Summary
ここでは、特定の標的ペプチドをビオチン化する大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAの新規変異体を選択する方法を提示する。プロトコルは、標的ペプチドの細菌表示のためのプラスミドの構築、BirAライブラリーの生成、BirA変異体の選択および特徴付けについて説明する。
Abstract
ビオチンは、タンパク質の単離と検出のための強力なタグを提供するタンパク質の魅力的な翻訳後修飾です。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAによる酵素生物化は非常に特異的であり、そのネイティブ環境における標的タンパク質の生体化を可能にする。しかしながら、BirA媒介バイオチリン化の現在の使用法は、標的タンパク質中の合成アクセプターペプチド(AP)の存在を必要とする。したがって、その用途は、APを含むするように設計されたタンパク質に限定される。本プロトコルの目的は、未修飾標的タンパク質に由来するペプチドの細菌表示を用い、ペプチドを生体化するBirA変異体を選択することである。システムは細菌表面のペプチド表示のための足場と共にBirA変異体の共発現を可能にする単一のプラスミドに基づいている。このプロトコルは、ターゲットペプチドをディスプレイ足場に組み込む場合の詳細な手順、BirAライブラリの作成、アクティブなBirA変異体の選択、および単離されたBirA変異体の初期特性を説明する。この方法は、複雑な溶液中で天然タンパク質を生体化するビオチンタンパク質リチウムのさらなる方向進化に使用できる新規BirA変異体の単離に対して非常に効果的な選択システムを提供する。
Introduction
タンパク質のバイオチリン化は、その親和性の単離および検出のための強力なタグを作成します。酵素タンパク質バイオチニル化は、ビオチンタンパク質リチウムによって触媒された非常に特異的な翻訳後修飾である。大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAは、非常に特異的であり、共有的に特定のリジン残剤1で天然に存在するタンパク質の制限された数のみを共有生物化する。BirA触媒バイオチニル化の利点は、現在、効果的にビオチン化された小さな合成15-アミノ酸ビオチンアクセプテイタペプチド(AP)と標的タンパク質を融合することによって利用され、非常に特異的であり、Via3,4,5の共発現または添加による生体内およびインビトロバイオチニル化の効率的な。インビボおよびインビトロBirA触媒ビオチンタンパク質ライゲーションは魅力的な標識戦略ですが、その用途はAP融合タンパク質を含むサンプルに限定されています。この方法の目的は、天然の未修飾タンパク質を選択的に生体化し、酵素生物化戦略を使用できるアプリケーションの数を拡大するビオチンタンパク質リチウムの新しい変異体の開発です。
タンパク質機能は、所望の機能を有する遺伝子変異、選択、増幅の反復ラウンドを通じて進化させることができる。強く、有効な選択戦略は、指向性進化のために重要であり、ビオチンタンパク質リガーゼ活性は、ビオチンとストレプトアビジンとそのホモログ6との間の強い結合のために容易に選択される。ファージディスプレイ技術は、バイオチニル化ペプチド7、8を表示するファージの選択を可能にします。しかし、単離されたファージの増幅は細菌宿主の感染を必要とするので、ストレプトアビジンを用いたファージ選択は、非変性下でのビオチンとストレプトアビジンの高親和性結合が事実上不可逆的であるという点でボトルネックを生み出す。条件。ビオチン化ファージの可逆結合を確実にするために、親和性の低いモノメリックアビジンが使用され、その結果、適度〜10倍の濃縮7が得られた。我々は最近、アフィニティマトリックスからの溶出の必要性を排除し、それによって以前のBirA選択システム9からボトルネックを取り除く新しいBirA変異体の単離のための細菌表示方法を開発した。実際、当社の細菌表示システムは、1回の選択ステップ9で活性クローンの>1,000,000倍の濃縮を可能にし、新規のBirA変異体の指向進化のための効果的な選択システムを提供します。
当社の細菌表示システムは、C末端6xHisタグを持つBirAと、標的ペプチドの表面表示を可能にする足場タンパク質の2つの成分で構成されています。ペプチドの有効表示はN-ターミニ10、11の両方で観察することができるので、我々は、円形に透過した外膜タンパク質X(eCPX)を増強足場タンパク質を用いた。標的ペプチド配列をeCPXのC-終位に融合させることで、活性BirA変異体を発現する細菌の生体化が保証される。細菌は、ビオチン化ペプチドが表面に表示されるようになったように効果的なストレプトアビジン選択を可能にする(図1a)。
