Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60266

Summary

כאן אנו מציגים שיטה לבחור עבור גרסאות הרומן של E. coli biotin-חלבון ליגאז בירה כי הביוטיטים מטרה מסוימת פפטיד. הפרוטוקול מתאר את בניית הפלסמיד לתצוגה החיידקית של פפטיד היעד, הדור של ספריית בירה, בחירה ואפיון של משתני בירה.

Abstract

Biotin הוא שינוי אטרקטיבי לאחר השינוי של חלבונים המספקת תג רב עוצמה עבור בידוד וזיהוי של חלבון. הביונילציה האנזימטית ע י החיידק הביוטין-ליאג-חלבון הוא מאוד ספציפי ומאפשר לביוטילציה של חלבונים מטרה בסביבתם הטבעית; עם זאת, השימוש הנוכחי של ביוקטילציה בירה מצריך נוכחות של פפטיד סינתטי (AP) בחלבון היעד. לכן, היישום שלו מוגבל לחלבונים שעברו הנדסה כדי להכיל את ה-AP. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להשתמש בתצוגה החיידקית של פפטיד שנגזר מחלבון מטרה שאינו שינה לבחור עבור משתני בירה שביוטיטים את הפפטיד. המערכת מבוססת על פלסמיד יחיד המאפשר ביטוי משותף של משתני בירה יחד עם פיגום לתצוגה פפטיד על פני החיידקים. הפרוטוקול מתאר הליך מפורט לשילוב פפטיד היעד לפיגום התצוגה, יצירת ספריית בירה, מבחר משתני בירה פעילים ואפיון ראשוני של משתני בירה מבודדים. השיטה מספקת מערכת בחירה יעילה ביותר לבידוד של משתני בירה חדשניים, שניתן להשתמש בהם להתפתחות מכוונת נוספת של ביוטין-חלבון, אשר בbiotinylate אוחר יותר חלבון מקורי בפתרונות מורכבים.

Introduction

ביוטילציה של חלבון יוצר תגית רבת עוצמה לבידוד ולגילוי האהדה שלו. ביוטילציה חלבון אנזימטית הוא שינוי מיוחד ביותר שלאחר השינוי באמצעות חלבון ביולוגי. ה- E. coli ביוטין-חלבון ליגאז בירה הוא מאוד ספציפי ומאוד biotinylates רק מספר מוגבל של חלבונים המתרחשים באופן טבעי על שאריות ליזין ספציפי1. היתרונות של הביוטילציה של הבירה מכוונים כיום על ידי החדרת חלבון היעד באמצעות ביוטין (AP) קטן מלאכותי של 15-חומצות אמינו ביולוגי-פפטיד, שהוא ביולוגי הביוטיליס2 ומאפשר את הספציפי וה יעיל בvivo ובביוטילציה על ידי ביטוי משותף או תוספת של בירה3,4,5. למרות vivo ו בירה מחוץ למבחנה ביוטין-חלבון לחות היא אסטרטגיה מושכת תיוג, היישום שלה מוגבל דגימות המכילות חלבונים AP-התמזגו. מטרת שיטה זו היא התפתחות של מוטציות חדשות של ביוטין-חלבון ליגסים, כי באופן סלקטיבי ביולוגי מקורי חלבונים שאינם שונו, ובכך להרחיב את מספר היישומים בהם ניתן להשתמש באסטרטגיית הביוטילציה האנזימטית.

