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Immunology and Infection

उपन्यास Biotinylating एंजाइमों के चयन के लिए बैक्टीरियल पेप्टाइड प्रदर्शन

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60266
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Nephrology, Odense University Hospital

Summary

यहाँ हम ई कोलाई बायोटिन-प्रोटीन लिगास बीरा के उपन्यास वेरिएंट के लिए चयन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो बायोटिनलेट एक विशिष्ट लक्ष्य पेप्टाइड को पेश करता है। प्रोटोकॉल लक्ष्य पेप्टाइड के जीवाणु प्रदर्शन के लिए एक प्लाज्मिड के निर्माण का वर्णन करता है, एक BirA पुस्तकालय की पीढ़ी, चयन और BirA वेरिएंट की विशेषता.

Abstract

Biotin प्रोटीन के एक आकर्षक पोस्ट-अनुवाद संशोधन है कि अलगाव और प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली टैग प्रदान करता है. ई. कोलाई बायोटिन-प्रोटीन लिगास बीरा द्वारा एंजाइमी बायोटिनिलेशन अत्यधिक विशिष्ट है और अपने मूल वातावरण में लक्ष्य प्रोटीन के biotinylation के लिए अनुमति देता है; हालांकि, BirA मध्यस्थता biotinylation के वर्तमान उपयोग लक्ष्य प्रोटीन में एक सिंथेटिक स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) की उपस्थिति की आवश्यकता है. इसलिए, इसके आवेदन एपी को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि प्रोटीन के लिए सीमित है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक असंशोधित लक्ष्य प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड के जीवाणु प्रदर्शन का उपयोग करने के लिए BirA वेरिएंट है कि biotinylates पेप्टाइड के लिए चयन करने के लिए है. प्रणाली एक एकल प्लाज्मिड पर आधारित है जो बैक्टीरिया की सतह पर पेप्टाइड प्रदर्शन के लिए पाड़ के साथ-साथ BirA वेरिएंट के सह-अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल प्रदर्शन पाड़ में लक्ष्य पेप्टाइड के समावेश के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है, BirA पुस्तकालय के निर्माण, सक्रिय BirA वेरिएंट का चयन और अलग BirA वेरिएंट के प्रारंभिक लक्षण. विधि उपन्यास BirA वेरिएंट है कि biotin प्रोटीन ligases के आगे निर्देशित विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि biotinylate जटिल समाधान में एक देशी प्रोटीन के अलगाव के लिए एक अत्यधिक प्रभावी चयन प्रणाली प्रदान करता है.

Introduction

एक प्रोटीन के Biotinylation अपनी आत्मीयता अलगाव और पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली टैग बनाता है. एंजाइमी प्रोटीन बायोटिनिलेशन बायोटिन प्रोटीन लिगैस द्वारा उत्प्रेरित एक अत्यधिक विशिष्ट पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है। ई. कोलाई बायोटिन प्रोटीन लिगासे बिरा अत्यंत विशिष्ट और सहसंयोजक रूप से बायोटिनलेट केवल विशिष्ट lysine अवशेषों1पर स्वाभाविक रूप से होने वाली प्रोटीन की एक प्रतिबंधित संख्या है। BirA उत्प्रेरित biotinylation के लाभ वर्तमान में एक छोटे से सिंथेटिक 15-एमिनो-एसिड बायोटिन स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) है कि प्रभावी रूप से biotinylated2 है और अत्यधिक विशिष्ट के लिए अनुमति देता है के साथ लक्ष्य प्रोटीन fusing द्वारा उपयोग कर रहे हैं और अत्यधिक विशिष्ट और के लिए अनुमति देता है विवो में कुशल और सह-अभिव्यक्ति या बीरए 3,4,5के अलावा द्वारा इन विट्रो बायोटिनिलेशन में । हालांकि इन विवो और इन विट्रो BirA उत्प्रेरित बायोटिन प्रोटीन लिगेशन एक आकर्षक लेबलिंग रणनीति है, इसके आवेदन के नमूने है कि एपी-फ्यूजप्रोटीन होते हैं करने के लिए सीमित है। इस विधि का उद्देश्य बायोटिन प्रोटीन ligases के नए म्यूटेंट का विकास है जो चुनिंदा biotinylate देशी असंशोधित प्रोटीन और, जिससे अनुप्रयोगों की संख्या का विस्तार जिसमें एंजाइमी biotinylation रणनीति इस्तेमाल किया जा सकता है.

प्रोटीन समारोह जीन उत्परिवर्तन, चयन, और वांछित समारोह के साथ जीन वेरिएंट के प्रवर्धन के पुनरावर्ती दौर के माध्यम से विकसित किया जा सकता है. एक मजबूत और कुशल चयन रणनीति निर्देशित विकास के लिए महत्वपूर्ण है और बायोटिन प्रोटीन लिगेस गतिविधि आसानी से बायोटिन और स्ट्रेप्टाविडिन और उसके समलॉग6के बीच मजबूत बंधन के कारण चुना जाता है। फैग प्रदर्शन प्रौद्योगिकियों phages के चयन के लिए अनुमति देते हैं कि biotinylated पेप्टाइड्स7,8प्रदर्शित करते हैं . चूंकि अलग phages के प्रवर्धन के लिए एक जीवाणु मेजबान के संक्रमण की आवश्यकता होती है, हालांकि, स्ट्रेप्टाविडिन के साथ फैज चयन में एक बाधा पैदा करता है जिसमें बायोटिन के स्ट्रेपविडिन के लिए उच्च-एफ़िनिटी बाइंडिंग गैर-डेनिंग के तहत लगभग अपरिवर्तनीय है शर्तों. biotinylated phages के प्रतिवर्ती बंधन सुनिश्चित करने के लिए, कम आत्मीयता के साथ monomeric avidins का उपयोग किया गया जिसके परिणामस्वरूप एक मामूली $ 10 गुना संवर्धन7. हमने हाल ही में उपन्यास बीरा रूपों के अलगाव के लिए एक जीवाणु प्रदर्शन विधि विकसित की है जो आत्मीयता मैट्रिक्स से अधिक्युशन की आवश्यकता को समाप्त करती है और इस प्रकार पिछले बीरा चयन प्रणालियों9से एक अवरोध को दूर करती है . वास्तव में, हमारे जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली एक एकल चयन चरण9में सक्रिय क्लोन के एक gt;1,000,000 गुना संवर्धन के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार उपन्यास BirA वेरिएंट के निर्देशित विकास के लिए एक प्रभावी चयन प्रणाली प्रदान.