この方法の目的は、天然タンパク質に存在するペプチド配列をビオチン化するBirAの新規変異体を選択することです。このシステムは、プラスミドpBAD-BirA-eCPX-AP上に存在する遺伝子によってコードされ、これは、アビノセ誘導性プロモーターを含むBirA(araBAD)、およびeCPX9を制御するT7プロモーター(図1b)を含む。本プロトコルは、1)標的タンパク質由来のペプチドをeCPXのC末端に組み込む場合の詳細な手順、2)エラーが起こりやすいPCRによるBirAの変異ライブラリーの作成、3)ストレプトアビジン結合細菌の選択について説明する。磁気活性化細胞選別(MACS)、4)細菌濃縮の定量化、および5)単離クローンの初期特性特性。
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Protocol
1. pBAD BirA-eCPX-APにおけるペプチド符号化シーケンシング配列の挿入
注:天然標的タンパク質を生体化するBirA変異体を選択するには、少なくとも1つのリジン(K)残剤を含むタンパク質一次配列中の15-アミノ酸ペプチド配列を同定することから始める。
- シーケンス操作スイート12に移動します。
- FASTA形式で入力ボックスに特定された15アミノ酸ペプチドシーケンスを貼り付け、[送信]を押します。
- ペプチド配列の45ヌクレオチド逆翻訳を選択してコピーする。
- http://n2t.net/addgene:121907からpBAD-BirA-eCPX-AP用のGenBankファイルをダウンロードしてください。
- プラスミドエディタ(例えば、ApE)にファイルをロードし、機能ウィンドウで「AviTag(TM)」と指定されたAPシーケンスを選択します。
- DNA シーケンス ウィンドウで強調表示されたAP シーケンスを右クリックし、コンテキスト メニューで[Rev-Com の貼り付け]を選択します。
注:eCPXのコード配列は逆方向であり、ペプチドコード配列は、したがって、逆補体として貼り付けるべきである。 - 強調表示されたシーケンスを右クリックし、[新機能]を選択します。
- 挿入されたシーケンスの説明的な名前を追加し、[OK]を押します。
- 変更したファイルを保存するには、[ファイル]メニューで [名前を付けて保存]を選択します。
- ペプチドコード配列の逆補体の最後の30ヌクレオチドを含むように前方プライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列(3'-GCGGCCGCCTGC-5')をその5'末端に加える。
- ペプチドコード配列の逆補体の最初の30ヌクレオチドを含むように逆プライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列(3'-CTTAAGTAGTTAATGATTCGAG-5')をその5'末端に加える。
- 表1に記載されている試薬を添加して、薄壁PCRチューブに20μL PCR反応を設定します。
- チューブをサーマルサイクラーに移し、初期回電を30°Cで98°C、30サイクル(98°Cで15s、60°Cで15s、72°Cで3分)のプログラムを使用してPCRを行い、72°Cで2分間の最終延長を行い、4°Cで保持します。
- 1%のアガロースゲル上でPCR反応の5μLを実行し、約6kbのPCR産物の増幅を確認します。
注:PCR 製品が観察されない場合は、製造元の指示に従って PCR 状態を最適化します。プロトコルはここで一時停止できます。 - PCR反応にDpnIの1 μLを追加し、37 °Cで1時間インキュベート
- DpnI消化PCR反応とプレートをリソジェニックブロス(LB)/Ampプレート上の2μLで大腸菌を変換します。37 °Cで一晩インキュベートします。
- 単一のコロニーで100 μg/mLアンピシリンを含む5 mL LBを接種する。200 rpmで振りながら37°Cで一晩インキュベートします。
注:少なくとも 6 つのコロニーをテストすることをお勧めします。 - グリセロールを培養に15%の最終濃度に加えて、各一晩培養量850μLの凍結ストックを作ります。-80 °C.で保存します。
- 残りの4mL培養物からプラスミドDNAをミニ調製DNA抽出キットにより抽出する。
