Summary
Ici, nous présentons une méthode pour sélectionner pour de nouvelles variantes de la bitine-protéine E. coli ligase BirA qui biotinylates un peptide cible spécifique. Le protocole décrit la construction d'un plasmide pour l'affichage bactérien du peptide cible, la génération d'une bibliothèque BirA, la sélection et la caractérisation des variantes de BirA.
Abstract
La biotine est une modification post-traductionnelle attrayante des protéines qui fournit une étiquette puissante pour l'isolement et la détection des protéines. La biotinylation enzymatique par la ligase de biotine-protéine E. coli BirA est très spécifique et permet la biotinylation des protéines cibles dans leur environnement indigène ; cependant, l'utilisation actuelle de la biotinylation médiée par BirA nécessite la présence d'un peptide accepteur synthétique (AP) dans la protéine cible. Par conséquent, son application est limitée aux protéines qui ont été conçues pour contenir l'AP. Le but du protocole actuel est d'utiliser l'affichage bactérien d'un peptide dérivé d'une protéine cible non modifiée pour sélectionner pour les variantes de BirA qui biotinylates le peptide. Le système est basé sur un plasmide unique qui permet la co-expression des variantes BirA avec un échafaudage pour l'affichage peptide sur la surface bactérienne. Le protocole décrit une procédure détaillée pour l'incorporation du peptide cible dans l'échafaudage d'affichage, la création de la bibliothèque BirA, la sélection des variantes actives de BirA et la caractérisation initiale des variantes isolées de BirA. La méthode fournit un système de sélection très efficace pour l'isolement de nouvelles variantes BirA qui peuvent être utilisés pour l'évolution dirigée des ligases biotine-protéines qui biotinylate une protéine indigène dans des solutions complexes.
Introduction
La biotinylation d'une protéine crée une étiquette puissante pour son isolement et sa détection d'affinité. La biotinylation des protéines enzymatiques est une modification post-traduction très spécifique catalysée par des ligases biotine-protéines. La ligase de biotine-protéine E. coli BirA est extrêmement spécifique et ne biotinylates covalently qu'un nombre restreint de protéines naturelles à des résidus spécifiques de lysine1. Les avantages de la biotinylation catalysée De BirA sont actuellement exploités en fusionnant la protéine cible avec un petit peptide synthétique de biotine de biotine à 15 amino-acides (AP) qui est effectivement biotinylated2 et permet le très spécifique et biotinylation efficace in vivo et in vitro par co-expression ou ajout de BirA3,4,5. Bien que la ligature biotine-protéine catalysée in vivo et in vitro de BirA soit une stratégie d'étiquetage attrayante, son application se limite aux échantillons qui contiennent des protéines fusionnées par ap. Le but de cette méthode est le développement de nouveaux mutants de ligases biotine-protéine qui biotinylate sélectivement protéines indigènes non modifiées et, ce faisant, augmenter le nombre d'applications dans lesquelles la stratégie de biotinylation enzymatique peut être utilisé.
La fonction protéique peut être évoluée par des cycles itératifs de la mutation, de la sélection et de l'amplification des variantes génétiques avec la fonction désirée. Une stratégie de sélection forte et efficace est cruciale pour l'évolution dirigée et l'activité de ligase biotine-protéine est facilement sélectionnée en raison de la forte liaison entre la biotine et la streptavidine et ses homologs6. Les technologies d'affichage des phages permettent la sélection de phages qui présentent des peptides biotinylated7,8. Puisque l'amplification des phages isolés exige l'infection d'un hôte bactérien, cependant, la sélection de phage avec la streptavidine crée un goulot d'étranglement en ce que la liaison à haute affinité de la biotine à la streptavidine est pratiquement irréversible sous non-dénaturation Conditions. Pour assurer la liaison réversible des phages biotinylated, les avidins monomeric avec l'affinité inférieure ont été employés qui ont eu comme conséquence un modeste enrichissement de 10 fois7. Nous avons récemment développé une méthode d'affichage bactérien pour l'isolement des nouvelles variantes BirA qui élimine la nécessité de l'élution de la matrice d'affinité et élimine ainsi un goulot d'étranglement des systèmes de sélection BirA précédents9. En effet, notre système d'affichage bactérien permet un enrichissement de clones actifs en une seule étape de sélection9,offrant ainsi un système de sélection efficace pour l'évolution dirigée de nouvelles variantes de BirA.
