Summary
在这里，我们提出一种方法，以选择大肠杆菌生物蛋白的倍酶BirA的新变种，生物异化特定靶肽。该协议描述了用于靶肽的细菌显示的质粒的构造、BirA库的生成、BirA变体的选择和表征。
Abstract
Biotin 是一种有吸引力的蛋白质转化后修饰，为蛋白质的分离和检测提供了强大的标签。大肠杆菌生物蛋白结合体比抗酶酶具有很强的特异性，允许在其原生环境中对靶蛋白进行生物异化;然而，目前使用BirA介导的生物小化需要在靶蛋白中存在合成接受肽（AP）。因此，其应用仅限于被设计成含有AP的蛋白质。本协议的目的是使用从未修饰的目标蛋白中提取的肽的细菌显示来选择生物仿制肽的BirA变体。该系统基于单个质粒，允许共同表达BirA变异，以及细菌表面肽显示的支架。该协议描述了将目标肽集成到显示支架中、创建 BirA 库、选择活动 BirA 变体和分离的 BirA 变体的初始特征的详细过程。该方法为分离新的BirA变体提供了一个高效的选择系统，可用于生物蛋白蛋白利气的进一步定向进化，在复杂溶液中生物适应原生蛋白。
Introduction
蛋白质的生物素化为它的亲和力分离和检测创造了一个强大的标签。酶蛋白生物异化是一种高度特异性的转化后修饰，由生物锡蛋白气化催化。大肠杆菌生物蛋白联苯比拉是极其特异性的，共价生物酸化仅在特定莱塞残留物1中产生数量有限的自然存在的蛋白质。BirA 催化生物异化的优点目前通过将靶蛋白与小型合成 15-氨基酸生物锡接受肽 （AP） 融合，该肽可有效生物异化2，并允许高度特异性和通过共同表达或添加BirA3，4，5，在体内和体外生物体内建立有效的生物体化。虽然体内和体外BirA催化生物蛋白结扎是一种有吸引力的标签策略，但其应用仅限于含有AP融合蛋白的样品。该方法的目的是开发新的生物蛋白利气突变体，选择性地对原生未改性蛋白质进行生物异化，从而扩大酶生物异化策略的应用范围。
蛋白质功能可以通过基因突变的迭代轮来进化，选择和扩增具有所需功能的基因变异。由于生物锡和链球菌蛋白及其同源性之间的强结合，一个强大而有效的选择策略对于定向进化至关重要，生物蛋白结合酶活性很容易选择。噬菌体显示技术允许选择显示生物仿菌肽7，8的噬菌体。然而，由于分离噬菌体的扩增需要细菌宿主的感染，因此，使用链球菌的噬菌体选择会产生瓶颈，因为生物锡与链球菌的高亲和力结合在非变性下几乎是不可逆的条件。为了确保生物氨酸噬菌体可逆结合，使用亲和力较低的单体性阿胶，从而获得适度的±10倍富集7。我们最近开发了一种细菌显示方法，用于分离新的BirA变体，消除了从亲和基质基质洗脱的需要，从而消除了以前的BirA选择系统9的瓶颈。事实上，我们的细菌显示系统允许在单个选择步骤9中增加1，000，000倍的活性克隆，从而为新型BirA变体的定向进化提供了一个有效的选择系统。
我们的细菌显示系统由两个部分组成，一个带有 C 端 6xHis 标签的 BirA 和一个支持目标肽的表面显示的支架蛋白。我们使用脚手架蛋白增强型循环渗透外膜蛋白X（eCPX），因为肽的有效显示可以在N-和C-termini10，11。目标肽序列与eCPX的C-终点的融合确保了表达活性BirA变异的细菌的生物素化。细菌允许有效的链球菌蛋白选择，因为生物仿当肽现在显示在表面上（图1a）。
这种方法的目的是选择在原生蛋白质中生物肽序列的生物仿菌的BirA的新变种。该系统由存在于质粒pBAD-BirA-eCPX-AP上的基因编码，其中包含控制BirA（阿拉巴德）的阿拉伯诱导启动子和控制eCPX9的T7启动子（图1b）。本协议描述了将来自靶蛋白的肽加入eCPX的C端的详细程序，2）通过容易出错的PCR创建BirA突变库，3）通过选择链球菌结合菌磁活细胞分类（MACS），4）细菌富集的定量，以及5）分离克隆的初始表征。
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Protocol
1. 在pBAD BirA-eCPX-AP中插入肽编码序列
注：要选择生物仿宗原生靶蛋白的 BirA 变体，首先在含有至少一种裂氨酸 （K） 残留物的蛋白质初级序列中识别 15-氨基酸肽序列。