- T7末端プライマー(GCTAGTTGCTCAGCGG)を用いたDNAシーケンシングによりペプチドコード配列の正しい挿入を確認する。
2. ビラ図書館の生成
注:初期 BirA 突然変異ライブラリー (図 1c、ステップ 1) は、エラーが発生しやすい PCR によって作成されます。BirA 変異ライブラリを生成する他の方法も同様に機能する可能性があります。
- 変異型メガプライマーをBirA-6xHisフォワード(ATGAAGGAACATGTGCCCCCC)とリバース(TCAATGGGGGGGGGGGTTTT)で、ターゲットペプチド配列(ステップ1.20で調製および確認)を使用して、ターゲットペプチド配列と35PCRサイクルを使用して、変異型メガプライマーを合成します。メーカーの指示に従って60 °Cのアニーリング温度と。
- 1%のアガロースゲル上で増幅反応の5μLを実行し、984 bp PCR製品の増幅を確認します。
- 市販のPCR精製キットを用いて増幅反応の残りの45μLからPCR生成物を精製し、分光光度計を使用してDNA収率を定量します。
注:単一の45 μL増幅反応からの精製は、一般に十分な収率(>250 ng)を生成します。 - 表2に記載の試薬を添加して薄壁PCRチューブでサンプル反応を調製する。
- 反応混合物をサーマルサイクラーに移し、次のパラメータを使用してステップ2.3で調製した変異型メガプライマーでPCRを実行します:95°Cで1分、95°Cで50sの25サイクル、60°Cで50s、68°Cで12分。反応を4°Cに保存します。
- 増幅反応に直接DpnI制限酵素の1 μLを加え、穏やかに混合します。
- 反応混合物をスピンダウンし、37°Cで2時間インキュベートします。
- DpnI反応の2μLを有するT7 Express lysY/Iq有能な大腸菌細胞を変換する。
- 100 μg/mLアンピシリンを含む100mL LBを形質転換細胞で接種し、200rpmで振盪して37°Cで一晩インキュベートします。
- 15%のグリセロールとLBの一晩培養の10 mLで冷凍ストックを作り、-80 °Cで保存します。
3. ビオチン化ペプチドを発現する細菌の選択
注:プロトコルのこの部分は、図 1cの手順 2-5 をカバーしています。選択アプローチは、pBAD-BirA-eCPX-AP と pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)を正および負のコントロールとして設定することを強くお勧めします。
- 1%のブドウ糖と100 μg/mLのアンピシリンを1mLのBirAライブラリーで含むLBの100 mLを接種し、200rpmで振って37°Cで一晩インキュベートします。
- 1%グルコースを含むLBの5 mLと100 μg/mLアンピシリンを一晩培養の100μLで接種する。
- 培養量が約0.5のOD600に達するまで2時間30分間インキュベートする。
- 0.2%w/v L-アラビノース、100 μMイソプロピルβ-D-1-チオガラクピラノサイド(IPTG)および100μMビオチンでeCPXおよびBirA発現を誘導し、37°Cで1時間200rpmで培養物を振ります。
- 5,000 x gで10分間培養を遠心分離し、上清を取り除きます。
- 氷冷PBSの1 mLで細胞を再中断し、遠心分離機を5分間5,000 x gで再濁させる。
- 上清を廃棄し、400 μLの氷冷PBSで細胞を再懸濁し、氷上に細胞を保存します。
- 再懸濁した細胞の10 μLを取り出し、「入力」とラベル付けされた1.5 mLチューブで氷の上に保存します。
- 20 μLのストレプトアビジン磁気ビーズを1mLの氷冷PBSで洗浄し、上清を慎重に除去する前に、チューブをベンチトップ磁性粒子セパレータに入れます。
- 20 μLの氷冷PBSでストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁し、ステップ3.8から再懸濁細胞の390 μLに移します。
- 穏やかにピペッティングして混ぜ、4°Cで30分間インキュベートします。
注:これは細胞をlysese可能性があるため、渦をしないでください。ビーズの凝集は、多くの場合、ビオチン化ペプチドを示す細菌の豊富さで観察される。 - 磁性磁性球を持つカラムを磁性粒子セパレータに入れ、5mLの氷冷PBSで洗浄します。
- セルセパレータに取り付けられたカラムに細胞およびストレプトアビジン磁気ビーズを移す。