हमारे जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली दो घटकों के होते हैं, एक सी-टर्मिनल 6xHis टैग और एक पाड़ प्रोटीन है कि एक लक्ष्य पेप्टाइड की सतह प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है के साथ BirA. हम पाड़ प्रोटीन बढ़ाया परिपत्र permuted बाहरी झिल्ली प्रोटीन एक्स (eCPX) के बाद से पेप्टाइड्स के प्रभावी प्रदर्शन दोनों एन और सी termini10,11पर मनाया जा सकता है. ईसीपीएक्स के सी-टर्मिनस को टारगेट पेप्टाइड अनुक्रम का संलयन सक्रिय बीरा वेरिएंट को व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया का बायोटिनिलेशन सुनिश्चित करता है। बैक्टीरिया प्रभावी स्ट्रेप्टाविडिन चयन के लिए अनुमति देते हैं क्योंकि बायोटिनलेट पेप्टाइड अब सतह पर प्रदर्शित होता है (चित्र 1क) .

इस विधि का उद्देश्य BirA के उपन्यास वेरिएंट के लिए चयन करने के लिए है कि biotinylates पेप्टाइड दृश्यों देशी प्रोटीन में मौजूद है. इस प्रणाली को प्लाज्मिड पीबीडी-बिरा-ईसीपीएक्स-एपी पर मौजूद जीनों द्वारा एनकोडेड किया जाता है, जिसमें एक अरबन-इंसुलेबल प्रमोटर नियंत्रित बीरा (आराबैड) और एक टी 7 प्रमोटर को नियंत्रित करने वाला ईसीपीएक्स9 (चित्र 1ख) होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन 1) eCPX के सी-टर्मिनल में एक लक्ष्य प्रोटीन से व्युत्पन्न पेप्टाइड का समावेश, 2) त्रुटि-प्रवण पीसीआर द्वारा बीरा के उत्परिवर्तन पुस्तकालय का निर्माण, 3) स्ट्रेप्टाविडिन बाध्यकारी बैक्टीरिया का चयन चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (MACS), 4) बैक्टीरिया संवर्धन के परिमाणीकरण, और 5) अलग क्लोन के प्रारंभिक लक्षण.

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Protocol

1. PBAD BirA-eCPX-AP में पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम अनुक्रम की प्रविष्टि

नोट: BirA वेरिएंट है कि biotinylate एक देशी लक्ष्य प्रोटीन के लिए चयन करने के लिए, प्रोटीन प्राथमिक अनुक्रम है कि कम से कम एक lysine (कश्मीर) अवशेषों में एक 15-एमिनो एसिड पेप्टाइड अनुक्रम की पहचान करके शुरू करते हैं.

  1. अनुक्रम हेरफेर सूट12पर जाएँ.
  2. पहचान की गई 15 एमिनो एसिड पेप्टाइड अनुक्रम को फास्टा प्रारूप में इनपुट बॉक्स में पेस्ट करें और सबमिट करें दबाएँ.
  3. का चयन करें और पेप्टाइड अनुक्रम के 45 न्यूक्लिओटाइड रिवर्स अनुवाद की प्रतिलिपि बनाएँ।
  4. http://n2t.net/addgene:121907 से pBAD-BirA-eCPX-AP के लिए GenBank फ़ाइल डाउनलोड करें।
  5. एक प्लाज्मिड संपादक में फ़ाइल लोड (उदा., ApE) और, सुविधा विंडो में, नामित एपी अनुक्रम का चयन करें "AviTag (TM)".
  6. डीएनए अनुक्रम विंडो में हाइलाइट किए गए AP अनुक्रम पर राइट-क्लिक करें और प्रासंगिक मेनू में चिपकाएँ Rev-Com का चयन करें।
    नोट: eCPX की कोडन अनुक्रम रिवर्स दिशा में है और पेप्टाइड कोडन अनुक्रम, इसलिए, एक रिवर्स पूरक के रूप में चिपकाया जाना चाहिए.
  7. हाइलाइट किए गए अनुक्रम पर राइट-क्लिक करें और नई सुविधाका चयन करें.
  8. सम्मिलित किए गए अनुक्रम का वर्णनात्मक नाम जोड़ें और ठीकदबाएं.
  9. संशोधित फ़ाइल सहेजने के लिए फ़ाइल मेनू में इस रूप में सहेजें का चयन करें.
  10. पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम के रिवर्स पूरक के पिछले 30 न्यूक्लिओटाइड शामिल करने के लिए आगे प्राइमर डिजाइन और अपने 5'अंत करने के लिए प्लाज्मिड बाइंडिंग न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम (3'-GCGCGC-5') जोड़ें।
  11. पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम के रिवर्स पूरक के पहले 30 न्यूक्लिओटाइड शामिल करने के लिए रिवर्स प्राइमर डिजाइन करें और अपने 5'अंत करने के लिए प्लाज्मिड बाइंडिंग न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम (3'- CTTAATTAATTAAACGAATTCGAG-5') जोड़ें।
  12. तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों को जोड़कर एक पतली दीवारवाली PCR ट्यूब में 20 डिग्री सेल्सियस PCR प्रतिक्रिया सेट करें।
  13. ट्यूब को एक थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें और पीसीआर को 30 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक denaturing के साथ एक कार्यक्रम का उपयोग कर, 98 डिग्री सेल्सियस पर $15 s के 30 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए अंतिम विस्तार, 72 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए अंतिम विस्तार और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  14. एक $ 6 kb पीसीआर उत्पाद के प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए एक 1% agarose जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया के 5 $L चलाएँ।
    नोट: कोई PCR उत्पाद मनाया जाता है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार PCR स्थिति ऑप्टिमाइज़ करें। प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  15. पीसीआर प्रतिक्रिया में DpnI के 1 $L जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें
  16. सक्षम ई. कोलाई को 2 डिग्री सेल्सियस के साथ बदलना पीसीआर प्रतिक्रिया और Lysogenic शोरबा (एलबी)/ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  17. एक ही कॉलोनी के साथ 100 डिग्री/ 200 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट।
    नोट: कम से कम 6 कालोनियों का परीक्षण करने की सिफारिश की गई है।
  18. संस्कृति के लिए 15% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लिसरोल जोड़कर प्रत्येक रात की संस्कृति के 850 डिग्री एल के फ्रीज स्टॉक बनाओ. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  19. मिनी तैयारी डीएनए निष्कर्षण किट द्वारा शेष 4 एमएल संस्कृति से प्लाज्मिड डीएनए निकालें.
  20. T7 टर्मिनल प्राइमर (GCTAGTATGCTCAGCGG) का उपयोग कर डीएनए अनुक्रमण द्वारा पेप्टाइड कोडिंग अनुक्रम के सही डालने की पुष्टि करें।