פונקציית חלבון ניתן להתפתח באמצעות סיבובים איטרטיביים של מוטציה גן, בחירה, הגברה של משתני גנים עם הפונקציה הרצויה. אסטרטגיה בחירה חזקה ויעילה היא חיונית עבור האבולוציה המנותבת ו ביוטין-חלבון ליגאז הפעילות מסומנת בקלות בשל הכריכה חזקה בין ביוטין ו streptavidin ו הומויומנים שלה6. טכנולוגיית התצוגה phage לאפשר את הבחירה של phage המציגות פפטידים biotinylated7,8. מאז הגברה של phages מבודדים דורש זיהום של מארח בקטריאלי, עם זאת, בחירת phages עם streptavidin יוצר צוואר בקבוק כי איגוד האהדה הגבוהה של ביוטין לstreptavidin הוא כמעט בלתי הפיך תחת לא מודצות תנאים. כדי להבטיח את הכריכה ההפיכה של phages ביולוגית, השתמשו במונמאריק אבידינס עם זיקהנמוכה יותר,שהביאה לעשרה בעלי קיפול צנוע של 10%. פיתחנו לאחרונה שיטת תצוגה בקטריאלי לבידוד של משתני בירה החדשניים המבטלת את הצורך להתחמק ממטריצת הזיקה ובכך מסירה צוואר בקבוק ממערכות הבחירה הקודמות9. אכן, מערכת התצוגה החיידקית שלנו מאפשרת ל> 1, 000, 000-קיפול של שיבוטים פעילים בשלב בחירה יחיד9, ובכך לספק מערכת בחירה יעילה עבור האבולוציה מכוונת של משתני בירה הרומן.

מערכת התצוגה החיידקית שלנו מורכבת משני מרכיבים, בירה עם תג C-טרמינל 6xHis וחלבון הגרדום המאפשר להציג את המשטח של פפטיד מטרה. השתמשנו בחלבון הפיגום מעגלי משופרת מעגליות חלבון ממברנה החיצוני X (eCPX) מאז התצוגה האפקטיבית של פפטידים ניתן לצפות הן N-ו-C-termini10,11. המיזוג של רצף פפטיד היעד ל C-הטרמינוס של eCPX מבטיח ביוקטילציה של חיידקים המבטאים משתני בירה פעילים. החיידק מאפשר בחירה streptavidin אפקטיבית כמו פפטיד ביולוגי מוצג כעת על פני השטח (איור 1א).

מטרת שיטה זו היא לבחור לגרסאות החדשניים של בירה כי רצפי פפטיד biotinylates קיימים בחלבונים יליד. המערכת מוצפנת על ידי הגנים הנמצאים על pBAD-בירה-eCPX-AP, אשר מכיל את השליטה arabinose-inducible יזם שליטה בירה (araBAD), ומקדם T7 השליטה eCPX9 (איור 1b). הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליך המפורט 1) התאגדות של פפטיד שנגזר חלבון היעד לתוך C-מסוף של eCPX, 2) יצירה של ספריית משנה של בירה על ידי נטייה לשגיאות PCR, 3) מבחר של חיידקים streptavidin-binding על ידי מיון תא מגנטי מופעל (מקינטוש), 4) קוונפיקציה של חיידקים העשרה, ו 5) האפיון הראשוני של שיבוטים מבודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. החדרת רצף פפטיד קידוד בתוך pBAD בירה-eCPX-AP

הערה: כדי לבחור עבור משתני בירה כי biotinylate איחור חלבון מטרה מקורית, להתחיל על ידי זיהוי רצף פפטיד 15-אמינו ברצף החלבונים העיקרי המכיל לפחות אחד ליזין (K) שאריות.