- カラムリザーバが空になったら、500 μLの氷冷PBSを追加し、カラムが5mLの氷冷PBSの総体積で洗浄されるまで繰り返します。
- セパレータからカラムを取り外し、1.5 mLチューブに入れます。
- 氷冷PBSのピペット1mLをカラム上に置き、カラムに付属のプランジャーを塗布して磁気標識細胞を溶出させる。
- 1.5 mLチューブをベンチトップセパレータに移し、磁気標識セルを1mLの氷冷PBSで洗浄します。
- 磁気標識細胞を氷冷PBSの1mLで静かに再懸濁してから、「出力」とラベル付けされた1.5mLチューブに10μLのリサスペンションを取り出して保存します。
- 1%グルコースと100μg/mLアンピシリンを磁気標識細胞で100mLのLBを接種し、200rpmで振盪して37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、10mLの一晩培養を使用して、15%のグリセロールを含むLBの細胞を用いて冷凍ストックを作り、次の選択の次のラウンド、すなわちステップ3.2の夜間培養物の-80°Cと1 mLで保存します。
注:一般に、ストレプトアビジン結合細菌の濃縮には3〜5ラウンドの選択が推奨される。
4. 濃縮の定量化
注:「入力」および「出力」サンプル中の生菌の定量は、サンプルのシリアル希釈のめっきとその後のコロニー形成単位(CCF)の計数によって、各選択ラウンド後に行われます。
- 入力(ステップ3.8から)と出力(ステップ3.18から)に990 μLの氷冷PBSを追加し、チューブにそれぞれ「入力10-2」と「出力10-2」のラベルを付けます。
- 「入力10-2」および「出力10-2」サンプルを、入力サンプルで10-10の最終希釈に達するまで、氷冷PBSのサンプルを10倍の連続希釈し、出力サンプルで10-4に達する。
- 「入力10-6」、「入力10-8」、「入力10-10」、「出力10-2」、「出力10-3」、「出力10-4」からのサンプルのプレート100μLをLB/Ampプレートに、37°Cで一晩インキュベートします。
- 明確に分離されたコロニーを持つプレート上のコロニーの数をカウントします。コロニー数に希釈係数を掛けて、細菌濃度数/100 μLを得ます。
- 入力サンプルと出力サンプルの総細菌数をそれぞれ入力(400 μL)と出力体積(1mL)で乗じて計算し、入力セル数で出力を分割して濃縮を推定します。
注:重要なエンリッチメントは、3-5の選択ラウンドの後に表示される必要があります
5. 選択したBirAバリアントの特性解析
注:キャラクタライゼーションは、最初の BirA ライブラリから BirA バリアントを選択した後に実行できます。しかし、BirA変異体は、一般にペプチドに対する活性が低い。したがって、キャラクタライゼーションの前に、追加の突然変異と選択を実行することもできます。通常、最終選択ラウンドから10クローンは、さらなる特性化のために分離されます。
- 最終選択ラウンドから選択したクローンで100 μg/mLアンピシリンを含む5 mL LBを接種します。さらに、T7 Express lysY/Iq E.coliを含む100μg/mLアンピシリンを含む5mL LBをpBAD-BirA-eCPX-APで変換し、以下に説明するウェスタンブロットの陽性対照として使用します。
- 200 rpmで振りながら37°Cで一晩インキュベートします。
- グリセロールを培養に15%の最終濃度に加えて、各一晩培養量850μLの凍結ストックを作ります。-80 °C.で保存します。
- 100 μg/mLアンピシリンを含むLBの5mLを100μLの一晩培養で接種し、2時間200rpmで振盪して37°Cでインキュベートします。
- 残りの4mL培養物からプラスミドDNAを市販のミニ調製DNA抽出キットにより抽出する。pBAD(ATGCCATAGCATTTTTCC)およびpTrcHis rev(CTTCTGTGTTGTTATATTG)プライマーを持つBirA変異体の前方および逆方向にDNA配列を実行します。
- ステップ5.4から培養物に0.2%w/v L-アラビノースと100 μM IPTGおよび100 μMビオチンを加え、37°Cで1時間200rpmで培養物を振り、eCPXおよびBirA変異体の発現を誘導する。
- 培養物の65 μLを、試料装填バッファーの25μLと還元剤の10μLを含む1.5mLチューブに移す。
- 95°Cで5分間インキュベートします。