2. एक बिरा पुस्तकालय का उत्पादन

नोट: प्रारंभिक बिरा उत्परिवर्तन पुस्तकालय (चित्र 1ग, चरण 1) त्रुटि-प्रवण पीसीआर द्वारा बनाया गया है। BirA उत्परिवर्तन पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए अन्य तरीकों के रूप में अच्छी तरह से काम करने की संभावना है.

  1. BirA-6xHis आगे (ATGAGATAACGTGCC) और रिवर्स (TCAATGATGATGATGTTT) प्राइमर के साथ उत्परिवर्ती megaprimers संश्लेषित लक्ष्य पेप्टाइड अनुक्रम के साथ pBAD-BirA-eCPX के 1 एनजी का उपयोग कर (तैयार और चरण 1.20 में पुष्टि) एक टेम्पलेट और 35 पीसीआर चक्र के रूप में निर्माता के निर्देश के अनुसार 60 डिग्री सेल्सियस के एक अनीलन तापमान के साथ।
  2. एक 984 बीपी पीसीआर उत्पाद के प्रवर्धन को सत्यापित करने के लिए एक 1% agarose जेल पर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के 5 डिग्री सेल्सियस भागो.
  3. एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर प्रवर्धन प्रतिक्रिया के शेष 45 डिग्री सेल्सियस से पीसीआर उत्पाद को शुद्ध और डीएनए उपज मात्रा निर्धारित करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें।
    नोट: एक एकल 45 डिग्री सेल्सियस प्रवर्धन प्रतिक्रिया से शुद्धि आम तौर पर एक पर्याप्त उपज पैदा करता है (gt; 250 एनजी)।
  4. सारणी 2में सूचीबद्ध अभिकर्मकों को जोड़कर पतली दीवारवाली पीसीआर ट्यूब में नमूना अभिक्रिया तैयार कीजिए।
  5. प्रतिक्रिया मिश्रण को एक थर्मल साइकिलर में स्थानांतरित करें और निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके चरण 2.3 में तैयार उत्परिवर्ती मेगाप्राइमर के साथ पीसीआर चलाएं: 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और 50 डिग्री सेल्सियस पर 25 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 50 एस और 68 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट। अभिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित की जा रही है।
  6. प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए सीधे DpnI प्रतिबंध एंजाइम के 1 डिग्री एल जोड़ें और धीरे मिश्रण.
  7. प्रतिक्रिया मिश्रण को स्पिन करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. रूपांतरण T7 एक्सप्रेस lysY / इक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के साथ 2 $L DpnI प्रतिक्रिया की.
  9. परिवर्तित कोशिकाओं के साथ 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन युक्त 100 एमएल एलबी टीका लगाएं और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  10. 15% ग्लिसरोल के साथ एलबी में रात भर की संस्कृति के 10 एमएल के साथ फ्रीजर स्टॉक करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. बैक्टीरिया का चयन व्यक्त Biotinylated पेप्टाइड

नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग में चित्र1गके चरण 2-5 को शामिल किया गया है। यह चयन प्रकिया pBAD-BirA-eCPX-AP और pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में का उपयोग कर सेटअप है कि उच्च अनुशंसा की जाती है।