  1. . לך לסוויטה מניפולציה12
  2. מדביקים את הרצף המזוהה 15 חומצת אמינו לתוך תיבת הקלט בפורמט FASTA ולחץ על Submit.
  3. לבחור ולהעתיק את התרגום 45 לאחור נוקלאוטיד של רצף פפטיד.
  4. הורד את קובץ GenBank עבור pBAD-בירה-eCPX-AP מ http://n2t.net/addgene:121907.
  5. טען את הקובץ בעורך פלסמיד (למשל, ApE) ובחלון התכונה בחר ברצף AP שצוין "AviTag (TM)".
  6. לחץ לחיצה ימנית על רצף AP המסומן בחלון רצף ה-DNA ובחר בהדבק Rev-Com בתפריט הקשרי.
    הערה: רצף הקידוד של eCPX נמצא בכיוון ההפוך, ורצף הקידוד הפפטיד צריך, לכן, להיות מודבק כהשלמה הפוכה.
  7. לחצו לחיצה ימנית על הרצף המסומן ובחרו ' תכונה חדשה'.
  8. הוסף שם תיאורי של הרצף המוסף והקש על אישור.
  9. בחרו ' שמור בשם ' בתפריט הקובץ כדי לשמור את הקובץ שהשתנה.
  10. עיצוב ההילוך הקדמי כדי לכלול את 30 נוקלאוטידים האחרון של ההשלמה הפוכה של רצף הקידוד פפטיד ולהוסיף את הרצף של כריכת הקשירה של הפלסטיק (3 '-GCGGCCGGC-5 ') לקצה שלה 5.
  11. עיצוב הפוך לאחור כדי לכלול את 30 הנוקלאוטידים הראשונים של ההשלמה הפוכה של רצף הקידוד פפטיד ולהוסיף את רצף הקשירה של הכריכה הפלאסיים (3 '-CTTAAGTAATAACGTTTAC, 5 ') לקצה שלה 5 '.
  12. הגדר 20 μL PCR בצינור PCR דק-חומה על-ידי הוספת הריאגנטים הרשום בטבלה 1.
  13. העבר את הצינור לציקלייר תרמי ובצע את ה-PCR באמצעות תוכנית עם הרפתקאות ראשוניות ב-98 ° c עבור 30, 30 מחזורים של [15 s ב-98 ° צ', 15 s ב-60 ° c ו-3 דקות בשעה 72 ° c, הארכה סופית עבור 2 דקות ב-72 ° c ומחזיקה ב -4 ° c.
  14. הפעל 5 μL של תגובת ה-PCR ב-1% agarose ג'ל כדי לאשר את הגברה של מוצר מתוצרת PCR 6 kb.
    הערה: אם לא נצפתה מוצר PCR, מטב את תנאי ה-PCR לפי הוראות היצרן. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
  15. הוסף 1 μL של DpnI לתגובת ה-PCR ו-הדגירה עבור 1 h ב 37 ° צ'
  16. הפוך את E. coli מוסמך עם 2 Μl של DpnI תגובה מתעכל PCR ואת הצלחת על ציר ליבסוגניים (LB)/amp לוחות. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c.
  17. מחסן ליברות 5 מ"ל המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם מושבה אחת. דגירה לילה ב 37 ° c עם טלטול ב 200 סל ד.
    הערה: מומלץ לבדוק לפחות 6 מושבות.
  18. הפוך את מלאי ההקפאה של 850 μL של כל תרבות לילה על ידי הוספת גליצרול לריכוז סופי של 15% לתרבות. חנות ב-80 ° c.
  19. לחלץ את ה-DNA הפלסטיות מן הנותרים 4 התרבות mL על ידי להכין מיני DNA ערכת החילוץ.
  20. לאשר את ההכנסה הנכונה של רצף הקידוד פפטיד על-ידי רצפי DNA באמצעות T7 מסוף פריימר (GCTAGTTATTCGG).

2. יצירת ספריית בירה

הערה: ספריית הבירה הראשונית (איור 1ג, שלב 1) נוצרת על-ידי PCR הנוטה לשגיאות. שיטות נוספות להפקת ספריית בירה עשויות לפעול גם כן.

  1. לסנתז את המוטציות מגה-במרס עם בירה-6xHis שלו קדימה (ATGAAGGATAACACCGTPA) ולהפוך (הפוך את ההילוך האחורי) התחל באמצעות 1 ng-בירה-eCPX עם רצף פפטיד היעד (מוכן ואישר בשלב 1.20) כתבנית ו 35 PCR מחזורים בטמפרטורת הריפוי של 60 ° c על פי הוראת היצרן.
  2. הפעל 5 μL של תגובת הגברה על 1% agarose ג'ל כדי לאמת את הגברה של מוצר 984 bp PCR.
  3. לטהר את המוצר PCR מן הנותרים 45 μL של תגובת הגברה באמצעות ערכת הטיהור המסחרי PCR ולהשתמש ספקטרוסקופיה כדי לכמת את התשואה DNA.
    הערה: טיהור מתגובת הגברה אחת 45 μL בדרך כלל מייצרת תשואה מספיקה (> 250 ng).
  4. הכינו את תגובת המדגם בצינור PCR דק-חומה על ידי הוספת הריאגנטים הרשום בטבלה 2.
  5. העבר את תערובת התגובה לציקלייר תרמי והפעל את ה-PCR עם מגה-פיקסל מוטנטים שהוכנו בשלב 2.3 באמצעות הפרמטרים הבאים: 1 דקות ב-95 ° צ' ו -25 מחזורים של 50 s ב-95 ° c, 50 s ב-60 ° c ו-12 דקות ב-68 ° c. אחסן את התגובה ב -4 ° c.
  6. הוסף 1 μL של האנזים DpnI הגבלה ישירות על תגובת הגברה ולערבב בעדינות.
  7. לסובב את תערובת התגובה ואת הדגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
  8. המרה T7 Express lysY/Iq המוסמכת תאים E. coli עם 2 μl של תגובת DpnI.
  9. אינו100 mL ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם התאים שעברו שינוי ו-דגירה לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 rpm.
  10. הפוך את מניות המקפיא עם 10 מ ל של תרבות לילה ב LB עם 15% גליצרול וחנות ב-80 ° c.

