Summary
Hier presenteren we een methode om te selecteren voor nieuwe varianten van de E. coli Biotine-proteïne ligase BirA dat biotinyates een specifieke doel peptide. Het protocol beschrijft de bouw van een plasmide voor de bacteriële weergave van de doel peptide, het genereren van een BirA bibliotheek, selectie en karakterisering van BirA varianten.
Abstract
Biotine is een aantrekkelijke post-translationele modificatie van eiwitten die een krachtige tag biedt voor de isolatie en detectie van eiwitten. Enzymatische biotinylatie door de E. coli Biotine-proteïne ligase BirA is zeer specifiek en zorgt voor de biotinylatie van doel eiwitten in hun eigen omgeving; het huidige gebruik van door BirA gemedieerde biotinylatie vereist echter de aanwezigheid van een synthetische acceptor peptide (AP) in het doeleiwit. Daarom is de toepassing ervan beperkt tot eiwitten die zijn ontworpen om de AP bevatten. Het doel van dit protocol is het gebruik van de bacteriële weergave van een peptide afgeleid van een niet-gemodificeerd doeleiwit om te selecteren voor BirA-varianten die biotinyates de peptide. Het systeem is gebaseerd op één plasmide die de co-expressie van BirA-varianten mogelijk maakt, samen met een steiger voor het peptide display op het bacteriële oppervlak. Het protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de opname van de doel peptide in de weergave-steiger, creatie van de BirA-bibliotheek, selectie van actieve BirA-varianten en initiële karakterisering van de geïsoleerde BirA-varianten. De methode biedt een zeer effectief selectiesysteem voor de isolatie van nieuwe BirA-varianten die kunnen worden gebruikt voor de verder geleide evolutie van biotine-eiwit ligasen die een inheems eiwit in complexe oplossingen biotinyeren.
Introduction
Biotinylatie van een eiwit creëert een krachtige tag voor zijn affiniteit isolatie en detectie. Enzymatische proteïne biotinylatie is een zeer specifieke post-translationele modificatie gekatalyseerd door Biotine-eiwit ligasen. De E. coli Biotine-proteïne ligase BirA is zeer specifiek en covalent biotinyaten slechts een beperkt aantal natuurlijk voorkomende eiwitten bij specifieke lysine residuen1. De voordelen van de door BirA gekatalyseerde biotinylatie worden momenteel benut door het doeleiwit te fusing met een kleine synthetische 15-aminozuur Biotine acceptor peptide (AP) die effectief biotinyleerd2 is en die de zeer specifieke en efficiënt in vivo en in vitro biotinylatie door co-expressie of toevoeging van BirA3,4,5. Hoewel de in vivo en in vitro BirA gekatalyseerde Biotine-eiwit ligatie een aantrekkelijke etiketterings strategie is, is de toepassing ervan beperkt tot monsters die AP-gesmolten eiwitten bevatten. Het doel van deze methode is de ontwikkeling van nieuwe mutanten van biotine-eiwit ligasen die selectief inheemse ongewijzigde eiwitten biotinyeren en daardoor het aantal toepassingen uitbreiden waarin de enzymatische biotinylatie strategie kan worden gebruikt.
Eiwit functie kan worden geëvolueerd door iteratieve rondes van de genmutatie, selectie en amplificatie van genvarianten met de gewenste functie. Een sterke en efficiënte selectie strategie is cruciaal voor de gerichte evolutie en biotine-eiwit ligase activiteit wordt gemakkelijk geselecteerd als gevolg van de sterke binding tussen Biotine en streptavidine en de homo logs6. Phage display technologieën maken het mogelijk om de Fagen te selecteren die biotinyleerd peptiden7,8vertonen. Omdat de versterking van geïsoleerde Fagen infectie van een bacteriële gastheer vereist, echter, de faag selectie met streptavidine creëert een knelpunt in dat de hoge-affiniteit binding van biotine streptavidine is vrijwel onomkeerbaar onder niet-denaturering Voorwaarden. Om een omkeerbare binding van biotinyleerd Fagen te garanderen, werden monomere avidins met een lagere affiniteit gebruikt, wat resulteerde in een bescheiden ~ 10-voudige verrijking7. We hebben onlangs een bacteriële weergavemethode ontwikkeld voor de isolatie van nieuwe BirA-varianten die de noodzaak van de elutie uit de affiniteits matrix elimineert en daardoor een knelpunt van de vorige BirA Selection Systems9verwijdert. Ons bacteriële display systeem zorgt immers voor een > 1, 000, 000-voudige verrijking van actieve klonen in één enkele selectie stap9, waardoor een effectief selectiesysteem wordt geboden voor de gerichte evolutie van nieuwe BirA-varianten.
