTT) грунтовки с использованием 1 нг PBAD-BirA-eCPX с целевой пептидной последовательности (подготовлены и подтверждены в шаге 1.20) в качестве шаблона и 35 Циклов ПЦР с температурой annealing 60 градусов по Цельсию в соответствии с инструкцией производителя.
- Запустите 5 qL реакции усиления на 1% агарозный гель для проверки усиления 984 bp ПЦР продукта.
- Очистите продукт ПЦР от оставшихся 45 qplification реакции с помощью коммерческого комплекта очистки ПЦР и использовать спектрофотометр для количественной оценки урожайности ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка от одной реакции усиления 45 л, как правило, дает достаточную урожайность (Nogt;250 нг). - Подготовьте реакцию образца в тонкостенной трубке ПЦР, добавив реагенты, перечисленные в таблице 2.
- Перенесите реакционную смесь на тепловой циклизатор и запустите ПЦР с помощью мегадюров-мутантов, подготовленных в шаге 2.3, используя следующие параметры: 1 мин при 95 градусах По кв. и 25 циклов по 50 градусов по Цельсию, 50 с при 60 градусах По цельсии и 12 мин при 68 градусах Цельсия. Храните реакцию при 4 градусах По Цельсию.
- Добавьте 1 зле фермента ограничения DpnI непосредственно к реакции усиления и аккуратно перемешайте.
- Спин вниз реакции смеси и инкубировать в течение 2 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Преобразование T7 Express lysY/Iq компетентных клеток кишечной палочки с 2 QL реакции DpnI.
- Прививать 100 мл ЛБ, содержащий 100 мкг/мл ампициллин с преобразованными клетками и инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия с тряской при 200 об/мин.
- Сделать морозильник запасов с 10 мл ночной культуры в LB с 15% глицерола и хранить при -80 градусов по Цельсию.
3. Выбор бактерий, выражающих биоинтинилатированный пептид
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола охватывает шаг 2-5 рисунка 1c. Настоятельно рекомендуется, чтобы подход к отбору был настроен с использованием pBAD-BirA-eCPX-AP и pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) в качестве позитивного и отрицательного контроля.
- Прививать 100 мл ЛБ, содержащий 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллин с 1 мл библиотеки BirA и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию с тряской при 200 об/мин.
- Прививать 5 мл LB, содержащий 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллин с 100 зл и л ночной культуры.
- Инкубировать в течение 2 ч и 30 мин, пока культура не достигнет OD600 примерно 0,5.
- Индуцировать eCPX и BirA выражение с 0,2% ж / V L-arabinose, 100 ММ изопропил -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) и 100 ММ биотин и встряхнуть культуру при 200 об/мин на 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Centrifuge культуры в течение 10 мин на 5000 х г и удалить супернатант.
- Приостанавливайте работу клеток в 1 мл ледяного PBS и центрифуги при 5000 х г в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта и resuspend клеток в 400 л ледяной PBS и хранить клетки на льду.
- Удалите 10 л из переитованных ячеек и храните на льду в трубке 1,5 мл с надписью "Вход".
- Вымойте 20 зл стрептавидиновых магнитных бусин в 1 мл ледяного PBS и поместите трубку в скамейке верхней магнитной частицы сепаратора, прежде чем тщательно удалить супернатант.
- Отрежь стрептавидин магнитные бусы в 20 Л ледяной PBS и передачи на 390 Л повторного клеток от шага 3.8.
- Смешайте, аккуратно пипетка, а затем инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихрь, как это может линизовызировать клетки. Агрегация бисера часто наблюдается с большим обилием бактерий, демонстрирующих биотинилатный пептид. - Поместите столбец с ферромагнитными сферами в магнитный сепаратор частиц и промойте 5 мл ледяного PBS.
- Передача клеток и стрептавидина магнитных бусин к столбце, прикрепленной к сепаратору.
- Как только столбик резервуара пуст, добавить 500 л ледяной PBS и повторить, пока столбец был промыт с общим объемом 5 мл ледяной PBS.
- Снимите столбец с сепаратора и поместите ее в трубку 1,5 мл.
- Пипетка 1 мл ледяной PBS на колонку и elute магнитно помечены клетки, применяя поршень поставляется с колонкой.
