Summary
Qui presentiamo un metodo per selezionare per nuove varianti della ligase biotina-proteina E. BirA che biotinyili uno specifico peptide bersaglio. Il protocollo descrive la costruzione di un plasmide per la visualizzazione batterica del peptide bersaglio, la generazione di una libreria BirA, la selezione e la caratterizzazione delle varianti BirA.
Abstract
La biotina è un'interessante modifica post-traduzionale delle proteine che fornisce un potente tag per l'isolamento e il rilevamento delle proteine. La biotinyalazione enzimatica da parte della ligase biotina-proteina E. tuttavia, l'attuale utilizzo della biotinylazione mediata BirA richiede la presenza di un peptide accettatore sintetico (AP) nella proteina bersaglio. Pertanto, la sua applicazione è limitata alle proteine che sono state progettate per contenere l'AP. Lo scopo del protocollo attuale è quello di utilizzare la visualizzazione batterica di un peptide derivato da una proteina bersaglio non modificata per selezionare per le varianti BirA che biotinyla il peptide. Il sistema si basa su un singolo plasmide che consente la co-espressione delle varianti BirA insieme a un'impalcatura per la visualizzazione del peptide sulla superficie batterica. Il protocollo descrive una procedura dettagliata per l'incorporazione del peptide bersaglio nello scaffold di visualizzazione, la creazione della libreria BirA, la selezione delle varianti BirA attive e la caratterizzazione iniziale delle varianti Isolate BirA. Il metodo fornisce un sistema di selezione altamente efficace per l'isolamento di nuove varianti BirA che possono essere utilizzate per l'ulteriore evoluzione diretta dei ligas proteici biotina che biotinyano una proteina nativa in soluzioni complesse.
Introduction
La biotinyalazione di una proteina crea un tag potente per il suo isolamento e rilevamento dell'affinità. La biotinylazione delle proteine ezimatiche è una modificazione post-traduzionale altamente specifica catalizzata dai ligas di biotina-proteina. La ligase biotina-proteina E. BirA è estremamente specifica e covalentmente biotinyla solo un numero limitato di proteine naturali a specifici residui di lisina1. I vantaggi della biotinylazione catalizzata BirA sono attualmente sfruttati fondendo la proteina bersaglio con un piccolo peptide biotina aminoacido sintetico (AP) che è efficacemente biotinylated2 e consente l'altamente specifico e biotinylazione in vivo e in vitro efficiente per co-espressione o aggiunta di BirA3,4,5. Anche se la legatura biotina-proteina in vivo e in vitro BirA catalizzata è un'interessante strategia di etichettatura, la sua applicazione è limitata a campioni che contengono proteine Fuse AP. Lo scopo di questo metodo è lo sviluppo di nuovi mutanti di legamenti biotino-proteine che biotinylano selettivamente le proteine native non modificate e, quindi, espandono il numero di applicazioni in cui può essere utilizzata la strategia di biotinylazione enzimatica.
La funzione proteica può essere evoluta attraverso cicli iterativi della mutazione genica, della selezione e dell'amplificazione delle varianti genetiche con la funzione desiderata. Una strategia di selezione forte ed efficiente è fondamentale per l'evoluzione diretta e l'attività della ligase biotina-proteina è facilmente selezionata a causa del forte legame tra biotina e streptavidin ai suoi omologhi6. Le tecnologie di visualizzazione dei fagi consentono la selezione di fagi che visualizzano peptidi biotinylati7,8. Poiché l'amplificazione di fagi isolati richiede l'infezione di un ospite batterico, tuttavia, la selezione dei fagi con streptavidina crea un collo di bottiglia in quanto il legame ad alta affinità della biotina alla streptavidina è praticamente irreversibile sotto non-denatura Condizioni. Per garantire il legame reversibile dei fagi biotinylati, sono stati utilizzati aftaepiine monomeriche con minore affinità che hanno portato a un modesto arricchimento di 10 volte7. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di visualizzazione batterica per l'isolamento delle nuove varianti BirA che elimina la necessità di eguagliare dalla matrice di affinità e quindi rimuove un collo di bottiglia dai precedenti sistemi di selezione BirA9. Infatti, il nostro sistema di visualizzazione batterico consente un >1,000.000 volte l'arricchimento di cloni attivi in un'unica fase di selezione9,fornendo così un sistema di selezione efficace per l'evoluzione diretta di nuove varianti BirA.