Notre système d'affichage bactérien se compose de deux composants, BirA avec une étiquette C-terminal 6xHis et une protéine d'échafaudage qui permet l'affichage de surface d'un peptide cible. Nous avons utilisé la protéine d'échafaudage augmentée circulairement permutée protéine de membrane externe X (eCPX) puisque l'affichage efficace des peptides peut être observé à la fois à la N- et C-termini10,11. La fusion de la séquence de peptide cible au terminus C de l'eCPX assure la biotinylation des bactéries exprimant des variantes actives de BirA. Les bactéries permettent la sélection efficace de streptavidin que le peptide biotinylated affiche maintenant sur la surface (figure 1a).
Le but de cette méthode est de sélectionner pour de nouvelles variantes de BirA qui biotinylates séquences peptidiques présentes dans les protéines indigènes. Le système est encodé par des gènes présents sur le plasmique pBAD-BirA-eCPX-AP, qui contient un promoteur arabinose-inductible contrôlant BirA (araBAD), et un promoteur T7 contrôlant eCPX9 (Figure 1b). Le protocole actuel décrit la procédure détaillée pour 1) l'incorporation d'un peptide dérivé d'une protéine cible dans le C-terminal d'eCPX, 2) la création d'une bibliothèque mutationnelle de BirA par PCR sujette aux erreurs, 3) sélection de bactéries liant la streptavidine par tri cellulaire activé magnétique (MACS), 4) quantification de l'enrichissement des bactéries et 5) caractérisation initiale des clones isolés.
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Protocol
1. Insertion de peptide Coding Séquence de séquençage dans pBAD BirA-eCPX-AP
REMARQUE: Pour sélectionner pour les variantes de BirA qui biotinylate une protéine cible indigène, commencez par identifier une séquence de peptide d'acide 15-amino dans la séquence primaire de protéines qui contient au moins un résidu de lysine (K).
- Allez à la suite de manipulation de séquence12.
- Collez la séquence de peptide de 15 acides aminés identifiée dans la boîte d'entrée en format EXPRES et appuyez sur Soumettre.
- Sélectionnez et copiez la traduction inversée de 45 nucléotides de la séquence peptidique.
- Téléchargez le fichier GenBank pour pBAD-BirA-eCPX-AP à partir de http://n2t.net/addgene:121907.
- Chargez le fichier dans un éditeur plasmide (p. ex., ApE) et, dans la fenêtre de fonctionnalité, sélectionnez la séquence AP désignée « AviTag(TM) ».
- Cliquez à droite sur la séquence AP mise en surbrillance dans la fenêtre de séquence d'ADN et sélectionnez Paste Rev-Com dans le menu contextuel.
REMARQUE: La séquence de codage d'eCPX est dans la direction inverse et la séquence de codage peptidique doit, par conséquent, être collée comme un complément inverse. - Cliquez à droite sur la séquence mise en surbrillance et sélectionnez Nouvelle fonctionnalité.
- Ajoutez un nom descriptif de la séquence insérée et appuyez sur OK.
- Sélectionnez Enregistrer As dans le menu Fichier pour enregistrer le fichier modifié.
- Concevoir l'apprêt avant pour inclure les 30 derniers nucléotides du complément inverse de la séquence de codage peptidique et ajouter la séquence de nucléotide de liaison plasmide (3'-GCGGCCGCCTGC-5') à sa fin de 5'.
- Concevoir l'amorce inverse pour inclure les 30 premiers nucléotides du complément inverse de la séquence de codage peptidique et ajouter la séquence de nucléotide de liaison plasmide (3'- CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5') à sa fin de 5'.
- Configurez une réaction PCR de 20 L dans un tube PCR à parois minces en ajoutant les réactifs énumérés dans le tableau 1.
- Transférer le tube à un cycleur thermique et effectuer pcR à l'aide d'un programme avec une dénaturation initiale à 98 oC pour 30 s, 30 cycles de [15 s à 98 oC, 15 s à 60 oC et 3 min à 72 oC], extension finale de 2 min à 72 oC et maintienà 4 oC.