- Перенесите трубку 1,5 мл на скамейку верхнего сепаратора и промойте магнитно маркированную ячейку 1 мл ледяного PBS.
- Аккуратно приостановите магнитно помеченные клетки в 1 мл ледяного PBS перед удалением и хранением 10 л повторной подвески в трубке объемом 1,5 мл с надписью "Выход".
- Прививать 100 мл ЛБ, содержащий 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллин с магнитно помеченными клетками и инкубировать ночь при 37 градусах Цельсия с тряской при 200 об/мин.
- На следующий день, используйте 10 мл ночной культуры, чтобы сделать морозильник запасов с клетками в LB с 15% глицерола и хранить на -80 градусов по Цельсию и 1 мл ночной культуры для следующего раунда отбора, т.е. шаг 3.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 3-5 раундов отбора рекомендуется для обогащения стрептавидина связывающих бактерий.
4. Количественная оценка обогащения
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка живых бактерий в образцах "входных" и "выходных" проводится после каждого раунда отбора путем покрытия серийных разбавлений образцов и последующего подсчета единиц формирования колоний (CfUs).
- Добавьте 990 л/с ледяные PBS к входным (от шага 3.8) и выход (от шага 3.18) образцов и обозначьте трубки "Вход 10-2"и "Выход 10-2", соответственно.
- Сделайте 10-кратное серийное разбавление образцов "Вход 10-2"и "Выход 10-2"в ледяных PBS до окончательного разбавления 10-10 в входной образце и 10-4 в выходном образце.
- Плита 100 злицил образцов из "Вход 10-6", "Вход 10-8", "Вход 10-10", "Выход 10-2", "Выход 10-3"и "Выход 10-4" на пластинах LB /Amp и инкубировать ночь на 37 градусов по Цельсию.
- Подсчитайте количество колоний на плитах с четко разделенными колониями. Умножьте количество колоний с коэффициентом разбавления, чтобы получить количество бактериальной концентрации/100 Л.
- Рассчитать общее количество бактерий в входных и выходных образцах, умножая концентрацию клеток с входными (400 л) и объем выхода (1 мл), соответственно, и оценить обогащение путем деления вывода с количеством входных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значительное обогащение должно быть видно после 3-5 отборочных раундов
5. Характеристика выбранного варианта BirA
ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристика может быть выполнена после выбора вариантов BirA из первой библиотеки BirA; однако, варианты BirA обычно имеют низкую активность к пептид. Таким образом, дополнительный раунд мутации и отбора также может быть выполнен а затем до характеристики. Как правило, 10 клонов из заключительного раунда отбора изолированы для дальнейшей характеристики.
- Прививать 5 мл LB, содержащий 100 мкг/мл ампициллин с выбранными клонами из финального раунда отбора. Кроме того, привить 5 мл LB, содержащий 100 мкг/мл ампициллин с T7 Express lysY/Iq E. coli преобразован с pBAD-BirA-eCPX-AP, который будет использоваться в качестве положительного контроля для западного помок, описанный ниже.
- Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 200 об/мин.
- Сделать заморозить запасы 850 л каждой ночной культуры, добавив глицерол до окончательной концентрации 15% к культуре. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
- Прививать 5 мл LB, содержащий 100 мкг/мл ампициллин с 100 злиц ночной культуры и инкубировать при 37 градусах Цельсия с тряской при 200 об/мин в течение 2 ч.
- Извлеките плазмидную ДНК из оставшейся культуры 4 мл с помощью комплекта для экстракции ДНК, который на коммерческой основе будет мини-подготовить. Выполните последовательность ДНК в передних и обратных направлениях вариантов BirA с помощью праймеров pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) и pTrcHis rev (CTTCTCTCTCTGATTAATCTG).
- Добавьте 0,2% ж/v L-arabinose и 100 МКм IPTG и 100 мкм биотин в культуры от шага 5.4 и встряхните культуру при 200 об/мин в течение 1 ч при 37 градусах По Цельсия, чтобы вызвать выражение вариантов eCPX и BirA.
- Передача 65 л культуры в трубки 1,5 мл, содержащие 25 л буфера погрузки образца и 10 л редуктора.
- Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
- Загрузите образец (включая положительный контроль) на 12% SDS-полиакриламид гель вместе с маркером размера и выполнять гель электрофорезаз при 200 V в течение примерно 45 минут до 20, 25 и 37 kDa стандартные полосы четко разделены.