Il nostro sistema di visualizzazione batterica è costituito da due componenti, BirA con un terminale C 6xIl suo tag e una proteina scaffold che consente la visualizzazione superficiale di un peptide bersaglio. Abbiamo usato la proteina scaffold potenziata circolaremente permutata proteina della membrana esterna X (eCPX) poiché l'efficace visualizzazione dei peptidi può essere osservata sia al bi-termini N che a quello C10,11. La fusione della sequenza di peptidi di destinazione con il capo"C di eCPX assicura la biotinylaazione dei batteri che esprimono varianti BirA attive. I batteri consentono l'effettiva selezione di streptavidin come il peptide biotinylato ora visualizza sulla superficie (Figura 1a).
Lo scopo di questo metodo è quello di selezionare per nuove varianti di BirA che biotinylas sequenze di peptidi presenti nelle proteine native. Il sistema è codificato da geni presenti sul pBAD-BirA-eCPX-AP, che contiene un promotore arabo-inducibile che controlla BirA (araBAD), e un promotore T7 che controlla eCPX9 (Figura 1b). Il presente protocollo descrive la procedura dettagliata per 1) incorporazione di un peptide derivato da una proteina bersaglio nel terminale C di eCPX, 2) creazione di una libreria mutazionale di BirA mediante PCR soggetto a errori, 3) selezione di batteri leganti streptavidina lo smistamento cellulare attivato magnetica (MACS), 4) la quantificazione dell'arricchimento dei batteri e 5) la caratterizzazione iniziale dei cloni isolati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inserimento della sequenza di sequenza di codifica peptide in pBAD BirA-eCPX-AP
NOT: Per selezionare le varianti di BirA che biotinyano una proteina bersaglio nativa, inizia identificando una sequenza di peptidi di 15 aminoacidi nella sequenza primaria delle proteine che contiene almeno un residuo di lisina (K).
- Vai al suite di manipolazione della sequenza12.
- Incollare la sequenza di peptidi di 15 aminoacidi identificata nella casella di input in formato FASTA e premere Invia.
- Selezionare e copiare la traduzione inversa a 45 nucleotidi della sequenza peptide.
- Scarica il file GenBank per pBAD-BirA-eCPX-AP di http://n2t.net/addgene:121907.
- Caricare il file in un editor plasmide (ad esempio, ApE) e, nella finestra delle caratteristiche, selezionare la sequenza AP designata "AviTag(TM)".
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza PA evidenziata nella finestra della sequenza DI DNA e selezionare Incolla Rev-Com nel menu contestuale.
NOT: La sequenza di codifica di eCPX è nella direzione inversa e la sequenza di codifica peptide dovrebbe, quindi, essere incollata come complemento inverso. - Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza evidenziata e selezionare Nuova feature.
- Aggiungere un nome descrittivo della sequenza inserita e premere OK.
- Selezionare Salva con nome nel menu File per salvare il file modificato.
- Progettare il primer in avanti per includere gli ultimi 30 nucleotidi del complemento inverso della sequenza di codifica dei peptidi e aggiungere la sequenza nucleotide di legame plasmid (3'-GCGGCCGCGCGC-5') alla sua estremità 5'.
- Progettare il primer inverso in modo da includere i primi 30 nucleotidi del complemento inverso della sequenza di codifica dei peptidi e aggiungere la sequenza nucleotide di legame plasmid (3'- CTTAAGTAGTTTAACGAATTCGAG-5') alla sua fine.
- Impostare una reazione PCR da 20 L in un tubo PCR a parete sottile aggiungendo i reagenti elencati nella Tabella 1.
- Trasferire il tubo su un ciclore termico ed eseguire la PCR utilizzando un programma con una denitura iniziale a 98 gradi centigradi per 30 s, 30 cicli di [15 s a 98 s, 15 s a 60 gradi centigradi e 3 min a 72 gradi centigradi), estensione finale per 2 min a 72 gradi centigradi e tenere premuto a 4 gradi centigradi.