  1. 1% ग्लूकोज और 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन युक्त 100 एमएल का टीका लगाने के साथ 1 एमएल बीरा लाइब्रेरी और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. रात भर की संस्कृति के 100 डिग्री एल के साथ 1% ग्लूकोज और 100 डिग्री सेल्सियस एम्फिसिलिन युक्त एलबी के 5 एमएल टीका।
  3. 2 ज और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट जब तक संस्कृति लगभग 0.5 के एक OD600 तक पहुँच ता.
  4. eCPX और BirA अभिव्यक्ति को 0.2% w/v L-arabinose, 100 $M Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) और 100 डिग्री सेल्सियस बायोटिन के साथ संस्कृति हिला और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 200 आरपीएम पर संस्कृति हिला।
  5. 5,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को हटा दें।
  6. बर्फ ठंडा पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 5 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  7. सुपरनेंट को त्याग दें और 400 डिग्री सेल्सियस बर्फ-ठंडा पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से चालू करें और बर्फ पर कोशिकाओं को स्टोर करें।
  8. पुन: निलंबित कोशिकाओं के 10 $L निकालें और एक 1.5 एमएल ट्यूब लेबल में बर्फ पर स्टोर "इनपुट".
  9. बर्फ ठंडा पीबीएस के 1 एमएल में streptavidin चुंबकीय मोती के 20 डिग्री एल धो लें और ध्यान से supernatant हटाने से पहले एक बेंच शीर्ष चुंबकीय कण विभाजक में ट्यूब जगह है।
  10. बर्फ ठंडा पीबीएस के 20 डिग्री एल में streptavidin चुंबकीय मोती को पुन: निलंबित और चरण 3.8 से resuspended कोशिकाओं के 390 डिग्री एल करने के लिए स्थानांतरण.
  11. धीरे से पाइपिंग द्वारा मिक्स और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: भंवर मत करो क्योंकि यह कोशिकाओं lyse हो सकता है. मोतियों का समूहन अक्सर बैक्टीरिया की एक उच्च बहुतायत के साथ मनाया जाता है जो बायोटिनलेटपेड प्रदर्शित करता है।
  12. एक चुंबकीय कण विभाजक में लौहचुंबकीय क्षेत्रों के साथ एक स्तंभ प्लेस और बर्फ ठंडा पीबीएस के 5 एमएल के साथ धोने।
  13. सेविका में संलग्न स्तंभ के लिए कोशिकाओं और streptavidin चुंबकीय मोती स्थानांतरण.
  14. एक बार स्तंभ जलाशय खाली है, बर्फ ठंडा पीबीएस के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए और स्तंभ बर्फ ठंडा पीबीएस की 5 एमएल की कुल मात्रा के साथ धोया गया है जब तक दोहराएँ.
  15. विभाजक से स्तंभ निकालें और इसे 1.5 एमएल ट्यूब में रखें.
  16. पिपेट 1 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस को कॉलम पर और स्तंभ के साथ आपूर्ति किए गए प्लंजर को लागू करके चुंबकीय लेबल वाली कोशिकाओं को एल्यूट करें।
  17. 1.5 एमएल ट्यूब को बेंच टॉप विभाजक में स्थानांतरित करें और 1 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ चुंबकीय लेबल वाले सेल को धोएं।
  18. "आउटपुट" लेबल वाले 1.5 एमएल ट्यूब में पुनर्निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियस को हटाने और भंडारण करने से पहले बर्फ-ठंडा पीबीएस के 1 एमएल में चुंबकीय लेबल वाली कोशिकाओं को धीरे से पुन: स्फूर्ति दें।
  19. एलबी के 100 एमएल को संयोक्ति करें जिसमें 1% ग्लूकोज और 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन चुंबकीय रूप से लेबल की गई कोशिकाओं के साथ और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  20. अगले दिन, रात भर संस्कृति के 10 एमएल का उपयोग करने के लिए 15% ग्लिसरोल के साथ LB में कोशिकाओं के साथ फ्रीजर स्टॉक बनाने के लिए और -80 डिग्री सेल्सियस और चयन के अगले दौर के लिए रात भर संस्कृति के 1 एमएल पर दुकान, यानी, कदम 3.2.
    नोट: आम तौर पर, स्ट्रेप्टाविडिन बाइंडिंग बैक्टीरिया के संवर्धन के लिए चयन के 3-5 दौर की सिफारिश की जाती है।

4. समृद्धि की मात्रा

नोट: "इनपुट" और "आउटपुट" नमूनों में लाइव बैक्टीरिया का परिमाण नमूनों के सीरियल कमजोर पड़ने की चढ़ाना और कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएफयू) के बाद की गिनती द्वारा प्रत्येक चयन दौर के बाद किया जाता है।

  1. इनपुट में 990 डिग्री सेल्सियस बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ें (चरण 3.8 से) और आउटपुट (चरण 3.18 से) नमूने और लेबल ट्यूबों "इनपुट 10-2"और "आउटपुट 10-2", क्रमशः.
  2. बनाओ 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के "इनपुट 10-2"और "आउटपुट 10-2"बर्फ ठंडा पीबीएस में नमूने 10-10 के एक अंतिम कमजोर पड़ने तक इनपुट नमूने में पहुँच गया है और 10-4 उत्पादन नमूने में.
  3. प्लेट 100 से नमूने की $L "इनपुट 10-6", "इनपुट 10-8", "इनपुट 10-10", "आउटपुट 10-2", "आउटपुट 10-3" और "आउटपुट 10-4"LB/Amp प्लेटों पर और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  4. स्पष्ट रूप से अलग कालोनियों के साथ प्लेटों पर कालोनियों की संख्या की गणना. जीवाणु सांद्रता संख्या/100 डिग्री सेल्सियस प्राप्त करने के लिए कॉलोनी गणना को कमजोर पड़ने के कारक के साथ गुणा करें।
  5. इनपुट (400 डिग्री सेल्सियस) और आउटपुट वॉल्यूम (1 एमएल) के साथ सेल सांद्रता को गुणा करके इनपुट और आउटपुट नमूनों में कुल जीवाणु गणना की गणना करें, और इनपुट सेल गणना के साथ आउटपुट को विभाजित करके संवर्धन का अनुमान लगाएं।
    नोट: एक महत्वपूर्ण संवर्धन 3-5 चयन दौर के बाद दिखाई देना चाहिए

5. चयनित BirA संस्करण की विशेषता

नोट: विशेषता पहले BirA पुस्तकालय से BirA वेरिएंट का चयन करने के बाद किया जा सकता है; हालांकि, BirA वेरिएंट आम तौर पर पेप्टाइड की ओर कम गतिविधि है. इसलिए, उत्परिवर्तन और चयन का एक अतिरिक्त दौर भी विशेषता से पहले किया जा सकता है. आमतौर पर, अंतिम चयन दौर से 10 क्लोन आगे की विशेषता के लिए अलग हैं.