3. מבחר של בקטריה ביטוי פפטיד ביולוגי

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מכסה. את שלב 2-5 של הספרה 1ג מומלץ מאוד כי גישת הבחירה היא ההתקנה באמצעות pBAD-בירה-eCPX-AP ו pBAD-בירה-eCPX-AP (K10A) כפקדים חיוביים ושליליים.

  1. איחסן 100 mL של LB המכיל 1% גלוקוז ו 100 μg/mL אמפיצילין עם 1 מ ל של ספריית בירה ו הדגירה לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד.
  2. איחסן 5 mL של LB המכיל 1% גלוקוז ו 100 μg/mL אמפיצילין עם 100 μL של התרבות הלילה.
  3. דגירה עבור 2 h ו 30 דקות עד התרבות מגיע OD600 של כ 0.5.
  4. לגרום ecpx וביטוי בירה עם 0.2% w/v L-arabinose, 100 μm איזופרופיל β-D-1-thioגלאוסייד (iptg) ו 100 μm ביוטין ולנער את התרבות בשעה 200 rpm עבור 1 h ב 37 ° c.
  5. צנטריפוגה את התרבות עבור 10 דקות ב 5,000 x g ולהסיר את הסופרנטאנט.
  6. להשעות מחדש את התאים 1 מ ל של הקרח קר PBS ו צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 5 דקות.
  7. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-400 μL של ה-PBS קר הקרח ומאחסנים תאים על הקרח.
  8. הסר 10 μL של תאים מושעה ולאחסן על הקרח בצינור 1.5 mL המסומנים "קלט".
  9. לשטוף 20 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin ב 1 מ ל של הקרח קר PBS ומניחים את הצינור בתוך מפריד חלקיקים מגנטי הספסל לפני הסרת בזהירות את supernatant.
  10. השהה מחדש את החרוזים streptavidin מגנטי ב 20 μL של הקרח קר PBS ולהעביר ל-390 μL של תאים מושעה משלב 3.8.
  11. לערבב על ידי ליטוף בעדינות ולאחר מכן הדגירה עבור 30 דקות ב 4 ° c.
    הערה: לא מערבולת כי זה עשוי להיות לאחר התאים. מצבור חרוזים לעתים קרובות נצפה עם שפע גבוה של חיידקים המציגים פפטיד biotinylated.
  12. הצב טור עם כדורים פרומגנטיים במפריד חלקיקים מגנטי ושטוף עם 5 מ ל של PBS קר הקרח.
  13. העבר תאים וחרוזי streptavidin מגנטיים לעמודה המצורפת במפריד.
  14. לאחר שמאגר העמודות ריק, הוסף 500 μL של PBS קר קרח וחזור על כך עד שהעמודה נשטפה בנפח כולל של 5 מ ל של PBS קר הקרח.
  15. הסר את העמודה מהמפריד והציבו אותה בשפופרת 1.5 mL.
  16. פיפטה 1 מ ל של ה-PBS הקר הקרח על הטור ומעלה את התאים המתויגים על ידי החלת הבוכנה שסופקה עם הטור.
  17. העבר את שפופרת 1.5 mL למפריד ספסל העליון ולשטוף את התא בתווית מגנטוסטי עם 1 מ ל של הקרח קר PBS.
  18. השהה מחדש בעדינות את התאים המתויגים בתווית 1 מ ל של ה-PBS הקר לפני הסרה ואחסון של 10 μL של ההשעיה בצינור 1.5 mL המסומן "פלט".
  19. האיחסן 100 mL של LB המכיל 1% גלוקוז ו 100 μg/mL אמפיצילין עם התאים מגנזיום התווית ו הדגירה לילה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 rpm.
  20. למחרת, השתמש 10 מ ל של התרבות לילה לעשות מניות המקפיא עם תאים LB עם 15% גליצרול ולאחסן ב-80 ° c ו 1 מ ל של התרבות לילה לסיבוב הבא של הבחירה, כלומר, צעד 3.2.
    הערה: באופן כללי, 3-5 סיבובים של בחירה מומלצים להעשרה של חיידקים מחייבים streptavidin.