- Exécuter 5 ll de la réaction PCR sur un gel d'agarose de 1% pour confirmer l'amplification d'un produit PCR de 6 kb.
REMARQUE: Si aucun produit PCR n'est observé, optimisez l'état PCR selon les instructions du fabricant. Le protocole peut être mis en pause ici. - Ajouter 1 l de DpnI à la réaction PCR et couver pendant 1 h à 37 oC
- Transformez la bactérie E. coli compétente avec une réaction et une assiette de PCR digérées de DpnI sur le bouillon lysogénique (LB)/assiettes d'ampli. Incuber toute la nuit à 37 oC.
- Inoculer 5 mL lb contenant 100 ampicilline de 100 g/mL avec une seule colonie. Incuber toute la nuit à 37 oC en secouant à 200 tr/min.
REMARQUE: Il est recommandé de tester au moins 6 colonies. - Faire des stocks de congélation de 850 l de chaque culture du jour au lendemain en ajoutant du glycérol à une concentration finale de 15 % à la culture. Conserver à -80 oC.
- Extraire l'ADN plasmide de la culture restante de 4 mL par kit d'extraction d'ADN de mini-préparation.
- Confirmer l'insertion correcte de la séquence de codage peptide par séquençage de l'ADN à l'aide de l'amorce terminale T7 (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).
2. Génération d'une bibliothèque BirA
REMARQUE: La bibliothèque mutationnelle BirA initiale(figure 1c,étape 1) est créée par PCR sujette aux erreurs. D'autres méthodes pour générer la bibliothèque mutationnelle BirA sont susceptibles de fonctionner ainsi.
- Synthétiser les mégaprimeurs mutants avec BirA-6xHis forward (ATGAAGGATAACACCGTGCC) et inversement (TCAATGATGATGATGATGATGATGATGATGTTT) à l'aide de 1 ng de pBAD-BirA-eCPX avec la séquence de peptide cible (préparée et confirmée à l'étape 1.20) comme modèle et 35 cycles PCR avec une température d'annealing de 60 oC selon les instructions du fabricant.
- Exécuter 5 L de la réaction d'amplification sur un gel d'agarose de 1% pour vérifier l'amplification d'un produit PCR de 984 pb.
- Purifiez le produit PCR des 45 l restants de la réaction d'amplification à l'aide d'un kit commercial de purification PCR et utilisez un spectrophotomètre pour quantifier le rendement de l'ADN.
REMARQUE: La purification d'une seule réaction d'amplification de 45 L produit généralement un rendement suffisant (à 250 ng). - Préparer la réaction de l'échantillon dans un tube PCR à parois minces en ajoutant les réactifs énumérés dans le tableau 2.
- Transférer le mélange de réaction à un cycleur thermique et faire fonctionner le PCR avec les mégaprimeurs mutants préparés à l'étape 2.3 en utilisant les paramètres suivants : 1 min à 95 oC et 25 cycles de 50 s à 95 oC, 50 s à 60 oC et 12 min à 68 oC. Conserver la réaction à 4 oC.
- Ajouter 1 L d'enzyme de restriction DpnI directement à la réaction d'amplification et mélanger doucement.
- Faire tourner le mélange de réaction et couver pendant 2 h à 37 oC.
- Transformez les cellules E. coli t7 Express lysY/Iq compétentes avec 2 l l de la réaction DpnI.
- Inoculer 100 mL lb contenant 100 ampicilline de 100 g/mL avec les cellules transformées et incuber pendant la nuit à 37 oC en secouant à 200 tr/min.
- Faire des stocks de congélateur avec 10 ml de la culture de nuit en LB avec 15% de glycérol et stocker à -80 oC.
3. Sélection de bactéries exprimant le peptide biotinylated
REMARQUE: Cette partie du protocole couvre l'étape 2-5 de la figure 1c. Il est fortement recommandé que l'approche de sélection soit mise en place en utilisant pBAD-BirA-eCPX-AP et pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) comme contrôles positifs et négatifs.
- Inoculer 100 ml de LB contenant 1 % de glucose et 100 'g/mL d'ampicilline avec 1 ml de bibliothèque BirA et incuber pendant la nuit à 37 oC en secouant à 200 tr/min.