Ons bacteriële display systeem bestaat uit twee componenten, BirA met een C-Terminal 6Xzijn tag en een steiger eiwit dat de oppervlakte weergave van een doel peptide mogelijk maakt. We gebruikten de steiger eiwit verbeterd circulair pergedempt buitenste membraan proteïne X (ecpx) omdat de effectieve weergave van peptiden kan worden waargenomen op zowel de N-en C-Termini10,11. De fusie van de doelpeptide sequentie tot het C-eindpunt van eCPX verzekert biotinylatie van bacteriën die actieve BirA-varianten uitdrukken. De bacteriën zorgen voor de effectieve streptavidine selectie als de biotinyleerd peptide nu op het oppervlak verschijnt (Figuur 1a).
Het doel van deze methode is om te selecteren voor nieuwe varianten van BirA dat biotinylates peptide sequenties aanwezig zijn in inheemse eiwitten. Het systeem is gecodeerd door genen die aanwezig zijn op het plasmide pBAD-BirA-eCPX-AP, dat een arabinose-oninduceerbaar promotor bevat die het BirA bestuurt (araBAD) en een T7 Promoter die eCPX9 bestuurt (Figuur 1b). Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor 1) opname van een peptide afgeleid van een doel proteïne in de C-terminal van ecpx, 2) creatie van een mutatie Library van BirA door foutgevoelige PCR, 3) selectie van streptavidine-bindende bacteriën door magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS), 4) kwantificering van bacterie verrijking en 5) initiële karakterisering van geïsoleerde klonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inbrengen van peptide Coding volgorde sequentie in pBAD BirA-eCPX-AP
Opmerking: Om te selecteren voor BirA varianten die biotinyate een native doelwit eiwit, beginnen met het identificeren van een 15-aminozuur peptide sequentie in de eiwitten primaire sequentie die ten minste één lysine (K) residu bevat.
- Ga naar de sequentie manipulatie Suite12.
- Plak de geïdentificeerde 15 aminozuur peptide sequentie in het invoervak in FASTA formaat en druk op Submit.
- Selecteer en kopieer de 45 nucleotide reverse vertaling van de peptide sequentie.
- Download het bestand GenBank voor pBAD-BirA-eCPX-AP van http://n2t.net/addgene:121907.
- Laad het bestand in een plasmide editor (bijv. ApE) en selecteer in het functievenster de AP- reeks die is aangeduid met "AviTag (TM)".
- Klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde AP-reeks in het DNA-sequentie venster en selecteer rev-com plakken in het contextuele menu.
Opmerking: De codeer volgorde van eCPX is in de omgekeerde richting en de peptide Codeer volgorde moet daarom worden geplakt als een omgekeerde aanvulling. - Klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde reeks en selecteer nieuwe functie.
- Voeg een beschrijvende naam van de ingevoegde reeks toe en druk op OK.
- Selecteer Opslaan als in het menu bestand om het gewijzigde bestand op te slaan.
- Ontwerp de voorwaartse primer om de laatste 30 nucleotiden van het omgekeerde complement van de peptide Codeer volgorde op te nemen en voeg de plasmide binding nucleotide sequentie (3 '-GCGGCCGCCTGC-5 ') toe aan het 5 ' uiteinde.
- Ontwerp de omgekeerde primer om de eerste 30 nucleotiden van het omgekeerde complement van de peptide Codeer volgorde op te nemen en voeg de plasmide binding nucleotide sequentie (3 '-CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5 ') toe aan het 5 ' uiteinde.
- Stel een PCR-reactie van 20 μL in een dunwandige PCR-buis in door de in tabel 1 vermelde reagentia toe te voegen.
- Breng de buis over naar een thermische cycler en voer PCR uit met behulp van een programma met een eerste denaturering bij 98 °C gedurende 30 s, 30 cycli van [15 s bij 98 °C, 15 sec. bij 60 °C en 3 min bij 72 °C], laatste verlenging voor 2 min bij 72 °C en vasthouden bij 4 °C.