- サンプル(陽性コントロールを含む)をサイズマーカーと共に12%SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、20、25、37 kDaの標準バンドが明確に分離されるまで約45分間200Vでゲル電気泳動を行います。
- カセットからゲルを放出し、PVDF膜にゲルをブロッティングするためのサンドイッチを組み立てます。
- 氷上で2時間35Vのエレクトロブロット。
- PVDF膜を取り出し、ブロッキングバッファー[PBS,0.05%Tween-20,3%スキムミルクパウダー]を1時間振った時にインキュベートします。
- PBSTでストレプトアビジン-HRP 1:1,000を希釈してビオチン検出溶液を調製します。
注:ブロッキングバッファにはビオチンが含まれているため、ストレプトアビジン-HRPの希釈バッファーとして使用しないでください。 - ブロッキングバッファーを廃棄し、PBST[PBS,0.05%Tween-20]で速やかに膜を洗浄し、ビオチン検出溶液を添加する。室温で1時間、振り付けでインキュベートします。
- ビオチン検出液を廃棄し、室温で穏やかに振って5分間、10分間PBSTで膜を十分に洗浄します。
- PBSTを破棄し、2 mL ECLミックスを追加し、振り付けで1分間インキュベートします。
- ティッシュペーパーで素早く膜を乾燥させ、X線フィルムまたはデジタルゲルイメージングシステムで画像を開発します。
注:陽性対照を搭載したレーンでは、2つの異なる連鎖性腫瘍反応バンドが明確に見える必要があります:30 kDaビオチン化内因性発現タンパク質と〜22 kDa eCXP-APバンド。選択された10のコロニーが表示されたペプチドを生化できる場合は、〜22 kDaのバンドが見える必要があります。これらのバンドの強度は、一般に正の制御よりも低いため、より長い露光時間を必要とする場合があります。
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Representative Results
pBAD-BirA-eCPX-AP発現細菌のウェスタンブロットは、eCPXの分子量と一致する〜22 kDa連鎖性連鎖反応バンドを産生する(図2a)。BirA-6xHisとは異なり、生体化eCPX-APは、未誘導培養および誘導培養培養(図2a)の両方に存在し、未誘導培養および内因性BirAによるAPのその後のバイオチリン化においても、T7プロモーター活性が小さいためであった。培養を発現するBirA-eCPX-AP(K10A)では、ビオチン化eCPXバンドは検出されなかった(図2a)。eCPX-AP発現細菌における強い表面生物化は、ストレプトアビジン磁気ビーズを添加した際に凝集を引き起こし、チューブの底部にペレットが形成される(図2b)。eCPX-AP(K10A)発現細菌では、ストレプトアビジンビーズ凝集および沈殿は認められなかった(図2b)。ストレプトアビジンプルダウンからの沈殿物の分析は、eCPX-AP培養物からのサンプル中に明確な22-kDa連鎖性連鎖反応および抗6xHisバンドを表示するが、eCPX-AP(K10A)培養物ではない(図2c)。同様に、ストレプトアビジンビーズに結合した細菌の数は、eCPX-AP(K10A)培養よりもeCPX-APにおいて有意に高かった(図2d)。
標的ペプチドを生体化するBirA変異体を選択するために、そのDNA配列はステップ1.10および1.11で設計されたプライマーを用いてPCRによってeCPXのC末端に組み込まれた。上皮Na+チャネル(ENaC)のαサブユニットに由来するペプチド配列の組み込み用に設計されたプライマーの一例を図3に示す。PCRの後、5μLアリコートをアガロースゲル電気泳動により分析し、約5900bpで透明で強いバンドを観察した(図3b)。
BirA変異ライブラリーの生成後、アクティブなBirA変異体の選択が開始された。最初の選択ラウンドの後、低レベルのストレプトアビジン結合対入力細菌が期待された。しかしながら、2ndおよび3rd選択ラウンド後、レンサパチビン結合細菌の程度で明確な濃縮が観察された図4a)。明確な濃縮が検出されない場合(図4b)、それはペプチドおよび別のペプチド配列を生化するBirA変異体の障害を示すものであり、したがって、試験されるべきである。