- Inoculer 5 ml de LB contenant 1 % de glucose et 100 ampicilline de 100 g/mL avec 100 ll de la culture du jour au lendemain.
- Incuber pendant 2 h et 30 min jusqu'à ce que la culture atteigne un OD600 d'environ 0,5.
- Induire l'expression eCPX et BirA avec 0,2% w/v L-arabinose, 100 'M Isopropyl '-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) et 100 'M biotine et secouer la culture à 200 tr/min pour 1 h à 37 'C.
- Centrifuger la culture pendant 10 min à 5 000 x g et retirer le supernatant.
- Resuspendre les cellules dans 1 ml du PBS glacé et la centrifugeuse à 5 000 x g pendant 5 min.
- Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans 400 L de PBS glacé et entreposer les cellules sur la glace.
- Enlever 10 l de cellules resuspensionets sur la glace dans un tube de 1,5 ml étiqueté « Entrée ».
- Laver 20 l de perles magnétiques streptavidin dans 1 ml de PBS glacé et placer le tube dans un séparateur de particules magnétiques supérieure de banc avant d'enlever soigneusement le supernatant.
- Resuspendre les perles magnétiques streptavidin dans 20 L de PBS glacé et transférer à la 390 L de cellules suspendues à partir de l'étape 3.8.
- Mélanger en pipetilage en douceur, puis couver pendant 30 min à 4 oC.
REMARQUE: Ne pas vortex car cela peut lyser les cellules. L'agrégation des perles est souvent observée avec une forte abondance de bactéries affichant un peptide biotinylated. - Placer une colonne avec des sphères ferromagnetic dans un séparateur de particules magnétiques et laver avec 5 ml de PBS glacé.
- Transférer les cellules et les perles magnétiques streptavidin à la colonne attachée dans le séparateur.
- Une fois que le réservoir de la colonne est vide, ajouter 500 l de PBS glacé et répéter jusqu'à ce que la colonne ait été lavée avec un volume total de 5 ml de PBS glacé.
- Retirez la colonne du séparateur et placez-la dans un tube de 1,5 ml.
- Pipette 1 ml du PBS glacé sur la colonne et éliuer les cellules étiquetées magnétiquement en appliquant le piston fourni avec la colonne.
- Transférer le tube de 1,5 ml dans un séparateur de banc et laver la cellule étiquetée magnétiquement avec 1 ml de PBS glacé.
- Resuspendre délicatement les cellules étiquetées magnétiquement dans 1 ml du PBS glacé avant d'enlever et de stocker 10 l de la suspension dans un tube de 1,5 ml étiqueté « Sortie ».
- Inoculer 100 ml de LB contenant 1 % de glucose et 100 'g/mL d'ampicilline avec les cellules étiquetées magnétiquement et incuber pendant la nuit à 37 oC en secouant à 200 tr/min.
- Le lendemain, utilisez 10 ml de la culture de la nuit pour faire des stocks de congélateur avec des cellules en LB avec 15% de glycérol et entreposez-en -80 oC et 1 ml de la culture de la nuit pour la prochaine ronde de sélection, c'est-à-dire l'étape 3.2.
REMARQUE: En général, 3-5 tours de sélection sont recommandés pour l'enrichissement des bactéries liant streptavidin.
4. Quantification de l'enrichissement
REMARQUE: La quantification des bactéries vivantes dans les échantillons d'« entrée » et de « sortie » est effectuée après chaque ronde de sélection par le placage des dilutions en série des échantillons et le comptage subséquent des unités de formation de colonies (UFC).
- Ajouter 990 l PBS glacé à l'entrée (à partir de l'étape 3.8) et à la sortie (à partir de l'étape 3.18) échantillons et étiqueter les tubes "Input 10-2"et "Output 10-2",respectivement.
- Faire des dilutions sérielles 10 fois des échantillons « Input 10-2» et « Output 10-2» dans le PBS glacé jusqu'à ce qu'une dilution finale de 10-10 soit atteinte dans l'échantillon d'entrée et de 10à 4 dans l'échantillon de sortie.