- Отпустите гель из кассеты и соберите сэндвич для проникания геля на мембрану PVDF.
- Электроблот при 35 В на 2 ч на льду.
- Удалите мембрану PVDF и инкубировать в блокирующем буфере «PBS, 0.05% Tween-20, 3% Обезжиренный сухой молоко» в течение 1 ч при комнатной температуре с тряской.
- Подготовьте раствор обнаружения биотина путем разбавления стрептавидина-HRP 1:1,000 в PBST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий буфер содержит биотин и поэтому не должен использоваться в качестве буфера разбавления для стрептавидина-HRP. - Откажитесь от блокирующего буфера, быстро промойте мембрану в PBST (PBS, 0.05% Tween-20) и добавьте раствор обнаружения биотина. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре с тряской.
- Откажитесь от раствора обнаружения биотина и тщательно промойте мембрану в PBST в течение 5 минут дважды и 10 мин один раз с нежной тряской при комнатной температуре.
- Откажитесь от PBST, добавьте смесь 2 мл ECL и инкубировать в течение 1 мин с встряхиванием.
- Высушите мембрану быстро на бумаге ткани и разработайте изображение на рентгеновской пленке или в цифровой системе визуализации геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: В полосе, загруженной положительным контролем, должны быть хорошо видны две различные полосы стрептавидина-реакции: биоинжинилатая эндогенно выраженная белка 30 kDa и диапазон 22 kDa eCXP-AP. Если 10 выбранных колоний могут биотинилат отображаемый пептид, полоса на 22 kDa должна быть видна. Интенсивность этих полос, как правило, ниже, чем положительный контроль и, следовательно, может потребовать более длительного времени воздействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Западный пятно pBAD-BirA-eCPX-AP, выражающие бактерии, производит стрептавидин-реакционную полосу в соответствии с молекулярным весом eCPX(Рисунок 2a). В отличие от BirA-6xHis, биотинилаповые eCPX-AP присутствовал как в неиндуцированных и индуцированных культур (Рисунок 2)из-за небольшой степени t7 промоутер деятельности даже в неиндуцированных культур и последующего биотиниляции AP эндогенных BirA. В BirA-eCPX-AP (K10A), выражающих культуры, не было обнаружено биотинилатированной полосы eCPX(рисунок 2a). Сильная поверхностная биоинлиниляция в eCPX-AP, выражающая бактерии, вызывает агрегацию при добавлении стрептавидидов магнитных бусинов и образовании гранул ы на дне трубки(рисунок 2b). В eCPX-AP (K10A) экспрессии бактерий, стрептавидин-бис агрегации и осадков не наблюдалось(рисунок 2b). Анализ осадка от стрептавидина выдвиженца, отображает четкие 22-kDa стрептавидин-реакции и анти-6xHis полоса в образцах из eCPX-AP культур, но не eCPX-AP (K10A) культур (Рисунок 2с). Аналогичным образом, количество бактерий, связанных с стрептавидин-бусы был значительно выше в eCPX-AP, чем eCPX-AP (K10A) культур (Рисунок 2d).
Чтобы выбрать для BirA варианты, которые биотинилат целевой пептид, его последовательность ДНК была включена в C-терминал eCPX пЦР с помощью праймеров, разработанных в шаге 1.10 и 1.11. Пример грунтовок, предназначенных для включения пептидной последовательности, полученной из канала эпителиального Naq (ENaC), показан на рисунке 3a. После ПЦР, 5-L aliquot был проанализирован агарозным гелем электрофорезом и была замечена четкая и сильная полоса на уровне 5900 б.п.(рисунок 3b).
После создания библиотеки мутаций BirA был начат выбор активных вариантов BirA. Низкая степень стрептавидина связаны против входных бактерий, как ожидается, после первого раунда отбора. Тем не менее, после2-го и3-го раундов отбора было отмечено явное обогащение в степени стрептавидидных бактерий Рисунок 4a). Если четкое обогащение не обнаружено(рисунок 4b),это свидетельствует о неспособности вариантов BirA биотинилат пептид и другой пептидной последовательности должны, следовательно, быть проверены.