- 转到序列操作套件12。
- 以 FASTA 格式将标识的 15 个氨基酸肽序列粘贴到输入框中，然后按"提交"。
- 选择并复制肽序列的45个核苷酸反向翻译。
- 从http://n2t.net/addgene:121907下载 pBAD-BirA-eCPX-AP 的 GenBank 文件。
- 在质粒编辑器（例如 ApE）中加载文件，并在功能窗口中选择指定"AviTag（TM）"的AP 序列。
- 右键单击 DNA 序列窗口中突出显示的AP 序列，并在上下文菜单中选择"粘贴 Rev-Com"。
注：eCPX的编码顺序是相反的，因此，肽编码序列应粘贴为反向补码。 - 右键单击突出显示的序列并选择"新功能"。
- 添加插入序列的描述性名称，然后按"确定"。
- 在"文件"菜单中选择"另存为"以保存修改后的文件。
- 设计前引基，包括肽编码序列反向补编的最后30个核苷酸，并将质粒结合核苷酸序列（3'-GCGGCCGCCTGC-5'）添加到其5'端。
- 设计反向引基，包括肽编码序列反向补编的前 30 个核苷酸，并将质粒结合核苷酸序列 （3' - CTTAAATATATATATATATATATATGGAG-5'） 添加到其 5' 端。
- 通过添加表 1 中列出的试剂，在薄壁 PCR 管中设置 20 μL PCR反应。
- 将管转移到热循环器上，并使用在 98°C 初始变性程序执行 PCR，在 98°C 下进行 30 秒的变性，在 98°C 下进行 30 次循环[15 秒，在 60°C 下 15 秒，在 72°C 下 3 分钟]进行 3 分钟，在 72°C 下最终延长 2 分钟，在 4°C 下保持。
- 在1%的胶凝剂上运行5μL的PCR反应，以确认+6 kb PCR产物的扩增。
注：如果未观察到 PCR 产品，则根据制造商的说明优化 PCR 条件。可以在此处暂停该协议。 - 在PCR反应中加入1μL的DpnI，并在37°C下孵育1小时
- 在合源肉汤（LB）/安培板上使用2μL的DpnI消化PCR反应和板转换合格的大肠杆菌。在37°C下孵育过夜。
- 接种5 mL LB，含有100μg/mL阿霉素，具有单一菌落。在 37°C 下孵育过夜，在 200 rpm 下摇动。
注：建议至少测试6个菌落。 - 将甘油添加到最终浓度为 15% 的培养物中，使每个隔夜培养物的冷冻库存为 850 μL。储存在-80°C。
- 通过微型制备DNA提取试剂盒从剩余的4 mL培养物中提取质粒DNA。
- 使用T7端子引物（GCTAGTTGCTCAGCGG）通过DNA测序确认肽编码序列的正确插入。
2. 生成比拉图书馆
注：初始的BirA突变库（图1c，步骤1）是由容易出错的PCR创建的。生成 BirA 突变库的其他方法也可能起作用。
- 使用 BirA-6xS 正向 （ATGAGGATAACACACGTGCC） 和反向 （TCAATATATAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtAtTTTTTTTTTTttt） 合成突变的兆基物，使用 1 ng pBAD-BirA-eCPX 与目标肽序列（在步骤 1.20 中制备和确认）作为模板和 35 PCR 周期根据制造商的指示，退火温度为60°C。
- 在1%的甘蔗凝胶上运行5μL的扩增反应，以验证984 bp PCR产物的扩增。
- 使用商用PCR纯化试剂盒从扩增反应的剩余45μL中纯化PCR产物，并使用分光光度计定量DNA收率。
注：从单个 45 μL 放大反应中纯化通常会产生足够的收率（>250 ng）。 - 加入表2所列试剂，在薄壁PCR管中制备样品反应。
- 将反应混合物转移到热循环器中，使用步骤 2.3 中制备的突变兆基器运行 PCR：95°C 时 1 分钟，95°C 时 25 周期 50 秒，60°C 时 50 秒，68°C 时运行 12 分钟。将反应储存在4°C。
- 将1μL的DpnI限制性酶直接加入扩增反应，并轻轻混合。
- 将反应混合物旋转，在37°C下孵育2小时。
- 用2μL的DpnI反应转化T7快速lysY/Iq能胜任的大肠杆菌细胞。