- Eseguire 5 l della reazione PCR su un gel di agarose dell'1% per confermare l'amplificazione di un prodotto PCR da 6 kb.
NOT: Se non viene osservato alcun prodotto PCR, ottimizzare la condizione PCR in base alle istruzioni del produttore. Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Aggiungete 1 - L di DpnI alla reazione PCR e incubate per 1 h a 37 gradi centigradi
- Trasformare l'e. coli competente con 2 L di DpnI digerito reazione PCR e piastra su brodo lisonidale (LB)/Piastre Amp. Incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
- Inoculare 5 mL LB contenente 100 g/mL di ampicillina con una singola colonia. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min.
NOT: Si raccomanda di testare almeno 6 colonie. - Fare congelare gli stock di 850 - L di ogni coltura overnight aggiungendo glicerolo ad una concentrazione finale del 15% alla coltura. Conservare a -80 gradi centigradi.
- Estrarre il DNA plasmide dalla coltura rimanente da 4 mL con il kit di estrazione del DNA di mini-prep.
- Confermare il corretto inserimento della sequenza di codifica del peptide mediante il sequenziamento del DNA utilizzando il primer terminale T7 (GCTAGTTATTGCTGCGG).
2. Generazione di una biblioteca BirA
NOT: La libreria mutazionale di BirA iniziale(Figura 1c, passaggio 1) viene creata dalla PCR soggetta a errori. Altri metodi per generare la libreria mutazionale BirA probabilmente funzioneranno pure.
- Synthesize i megaprimer mutanti con BirA-6xIl suo avanti (ATGAAGGATACACCGGCC) e invertire (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) primers utilizzando 1 ng di pBAD-BirA-eCPX con la sequenza di peptide target (preparato e confermato nel passaggio 1.20) come modello e 35 cicli PCR con una temperatura di annealing di 60 gradi centigradi secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire 5 l della reazione di amplificazione su un gel di agarose dell'1% per verificare l'amplificazione di un prodotto PCR da 984 bp.
- Purificare il prodotto PCR dai restanti 45 gradi della reazione di amplificazione utilizzando un kit di purificazione PCR commerciale e utilizzare uno spettrofotometro per quantificare la resa del DNA.
NOT: La purificazione da una singola reazione di amplificazione di 45 anni produce generalmente una resa sufficiente (>250 ng). - Preparare la reazione del campione in un tubo PCR a parete sottile aggiungendo i reagenti elencati nella tabella 2.
- Trasferire la miscela di reazione in un ciclore termico ed eseguire la PCR con i megaprimer mutanti preparati al passo 2.3 utilizzando i seguenti parametri: 1 min a 95 s C e 25 cicli di 50 s a 95 s, 50 s a 60 e 12 min a 68 . Conservare la reazione a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere 1 enzima di restrizione DpnI direttamente alla reazione di amplificazione e mescolare delicatamente.
- Abbassare la miscela di reazione e incubare per 2 h a 37 .
- Trasformare le cellule E. coli competenti T7 Express con 2 -L della reazione DpnI.
- Inoculare 100 mL di ampicillina di 100 g/mL con le cellule trasformate e incubare durante la notte a 37 sfacio a 200 rpm.
- Effettua scorte congelatori con 10 mL della coltura notturna in LB con il 15% di glicerolo e conserva a -80 gradi centigradi.
3. Selezione di batteri che esprimono peptide biomutato
NOT: Questa parte del protocollo riguarda il passaggio 2-5 della figura 1c. Si consiglia vivamente di utilizzare pBAD-BirA-eCPX-AP e pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) come controlli positivi e negativi.
- Inoculare 100 mL di LB contenente 1% di glucosio e 100 g/mL di ampicillina con 1 mL di libreria BirA e incubare durante la notte a 37 s.C con agitazione a 200 rpm.
- Inoculare 5 mL di LB contenente 1% di glucosio e 100 g/mL di ampicillina con 100 litri della cultura notturna.
- Incubare per 2 h e 30 min fino a quando la coltura raggiunge un OD600 di circa 0,5.