4. כימות העשרה

הערה: בדיקת קוונפיקציה של החיידק החי בדגימות "קלט" ו "פלט" מתבצעות לאחר כל בחירה על ידי הציפוי של מדלל סדרתי של דגימות וספירה של המושבה ביחידות היוצרים (CFUs).

  1. הוסף 990 μL ice-קר PBS לקלט (משלב 3.8) ופלט (משלב 3.18) דגימות ותווית את הצינורות "קלט 10-2" ו "פלט 10-2", בהתאמה.
  2. הפוך לדילול טורי של 10 מקפלים של "קלט 10-2" ו-"פלט 10-2" דגימות ב-PBS קר קרח עד הדקה הסופית של 10-10 הגיע לדגימת הקלט ו-10-4 במדגם הפלט.
  3. צלחת 100 μL של דגימות מתוך "קלט10-6", "קלט10-8", "קלט 10-10", "פלט 10-2", "פלט 10-3" ו "פלט 10-4" על LB/Amp לוחות ו-דגירה הלילה ב 37 ° c.
  4. לספור את מספר מושבות על לוחיות עם מושבות מופרדים בבירור. הכפל את ספירת המושבה עם גורם הדילול כדי להשיג את ספירת הריכוז חיידקי/100 μL.
  5. חשב את ספירת החיידקים הכוללת בדגימות הקלט והפלט על-ידי הכפלת הריכוז של התא עם הקלט (400 μL) ועוצמת הפלט (1 mL), בהתאמה והערכת העשרה על-ידי חלוקת הפלט בספירת תאי קלט.
    הערה: יש לראות העשרה משמעותית לאחר 3-5 סיבובים של בחירה

5. אפיון משתנה בירה נבחר

הערה: ניתן לבצע את האפיון לאחר בחירת משתני בירה מספריית הבירה הראשונה; עם זאת, למשתני בירה יש בדרך כלל פעילות נמוכה כלפי הפפטיד. לכן ניתן לבצע סבב נוסף של מוטציה ובחירה לפני האפיון. בדרך כלל, 10 שיבוטים מסיבוב הבחירה הסופי מבודדים לאפיון נוסף.