- Voer 5 μL van de PCR-reactie uit op een 1% agarose-gel om de versterking van een PCR-product van ~ 6 KB te bevestigen.
Opmerking: Als er geen PCR-product wordt waargenomen, optimaliseert u de PCR-conditie volgens de instructies van de fabrikant. Het protocol kan hier worden onderbroken. - Voeg 1 μL DpnI toe aan de PCR-reactie en incuberen gedurende 1 uur bij 37 °C
- Transformeer de bevoegde E. coli met 2 ΜL DPNI VERTEERDE PCR-reactie en plaat op Lysogene Bouillon (lb)/amp platen. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.
- Inoculeren 5 mL LB bevattende 100 μg/mL ampicillaire met een enkele kolonie. Incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 200 rpm.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om ten minste 6 kolonies te testen. - Maak Vries voorraden van 850 μL van elke nachtelijke kweek door het toevoegen van glycerol aan een uiteindelijke concentratie van 15% aan de cultuur. Bewaren bij-80 °C.
- Extraheer het plasmide DNA uit de resterende 4 mL cultuur met de mini-prep DNA extraction Kit.
- Bevestig de juiste insert van de peptide Codeer volgorde door DNA-sequencing met T7 Terminal primer (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).
2. het genereren van een BirA-bibliotheek
Opmerking: De initiële BirA mutatie Library (Figuur 1c, stap 1) wordt gecreëerd door een foutgevoelige PCR. Andere methoden voor het genereren van de BirA mutatie Library zijn waarschijnlijk ook werken.
- Synthetiseren van de Mutant megaprimers met BirA-x zijn voorwaartse (ATGAAGGATAACACCGTGCC) en reverse (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) primers met behulp van 1 ng van pBAD-BirA-eCPX met de beoogde peptide sequentie (voorbereid en bevestigd in stap 1,20) als een sjabloon en 35 PCR-cycli met een gloeien temperatuur van 60 °C volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer 5 μL van de versterkings reactie uit op een 1% agarose-gel om de versterking van een 984 BP PCR-product te controleren.
- Reinig het PCR-product van de resterende 45 μL van de versterkings reactie met behulp van een commerciële PCR-reinigingsset en gebruik een spectrofotometer om de DNA-opbrengst te kwantificeren.
Opmerking: Zuivering uit een enkele 45 μL-amplificatie reactie produceert in het algemeen een voldoende opbrengst (> 250 ng). - Bereid de monster reactie in een dunwandige PCR-buis door de in tabel 2vermelde reagentia toe te voegen.
- Breng het reactiemengsel over naar een thermische cycler en voer de PCR uit met de Mutante Mega rimers bereid in stap 2,3 met de volgende parameters: 1 min bij 95 °C en 25 cycli van 50 s bij 95 °C, 50 s bij 60 °C en 12 min bij 68 °C. Bewaar de reactie bij 4 °C.
- Voeg 1 μL DpnI restrictie enzym direct toe aan de versterkings reactie en meng zachtjes.
- Draai het reactiemengsel door en inbroed gedurende 2 uur bij 37 °C.
- Transformeer T7 Express lysY/IQ competente E. coli cellen met 2 μL van de DPNI-reactie.
- Inoculeren 100 mL LB bevattende 100 μg/mL ampicillaire met de getransformeerde cellen en incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 200 rpm.
- Maak diepvries voorraden met 10 mL van de nachtelijke kweek in LB met 15% glycerol en bewaar bij-80 °C.
3. selectie van bacteriën die Biotinylated peptide uitdrukken
Opmerking: Dit deel van het protocol heeft betrekking op stap 2-5 van Figuur 1c. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat de selectie benadering is ingesteld met behulp van pBAD-BirA-eCPX-AP en pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) als positieve en negatieve controles.
- Inoculeren 100 mL LB bevattende 1% glucose en 100 μg/mL ampicillaire met 1 mL BirA bibliotheek en incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 200 rpm.
- Inoculeren 5 mL LB bevattende 1% glucose en 100 μg/mL ampicillaire met 100 μL van de nachtelijke kweek.
- Inbroed gedurende 2 uur en 30 minuten totdat de cultuur een OD600 bereikt van ongeveer 0,5.