- Plaque 100 l d'échantillons de "Input 10-6", "Input 10-8", "Input 10-10", "Output 10-2", "Output 10-3" et "Output 10-4"sur LB/Amp plaques et incuber la nuit à 37 oC.
- Comptez le nombre de colonies sur les plaques avec des colonies clairement séparées. Multipliez le nombre de colonies avec le facteur de dilution pour obtenir le nombre de concentration bactérienne/100 L.
- Calculez le nombre total de bactéries dans les échantillons d'entrée et de sortie en multipliant la concentration cellulaire avec l'entrée (400 l) et le volume de sortie (1 mL), respectivement, et estimez l'enrichissement en divisant la production avec le nombre de cellules d'entrée.
REMARQUE: Un enrichissement significatif devrait être visible après 3-5 tours de sélection
5. Caractérisation de la variante BirA sélectionnée
REMARQUE: La caractérisation peut être effectuée après avoir sélectionné les variantes BirA de la première bibliothèque BirA; cependant, les variantes de BirA ont généralement une faible activité vers le peptide. Par conséquent, un cycle supplémentaire de mutation et de sélection peut également être effectué avant la caractérisation. Habituellement, 10 clones de la ronde de sélection finale sont isolés pour une caractérisation ultérieure.
- Inoculer 5 mL LB contenant 100 ampicilline de 100 g/mL avec des clones sélectionnés de la ronde de sélection finale. En outre, inoculer 5 mL LB contenant 100 'g/mL d'ampicilline avec T7 Express lysY/Iq E. coli transformé avec pBAD-BirA-eCPX-AP, qui sera utilisé comme un contrôle positif pour la tache occidentale décrite ci-dessous.
- Incuber toute la nuit à 37 oC en secouant à 200 tr/min.
- Faire des stocks de congélation de 850 l de chaque culture du jour au lendemain en ajoutant du glycérol à une concentration finale de 15 % à la culture. Conserver à -80 oC.
- Inoculer 5 ml de LB contenant 100 'g/mL d'ampicilline avec 100 oL de culture de nuit et incuber à 37 oC avec secouer à 200 tr/min pendant 2 h.
- Extraire l'ADN plasmide de la culture restante de 4 mL par s commercialement mini-préparation kit d'extraction d'ADN. Effectuez la séquence d'ADN dans les directions avant et inverse des variantes de BirA avec des amorces pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) et pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG).
- Ajoutez 0,2 % w/v L-arabinose et 100 M IPTG et 100 M de biotine aux cultures à partir de l'étape 5.4 et secouez la culture à 200 tr/min pour 1 h à 37 oC pour induire l'expression des variantes eCPX et BirA.
- Transférer 65 l de la culture dans des tubes de 1,5 ml contenant 25 l de la mémoire tampon de chargement de l'échantillon et 10 l de l'agent réductur.
- Incuber à 95 oC pendant 5 min.
- Chargez l'échantillon (y compris le contrôle positif) sur un gel SDS-polyacrylamide de 12 % avec un marqueur de taille et effectuez une électrophorèse de gel à 200 V pendant environ 45 min jusqu'à ce que les bandes standard de 20, 25 et 37 kDa soient clairement séparées.
- Relâchez le gel de la cassette et assemblez le sandwich pour le ballonnement du gel sur une membrane PVDF.
- Electroblot à 35 V pour 2 h sur glace.
- Retirez la membrane PVDF et incubez-la en bloquant le tampon [PBS, 0,05% Tween-20, 3% Poudre de lait écrémé] pendant 1 h à température ambiante avec secousses.
- Préparer la solution de détection de la biotine en diluant la streptavidine-HRP 1:1,000 en PBST.
REMARQUE: Le tampon de blocage contient de la biotine et ne doit donc pas être utilisé comme tampon de dilution pour la streptavidine-HRP. - Jetez le tampon de blocage, lavez la membrane rapidement dans PBST [PBS, 0.05% Tween-20] et ajoutez la solution de détection de biotine. Incuber pendant 1 h à température ambiante en secouant.
- Jeter la solution de détection de biotine et laver la membrane à fond en PBST pendant 5 min deux fois et 10 min une fois avec des secousses douces à température ambiante.
- Jeter le PBST, ajouter 2 mL de mélange ECL et incuber pendant 1 min en secouant.