После финального раунда отбора, 10 клонов были охарактеризованы западной blotting за их способность биотинилат отображаемый пептид(Рисунок 4c). В положительном контроле (т.е. AP) полоса 22 kDa, соответствующая биоинтинилату eCPX-AP, была замечена в западной промокнении, исследуемой стрептавидином-HRP(рисунок 4c). В испытанных клонах полоса аналогичного размера была показательна биотиниляции отображаемого пептида, слитого с eCPX(рисунок 4с). Интенсивность полос ы 22 kDa была ниже, чем интенсивность диапазона eCPX-AP в положительном контроле, что указывает на более низкую активность изолированных вариантов BirA. Таким образом, изолированные клоны могут быть использованы в качестве шаблона для очередного раунда мутаций и отбора, что дает высокоактивные клоны. Дополнительные полосы указывают на то, что изолированные клоны не были специфичны по отношению к отображаемому пептиду, и что дополнительные цели были также биотиниланированы(рисунок 4с).
| Реагента | объем (КЛ) |
| 5x Реакция буфера | 4 |
| 10 мМ dNTP | 0.4 |
| 10 мкм Вперед Праймер | 1 |
| 10 мкм Обратный праймер | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Переменный (25 нг) |
| Высоковерной ДНК полимераза | 0.20 |
| Безобесная вода | до 20 |
Таблица 1: РЦП реагенты. Единицы и объемы могут варьироваться между производителями.
| Реагента | объем (КЛ) |
| 2x Ферментная смесь | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP с последовательность пептида-мишени | Переменный (50 нг) |
| Мутант мегапремьер | 250 нг |
| Буфера | 3 |
| Безобесная вода | до 50 |
Таблица 2: Реагенты ПЦР, подверженные ошибкам. Единицы и объемы могут варьироваться между производителями. подготовлено в разделе 1 протокола.
Рисунок 1: Бактериальная система отображения для выбора BirA. ()Система была основана на со-выражении 2 компонентов: BirA и eCPX сливается с пептидом принимает (AP). eCPX транспортируется на поверхность, и, если вариант BirA биотинилатирует AP, на поверхности отображается биотин (красный B), прикрепленный к eCPX-AP. (b) Система была выражена от плазмида pBAD-BirA-eCPX-AP, где выражение BirA контролируется арабинос-индуцируемым промоутером и выражением eCPX-AP управляется промоутером T7. (c)После создания случайно мутировавшей библиотеки вариантов BirA (шаг 1), выражение BirA и eCPX-AP было индуцировано (шаг 2). Бактерии были инкубированы сродством реагента (шаг 3), несвязанные бактерии были отброшены (шаг 4) и отдельные бактерии были усилены (шаг 5). Эта цифра была изменена из Granh'j и др.9Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель результаты выбора модели с pBAD-BirA-eCPX-AP и pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A). ()По западной blotting, eCPX-AP было отмечено, что биотинилаты в неиндуцированных и индуцированных бактерий, в то время как биотинилация eCPX-AP (K10A) была обнаружена даже после индукции BirA. Выражение BirA было обнаружено анти-6xHis антитела. Указывает на неспецифический стрептавидин-реагирующий белок, когда BirA был индуцирован. (b)Бактериальные культуры с индуцированной экспрессией BirA и eCPX-AP быстро агрегатпосле после добавления магнитных стрептавидин-бусы (стрелка), в то время как агрегация не наблюдалась в бактериях AP (K10A). (c)BirA присутствовал в бактериях, выражающих eCPX-AP и eCPX-AP (K10A) до того, как стрептавидин-вытягивание (вход), но только BirA в eCPX-AP, выражающие бактерии, были снесены стрептавидином. В согласии,(d) жизнеспособные бактерии были осаждены эффективными в eCPX-AP, но не eCPX-AP (K10A), выражая бактерии. Эта цифра была изменена из Granh'j и др.9Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Дизайн праймера и включение последовательности цепного кодирования в pBAD-BirA-eCPX-AP по ПЦР. () Пример дизайна праймеров, используемых для включения пептидной последовательности, полученной из ЗЭНАК в C-терминал eCPX. Биотин, принимающий лизин, показан красным цветом. Целевая пептидная последовательность была обратно переведена на ДНК, а передние и обратные грунтовки были разработаны путем обеспечения перекрытия базы в 15 фунтов между грунтовщиками. (b) Представитель агарозный гель электрофорекс ПЦР с pBAD-BirA-eCPX-AP в качестве шаблона и праймеров, специфичендля для конъюнктуры пептида, соответственно. Четкий и сильный продукт ДНК на 5900 bp указывает на успешный ПЦР. "М" указывает