- Induceren eCPX en BirA expressie met 0,2% w/v L-arabinose, 100 μM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 100 μM Biotine en schud de cultuur bij 200 rpm voor 1 uur bij 37 °C.
- Centrifugeer de kweek 10 min bij 5.000 x g en verwijder het supernatant.
- Respendeer de cellen in 1 mL ijskoude PBS en Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 5.000 x g .
- Gooi de supernatant weg en regeer de cellen in 400 μL ijskoude PBS en bewaarcellen op het ijs.
- Verwijder 10 μL geresuspendeerde cellen en bewaar op het ijs in een buis van 1,5 mL met het opschrift "input".
- Was 20 μL streptavidine magnetische kralen in 1 mL ijskoude PBS en plaats de buis in een bench top magnetische deeltjes separator voordat u het supernatant zorgvuldig verwijdert.
- Resuspendeer de magnetische streptavidine-parels in 20 μL ijskoude PBS en breng over in de 390 μL van de geresuspendeerde cellen uit stap 3,8.
- Meng door zachtjes te pipetteren en vervolgens 30 minuten bij 4 °C te inbroed.
Opmerking: Niet Vortex omdat dit de cellen kan lyse. Aggregatie van kralen wordt vaak waargenomen met een grote overvloed aan bacteriën die een biotinyleerd peptide weergeven. - Plaats een kolom met Ferromagnetische bollen in een magnetische deeltjes separator en was met 5 mL ijskoude PBS.
- Breng cellen en streptavidine magnetische kralen over naar de kolom die in de separator is bevestigd.
- Zodra het kolom reservoir leeg is, voegt u 500 μL ijskoude PBS toe en herhaalt u totdat de kolom is gewassen met een totaal volume van 5 mL ijskoude PBS.
- Verwijder de kolom uit de separator en plaats deze in een tube van 1,5 mL.
- Pipetteer 1 ml ijskoude PBS op de kolom en elueer de magnetisch gelabelde cellen door de met de kolom meegeleverde zuiger toe te passen.
- Breng de 1,5 mL Tube over naar een bench top separator en was de magnetisch gelabelde cel met 1 mL ijskoude PBS.
- Breng de magnetisch gelabelde cellen voorzichtig over in 1 mL ijskoude PBS voordat u 10 μL van de resuspensie in een tube van 1,5 mL met de aanduiding "output" verwijdert en opslaat.
- Inoculeren 100 mL LB bevattende 1% glucose en 100 μg/mL ampicillaire met de magnetisch gelabelde cellen en incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 200 rpm.
- De volgende dag, gebruik 10 mL van de nachtelijke cultuur om diepvries voorraden te maken met cellen in LB met 15% glycerol en op te slaan bij-80 °C en 1 mL van de nachtelijke cultuur voor de volgende selectieronde, d.w.z. stap 3,2.
Opmerking: In het algemeen, 3-5 rondes van selectie worden aanbevolen voor de verrijking van streptavidine bindende bacteriën.
4. kwantificering van verrijking
Opmerking: Kwantificering van de levende bacteriën in de "input" en "output" monsters worden uitgevoerd na elke selectieronde door plating van seriële verdunningen van de monsters en het daaropvolgende tellen van kolonie vormende eenheden (CFUs).
- Voeg 990 μL ijskoude PBS toe aan de ingang (vanaf stap 3,8) en uitvoer (vanaf stap 3,18) monsters en label de buizen "ingang 10-2" en "uitgang 10-2", respectievelijk.
- Maak 10-voudige seriële verdunningen van de "input 10-2" en "output 10-2" samples in ijskoude PBS tot een uiteindelijke verdunning van 10-10 is bereikt in het invoer monster en 10-4 in het uitgangs monster.
- Plaat 100 μL monsters van "ingang 10-6", "ingang 10-8", "ingang 10-10", "uitgang 10-2", "uitgang 10-3" en "uitgang 10-4" op lb/amp platen en incuberen 's nachts bij 37 °c.
- Tel het aantal kolonies op de platen met duidelijk gescheiden kolonies. Vermenigvuldig de kiem telling met de verdunningsfactor om de bacterie concentratie/100 μL te verkrijgen.
- Bereken het totale aantal bacteriën in de input-en output samples door vermenigvuldiging van de celconcentratie met de input (400 μL) en het output volume (1 mL), en schat de verrijking door de output te verdelen met het aantal input cellen.