  1. अंतिम चयन दौर से चयनित क्लोन के साथ 100 ग्राम/एमएल एम्पसिलिन युक्त 5 एमएल एलबी टीका। इसके अतिरिक्त, टी 7 एक्सप्रेस lysY/IQ ई. कोलाई के साथ 100 डिग्री/एमएल एम्पिसिलिन युक्त 5 एमएल एलबी टीका लगाना, जो नीचे वर्णित पश्चिमी दाग के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाएगा।
  2. 200 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट।
  3. संस्कृति के लिए 15% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लिसरोल जोड़कर प्रत्येक रात की संस्कृति के 850 डिग्री एल के फ्रीज स्टॉक बनाओ. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एलएलबी के 5 एमएल में 100 ग्राम/एमएल एम्पीसिलिन युक्त 100 डिग्री सेल्सियस रात की संस्कृति और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट के साथ 2 एच के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  5. व्यावसायिक रूप से मिनी तैयारी डीएनए निष्कर्षण किट द्वारा शेष 4 एमएल संस्कृति से प्लाज्मिड डीएनए निकालें। पीबीएडी (ATGCCATAGCATTTATCC) और पीटीआरसीएचआईएस रेव (सीटीसीटीजीजीसीटीटीटीटीजी) प्राइमर्स के साथ बीरा वेरिएंट के आगे और रिवर्स दिशाओं में डीएनए अनुक्रम निष्पादित करें।
  6. 0.2% w/v L-arabinose और 100 डिग्री एम IPTG और 100 डिग्री एम बायोटिन कदम 5.4 से संस्कृतियों के लिए जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 200 आरपीएम पर संस्कृति हिला eCPX और BirA वेरिएंट की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित.
  7. संस्कृति के 65 डिग्री एल को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें 25 डिग्री सेल्सियस नमूना लोडिंग बफर और अपकरने एजेंट का 10 डिग्री एल है।
  8. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  9. एक आकार मार्कर के साथ एक 12% एसडीएस-polyacrylamide जेल पर नमूना लोड और लगभग 45 मिनट के लिए 200 वी पर जेल electrophoresis प्रदर्शन जब तक 20, 25 और 37 kDa मानक बैंड स्पष्ट रूप से अलग कर रहे हैं.
  10. कैसेट से जेल रिलीज और एक PVDF झिल्ली पर जेल की blotting के लिए सैंडविच इकट्ठा.
  11. बर्फ पर 2 ज के लिए 35 ट पर इलेक्ट्रोब्लॉट।
  12. पीवीडीएफ झिल्ली निकालें और बफर को अवरुद्ध करने में इनक्यूबेट [पीबीएस, 0.05% ट्वीन-20, 3% स्किम मिल्क पाउडर] को मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए।
  13. PBST में streptavidin-HRP 1:1,000 को कम करके बायोटिन-डिटेक्शन समाधान तैयार करें।
    नोट: अवरुद्ध बफर biotin शामिल हैं और इसलिए streptavidin-HRP के लिए कमजोर पड़ने बफर के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए.
  14. अवरुद्ध बफर छोड़ें, PBST [पीबीएस, 0.05% ट्वीन-20] में तेजी से झिल्ली धोने और बायोटिन-डिटेक्शन समाधान जोड़ें। मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट।
  15. बायोटिन-डिटेक्शन समाधान को छोड़ दें और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए एक बार 5 मिनट दो बार और 10 मिनट के लिए PBST में झिल्ली को अच्छी तरह से धो लें।
  16. PBST छोड़ें, मिलाते हुए 1 मिनट के लिए 2 एमएल ईसीएल मिश्रण जोड़ें और इनक्यूबेट करें।
  17. एक ऊतक कागज पर तेजी से झिल्ली सूखी और एक एक्स-रे फिल्म पर या एक डिजिटल जेल इमेजिंग प्रणाली में छवि का विकास।
    नोट: सकारात्मक नियंत्रण के साथ भरी हुई लेन में, दो अलग streptavidin प्रतिक्रिया बैंड स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए: एक 30 kDa biotinylated अंतर्जात रूप से व्यक्त प्रोटीन और $ 22 kDa eCXP-एपी बैंड. यदि 10 चयनित कालोनियों प्रदर्शित पेप्टाइड biotinylate कर सकते हैं, $ 22 kDa पर एक बैंड दिखाई देना चाहिए. इन बैंड की तीव्रता आम तौर पर सकारात्मक नियंत्रण से कम है और हो सकता है, इसलिए, लंबे समय तक जोखिम समय की आवश्यकता होती है.

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Representative Results

पीबीएडी-बिरा-ए-सीसीपीएक्स-एपी का पश्चिमी धब्बा बैक्टीरिया व्यक्त करने से ईसीपीएक्स के आण्विक भार के अनुरूप एक $22 केडीए स्ट्रेप्टाविडिन-प्रतिक्रिया बैंड उत्पन्न होता है (चित्र 2क)। BirA-6xHis के विपरीत, biotinylated eCPX-AP दोनों प्रेरित और प्रेरित संस्कृतियों में मौजूद था (चित्र 2एक) T7 प्रमोटर गतिविधि के एक छोटे से डिग्री के कारण भी अप्रेरित संस्कृतियों में और बाद में अंतर्जात BirA द्वारा एपी के biotinylation. BirA-eCPX-AP(K10A) में संस्कृतियों को व्यक्त करने के लिए, कोई biotinylated eCPX बैंड का पता लगाया गया था (चित्र 2एक). ईसीपीएक्स-एपी में मजबूत सतह biotinylation बैक्टीरिया व्यक्त streptavidin चुंबकीय मोती के अलावा पर एकत्रीकरण का कारण बनता है और एक ट्यूब के तल पर एक गोली के गठन (चित्र 2ख) . eCPX-AP (K10A) अभिव्यक्ति बैक्टीरिया में, streptavidin-bead एकत्रीकरण और वर्षा नहीं मनाया गया था (चित्र 2ख). streptavidin पुलडाउन से वेग का विश्लेषण, एक स्पष्ट 22-kDa streptavidin-प्रतिक्रिया और विरोधी 6xHis बैंड eCPX-एपी संस्कृतियों से नमूने में प्रदर्शित करता है, लेकिन नहीं eCPX-एपी (K10A) संस्कृतियों (चित्र 2ग)। इसी प्रकार, स्ट्रेप्टाविडिन-बीड्स से बंधे बैक्टीरिया की संख्या eCPX-AP(K10A) संस्कृतियों की तुलना में काफी अधिक थी (चित्र 2घ)।