- 用转化的细胞接种含有100μg/mL的阿霉素的100 mL LB，并在37°C下孵育过夜，在200rpm下摇动。
- 使冷冻库存与10 mL的过夜培养在LB与15%甘油和储存在-80°C。
3. 细菌表达生物肽的选择
注：协议的这一部分涵盖了图1c的步骤2-5。强烈建议使用 pBAD-BirA-eCPX-AP 和 pBAD-BirA-eCPX-AP（K10A）作为正负对照来设置选择方法。
- 用1mL的BirA库接种含有1%葡萄糖和100μg/mL阿霉素的100 mL的LB，并在37°C下孵育过夜，在200rpm下摇动。
- 接种5 mL的LB含有1%葡萄糖和100μg/mL阿霉素，过夜培养基为100μL。
- 孵育2小时30分钟，直到培养达到约0.5的OD600。
- 诱导eCPX和BirA表达与0.2%w/v L-阿拉伯，100μM异丙基β-D-1-硫丙酮苷（IPTG）和100μM生物素，并在200rpm下摇动培养物1小时，在37°C。
- 在 5，000 x g下将培养物离心 10 分钟，并去除上清液。
- 将细胞悬浮在1mL的冰冷的PBS和离心机在5，000 x g5分钟。
- 丢弃上清液，将细胞重新悬浮在400 μL的冰冷的PBS中，并将细胞储存在冰上。
- 取出10 μL的再悬浮细胞，并储存在标有"输入"的1.5 mL管中。
- 在 1 mL 的冷型 PBS 中清洗 20 μL 的链球蛋白磁珠，并将管放入台顶磁性颗粒分离器中，然后小心地去除上清液。
- 在20μL的冷冷PBS中重新悬浮链球菌磁珠，从步骤3.8转移到390μL的再悬浮细胞。
- 通过轻轻移液混合，然后在4°C下孵育30分钟。
注：不要涡旋，因为这可能会使细胞被流。经常观察到珠子的聚集，大量细菌表现出生物仿当肽。 - 将带有铁磁性球的柱放入磁性颗粒分离器中，用 5 mL 的冷 PBS 清洗。
- 将细胞和链球菌磁珠转移到分离器中所附的柱上。
- 一旦柱储液库是空的，加入500 μL的冷冷PBS，并重复，直到柱被洗涤与总体积为5 mL的冷PBS。
- 从分离器上取下柱子，并将其放入 1.5 mL 管中。
- 将冰冷的PBS移液器1 mL移至柱上，通过应用柱塞随柱线一起提供，使磁性标记的电池洗空。
- 将 1.5 mL 管转移到台面分离器，用 1 mL 的冷型 PBS 清洗磁性标记电池。
- 在取出 10 μL 的重新悬浮液并将其储存在标有"输出"的 1.5 mL 管中之前，将磁性标记的电池轻轻重新悬浮在 1 mL 的冰冷的 PBS 中。
- 用磁性标记的细胞接种含有1%葡萄糖和100μg/mL阿霉素的100 mL的LB，并在37°C下孵育过夜，在200rpm下摇动。
- 第二天，使用10 mL的隔夜培养基，用含有15%甘油的LB细胞制作冷冻库，并储存在-80°C和1 mL的隔夜培养基，用于下一轮选择，即步骤3.2。
注：一般来说，建议3-5轮选择，以丰富链球菌结合细菌。
4. 浓缩量化
注：通过电镀样品的连续稀释和随后的菌群形成单元（CCFU）计数，在每次选择一轮后对"输入"和"输出"样品中的活细菌进行定量。
- 将 990 μL 冷型 PBS 添加到输入（从步骤 3.8）和输出（从步骤 3.18）样品中，并分别标记管"输入10-2"和"输出10-2"。
- 在冰冷的PBS中对"输入10-2"和"输出10-2"样品进行10倍的连续稀释，直到输入样品中最终稀释10-10和输出样品中达到10-4。
- "输入10-6"、"输入10-8"、"输入10-10"、"输出10-2"、"输出10-3"和LB/Amp板上的"输出10-4"样品的板100μL，在37°C下孵育过夜。
- 计算板块上具有明显分离的殖民地的菌落数。将菌落计数与稀释因子相乘，以获得细菌浓度计数/100 μL。
- 通过将细胞浓度分别与输入（400 μL）和输出体积（1 mL）相乘，计算输入和输出样本中的细菌总数，并通过将输出与输入单元计数相乘来估计富集。
注：在 3-5 个选择回合后，应可见显著富集
5. 选定 BirA 变体的特征