- Séchez la membrane rapidement sur un papier de soie et développez l'image sur un film à rayons X ou dans un système d'imagerie numérique en gel.
REMARQUE: Dans la voie chargée du contrôle positif, deux bandes distinctes de réaction streptavidine doivent être clairement visibles : une protéine biotinylated de 30 kDa et la bande eCXP-AP de 22 kDa. Si les 10 colonies sélectionnées peuvent biotinylate le peptide affiché, une bande à 22 kDa doit être visible. L'intensité de ces bandes est généralement inférieure au contrôle positif et peut, par conséquent, nécessiter des temps d'exposition plus longs.
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Representative Results
La tache occidentale des bactéries exprimant pBAD-BirA-eCPX-AP produit une bande de streptavidin-réaction de 22 kDa compatible avec le poids moléculaire d'eCPX (Figure 2a). Contrairement à BirA-6xHis, l'eCPX-AP biotinylated était présent dans les cultures non induites et induites (Figure 2a) due à un petit degré d'activité de promoteur de T7 même dans les cultures non induites et à la biotinylation suivante de l'AP par BirA endogène. Dans BirA-eCPX-AP(K10A) exprimant des cultures, aucune bande eCPX biotinylated n'a été détectée (figure 2a). La forte biotinylation de surface dans les bactéries exprimant eCPX-AP provoque l'agrégation à l'ajout de perles magnétiques streptavidin et la formation d'une pastille au fond d'un tube (Figure 2b). Dans les bactéries d'expression eCPX-AP(K10A), l'agrégation et les précipitations de perles de streptavidin n'ont pas été observées (figure 2b). L'analyse du précipité de la streptavidine pulldown, affiche un clair 22-kDa streptavidin-réagir et anti-6xHis bande dans les échantillons de cultures eCPX-AP, mais pas eCPX-AP(K10A) cultures (Figure 2c). De même, le nombre de bactéries liées aux perles de streptavidin était significativement plus élevé dans les cultures eCPX-AP que dans les cultures eCPX-AP(K10A)(figure 2d).
Pour sélectionner pour les variantes BirA qui biotinylate un peptide cible, sa séquence d'ADN a été incorporée dans le C-terminal d'eCPX par PCR en utilisant les amorces conçues à l'étape 1.10 et 1.11. Un exemple des amorces conçues pour l'incorporation d'une séquence de peptides dérivée de la sous-unité de l'épithélial Na-Canal (ENaC) est montré dans la figure 3a. Après PCR, un aliquot de 5 l a été analysé par électrophorèse de gel d'agarose et une bande claire et forte à 5900 bp a été observée (figure 3b).
Après la génération de la bibliothèque de mutation de BirA, la sélection des variantes actives de BirA a été lancée. On s'attendait à un faible degré de bactéries liées à la streptavidine par rapport aux intrants après la première ronde de sélection. Cependant, après 2nd et 3rd tours de sélection un enrichissement clair a été observé dans le degré de bactéries liées à la streptavidinfigure 4a). Si un enrichissement clair n'est pas détecté (figure 4b), il est révélateur de l'échec des variantes de BirA à biotinylate le peptide et une autre séquence de peptide devrait, par conséquent, être testée.
Après la ronde de sélection finale, 10 clones ont été caractérisés par des ballonnements occidentaux pour leur capacité à biotinylate le peptide affiché (Figure 4c). Dans le contrôle positif (c.-à-d., AP), la bande de 22 kDa correspondant à l'eCPX-AP biotinylated a été observée dans une tache occidentale sondée avec streptavidin-HRP (figure 4c). Dans les clones testés, une bande de taille similaire était indicative de la biotinylation du peptide affiché fusionné à eCPX (Figure 4c). L'intensité des bandes de 22 kDa était inférieure à l'intensité de la bande eCPX-AP dans le contrôle positif, ce qui indique une activité plus faible des variantes isolées de BirA. Les clones isolés peuvent donc être utilisés comme modèle pour une autre série de mutations et de sélection, donnant des clones très actifs. D'autres bandes indiquent que les clones isolés n'étaient pas spécifiques au peptide affiché et que d'autres cibles ont également été biotinylated (figure 4c).