Opmerking: Een significante verrijking moet zichtbaar zijn na 3-5 selectie rondes
5. karakterisering van de geselecteerde BirA-variant
Opmerking: De karakterisering kan worden uitgevoerd na het selecteren van BirA-varianten uit de eerste BirA-bibliotheek; echter, de BirA varianten over het algemeen hebben lage activiteit naar de peptide. Daarom kan voor de karakterisering ook een extra mutatie-en selectieronde worden uitgevoerd. Meestal zijn 10 klonen uit de uiteindelijke selectieronde geïsoleerd voor verdere karakterisatie.
- Inoculeren 5 mL LB bevattende 100 μg/mL ampicillaire met geselecteerde klonen uit de uiteindelijke selectieronde. Daarnaast wordt 5 mL LB met 100 μg/mL ampicilinein met T7 Express lysY/IQ E. coli , getransformeerd met Pbad-BirA-ecpx-AP, gebruikt als positieve controle voor de hieronder beschreven Western Blot.
- Incuberen 's nachts bij 37 °C met schudden bij 200 rpm.
- Maak Vries voorraden van 850 μL van elke nachtelijke kweek door het toevoegen van glycerol aan een uiteindelijke concentratie van 15% aan de cultuur. Bewaren bij-80 °C.
- Inoculeren 5 mL LB bevattende 100 μg/mL ampicillaire met 100 μL van de nachtelijke kweek en incuberen bij 37 °C met schudden bij 200 rpm gedurende 2 uur.
- Extract het plasmide DNA uit de resterende 4 mL kweek door s commercieel mini-prep DNA extraction Kit. Voer de DNA sequentie in voorwaartse en omgekeerde richtingen van de BirA varianten met pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) en pTrcHis Rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) primers.
- Voeg 0,2% w/v L-arabinose en 100 μM IPTG en 100 μM Biotine toe aan culturen uit stap 5,4 en schud de cultuur bij 200 rpm gedurende 1 uur bij 37 °C om de expressie van eCPX-en BirA-varianten te induceren.
- Breng 65 μL van de kweek naar 1,5 mL buisjes met 25 μL van de monster laad buffer en 10 μL van het reduceermiddel.
- Incuberen bij 95 °C gedurende 5 min.
- Laad het monster (inclusief de positieve controle) op een 12% SDS-Polyacrylamide gel samen met een maat marker en voer gel elektroforese uit bij 200 V gedurende ongeveer 45 min tot de 20, 25 en 37 kDa standaard banden duidelijk gescheiden zijn.
- Laat de gel los van de cassette en monteer de sandwich voor het blotting van de gel op een PVDF-membraan.
- Elektro vlek bij 35 V voor 2 uur op ijs.
- Verwijder het PVDF-membraan en inincuberen in blokkerende buffer [PBS, 0,05% Tween-20, 3% magere melkpoeder] voor 1 uur bij kamertemperatuur met schudden.
- Bereid de oplossing voor Biotine detectie in door streptavidin-HRP 1:1000 in PBST te verdunen.
Opmerking: De blokkerende buffer bevat Biotine en mag daarom niet worden gebruikt als verdunningsbuffer voor streptavidine-HRP. - Gooi de blokkerende buffer weg, was het membraan snel in PBST [PBS, 0,05% Tween-20] en voeg de oplossing voor Biotine detectie toe. Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met schudden.
- Gooi de oplossing voor Biotine detectie weg en was het membraan grondig in PBST gedurende 5 minuten tweemaal en 10 minuten eenmaal met zachtjes schudden bij kamertemperatuur.
- Gooi de PBST weg, voeg 2 mL ECL mix toe en inbroed gedurende 1 minuut met schudden.
- Droog het membraan snel op een tissuepapier en ontwikkel het beeld op een röntgenfilm of in een digitaal gelbeeldvormings systeem.