- Indurre eCPX e BirA espressione con 0.2% w/v L-arabnose, 100 Sopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e 100M biotina e scuotere la coltura a 200 rpm per 1 h a 37 .
- Centrifugare la coltura per 10 min a 5.000 x g e rimuovere il supernatante.
- Risospendere le cellule in 1 mL del PBS ghiacciato e centrifugare a 5.000 x g per 5 min.
- Scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in 400 gradi di PBS ghiacciato e conservare le cellule sul ghiaccio.
- Rimuovere 10 celle risospese e conservarle sul ghiaccio in un tubo da 1,5 mL con l'etichetta "Input".
- Lavare 20 - L di perline magnetiche streptavidin in 1 mL di PBS ghiacciato e posizionare il tubo in un separatore di particelle magnetiche panca superiore prima di rimuovere con attenzione il supernatante.
- Risospendere le perle magnetiche di streptavidin a 20 gradi di PBS ghiacciato e trasferire a 390 - L di cellule risospese dal passo 3.8.
- Mescolare con filtrando delicatamente e poi incubando per 30 min a 4 gradi centigradi.
NOT: Non vortice come questo può lamentele le cellule. L'aggregazione di perline è spesso osservata con un'alta abbondanza di batteri che mostrano un peptide biotinylato. - Posizionare una colonna con sfere ferromagnetiche in un separatore di particelle magnetiche e lavare con 5 mL di PBS ghiacciato.
- Trasferire le celle e le perle magnetiche streptavidin alla colonna attaccata nel separatore.
- Una volta che il serbatoio della colonna è vuoto, aggiungere 500 l di PBS ghiacciato e ripetere fino a quando la colonna non è stata lavata con un volume totale di 5 mL di PBS ghiacciato.
- Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla in un tubo da 1,5 mL.
- Pipetta 1 mL del PBS ghiacciato sulla colonna ed eluire le cellule etichettate magneticamente applicando lo stantuffo fornito con la colonna.
- Trasferire il tubo da 1,5 mL su un separatore panca superiore e lavare la cella etichettata magneticamente con 1 mL di PBS ghiacciato.
- Resospendere delicatamente le celle etichettate magneticamente in 1 mL del PBS ghiacciato prima di rimuovere e conservare 10 - L della sospensione in un tubo da 1,5 mL etichettato "Output".
- Inoculare 100 mL di LB contenente 1% di glucosio e 100 g/mL di ampicillina con le cellule etichettate magneticamente e incubare durante la notte a 37 sfamicon a 200 giri/mm.
- Il giorno successivo, utilizzare 10 mL della coltura durante la notte per effettuare scorte congelatori con celle in LB con 15% glicerolo e conservare a -80 oC e 1 mL della coltura durante la notte per il prossimo ciclo di selezione, vale a dire, passo 3.2.
NOT: Generalmente, 3-5 cicli di selezione sono raccomandati per l'arricchimento di batteri leganti streptavidin.
4. Quantificazione dell'arricchimento
NOT: La quantificazione dei batteri vivi nei campioni "input" e "output" viene eseguita dopo ogni round di selezione mediante placcatura di diluizioni seriali dei campioni e il successivo conteggio delle unità formanti colonia (CFU).
- Aggiungete 990 PBS ghiacciato all'ingresso (dal punto 3.8) e i campioni di uscita (dal punto 3.18) ed etichettate i tubi "Input 10-2"e "Output 10-2", rispettivamente.
- Effettuare diluizioni seriali di 10 volte dei campioni "Input 10-2"e "Output 10-2"in PBS ghiacciato fino a raggiungere una diluizione finale di 10-10 nel campione di input e 10-4 nel campione di output.
- Piastra 100 - L di campioni da "Input 10-6","Input 10-8", "Input 10-10", "Output 10-2", "Output 10-3"e "Output 10-4"su piastre LB/Amp e incubare per la notte a 37 gradi centigradi.
- Contare il numero di colonie sulle piastre con colonie chiaramente separate. Moltiplicare il conteggio delle colonie con il fattore di diluizione per ottenere il numero di concentrazioni batteriche/100 l.