маркерную полосу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель результаты отбора и характеристики бактерий, отображающих пептиды. Бактерии, демонстрирующие пептид, полученный из(a) TagRFP показал четкое обогащение после 3 раундов отбора, в то время как пептид, полученный из (b) EGFP не показал обогащения стрептавидина связанных бактерий даже после 4 раундов отбора. (c) 10 клонов бактерий, демонстрирующих пептид от ЗенаК через 5 отборочных раундов были протестированы на их способность биотинилатировать ЗЕНАК-пептид. Все 10 клонов показали стрептавидин-реакционную полосу в соответствии с размером eCPX-AP, указывая, что изолированные клоны содержат варианты BirA, которые биотинилат отображаемый пептид. Были также замечены дополнительные стрептавидин-реакционные полосы, указывающие на то, что другие белки, помимо отображаемого пептида, также были биоинтинилатизированы. Указывает на эндогенный белок E. coli, биоинтиниляционный BirA. Эта цифра была изменена из Granh'j и др.9Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Что касается всех методов отбора, строгость стирки шагов имеет первостепенное значение. Так как бактерии не должны быть eluted от бисера до усиления выбранных клонов, высокое сродство связывания между биотином и стрептавидин может быть использован вместо использования нижней сродности алзинины, как ранее сделано с фагой дисплей системы, для выбор вариантов BirA7,8. Это гарантирует, что редкие клоны выбраны и что не биотининатилированные бактерии отбрасываются. Еще одним преимуществом использования бактериального дисплея, по сравнению с фаговым дисплеем, является то, что бактериальный дисплей является количественным11 и, следовательно, позволяет для выбора бактерий на основе ферментатической активности.
В протоколе мы использовали MACS для выбора бактерий, создающих двоичную систему отбора, основанную на наличии или отсутствии биотина на поверхности. Однако, с помощью количественной флуоресценции активированной сортировки клеток, вместо этого, следует возможность выбрать для бактерий, которые выражают наиболее активные варианты BirA. Это будет важно в будущем разработке новых вариантов BirA, так как позволит эффективно подбирать наиболее активные варианты BirA.
Мы до сих пор использовали бактериальный дисплей 14 различных пептидов и, из них, 13 производится четкое обогащение9, указывая, что наша система отбора обеспечивает надежный метод, чтобы выбрать для романа Варианты BirA. В текущей установке мы только протестировали выбор вариантов BirA, которые активны к 15-аминокислотным пептидам и, таким образом, мы преимущественно отобраны для вариантов BirA, которые активны к первичной последовательности целевого белка. Целевой лизин, однако, может быть похоронен внутри 3D-структуры белка или не быть иначе доступными для BirA, что дает варианты BirA, которые не активны против их целевого белка. Потенциальным решением было бы отображение более крупного фрагмента белка на eCPX. Эшафот eCPX является универсальным по отношению к пептидный дисплей11; однако, не известно, могут ли быть отображены более крупные белки.
Мы использовали систему отбора, чтобы изолировать вариант BirA, который биотиниратирует родной TagRFP9. Испытанный вариант BirA специально биотиниталированный TagRFP на целевых лизинах, но активность изолированного варианта была низкой9. Поэтому для улучшения ее деятельности следует проводить дальнейшие раунды направленной эволюции. Целевой пептид находится в C-термине TagRFP, где структурное сходство между отображаемым пептидом и белковой областью более вероятно. Биоинформатический анализ всех белков человека и мыши показывает, что 75% белков содержат один или несколько лизинв в пределах их первой и/или последней 30 аминокислот9. Таким образом, бактериальная система отображения пептидов потенциально может быть использована для изоляции активных вариантов BirA к большой части местных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Мохамеда Абдуллахи Ахмеда за помощь специалиста-технического специалиста. Эта работа была поддержана грантами Фонда Лундбека, Фонда Ново Нордиска, Датской ассоциации почек, Фонда Аасе ог. Эйнара Даниэлсена, Фонда А.П. Мюллера по развитию медицинской науки, а также Кнуда и Эдит Эриксен Мемориальный фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