BirA वेरिएंट है कि biotinylate एक लक्ष्य पेप्टाइड के लिए चयन करने के लिए, अपने डीएनए अनुक्रम कदम 1.10 और 1.11 में डिजाइन प्राइमर का उपयोग कर पीसीआर द्वारा eCPX के सी-टर्मिनल में शामिल किया गया था। उपकला ना+ चैनल (ENAC) के उपइकाई से व्युत्पन्न पेप्टाइड अनुक्रम को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर का एक उदाहरण चित्र 3में दिखाया गयाहै। पीसीआर के बाद, एक 5-जेडएल एलिकोट का विश्लेषण एग्रोस जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा किया गया था और 5900 बीपी पर एक स्पष्ट और मजबूत बैंड मनाया गया था (चित्र 3ख)।

BirA उत्परिवर्तन पुस्तकालय की पीढ़ी के बाद, सक्रिय BirA वेरिएंट का चयन शुरू किया गया था. पहले चयन दौर के बाद स्ट्रेप्टाविडिन-बाउंड बनाम इनपुट बैक्टीरिया की कम डिग्री की उम्मीद की गई थी। तथापि, 2एन डी और 3rd चयन राउंड के बाद स्ट्रेप्टविडिन-बाउंड बैक्टीरिया चित्रा 4एकी डिग्री में एक स्पष्ट संवर्धन देखा गया था। यदि एक स्पष्ट संवर्धन का पता नहीं लगाया जाता है (चित्र 4ख), यह पेप्टाइड biotinylate करने के लिए BirA वेरिएंट की विफलता का संकेत है और एक और पेप्टाइड अनुक्रम, इसलिए, परीक्षण किया जाना चाहिए.

अंतिम चयन दौर के बाद, 10 क्लोनों को प्रदर्शित पेप्टाइड ( चित्र4ग) को बायोटिनलेट करने की क्षमता के लिए पश्चिमी सोख्ता द्वारा विशेषता दी गई थी। सकारात्मक नियंत्रण (अर्थात्, एपी) में, बायोटिनीलेटिड ईसीपीएक्स-एपी के संगत 22 केडीए बैंड को स्ट्रेप्टविडिन-एचआरपी(चित्र 4ग) के साथ जांच किए गए पश्चिमी दाग में देखा गया था। परीक्षण क्लोन में, समान आकार पर एक बैंड eCPX के लिए जुड़े प्रदर्शित पेप्टाइड के biotinylation का संकेत था (चित्र 4ग) . $22 केडीए बैंड की तीव्रता सकारात्मक नियंत्रण में eCPX-एपी बैंड की तीव्रता से कम थी, जो अलग-अलग बिरा वेरिएंट की कम गतिविधि का संकेत देती है। अलग क्लोन, इसलिए, उत्परिवर्तनों और चयन के एक और दौर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, अत्यधिक सक्रिय क्लोन उपज. अतिरिक्त बैंडों से पता चलता है कि पृथक क्लोन प्रदर्शित पेप्टाइड की ओर विशिष्ट नहीं थे और अतिरिक्त लक्ष्य भी biotinylated थे (चित्र 4ग)।

अभिकर्मक मात्रा (जेडएल)
5x प्रतिक्रिया बफर 4
10 एमएम डीएनटीपी 0.4
10 डिग्री एम फॉरवर्ड प्राइमर 1
10 डिग्री मीटर रिवर्स प्राइमर 1
पीबीएडी-बिरा-ईसीपीएक्स-एपी चर ($25 एनजी)
उच्च निष्ठा डीएनए पॉलिमरेज 0.20
Nuclease-मुक्त पानी 20 को

तालिका 1: PCR अभिकर्मकों. इकाइयों और मात्रा निर्माताओं के बीच भिन्न हो सकते हैं.

अभिकर्मक मात्रा (जेडएल)
2x एंजाइम मिश्रण 25
लक्ष्य पेप्टाइड अनुक्रम के साथ pBAD-BirA-eCPX-एपी * चर ($ 50 एनजी)
उत्परिवर्ती मेगाप्राइमर 250 एनजी
बफ़र 3
Nuclease-मुक्त पानी 50 करने के लिए

तालिका 2: त्रुटि-प्रवण PCR अभिकर्मकों। इकाइयों और मात्रा निर्माताओं के बीच भिन्न हो सकते हैं. * प्रोटोकॉल की धारा 1 में तैयार किया।