  1. מחסן 5 מ"ל ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם שיבוטים שנבחרו מסיבוב הבחירה הסופי. בנוסף, החיסונים 5 mL ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם T7 Express lysY/Iq E. coli השתנה עם pbad-בירה-ECPX-AP, אשר ישמשו כפקד חיובי עבור הכתם המערבי המתואר להלן.
  2. דגירה לילה ב 37 ° c עם טלטול ב 200 סל ד.
  3. הפוך את מלאי ההקפאה של 850 μL של כל תרבות לילה על ידי הוספת גליצרול לריכוז סופי של 15% לתרבות. חנות ב-80 ° c.
  4. מחסן 5 מ ל ליברות המכיל 100 μg/mL אמפיצילין עם 100 μL של תרבות לילה ו דגירה ב 37 ° צ' עם טלטול ב 200 סל ד עבור 2 h.
  5. לחלץ את ה-DNA הפלסטיות מן הנותרים 4 התרבות mL על ידי ערכת מיני הכנה מסחרית DNA. לבצע את רצף ה-DNA הכיוונים קדימה והפוך של משתני בירה עם pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) ו Ptrכיס rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) התחל.
  6. הוסף 0.2% w/v L-arabinose ו 100 μm iptg ו 100 μm ביוטין לתרבויות משלב 5.4 ולנער את התרבות ב-200 rpm עבור 1 h ב 37 ° צ' כדי לגרום לביטוי של ecpx ומשתני בירה.
  7. העברת 65 μL של התרבות כדי 1.5 צינורות mL המכיל 25 μL של מאגר טעינת לדוגמה ו 10 μL של הסוכן להפחתת.
  8. מודקון ב 95 ° c עבור 5 דקות.
  9. לטעון את המדגם (כולל את השליטה החיובית) על 12% SDS-polyacrylamide ג'ל יחד עם סמן גודל ולבצע אלקטרופורזה ג'ל ב 200 V עבור כ 45 דקות עד 20, 25 ו 37 kDa להקות רגיל מופרדים בבירור.
  10. שחררו את הג מתוך הקלטת והרכיבו את הכריך לגושי ג'ל על קרום PVDF.
  11. כרוב בשעה 35 וולט. ב -2 על הקרח
  12. הסר את קרום PVDF ואת הדגירה מאגר חסימה [PBS, 0.05% הרצף-20, 3% אבקת חלב רזה] עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם רעד.
  13. להכין את הפתרון biotin זיהוי על ידי דילול streptavidin-HRP 1:1000 ב PBST.
    הערה: המאגר החוסם מכיל ביוטין ולכן אין להשתמש בו כמאגר דילול עבור streptavidin-hrp.
  14. התעלם ממאגר החסימות, רחץ את הממברנה במהירות ב-PBST [PBS, 0.05% רצף-20] והוסף את פתרון הזיהוי הביוטין. מיכל החום בטמפרטורה של 1. בחדר עם רעידות
  15. מחק את הפתרון biotin לזיהוי ולשטוף את הקרום ביסודיות PBST עבור 5 דקות פעמיים ו 10 דקות פעם אחת עם טלטול עדין בטמפרטורת החדר.
  16. להיפטר PBST, להוסיף מיקס ל 2 מ"ל ו-מודטה עבור 1 דקות עם טלטול.
  17. מייבשים את הקרום במהירות על נייר טישו ומפתחים את התמונה על סרט רנטגן או במערכת הדמיה של ג'ל דיגיטלי.
    הערה: בנתיב טעון עם השליטה החיובית, שתי להקות streptavidin-התגובה ברורים צריך להיות גלוי בבירור: a 30 kDa biotinylated באופן מובהק חלבון ו-~ 22 kDa eCXP-AP להקה. אם 10 המושבות שנבחרו יכול biotinylate סוף את הפפטיד המוצג, להקה ב ~ 22 kDa צריך להיות גלוי. העוצמה של להקות אלה נמוכה בדרך כלל מאשר השליטה החיובית, ולכן עשויה לדרוש זמני חשיפה ארוכים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכתם המערבי של pBAD-בירה-eCPX-AP להביע חיידקים מייצרת ~ 22 kDa streptavidin-הלהקה הגיבה בעקביות עם המשקל המולקולרי של eCPX (איור 2א). בניגוד לבירה-6xHis, eCPX ביולוגית-AP היה נוכח בתרבויות שאינן המושרה והמושרה (איור 2א) בשל מידה קטנה של פעילות T7 יזם גם בתרבויות שאינן מושרה וביוטילציה הבאים של AP על ידי אנדוגני בירה. ב בירה-eCPX-AP (K10A) המבטא תרבויות, לא זוהה להקה eCPX ביולוגית (איור 2א). הביוטילציה החזקים של המשטח בתוך eCPX-AP מבטאת חיידקים גורם לצבירה בתוספת של חרוזים streptavidin מגנטיים והיווצרות של גלולה בתחתית הצינור (איור 2ב). ב-eCPX-AP (K10A) ביטויים, צבירת streptavidin חרוז ומשקעים לא נצפתה (איור 2ב). ניתוח של הזרז מן streptavidin down, מציג ברור 22-kDa streptavidin-מגיב ו anti-6xHis להקה שלו בדגימות של eCPX-AP תרבויות, אבל לא eCPX-AP (K10A) תרבויות (איור 2ג). באופן דומה, מספר החיידקים המאוגדים לחרוזי הstreptavidin היה גבוה באופן משמעותי ב-eCPX-AP מאשר בתרבויות eCPX-AP (K10A) (איור 2ד).