注：从第一个 BirA 库中选择 BirA 变体后，可以执行特征化;然而，BirA变异对肽的活性通常较低。因此，在表征之前也可以执行另一轮突变和选择。通常，从最终选择轮中分离出 10 个克隆，以便进一步表征。
- 接种5 mL LB，含有100μg/mL环西林，从最终选择轮中选定克隆。此外，用T7速成片/Iq E.大肠杆菌接种5mL LB，含有100μg/mL的阿霉素，用pBAD-BirA-eCPX-AP转化，该大肠杆菌将用作下面描述的西方斑点的正对照。
- 在 37°C 下孵育过夜，在 200 rpm 下摇动。
- 将甘油添加到最终浓度为 15% 的培养物中，使每个隔夜培养物的冷冻库存为 850 μL。储存在-80°C。
- 接种5 mL的LB，含有100μg/mL的阿霉素，100μL的过夜培养，并在37°C下孵育，在200rpm下摇动2小时。
- 通过商业微型制备DNA提取试剂盒从剩余的4 mL培养物中提取质粒DNA。使用 pBAD（ATGCCATAGATTTATATCC）和 pTrcHis rev（CTCTGCTCTTATAtATG）引物在 BirA 变型的正向和反向执行 DNA 序列。
- 从步骤 5.4 向培养物添加 0.2% 的 L-arabinose 和 100 μM IPTG 和 100 μM 生物素，并在 200 rpm 的转速下在 37°C 下摇动培养物 1 小时，以诱导 eCPX 和 BirA 变体的表达。
- 将 65 μL 的培养液转移到包含 25 μL 样品加载缓冲液和 10 μL 还原剂的 1.5 mL 管。
- 在95°C孵育5分钟。
- 将样品（包括正对照）与尺寸标记一起加载到 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，并在 200 V 下执行凝胶电泳约 45 分钟，直到 20、25 和 37 kDa 标准带明确分离。
- 从盒中取出凝胶，将三明治组装在PVDF膜上，将凝胶印迹。
- 35 V 的电布在冰上 2 小时。
- 取出PVDF膜，在阻滞缓冲液中孵育[PBS，0.05%补间-20，3%脱脂奶粉]，在室温下摇动1小时。
- 通过稀释在PBST中的链球菌-HRP 1：1，000制备生物锡检测溶液。
注：阻塞缓冲液含有生物锡，因此不应用作链球菌-HRP的稀释缓冲液。 - 丢弃阻塞缓冲液，在PBST[PBS，0.05%补间-20]中快速清洗膜，并加入生物锡检测溶液。在室温下孵育1小时，摇动。
- 丢弃生物锡检测溶液，在PBST中彻底清洗膜5分钟两次，在室温下轻轻摇动10分钟。
- 丢弃 PBST，加入 2 mL ECL 混合物，在摇动下孵育 1 分钟。
- 在纸巾上快速干燥膜，并在 X 射线胶片或数字凝胶成像系统中开发图像。
注：在装有正控制的通道中，两个不同的链球蛋白反应带应清晰可见：30 kDa 生物素化内生表达蛋白和+22 kDa eCXP-AP 波段。如果10个选定的菌落可以生物化显示的肽，一个带在+22 kDa应该是可见的。这些波段的强度通常低于正控制，因此可能需要更长的暴露时间。
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Representative Results
pBAD-BirA-eCPX-AP表达细菌的西方斑点产生一个+22 kDa链球蛋白反应带，与eCPX的分子量一致（图2a）。与BirA-6xHis不同，生物素化eCPX-AP存在于非诱导和诱导培养物中（图2a），因为即使在非诱导培养物和随后的内源性BirA对AP的生物素化中，T7促进因素活动程度很小。在比较多的-eCPX-AP（K10A）表达培养物中，未检测到生物素素eCPX带（图2a）。eCPX-AP表达细菌中的强表面生物素化在加入链球蛋白磁珠并在管底部形成颗粒后引起聚集（图2b）。在eCPX-AP（K10A）表达细菌中，未观察到链球蛋白-珠聚集和沉淀（图2b）。分析链球菌下拉的沉淀物，在eCPX-AP培养物的样本中显示明显的22kDa链球菌反应和抗6xHis带，但不包括eCPX-AP（K10A）培养基（图2c）。同样，在eCPX-AP中，与链球菌（链球蛋白）珠子结合的细菌计数明显高于eCPX-AP（K10A）培养物（图2d）。