最終選択ラウンドの後、10クローンは、表示されたペプチドを生化する能力のためにウェスタンブロッティングによって特徴付けられた(図4c)。陽性対照(すなわち、AP)において、ビオチン化eCPX-APに対応する〜22 kDaバンドは、ストレプトアビジン-HRP(図4c)でプローブされたウェスタンブロットで観察された。試験されたクローンにおいて、同様のサイズのバンドは、eCPXに融合した表示されたペプチドの生体化を示した(図4c)。〜22 kDaバンドの強度は、陽性対照におけるeCPX-APバンドの強度よりも低く、単離されたBirA変異体の活性が低いことを示す。したがって、分離されたクローンは、変異と選択の別のラウンドのテンプレートとして使用することができ、非常に活性なクローンを生成します。追加のバンドは、単離されたクローンが表示されたペプチドに対して特異的ではなく、追加の標的も生体化されたことを示す(図4c)。
| 試薬 | 体積 (μL) |
| 5x反応バッファー | 4 |
| 10 mM dNTP | 0.4 |
| 10 μM フォワードプライマー | 1 |
| 10 μM リバースプライマー | 1 |
| pBAD-ビラ-eCPX-AP | 変数 (~25 ng) |
| 高忠実度DNAポリメラーゼ | 0.20 |
| ヌクレスフリーウォーター | 20 まで |
表1:PCR試薬。単位と容積はメーカーによって異なる場合があります。
| 試薬 | 体積 (μL) |
| 2x酵素ミックス | 25 |
| 標的ペプチド配列を持つpBAD-BirA-eCPX-AP* | 変数 (約 50 ng) |
| ミュータントメガプライマー | 250 ng |
| バッファー | 3 |
| ヌクレスフリーウォーター | 50まで |
表 2: エラーが発生しやすい PCR 試薬。単位と容積はメーカーによって異なる場合があります。*プロトコルのセクション1で調製。
図1:BirA選択のための細菌表示システム。(a)システムは、アクセプタペプチド(AP)と融合したBirAとeCPXの2つの成分の共発現に基づいていました。eCPXは表面に輸送され、BirA変異体がAPをビオティンレートする場合、eCPX-APに付着したビオチン(赤B)が表面に表示されます。(b)このシステムは、プラスミドpBAD-BirA-eCPX-APから発現し、BirA発現はアラビノース誘導性プロモーターによって制御され、eCPX-AP式はT7プロモーターによって駆動される。(c)BirA変異体のランダムに変異したライブラリーの生成後(ステップ1)、BirAおよびeCPX-AP式が誘導された(ステップ2)。細菌をアフィニティ試薬(ステップ3)でインキュベートし、結合のない細菌を廃棄(ステップ4)し、選択した細菌を増幅した(ステップ5)。この図は Granhøj etal.9 から変更されています。
図2:pBAD-BirA-eCPX-APおよびpBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)を使用したモデル選択の代表的な結果。(a)ウェスタンブロッティングにより、eCPX-APは未誘導および誘導細菌の両方で生体化が認められたが、BirAの誘導後もeCPX-AP(K10A)の生体化は検出されなかった。BirA発現は抗6xHis抗体により検出した。*BirAが誘導されたときに非特異的な連鎖性樹脂反応タンパク質を示す。(b)磁気連鎖化ビンビーズ(矢印)を添加した後、BirAおよびeCPX-APの誘導発現を伴う細菌培養物は急速に凝集し、AP(K10A)細菌では凝集は認められなかった。(c)BirAは、eCPX-APおよびeCPX-AP(K10A)を発現する細菌中に存在し、連鎖性腫瘍を発現するeCPX-APのBirAのみがストレプトアビジンによって引き下げられた。合意では、(d)生存可能な細菌はeCPX-APで有効に沈殿したが、eCPX-AP(K10A)ではなく、細菌を発現させた。この図は Granhøj etal.9 から変更されています。
図3:PCRによるpBAD-BirA-eCPX-APへの標的ペプチドコード配列のプライマー設計と組み込み(a)αENaC由来のペプチド配列をeCPXのC末端に組み込むのに用いられるプライマー設計の一例。リジンを受け入れるビオチンは赤色で表示されます。標的ペプチド配列をDNAに逆翻訳し、前方プライマーとリバースプライマーをプライマー間で約15塩基の重なりを確保して設計した。(b)pBAD-BirA-eCPX-APを用いたPCRの代表的なアガロースゲル電気泳動は、それぞれα、β、γ-ENaC由来ペプチド配列に特異的なテンプレートおよびプライマーである。~5900 bpの明確で強力なDNA産物は、PCRの成功を示すものでした。