| réactif | volume (L) |
| Tampon de réaction 5x | 4 |
| 10 mM dNTP | 0.4 |
| 10 M Avant Amorce | 1 |
| 10 M Amorce inversée | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Variable (25 ng) |
| Polymérase d'ADN haute fidélité | 0.20 |
| Eau sans nucléane | à 20 |
Tableau 1 : réactifs PCR. Les unités et les volumes peuvent varier d'un fabricant à l'autre.
| réactif | volume (L) |
| 2x Mélange d'enzymes | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP avec séquence peptide cible | Variable (50 ng) |
| Megaprimer mutant | 250 ng |
| tampon | 3 |
| Eau sans nucléane | à 50 |
Tableau 2 : Réactifs PCR sujets aux erreurs. Les unités et les volumes peuvent varier d'un fabricant à l'autre. - préparé à la section 1 du protocole.
Figure 1: Le système d'affichage bactérien pour la sélection BirA. (a) Le système était basé sur la co-expression de 2 composants : BirA et eCPX fusionnés avec le peptide d'accepteur (AP). eCPX est transporté à la surface et, si la variante BirA biotinylates l'AP, la biotine (rouge B) attachée à l'eCPX-AP est affichée sur la surface. ( b) Le système a été exprimé à partir du plasmide pBAD-BirA-eCPX-AP, où l'expression BirA est contrôlée par un promoteur arabinose-inductible et l'expression eCPX-AP est pilotée par le promoteur T7. (c) Après la génération d'une bibliothèque mutée au hasard des variantes de BirA (étape 1), l'expression BirA et eCPX-AP a été induite (étape 2). Les bactéries ont été incubées avec un réactif d'affinité (étape 3), des bactéries non liées ont été rejetées (étape 4) et certaines bactéries ont été amplifiées (étape 5). Ce chiffre a été modifié à partir de Granhôj et al.9S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Résultats représentatifs de la sélection des modèles avec pBAD-BirA-eCPX-AP et pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A). (a) Par le ballonnement occidental, eCPX-AP a été observé pour être biotinylated dans les bactéries non induites et induites, alors qu'aucune biotinylation d'eCPX-AP (K10A) n'a été détectée même après l'induction de BirA. L'expression de BirA a été détectée par l'anticorps anti-6xHis. Indique une protéine non spécifique réagissant à la streptavidine lorsque BirA a été induit. ( b) Cultures bactériennes avec l'expression induite de BirA et eCPX-AP agrégent rapidement après l'addition des perles magnétiques de streptavidin (flèche), alors qu'aucune agrégation n'a été observée dans ap(K10A) bactéries. (c) BirA était présent dans les bactéries exprimant eCPX-AP et eCPX-AP(K10A) avant le thestreptavidin-pulldown (entrée), mais seulement BirA dans les bactéries exprimant eCPX-AP a été tiré vers le bas par streptavidin. En accord, (d) bactéries viables ont été précipités efficaces dans eCPX-AP, mais pas eCPX-AP(K10A), exprimant des bactéries. Ce chiffre a été modifié à partir de Granhôj et al.9S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Conception de l'amorce et incorporation de la séquence de codage peptide cible dans pBAD-BirA-eCPX-AP par PCR. (a) Exemple de la conception des amorces utilisée pour l'incorporation d'une séquence de peptides dérivée de l'ENaC dans le c-terminal de l'eCPX. La biotine acceptant la lysine est représentée en rouge. La séquence de peptide cible a été inversée traduite en ADN, et les amorces avant et inverses ont été conçues en assurant un chevauchement de base de 15 entre les amorces. (b) Électrophoresis de gel agarose représentatif de PCR avec pBAD-BirA-eCPX-AP comme modèle et amorces spécifiques pour les séquences de peptides dérivées de l'AAR-ENaC, respectivement. Un produit d'ADN clair et fort à 5900 pb était révélateur d'un PCR réussi. "M" indique la voie des marqueurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Résultats représentatifs de la sélection et de la caractérisation des bactéries présentant des peptides. Les bactéries affichant un peptide dérivé de (a) TagRFP ont montré un enrichissement clair après 3 tours de sélection, alors qu'un peptide dérivé de (b) EGFP n'a montré aucun enrichissement des bactéries streptavidin-liées même après 4 tours de sélection. (c) 10 clones de bactéries affichant un peptide de l'ENaC à travers 5 séries de sélection ont été testés pour leur capacité à biotinylate le peptide-ENaC. Tous les 10 clones