为了选择生物素化靶肽的BirA变体，其DNA序列被PCR使用步骤1.10和1.11中设计的引体合并到eCPX的C端。图3a中所示，用于结合从上皮 Na+通道 （ENaC） 的 β-亚单位派生的肽序列的引体示例。PCR后，通过阿加辛胶电泳分析5μL等分，在+5900 bp处观察到一个清晰而强的带子（图3b）。
在生成 BirA 突变库后，开始选择活动 BirA 变体。第一轮选择后，预计会有低程度的链球菌与输入细菌。然而，在第2次和第3次选择轮后，在链球菌结合的细菌程度图4a中观察到明显的富集。如果未检测到明显的扩充（图4b），则表明BirA变异体未能对肽进行生物适应，因此应测试另一种肽序列。
经过最后一轮选择，10个克隆人的特点是西方印迹，因为他们能够生物化显示的肽（图4c）。在正对照（即AP）中，在用链球菌素-HRP探测的西部斑点中观察到与生物素化eCPX-AP对应的±22 kDa带（图4c）。在测试的克隆中，大小相似的带表示所显示的肽与eCPX的仿生化（图4c）。±22 kDa 波段的强度低于正对照中 eCPX-AP 波段的强度，表明隔离的 BirA 变体的活动较低。因此，分离的克隆可以用作另一轮突变和选择的模板，从而产生高度活跃的克隆。附加带表明分离的克隆对显示的肽没有特异性，并且其他靶点也具有生物素化（图4c）。
| 试剂 | 体积 （μL） |
| 5x 反应缓冲液 | 4 |
| 10 mM dNTP | 0.4 |
| 10 μM 正向底漆 | 1 |
| 10 μM 反向底漆 | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | 可变 （±25 纳克） |
| 高保真DNA聚合酶 | 0.20 |
| 无核酸水 | 到 20 |
表1：PCR试剂。数量和数量可能因制造商而异。
| 试剂 | 体积 （μL） |
| 2x 酶混合 | 25 |
| 带靶肽序列的pBAD-BirA-eCPX-AP* | 可变 （±50 纳克） |
| 突变兆刺激物 | 250 纳克 |
| 缓冲区 | 3 |
| 无核酸水 | 到 50 |
表2：容易出错的PCR试剂。数量和数量可能因制造商而异。* 在议定书第1节中编写。
图1：用于BirA选择的细菌显示系统。（a） 系统基于两个组分的共同表达：比抗和eCPX与接受肽（AP）融合。eCPX 被输送到表面，如果 BirA 变体对 AP 进行生物素，则附着在 eCPX-AP 上的生物素 （红色 B） 将显示在表面上。（b） 系统由质粒 pBAD-BirA-eCPX-AP 表示，其中 BirA 表达由阿拉伯诱导启动子控制，eCPX-AP 表达由 T7 启动子驱动。（c） 生成随机突变的 BirA 变体库（步骤 1）后，诱导了 BirA 和 eCPX-AP 表达式（步骤 2）。用亲和试剂（步骤3）孵育细菌，丢弃未结合的细菌（步骤4），将选定的细菌放大（步骤5）。此图已由 Granhéj 等人9中修改，请点击此处查看此图的较大版本。
图 2： 使用 pBAD-BirA-eCPX-AP 和 pBAD-BirA-eCPX-AP（K10A）选择模型的代表性结果。（a） 通过西方印迹，eCPX-AP在未诱导和诱导的细菌中被观察到生物素化，而即使在BirA诱导后，也没有检测到eCPX-AP（K10A）的生物素化。抗6xS抗体检测到比拉表达。• 指示诱导BirA时未特异性链球蛋白反应蛋白。（b） 添加磁性链球蛋白珠（箭头）后，具有诱导表达的比抗和eCPX-AP聚集的细菌培养物迅速，而AP（K10A）细菌未观察到聚集。（c） 在链球蛋白下拉（输入）之前，在表达eCPX-AP和eCPX-AP（K10A）的细菌中存在BirA，但只有eCPX-AP表达细菌中的BirA被链球菌拉下。在一致， （d） 活细菌沉淀有效在eCPX-AP， 但不是 eCPX-AP （K10A）， 表达细菌.此图已由 Granhéj 等人9中修改，请点击此处查看此图的较大版本。