「M」はマーカーレーンを示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ペプチドを表示する細菌の選択および特徴付けから代表的な結果を示す。(a)TagRFPに由来するペプチドを示す細菌は、3回の選択ラウンド後に明確な濃縮を示し、一方、(b)EGFP由来のペプチドは4回の選択ラウンド後もストレプトアビジン結合細菌の濃縮を示さなかった。(c)γENaCから5回の選択ラウンドを通じてペプチドを表示する細菌の10クローンを、γENaC-ペプチドを生化する能力について試験した。全10クローンは、eCPX-APの大きさと一致する連鎖アビジン反応バンドを示し、単離されたクローンには、表示されたペプチドを生体化するBirA変異体が含まれていることを示した。追加のストレプトアビジン反応バンドも観察され、表示されたペプチド以外の他のタンパク質も生体化されたことを示す。*BirAによって生体化された内因性大腸菌タンパク質を示す。この図は Granhøj etal.9 から変更されています。
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Discussion
すべての選択方法に関しては、洗浄ステップのストリンジェンシーが最も重要です。選択したクローンの増幅前にビーズから細菌を照合する必要がないため、以前にファージディスプレイシステムで行われたように、ビオチンとストレプトアビジンの間の高い親和性結合を使用することができます。BirAバリアント7、8の選択。これにより、希少なクローンが選択され、非生物化細菌が廃棄されます。細菌表示を使用するもう一つの利点は、ファージ表示と比較して、細菌表示が定量的な11であり、したがって、酵素活性に基づいて細菌の選択を可能にする。
プロトコルでは、表面上のビオチンの有無に基づいてバイナリ選択システムを作成する細菌を選択するためにMACSを使用しました。しかしながら、定量蛍光活性化細胞選別を用いることにより、代わりに、BirAの最も活性な変異体を発現する細菌を選択することが可能である。これは、最もアクティブなBirAバリアントの効果的な選択を可能にする新しいBirAバリアントの将来の開発に重要になります。
我々は、これまでに、14種類のペプチドの細菌表示を使用し、そのうちの13は、我々の選択システムが新規BirA変異体を選択するための堅牢な方法を提供することを示す明確な濃縮9を生成した。現在のセットアップでは、15-アミノ酸ペプチドに対して活性であるBirA変異体の選択のみをテストし、それによって標的タンパク質の一次配列に向かって活性であるBirA変異体に対して優先的に選択した。しかし、標的リジンは、タンパク質の3D構造の中に埋め込まれたり、BirAにアクセスできなくなったりして、標的タンパク質に対して活性でないBirA変異体を生み出すことができます。潜在的な解決策は、eCPX上でより大きなタンパク質断片を表示することです。eCPX足場は、ペプチドディスプレイ11に対して汎用性が高い。しかし、より大きなタンパク質を表示できるかどうかは不明です。
我々は、ネイティブTagRFP9を生体化するBirA変異体を分離するために選択システムを使用した。標的リジンに対して特異的に生体化したBirA変異体のBirA変異体は、単離された変異体の活性は低い9であった。したがって、その活動を改善するために、より遠い方向進化のラウンドを行う必要があります。標的ペプチドはTagRFPのC終位にあり、表示されたペプチドとタンパク質領域との構造的類似性がより高い。すべてのヒトおよびマウスタンパク質のバイオインフォマティクス分析は、タンパク質の約75%が最初および/または最後の30アミノ酸内に1つ以上のリジンを含むことを示しています9.したがって、ペプチドの細菌表示システムは、活性BirA変異体を天然タンパク質の大部分に向けて単離するために使用される可能性がある。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、専門家の技術者の支援のためにモハメド・アブドゥラヒ・アーメドに感謝します。この研究は、ルンドベック財団、ノボ・ノルディスク財団、デンマーク腎臓協会、Aase og Ejnarダニエルセン財団、A.P.モラー医学振興財団、クヌードとエディス・エリクセンからの助成金によって支援されました。記念財団
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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