Figure 1
चित्र 1: BirA चयन के लिए जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली. (क)प्रणाली 2 घटकों के सह-अभिव्यक्ति पर आधारित थी: बीरए और ईसीपीएक्स को स्वीकारकर्ता पेप्टाइड (एपी) के साथ संबद्ध किया गया था। eCPX सतह पर ले जाया जाता है और, अगर BirA संस्करण biotinylates एपी, biotin (लाल बी) eCPX-एपी से जुड़ी सतह पर प्रदर्शित किया जाता है. (ख)यह प्रणाली प्लाज्मिड पीबीडी-बिरा-ईसीपीएक्स-एपी से व्यक्त की गई थी, जहां बीरा अभिव्यक्ति को एक अरबन-प्रेरित प्रमोटर और ईसीपीएक्स-एपी अभिव्यक्ति द्वारा नियंत्रित किया जाता है। (ग)बीरा वेरिएंट (चरण 1), बीरा और ईसीपीएक्स-एपी अभिव्यक्ति के बेतरतीब ढंग से उत्परिवर्तित पुस्तकालय की पीढ़ी के बाद प्रेरित किया गया (चरण 2)। बैक्टीरिया आत्मीयता अभिकर्मक (चरण 3) के साथ incubated थे, असीमित बैक्टीरिया (कदम 4) त्याग दिया गया और चयनित बैक्टीरिया प्रवर्धित थे (चरण 5). इस आंकड़े को Granh से संशोधित किया गया है एट अल.9कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2:pBAD-BirA-eCPX-AP और pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) के साथ मॉडल चयन से प्रतिनिधि परिणाम। (क)पश्चिमी सोख्ता द्वारा, ईसीपीएक्स-एपी को अप्रेरित और प्रेरित दोनों बैक्टीरिया में बायोटिनिनलेट पाया गया, जबकि बीरा के शामिल होने के बाद भी ईसीपीएक्स-एपी (के10ए) का कोई बायोटिनेशन नहीं पाया गया। BirA अभिव्यक्ति विरोधी 6xHis एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया गया था. * एक विशिष्ट streptavidin प्रतिक्रिया प्रोटीन इंगित करता है जब BirA प्रेरित किया गया था. (ख)चुंबकीय स्ट्रेप्टविडिन-बीड्स (तीर) के अलावा, जबकि एपी (K10A) बैक्टीरिया में कोई एकत्रीकरण नहीं देखा गया था, के बाद बीरा और ईसीपीएक्स-एपी की प्रेरित अभिव्यक्ति के साथ जीवाणु संस्कृतियों। (ग) बीरा ईसीपीएक्स-एपी और ईसीपीएक्स-एपी (के10ए) को स्ट्रेप्टविडिन-पुलडाउन (इनपुट) से पहले व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया में मौजूद थे, लेकिन ईसीपीएक्स-एपी में केवल बीरा को स्ट्रेप्टविडिन द्वारा नीचे खींच लिया गया था। समझौते में,(घ)व्यवहार्य बैक्टीरिया eCPX-एपी में प्रभावी वेग थे, लेकिन नहीं eCPX-एपी (K10A), बैक्टीरिया व्यक्त. इस आंकड़े को Granh से संशोधित किया गया है एट अल.9कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रााा्वकुलःप्राइमर डिजाइन तथा लक्ष्य पेप्टाइड कोडन अनुक्रम को पीसीआर द्वारा पीबीएडी-बिरा-ईसीपीएक्स-एपी में शामिल करना. (ं)इसीपीएक्स के सी-टर्मिनल में जेनाक से व्युत्पन्न पेप्टाइड अनुक्रम को शामिल करने के लिए प्रयुक्त प्राइमर डिजाइन का एक उदाहरण। लाइसिन स्वीकार करने वाली बायोटिन लाल रंग में दिखाई जाती है। लक्ष्य पेप्टाइड अनुक्रम डीएनए के लिए अनुवाद रिवर्स किया गया था, और आगे और रिवर्स प्राइमर प्राइमर्स के बीच एक $ 15 आधार ओवरलैप सुनिश्चित करने के द्वारा डिजाइन किए गए थे. (ख)पीबीएडी-बिरा-ईसीपीएक्स-एपी के साथ पीसीआर के प्रतिनिधि अगारोस जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस क्रमशः $ , जेड, और जेड-ईएनओसी व्युत्पन्न पेप्टाइड अनुक्रमों के लिए टेम्पलेट और प्राइमर के रूप में विशिष्ट। $ 5900 बीपी पर एक स्पष्ट और मजबूत डीएनए उत्पाद एक सफल पीसीआर का संकेत था. "एम" मार्कर लेन इंगित करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: पेप्टाइड्स प्रदर्शित बैक्टीरिया के चयन और अभिलक्षण से प्रतिनिधि परिणाम. (एक) TagRFP से व्युत्पन्न एक पेप्टाइड प्रदर्शित बैक्टीरिया 3 चयन दौर के बाद एक स्पष्ट संवर्धन दिखाया, जबकि एक पेप्टाइड से व्युत्पन्न ( (बी) EGFP 4 चयन दौर के बाद भी streptavidin बाध्य बैक्टीरिया का कोई संवर्धन दिखाया. (ग)जेडईएनओसी से पेप्टाइड को प्रदर्शित करने वाले बैक्टीरिया के 10 क्लोनों का परीक्षण किया गया ताकि वे ईईएनओसी-पेप्टाइड को बायोटिनलेट करने की क्षमता के लिए तैयार हो सके। सभी 10 क्लोन एक streptavidin-प्रतिक्रिया eCPX-एपी के आकार के साथ संगत बैंड दिखाया, यह दर्शाता है कि अलग क्लोन BirA वेरिएंट है कि biotinylate प्रदर्शित पेप्टाइड होते हैं. अतिरिक्त streptavidin प्रतिक्रिया बैंड भी मनाया गया, यह दर्शाता है कि अन्य प्रोटीन, प्रदर्शित पेप्टाइड के अलावा, भी biotinylated थे. * एक अंतर्जात ई. कोलाई प्रोटीन BirA द्वारा biotinylated इंगित करता है. इस आंकड़े को Granh से संशोधित किया गया है एट अल.9कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सभी चयन विधियों के लिए के रूप में, कपड़े धोने के चरणों की कठोरता अत्यंत महत्वपूर्ण है. चूंकि बैक्टीरिया चयनित क्लोन के प्रवर्धन से पहले मोती से eluted होने की जरूरत नहीं है, biotin और streptavidin के बीच उच्च आत्मीयता बंधन कम आत्मीयता avidins का उपयोग करने के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में पहले phage प्रदर्शन प्रणाली के साथ किया, के लिए BirA वेरिएंट 7,8का चयन . यह सुनिश्चित करता है कि दुर्लभ क्लोन का चयन कर रहे हैं और गैर biotinylated बैक्टीरिया त्याग रहे हैं. जीवाणु प्रदर्शन का उपयोग करने का एक अन्य लाभ, phage प्रदर्शन की तुलना में, यह है कि जीवाणु प्रदर्शन मात्रात्मक11 है और, इसलिए, एंजाइमी गतिविधि के आधार पर बैक्टीरिया के चयन के लिए अनुमति देता है.