图3：由PCR设计并结合目标肽编码序列到pBAD-BirA-eCPX-AP中。（a） 用于将来自βENaC的肽序列的引体设计实例纳入eCPX的C端子中。接受以酶的生物锡以红色显示。目标肽序列反向转换为DNA，通过确保引基之间的15个基重叠来设计正向和反向引基。（b） PCR的代表性抗胶胶电泳，以pBAD-BirA-eCPX-AP作为模板和底漆，分别用于β、β和β-ENaC衍生肽序列。以±5900 bp为明显而强的DNA产物表明PCR是成功的。"M"表示标记车道。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：显示肽的细菌的选择和表征具有代表性的结果。显示来自（a） TagRFP 的肽的细菌在 3 个选择轮后表现出明显的富集，而来自 （b） EGFP 的肽即使在 4 个选择轮后也没有显示链球蛋白结合的细菌富集。（c） 通过5个选择轮，对10个从βENaC中显示出肽的细菌克隆进行了检测，以检测其生物素化βENaC-肽的能力。所有 10 个克隆都显示了与 eCPX-AP 大小一致的链球蛋白反应带，表明分离的克隆包含比A变体，该变异蛋白对显示的肽进行生物素化。还观察到了额外的链球蛋白反应带，表明除显示的肽外，其他蛋白质也进行了生物月化。• 表示由 BirA 生物酸酯的内源性大肠杆菌蛋白。此图已由 Granhéj 等人9中修改，请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
对于所有选择方法，洗涤步骤的严格性至关重要。由于细菌在选定克隆的扩增之前不需要从珠子中洗脱，因此可以使用生物素和链球菌之间的高亲和力结合，而不是像以前使用噬菌体显示系统那样使用较低的亲亲性阿胶，选择比A变型7，8。这确保了稀有的克隆被选择，并且非生物仿菌被丢弃。与噬菌体显示相比，使用细菌显示的另一个优点是细菌显示是定量的 11，因此允许根据酶活性选择细菌。
在协议中，我们使用 MACS 来选择细菌，根据表面是否存在生物锡来创建二元选择系统。然而，通过使用定量荧光活化细胞排序，相反，应该可以选择表达BirA最活跃的变种的细菌。这对未来开发新的BirA变体非常重要，因为它将允许有效选择最活跃的BirA变体。
到目前为止，我们已经使用了14种不同的肽的细菌显示，其中13个产生了明显的富集9，表明我们的选择系统提供了一个强大的方法来选择新的BirA变种。在当前设置中，我们只测试了对 15 个氨基酸肽有活性的 BirA 变体的选择，因此，我们优先选择对目标蛋白初级序列有活性的 BirA 变体。然而，靶向的莱辛可以埋在蛋白质的3D结构中，或者不能为BirA提供，从而产生对其靶蛋白不活跃的BirA变异。一个潜在的解决方案是显示eCPX上较大的蛋白质片段。eCPX 支架在肽显示11方面用途广泛;然而，不知道是否更大的蛋白质可以显示。
我们使用选择系统来分离一个BirA变种，这种变异能将原生TagRFP9生物素。测试的BirA变异物在靶向的莱因上特别生物素素TagRFP，但分离变异的活性低9。因此，应进行进一步的定向进化，以改进其活动。靶肽位于TagRFP的C-终点，显示肽和蛋白质区域之间的结构相似性更可能。对所有人类和小鼠蛋白质的生物信息学分析表明，75%的蛋白质在第一和/或最后30个氨基酸9中含有一种或多个流氨酸。因此，肽的细菌显示系统可能被用来分离活性的BirA变体，以接近大部分本地蛋白质。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
提交人感谢穆罕默德·阿卜杜拉希·艾哈迈德提供专家技术员援助。这项工作得到了伦德贝克基金会、诺和诺德基金会、丹麦肾脏协会、Aase og Ejnar Danielsen基金会、A.P. Müller 医学科学促进基金会以及克努德和伊迪丝·埃里克森的资助。纪念基金会
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
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