- Calcolare il conteggio batterico totale nei campioni di input e output moltiplicando la concentrazione cellulare con il volume di input (400) e il volume di uscita (1 mL), e stimare l'arricchimento dividendo l'output con il numero di celle di input.
NOT: Un significativo arricchimento dovrebbe essere visibile dopo 3-5 giri di selezione
5. Caratterizzazione della variante BirA selezionata
NOT: La caratterizzazione può essere eseguita dopo aver selezionato le varianti BirA dalla prima libreria BirA; tuttavia, le varianti BirA hanno generalmente una bassa attività verso il peptide. Pertanto, un ulteriore giro di mutazione e selezione può essere eseguito anche prima della caratterizzazione. Di solito, 10 cloni del round di selezione finale sono isolati per un'ulteriore caratterizzazione.
- Inoculare 5 mL LB contenente 100 g/mL di ampicillina con cloni selezionati dal round di selezione finale. Inoltre, inoculare 5 mL LB contenente 100 g/mL ampicillina con T7 Express lysY/Iq E. coli trasformato con pBAD-BirA-eCPX-AP, che sarà utilizzato come un controllo positivo per la macchia occidentale descritta di seguito.
- Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/min.
- Fare congelare gli stock di 850 - L di ogni coltura overnight aggiungendo glicerolo ad una concentrazione finale del 15% alla coltura. Conservare a -80 gradi centigradi.
- Inoculare 5 mL di LB contenente 100 g/mL di ampicillina con 100 l di coltura notturna e incubare a 37 gradi centigradi con agitazione a 200 rpm per 2 h.
- Estrarre il DNA plasmide dalla coltura rimanente 4 mL con il kit di estrazione del DNA commercialmente mini-prep. Eseguire la sequenza del DNA in avanti e in senso inverso delle varianti BirA con pBAD (ATGCCATAGCATTTCTCC) e pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTACTCTG) primer.
- Aggiungete lo 0,2% w/v L-arabinose e 100 IPTG e 100 biotine M alle colture del punto 5.4 e scuotete la coltura a 200 giri per 1 h a 37 gradi per indurre l'espressione delle varianti eCPX e BirA.
- Trasferire 65 l della coltura a tubi da 1,5 mL contenenti 25 l del buffer di carico del campione e 10 l dell'agente di riduzione.
- Incubare a 95 gradi centigradi per 5 min.
- Caricare il campione (compreso il controllo positivo) su un gel 12% SDS-polyacrilmide insieme a un marcatore di dimensione ed eseguire l'elettroforesi gel a 200 V per circa 45 min fino a quando le bande standard 20, 25 e 37 kDa sono chiaramente separate.
- Rilasciare il gel dalla cassetta e assemblare il panino per il gonfio del gel su una membrana PVDF.
- Elettroblot a 35 V per 2 ore sul ghiaccio.
- Rimuovere la membrana PVDF e incubare nel buffer di blocco [PBS, 0.05% Tween-20, 3% Skim Milk Powder] per 1 h a temperatura ambiente con agitazione.
- Preparare la soluzione di rilevamento della biotina diluindo streptavidin-HRP 1:1,000 in PBST.
NOT: Il buffer di blocco contiene biotina e pertanto non deve essere utilizzato come buffer di diluizione per streptavidin-HRP. - Scartare il buffer di blocco, lavare rapidamente la membrana in PBST [PBS, 0,05% Tween-20] e aggiungere la soluzione di rilevamento della biotina. Incubare per 1 h a temperatura ambiente con agitazione.
- Scartare la soluzione di rilevamento della biotina e lavare accuratamente la membrana in PBST per 5 min due volte e 10 min una volta con agitazione delicata a temperatura ambiente.
- Scartare il PBST, aggiungere 2 mL ECL mix e incubare per 1 min con agitazione.
- Asciugare rapidamente la membrana su una carta velina e sviluppare l'immagine su una pellicola a raggi X o in un sistema di imaging gel digitale.