Opmerking: In de Lane geladen met de positieve controle, moeten twee verschillende streptavidin-reactie bands duidelijk zichtbaar zijn: een 30 kDa biotinyleerd endogeen uitgedrukt eiwit en de ~ 22 kDa ecxp-AP band. Als de 10 geselecteerde kolonies de weergegeven peptide kunnen biotinyeren, moet een band op ~ 22 kDa zichtbaar zijn. De intensiteit van deze banden is over het algemeen lager dan de positieve controle en kan daarom langere blootstellings tijden vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Western Blot van pBAD-BirA-eCPX-AP dat bacteriën uitdrukt produceert een ~ 22 kDa streptavidine-reactie band die consistent is met het molecuulgewicht van eCPX (Figuur 2a). In tegenstelling tot BirA was de biotinyleerd ecpx-AP aanwezig in zowel ongeïnduceerde als geïnduceerde culturen (Figuur 2a) als gevolg van een kleine mate van T7-promotor activiteit, zelfs in niet-geïnduceerde culturen en daaropvolgende biotinylatie van de AP door het endogene BirA. In BirA-ecpx-AP (K10A) werd geen biotinyleerd ecpx band gedetecteerd (Figuur 2a). Het sterke oppervlak biotinylation in de eCPX-AP uitdrukken van bacteriën veroorzaakt aggregatie bij toevoeging van streptavidine magnetische kralen en de vorming van een pellet aan de onderkant van een buis (Figuur 2b). In de eCPX-AP (K10A) expressie bacteriën, streptavidin-kraal aggregatie en neerslag werd niet waargenomen (Figuur 2b). Analyse van het precipitaat van de streptavidine pulldown, toont een duidelijke 22-kDa streptavidine-reageren en anti-6Xzijn band in de monsters van eCPX-AP culturen, maar niet eCPX-AP (K10A) culturen (Figuur 2c). Evenzo was de telling van bacteriën gebonden aan de streptavidin-kralen significant hoger in de eCPX-AP dan de eCPX-AP (K10A) culturen (Figuur 2d).
Om te selecteren voor BirA varianten die biotinyeren een doel peptide, de DNA-sequentie werd opgenomen in de C-terminal van eCPX door PCR met behulp van de primers ontworpen in stap 1,10 en 1,11. Een voorbeeld van de primers die zijn ontworpen voor de opname van een peptide sequentie die is afgeleid van de α-subeenheid van het epitheel na+ kanaal (ENAC) wordt weergegeven in Figuur 3a. Na PCR werd een 5-μL aliquot geanalyseerd door agarose-gel elektroforese en een duidelijke en sterke band bij ~ 5900 BP werd waargenomen (Figuur 3b).
Na de generatie van de BirA-mutatie bibliotheek werd de selectie van actieve BirA-varianten geïnitieerd. Een lage mate van streptavidin-gebonden vs. input bacteriën werd verwacht na de eerste selectieronde. Echter, na 2ND en 3RD selectie rondes werd een duidelijke verrijking waargenomen in de mate van streptavidine-gebonden bacteriën Figuur 4a). Als er geen duidelijke verrijking wordt gedetecteerd (Figuur 4b), is het een indicatie van het falen van de BirA-varianten om de peptide te biotinyeren en moet daarom een andere peptide sequentie worden getest.
Na de laatste selectieronde werden 10 klonen gekenmerkt door westerse blotting voor hun vermogen om het getoonde peptide te biotinyeren (Figuur 4c). In de positieve controle (d.w.z. AP), werd ~ 22 kDa band overeenkomend met de biotinyleerd ecpx-AP waargenomen in een westerse Blot met streptavidin-HRP (Figuur 4c). In de geteste klonen was een band op vergelijkbare grootte indicatief voor biotinylatie van het getoonde peptide gesmolten tot eCPX (Figuur 4c). De intensiteit van de ~ 22 kDa bands was lager dan de intensiteit van de eCPX-AP band in de positieve controle, wat duidt op een lagere activiteit van de geïsoleerde BirA varianten. De geïsoleerde klonen kunnen daarom worden gebruikt als een sjabloon voor een andere ronde van mutaties en selectie, die zeer actieve klonen oplevert. Extra banden geven aan dat de geïsoleerde klonen niet specifiek waren voor de weergegeven peptide en dat extra doelwitten ook biotinyated waren (Figuur 4c).
| Reagens | volume (μL) |
| 5x reactie buffer | 4 |
| 10 mM dNTP | 0,4 |
| 10 μM voorwaartse primer | 1 |
| 10 μM omgekeerde primer | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Variabel (~ 25 ng) |
| High-Fidelity DNA-polymerase | 0,20 |
| Nuclease-vrij water | tot 20 |
Tabel 1: PCR-reagentia. Eenheden en volumes kunnen per fabrikant verschillen.
| Reagens | volume (μL) |
| 2x enzym mix | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP met doel peptide sequentie * | Variabele (~ 50 ng) |
| Mutant megaprimer | 250 ng |
| Buffer | 3 |
| Nuclease-vrij water | tot en met 50 |
Tabel 2: foutgevoelige PCR-reagentia. Eenheden en volumes kunnen per fabrikant verschillen. * opgesteld in sectie 1 van het protocol.