प्रोटोकॉल में, हम सतह पर बायोटिन की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर एक द्विआधारी चयन प्रणाली बनाने बैक्टीरिया के लिए चयन करने के लिए एमएसी का इस्तेमाल किया। हालांकि, मात्रात्मक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग करके, इसके बजाय, बैक्टीरिया के लिए चयन करना संभव होना चाहिए जो बीरा के सबसे सक्रिय वेरिएंट को व्यक्त करते हैं। यह उपन्यास BirA वेरिएंट के भविष्य के विकास में महत्वपूर्ण होगा के रूप में यह सबसे सक्रिय BirA वेरिएंट के लिए एक प्रभावी चयन की अनुमति देगा.

हम, अब तक, 14 विभिन्न पेप्टाइड्स के जीवाणु प्रदर्शन का इस्तेमाल किया है और उन में से, 13 एक स्पष्ट संवर्धन9का उत्पादन किया, यह दर्शाता है कि हमारी चयन प्रणाली उपन्यास BirA वेरिएंट के लिए चयन करने के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करता है. वर्तमान सेटअप में, हम केवल BirA वेरिएंट है कि 15-एमिनो एसिड पेप्टाइड्स की ओर सक्रिय हैं के चयन का परीक्षण किया है और, जिससे हम वरीयता BirA वेरिएंट है कि लक्ष्य प्रोटीन के प्राथमिक अनुक्रम की दिशा में सक्रिय हैं के लिए चयनित. लक्षित lysine, तथापि, एक प्रोटीन की 3 डी संरचना के अंदर दफन किया जा सकता है या नहीं अन्यथा BirA के लिए सुलभ हो, BirA वेरिएंट है कि उनके लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ सक्रिय नहीं हैं उपज. एक संभावित समाधान eCPX पर बड़ा प्रोटीन टुकड़ा प्रदर्शित करने के लिए किया जाएगा. eCPX पाड़ पेप्टाइड प्रदर्शन11के संबंध में बहुमुखी है; हालांकि, यह पता नहीं है कि बड़े प्रोटीन प्रदर्शित किया जा सकता है.

हमने एक बिरा संस्करण को अलग करने के लिए चयन प्रणाली का उपयोग किया जो देशी TagRFP9को biotinylates करता है. परीक्षण BirA संस्करण विशेष रूप से लक्षित lysines पर biotinylated TagRFP, लेकिन अलग संस्करण की गतिविधि कम9था. इसलिए, अपनी गतिविधि में सुधार करने के लिए निर्देशित विकास के आगे दौर किया जाना चाहिए। लक्ष्य पेप्टाइड TagRFP के सी-टर्मिनस में है, जहां प्रदर्शित पेप्टाइड और प्रोटीन क्षेत्र के बीच संरचनात्मक समानता अधिक होने की संभावना है। सभी मानव और माउस प्रोटीन ों के जैव सूचनाविज्ञान विश्लेषण से पता चलता है कि प्रोटीन के 75% अपनेपहले और / इस प्रकार, पेप्टाइड्स के जीवाणु प्रदर्शन प्रणाली संभावित देशी प्रोटीन का एक बड़ा अंश की ओर सक्रिय BirA वेरिएंट को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों विशेषज्ञ तकनीशियन सहायता के लिए मोहम्मद अब्दुल्लाई अहमद धन्यवाद. यह काम Lundbeck फाउंडेशन, नोवो Nordisk फाउंडेशन, डेनिश किडनी एसोसिएशन, Aase ओग EZnar डैनियलसन फाउंडेशन, चिकित्सा विज्ञान की उन्नति के लिए ए.पी. मेलर फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और Knud और Edith एरिकसन मेमोरियल फाउंडेशन.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561033
Ampicilin Sigma-Aldrich A1593
ApE - A plasmid editor v2.0 NA NA downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Biotin Sigma-Aldrich B4501
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DPBS (10x), no calcium, no magnesium ThermoFischer Scientific 14200083
DpnI restriction enzyme New England BioLabs R0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFischer Scientific 65001
GenElute Plasmid Miniprep Kit Sigma-Aldrich PLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit Agilent Technologies 200552
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immobilon-P PVDF Membrane Millipore IPVH15150
IPTG Sigma-Aldrich I6758
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NEB 5-alpha Competent E. coli New England BioLabs C2987
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) ThermoFischer Scientific NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) ThermoFischer Scientific NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP Addgene 121907 Used a template and positive control
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) Addgene 121908 negative control
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491 For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
Skim Milk Powder Sigma-Aldrich 70166
Streptavidin-HRP Agilent Technologies P0397
T7 Express lysY/Iq Competent E. coli New England BioLabs C3013
Tryptone Millipore T9410
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Western Lightning Plus-ECL PerkinElmer NEL103001EA
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 152 निर्देशित विकास यादृच्छिक mutagenesis लेबलिंग प्रोटीन इंजीनियरिंग प्रोटीन बायोटिन लिगेज़ प्रोटीन टैग
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Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes. J. Vis. Exp. (152), e60266, doi:10.3791/60266 (2019).

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