NOT: Nella corsia carica di controllo positivo, due distinte bande di reazione allo streptavidin dovrebbero essere chiaramente visibili: una proteina biotinylata da 30 kDa e la banda di 22 kDa eCXP-AP. Se le 10 colonie selezionate possono biotinyare il peptide visualizzato, una banda di 22 kDa dovrebbe essere visibile. L'intensità di queste bande è generalmente inferiore al controllo positivo e può, pertanto, richiedere tempi di esposizione più lunghi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La macchia occidentale di batteri che esprimono pBAD-BirA-eCPX-AP produce una banda che recita la streptavidina da 22 kDa coerente con il peso molecolare di eCPX (Figura 2a). A differenza di BirA-6xHis, eCPX-AP biotinylata era presente sia in colture non indotte che indotte (Figura 2a) a causa di un piccolo grado di attività promotrice di T7 anche in culture non indotte e successiva biotinylazione dell'AP da parte di BirA endogena. In BirA-eCPX-AP (K10A) che esprime le culture, non è stata rilevata alcuna banda eCPX biomutlata (Figura 2a). La forte biotinylazione superficiale nell'eCPX-AP che esprime i batteri provoca l'aggregazione dopo l'aggiunta di perle magnetiche streptavidine e la formazione di un pellet nella parte inferiore di un tubo (Figura 2b). Nei batteri di espressione eCPX-AP(K10A), l'aggregazione e la precipitazione di streptavidin-bead non sono state osservate (Figura 2b). L'analisi del precipitato dal pulldown streptavidin, visualizza una chiara banda di 22 kDa che reage e anti-6xHis nei campioni delle colture eCPX-AP, ma non le colture eCPX-AP(K10A) (Figura 2c). Allo stesso modo, il numero di batteri legati alle perle di streptavidin a era significativamente più alto nelle colture eCPX-AP rispetto alle colture eCPX-AP (K10A) (Figura 2d).
Per selezionare per le varianti BirA che biotinylano un peptide bersaglio, la sua sequenza di DNA è stata incorporata nel terminale C di eCPX da PCR utilizzando i primer progettati nei gradi 1.10 e 1.11. Un esempio dei primer progettati per l'incorporazione di una sequenza di peptidi derivata dalla sottounità z delcanale epiteliale Na (ENaC) è illustrato nella Figura 3a. Dopo la PCR, un'aliquota da 5-l è stata analizzata dall'elettroforesi del gel di agarose ed è stata osservata una banda chiara e forte a 5900 bp (Figura 3b).
Dopo la generazione della libreria di mutazioni BirA, è stata avviata la selezione delle varianti BirA attive. Un basso grado di batteri streptavidin vs input era previsto dopo il primo round di selezione. Tuttavia, dopo i round di selezione di 2nd e 3rd è stato osservato un chiaro arricchimento nel grado di batteri legati alla streptavidina Figura 4a). Se non viene rilevato un chiaro arricchimento (Figura 4b), è indicativo del fallimento delle varianti BirA di biotinyare il peptide e un'altra sequenza di peptidi dovrebbe, quindi, essere testata.
Dopo il round di selezione finale, 10 cloni sono stati caratterizzati da gonfiore occidentale per la loro capacità di biotinylate del peptide visualizzato (Figura 4c). Nel controllo positivo (cioè AP), banda da 22 kDa corrispondente alla biotinylated eCPX-AP è stata osservata in una macchia occidentale sondacona con streptavidin-HRP (Figura 4c). Nei cloni testati, una banda di dimensioni simili era indicativa della biotinylazione del peptide visualizzato fuso in eCPX (Figura 4c). L'intensità delle bande kDa da 22 kDa era inferiore all'intensità della banda eCPX-AP nel controllo positivo, indicando una minore attività delle varianti BirA isolate. I cloni isolati possono quindi essere utilizzati come modello per un altro ciclo di mutazioni e selezione, producendo cloni altamente attivi. Bande aggiuntive indicano che i cloni isolati non erano specifici per il peptide visualizzato e che sono stati biotinylati anche obiettivi aggiuntivi (Figura 4c).