Figuur 1: het bacteriële display systeem voor BirA selectie. a) het systeem was gebaseerd op de co-expressie van 2 componenten: BirA en ecpx gefuseerd met de acceptor PEPTIDE (AP). eCPX wordt getransporteerd naar het oppervlak en, als de BirA variant biotinyates de AP, de Biotine (rode B) bevestigd aan de eCPX-AP wordt weergegeven op het oppervlak. b) het systeem werd uitgedruct uit het plasmide Pbad-BirA-ecpx-AP, waar BirA expressie wordt bestuurd door een arabinose-inducible promoter en ecpx-AP expressie wordt gedreven door de T7 Promoter. (c) na het genereren van een willekeurig gemuleerde bibliotheek van BIRA-varianten (stap 1) werden BIRA en ecpx-AP-expressie geïnduceerd (stap 2). Bacteriën werden geïnfiltreerd met affiniteits reagens (stap 3), ongebonden bacteriën werden weggegooid (stap 4) en geselecteerde bacteriën werden versterkt (stap 5). Dit cijfer is gewijzigd van Granhøj et al.9Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve resultaten uit model selectie met Pbad-BIRA-ecpx-AP en Pbad-BIRA-ecpx-AP (K10A). (a) door Western blotting, ecpx-AP werd waargenomen biotinyated in zowel ongeinduceerde en geïnduceerde bacteriën, terwijl geen biotinylatie van ecpx-AP (K10A) werd gedetecteerd, zelfs na de inductie van BirA. BirA expressie werd gedetecteerd door anti-6Xzijn antilichaam. * Duidt op een niet-specifiek streptavidine-reagerende proteïne wanneer BirA werd geïnduceerd. b) bacteriële culturen met geïnduceerde expressie van BirA en ecpx-AP aggregaat snel na toevoeging van magnetische streptavidine-kralen (Arrow), terwijl geen aggregatie werd WAARGENOMEN in AP (K10A) bacteriën. c) BirA was aanwezig in bacteriën die ECPX-AP en ecpx-AP (K10A) uitdrukken vóór thestreptavidin-pulldown (input), maar alleen BIRA in ecpx-AP dat bacteriën uitdrukt, werd naar beneden getrokken door streptavidin. In overeenstemming, (d) levensvatbare bacteriën werden neergeprecipiteerd effectief in ecpx-AP, maar niet ECPX-AP (K10A), uitdrukken van bacteriën. Dit cijfer is gewijzigd van Granhøj et al.9Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: primer ontwerp en opname van doel peptide Codeer sequentie in Pbad-BirA-ECPX-AP door PCR. a) een voorbeeld van het ontwerp van primers dat wordt gebruikt voor de opname van een peptide sequentie die is afgeleid van αENaC in de C-terminal van ecpx. De Biotine accepteren lysine wordt weergegeven in het rood. De doel peptide sequentie werd omgekeerd vertaald naar DNA, en forward en reverse primers werden ontworpen door te zorgen voor een ~ 15 base overlapping tussen de primers. b) representatieve agarose-gel elektroforese van PCR met Pbad-BirA-ecpx-AP als template en primers specifiek voor respectievelijk α, β en γ-ENAC afgeleide peptide sequenties. Een duidelijk en sterk DNA-product bij ~ 5900 BP was indicatief voor een succesvolle PCR. "M" geeft marker Lane aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve resultaten van de selectie en karakterisering van bacteriën die peptiden weergeven. Bacteriën weergeven van een peptide afgeleid van (a) tagrfp toonde een duidelijke verrijking na 3 selectie rondes, terwijl een peptide afgeleid van (b) EGFP toonde geen verrijking van streptavidin-gebonden bacteriën zelfs na 4 selectie rondes. c) 10 klonen van bacteriën die een peptide van de γenac door 5 selectie rondes vertonen, werden getest op hun vermogen om de γenac-peptide te biotinyeren. Alle 10 klonen toonden een streptavidine-reactie band consistent met de grootte van eCPX-AP, wat aangeeft dat de geïsoleerde klonen BirA-varianten bevatten die de getoonde peptide biotinyeren. Extra streptavidine-reagerende bands werden ook waargenomen, wat aangeeft dat andere eiwitten, naast de getoonde peptide, ook biotinyleerd