ont montré une bande streptavidin-réagissant compatible avec la taille d'eCPX-AP, indiquant que les clones isolés contiennent des variantes de BirA qui biotinylate le peptide affiché. D'autres bandes streptavidin-réagissant ont été également observées, indiquant que d'autres protéines, outre le peptide montré, ont été également biotinylated. Indique une protéine endogène E. coli biotinylated par BirA. Ce chiffre a été modifié à partir de Granhôj et al.9S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Comme pour toutes les méthodes de sélection, la rigueur des étapes de lavage est de la plus haute importance. Étant donné que les bactéries n'ont pas besoin d'être élifiées des perles avant l'amplification des clones sélectionnés, la liaison à forte affinité entre la biotine et la streptavidine peut être utilisée au lieu d'utiliser des avidins à faible affinité, comme cela a déjà été fait avec le système d'affichage des phages, pour la sélection des variantes BirA7,8. Cela garantit que des clones rares sont sélectionnés et que les bactéries non biomutées sont jetées. Un autre avantage de l'utilisation de l'affichage bactérien, par rapport à l'affichage phage, est que l'affichage bactérien est quantitatif11 et, par conséquent, permet la sélection des bactéries en fonction de l'activité enzymatique.
Dans le protocole, nous avons utilisé MACS pour sélectionner des bactéries créant un système de sélection binaire basé sur la présence ou l'absence de biotine à la surface. Cependant, en utilisant le tri des cellules activées par fluorescence quantitative, au lieu de cela, il devrait être possible de choisir pour les bactéries qui expriment les variantes les plus actives de BirA. Cela sera important dans le développement futur des nouvelles variantes BirA car il permettra une sélection efficace pour les variantes BirA les plus actives.
Nous avons, jusqu'à présent, utilisé l'affichage bactérien de 14 peptides différents et, de ceux-ci, 13 produit un enrichissement clair9, indiquant que notre système de sélection fournit une méthode robuste pour sélectionner pour les nouvelles variantes BirA. Dans la configuration actuelle, nous avons seulement testé la sélection de variantes BirA qui sont actives vers les peptides d'acide 15-amino et, ainsi, nous avons choisi préférentiellement pour les variantes BirA qui sont actives vers la séquence primaire de la protéine cible. La lysine ciblée peut, cependant, être enterrée à l'intérieur de la structure 3D d'une protéine ou ne pas être autrement accessible pour BirA, produisant des variantes de BirA qui ne sont pas actives contre leur protéine cible. Une solution potentielle serait d'afficher le plus grand fragment de protéine sur eCPX. L'échafaudage eCPX est polyvalent en ce qui concerne l'affichage peptide11; cependant, on ne sait pas si de plus grandes protéines peuvent être affichées.
Nous avons utilisé le système de sélection pour isoler une variante BirA qui biotinylates natif TagRFP9. La variante BirA testée spécifiquement biotinylated TagRFP sur les lysines ciblées, mais l'activité de la variante isolée était faible9. Par conséquent, d'autres cycles d'évolution dirigée devraient être effectués pour améliorer son activité. Le peptide cible se trouve dans le terminus C du TagRFP, où la similitude structurelle entre le peptide affiché et la région protéique est plus probable. L'analyse bioinformatique de toutes les protéines humaines et de souris montre qu'environ 75 % des protéines contiennent une ou plusieurs lysines dans leur premier et/ou les 30 derniers acides aminés9. Ainsi, le système d'affichage bactérien des peptides peut potentiellement être utilisé pour isoler les variantes actives de BirA vers une grande fraction de protéines indigènes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Mohamed Abdullahi Ahmed pour l'assistance d'un technicien expert. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Lundbeck, de la Fondation Novo Nordisk, de l'Association danoise du rein, de la Fondation Aase og Ejnar Danielsen, de la Fondation A.P. M'ller pour l'avancement des sciences médicales, et de Knud et Edith Eriksen. Fondation Memorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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