| Reagente | volume (L) |
| 5x Buffer di reazione | 4 |
| 10 mM dNTP | 0.4 |
| 10 - M Primer in avanti | 1 |
| 10 - M Primer inverso | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Variabile (25 ng) |
| Polimerasi del DNA ad alta fedeltà | 0.20 |
| Acqua priva di nucle | fino a 20 anni |
Tabella 1: reagenti PCR. Le unità e i volumi possono variare da un produttore all'altro.
| Reagente | volume (L) |
| 2x Mix di enzimi | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP con sequenza di peptidi target | Variabile (50 ng) |
| Megaprimer mutante | 250 ng |
| buffer m inv | 3 |
| Acqua priva di nucle | fino a 50 |
Tabella 2: Reagenti PCR soggetti a errori. Le unità e i volumi possono variare da un produttore all'altro. - preparato nella sezione 1 del protocollo.
Figura 1: Il sistema di visualizzazione batterico per laselezione BirA. (a) Il sistema si è basato sulla co-espressione di 2 componenti: BirA ed eCPX fusa con il peptide dell'accettatore (AP). eCPX viene trasportato in superficie e, se la variante BirA biotinyilla l'AP, la biotina (rosso B) attaccata all'eCPX-AP viene visualizzata sulla superficie. (b) Il sistema è stato espresso dal pBAD-BirA-eCPX-AP, dove l'espressione di BirA è controllata da un promotore araboso-inducibile e l'espressione eCPX-AP è guidata dal promotore T7. (c) Dopo la generazione di una libreria mutata casualmente di varianti BirA (passaggio 1), sono state indotte le espressioni BirA e eCPX-AP (passaggio 2). I batteri sono stati incubati con reagente di affinità (passaggio 3), i batteri non legati sono stati scartati (passaggio 4) e i batteri selezionati sono stati amplificati (passaggio 5). Questa cifra è stata modificata da Granhàj et al.9Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi della selezione delmodello con pBAD-BirA-eCPX-AP e pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A). (a) Con gonfiore occidentale, eCPX-AP è stato osservato essere biotinylated in batteri non indotti e indotti, mentre nessuna biotinyalazione di eCPX-AP(K10A) è stata rilevata anche dopo l'induzione di BirA. Espressione BirA è stato rilevato da anti-6xIl suo anticorpo. Indica una proteina aspecifica che reagisce alla streptavidina quando BirA è stata indotta. (b) Le colture batteriche con espressione indotta di BirA e eCPX-AP si aggregano rapidamente dopo l'aggiunta di perle magnetiche di streptavidina (freccia), mentre non è stata osservata alcuna aggregazione nei batteri AP(K10A). (c) BirA era presente nei batteri che esprimevano eCPX-AP e eCPX-AP(K10A) prima dell'inserimento tra thestreptavidin-pulldown (input), ma solo BirA nei batteri esprimimenti eCPX-AP è stata tirata giù dalla streptavidin. In accordo, (d) i batteri vitali sono stati precipitati efficaci in eCPX-AP, ma non eCPX-AP(K10A), esprimendo batteri. Questa cifra è stata modificata da Granhàj et al.9Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Progettazione diprimer e incorporazione della sequenza di codifica dei peptidi target in pBAD-BirA-eCPX-AP di PCR. (a) Un esempio del disegno dei primer utilizzato per l'incorporazione di una sequenza di peptidi derivata da La biotina che accetta la lisina è mostrata in rosso. La sequenza di peptidi bersaglio è stata tradotta inversa nel DNA, e i primer in avanti e inverso sono stati progettati garantendo una sovrapposizione di base di 15 dollari tra i primer. (b) Elettroforesi rappresentativa del gel di agarose di PCR con pBAD-BirA-eCPX-AP come modello e primer specifici per sequenze di peptidi derivati da z, z e-ENaC, rispettivamente. Un prodotto DNA chiaro e forte a 5900 pb è stato indicativo di una PCR di successo. "M" indica la corsia marcatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi della selezione e della caratterizzazione dei batteri che mostrano i peptidi. I batteri che mostrano un peptide derivato da(a) TagRFP hanno mostrato un chiaro arricchimento dopo 3 turni di selezione, mentre un peptide derivato da (b) EGFP non ha mostrato alcun arricchimento di batteri legati alla streptavidina anche dopo 4 turni di selezione. (c) sono stati testati 10 cloni di batteri che mostrano un peptide da ENaC a 