waren. * Duidt op een endogene E. coli eiwit biotinyleerd door BirA. Dit cijfer is gewijzigd van Granhøj et al.9Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals voor alle selectiemethodes, is de striktheid van de wasstappen van het allergrootste belang. Omdat bacteriën niet hoeven te worden afgeleid van de kralen vóór de versterking van de geselecteerde klonen, de hoge affiniteit binding tussen Biotine en streptavidine kan worden gebruikt in plaats van het gebruik van lagere affiniteit avidins, zoals eerder gedaan met de faag display systeem, voor de selectie van BirA-varianten7,8. Dit zorgt ervoor dat zeldzame klonen worden geselecteerd en dat niet-biotinylated bacteriën worden weggegooid. Een ander voordeel van het gebruik van bacteriële weergave, in vergelijking met faag display, is dat bacteriële weergave is kwantitatief11 en daarom, maakt het mogelijk voor de selectie van de bacteriën op basis van de enzymatische activiteit.
In het protocol gebruikten we MACS om te selecteren voor bacteriën die een binair selectiesysteem creëeren op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van biotine op het oppervlak. Echter, met behulp van kwantitatieve fluorescentie geactiveerde celsortering, in plaats daarvan, moet het mogelijk zijn om te selecteren voor bacteriën die de meest actieve varianten van BirA uitdrukken. Dit zal belangrijk zijn in de toekomstige ontwikkeling van de nieuwe BirA-varianten, omdat het een effectieve selectie voor de meest actieve BirA-varianten mogelijk maakt.
We hebben tot nu toe de bacteriële weergave van 14 verschillende peptiden gebruikt en, van hen, 13 produceerde een duidelijke verrijking9, wat aangeeft dat ons selectiesysteem een robuuste methode biedt om te selecteren voor de nieuwe BirA-varianten. In de huidige opstelling hebben we alleen de selectie van BirA-varianten getest die actief zijn in de richting van 15-aminozuur peptiden en, daardoor hebben we bij voorkeur geselecteerd voor de BirA-varianten die actief zijn in de richting van de primaire sequentie van het doeleiwit. De beoogde lysine kan echter worden begraven in de 3D-structuur van een eiwit of niet anderszins toegankelijk zijn voor BirA, het geven van BirA varianten die niet actief zijn tegen hun doeleiwit. Een mogelijke oplossing zou zijn om het grotere eiwit fragment op eCPX weer te geven. De ecpx steiger is veelzijdig met betrekking tot de peptide display11; het is echter niet bekend of grotere eiwitten kunnen worden weergegeven.
We gebruikten het selectiesysteem om een BirA variant te isoleren die biotinylates native TagRFP9. De geteste BirA variant specifiek biotinyleerd tagrfp op de beoogde lysines, maar de activiteit van de geïsoleerde variant was laag9. Daarom moeten verdere rondes van gerichte evolutie worden uitgevoerd om de activiteit te verbeteren. De doel peptide is in het C-eindpunt van TagRFP, waar de structurele gelijkenis tussen de getoonde peptide en de eiwit regio is waarschijnlijker. Bioinformatische analyse van alle menselijke en muis eiwitten toont aan dat ~ 75% van de eiwitten bevatten een of meer lysine binnen hun eerste en/of laatste 30 aminozuren9. Zo kan het bacteriële display systeem van peptiden mogelijk worden gebruikt om actieve BirA-varianten te isoleren naar een grote fractie van inheemse eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Mohamed Abdullahi Ahmed voor de deskundige technicus assistentie. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Stichting Lundbeck, de Novo Nordisk Foundation, de Deense Niervereniging, de Aase og Ejnar Danielsen Foundation, de A.P. Møller Foundation voor de vooruitgang van de medische wetenschap, en Knud en Edith Eriksen Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