5 giri di selezione per la loro capacità di biotinyilare il peptide di ENaC. Tutti e 10 i cloni hanno mostrato una banda che reagisce agli streptavidin, coerente mente con le dimensioni di eCPX-AP, indicando che i cloni isolati contengono varianti Dive che biotinylano il peptide visualizzato. Sono state osservate anche altre bande che reagiscono alla streptavidina, indicando che altre proteine, oltre al peptide visualizzato, erano anche biotinylate. Indica una proteina E. coli endogena biotinylata da BirA. Questa cifra è stata modificata da Granhàj et al.9Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Come per tutti i metodi di selezione, la severità delle fasi di lavaggio è della massima importanza. Poiché i batteri non hanno bisogno di essere eluiti dalle perline prima dell'amplificazione dei cloni selezionati, l'alta affinità di legame tra biotina e streptavidina può essere utilizzata invece di utilizzare avidini di affinità inferiore, come precedentemente fatto con il sistema di visualizzazione dei faghi, per la selezione delle varianti BirA7,8. Ciò garantisce che vengano selezionati cloni rari e che i batteri non biotinylati vengano scartati. Un altro vantaggio dell'utilizzo del display batterico, rispetto al display dei fagi, è che il display batterico è quantitativo11 e, pertanto, consente la selezione dei batteri in base all'attività enzimatica.
Nel protocollo, abbiamo usato MACS per selezionare per i batteri la creazione di un sistema di selezione binaria basato sulla presenza o l'assenza di biotina sulla superficie. Tuttavia, utilizzando la fluorescenza quantitativa ha attivato lo smistamento cellulare, invece, dovrebbe essere possibile selezionare per i batteri che esprimono le varianti più attive di BirA. Questo sarà importante nel futuro sviluppo delle nuove varianti BirA in quanto consentirà una selezione efficace per le varianti BirA più attive.
Finora abbiamo utilizzato il display batterico di 14 diversi peptidi e, di questi, 13 ne abbiamo prodotti un chiaro arricchimento9,indicando che il nostro sistema di selezione fornisce un metodo robusto per selezionare per le nuove varianti BirA. Nella configurazione attuale, abbiamo testato solo la selezione delle varianti BirA attive verso peptidi 15 aminoacidi e, quindi, preferenzialmente selezionate per le varianti BirA attive verso la sequenza primaria della proteina bersaglio. La lisina mirata può, tuttavia, essere sepolta all'interno della struttura 3D di una proteina o non essere altrimenti accessibile per BirA, producendo varianti BirA che non sono attive contro la loro proteina bersaglio. Una potenziale soluzione potrebbe essere quella di visualizzare il frammento proteico più grande su eCPX. L'impalcatura eCPX è versatile rispetto al display peptide11; tuttavia, non è noto se possano essere visualizzate proteine più grandi.
Abbiamo usato il sistema di selezione per isolare una variante BirA che biotinyizza TagRFP9nativo . La variante BirA testato specificamente biotinylated TagRF sulle lisine mirate, ma l'attività della variante isolata era bassa9. Pertanto, ulteriori cicli di evoluzione diretta dovrebbero essere eseguiti per migliorare la sua attività. Il peptide bersaglio è nel capofamiglia C di TagRFP, dove la somiglianza strutturale tra il peptide visualizzato e la regione proteica è più probabile. L'analisi bioinformatica di tutte le proteine umane e topi mostra che il 75% delle proteine contiene una o più lisine all'interno del loro primo e/o ultimo 30 aminoacidi9. Pertanto, il sistema di visualizzazione batterica dei peptidi può potenzialmente essere utilizzato per isolare le varianti BirA attive verso una grande frazione di proteine native.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Mohamed Abdullahi Ahmed per l'assistenza tecnica esperta. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Lundbeck, della Novo Nordisk Foundation, dell'Associazione danese dei reni, della Fondazione Aase og Ejnar Danielsen, della Fondazione A.P. M'ller per l'avanzamento della scienza medica e di Knud e Edith Eriksen Fondazione Memoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