כדי לבחור עבור משתני בירה כי biotinylate אוחר פפטיד היעד, רצף ה-DNA שלה שולבו C-מסוף של eCPX על ידי ה-PCR באמצעות התחל מעוצב בשלב 1.10 ו 1.11. דוגמה של התחל שנועד לשילוב של רצף פפטיד נגזר של α-יחידת משנה של אפיתל Na+ ערוץ (enac) מוצג באיור 3א. לאחר ה-PCR, 5-μl סדרת מחלקים נותחו על ידי האלקטרופורזה ג'ל ג ' ו הלהקה ברורה וחזקה ב ~ 5900 bp נצפתה (איור 3ב).

לאחר הדור של ספריית מוטציה בירה, הופעלה הבחירה של משתני הבירה הפעילים. לאחר סיבוב הבחירה הראשון, צפוי להיות מידה נמוכה של streptavidin לעומת חיידק קלט מאוגד. עם זאת, לאחר סבביבחירה של 2 ו -3 העשרה ברורה נצפתה במידה של חיידקים streptavidinמאוגדים איור 4א). אם לא זוהתה העשרה ברורה (איור 4ב), היא מעידה על כישלון של משתני בירה כדי לעשות את הפפטיד ואת רצף פפטיד אחר, לכן יש לבדוק.

לאחר סיבוב הבחירה האחרון, 10 שיבוטים האופיינים על ידי בלוק המערבי על היכולת שלהם biotinylate אוחר את פפטיד מוצג (איור 4ג). ב שליטה חיובית (כלומר, AP), ~ 22 kDa הלהקה המקבילה eCPX ביוטילated-AP נצפתה בכתם המערבי נחקר עם streptavidin-HRP (איור 4ג). במשובטים שנבדקו, להקה בגודל דומה הייתה מעידה על ביוקטילציה של התמזגו פפטיד הציג ל-eCPX (איור 4ג). האינטנסיביות של הלהקות ~ 22 kDa היה נמוך יותר מאשר האינטנסיביות של הלהקה eCPX-AP בשליטה חיובית, המציינת פעילות נמוכה יותר של משתני בירה מבודדים. שיבוטים מבודדים יכול, לפיכך, לשמש כתבנית עבור סיבוב אחר של מוטציות ובחירה, מניב שיבוטים פעילים מאוד. להקות נוספות מצביעות על כך שהשיבוטים המבודדים לא היו ספציפיים כלפי הפפטיד המוצג, ושיעדים נוספים היו גם ביולוגיים (איור 4ג).

ריאגנט אמצעי אחסון (μL)
5x מאגר התגובות 4
10 מילימטר dNTP 0.4
10 מטרים קדימה פריימר 1
10 היפוך פריימר מיקרומטר 1
pBAD-בירה-eCPX-AP משתנה (~ 25 ng)
דנ א באיכות גבוהה פולימראז 0.20
Nuclease-מים ללא תשלום עד 20

שולחן 1: ריאגנטים PCR. היחידות ואמצעי האחסון עשויים להשתנות בין יצרנים.

ריאגנט אמצעי אחסון (μL)
2x שילוב אנזימים 25
pBAD-בירה-eCPX-AP עם רצף פפטיד מטרה * משתנה (~ 50 ng)
מוטציה מגה פיקסל 250
אגר 3
Nuclease-מים ללא תשלום ל50

שולחן 2: שגיאה מועדת PCR ריאגנטים. היחידות ואמצעי האחסון עשויים להשתנות בין יצרנים. * מוכן בסעיף 1 של הפרוטוקול.

Figure 1
איור 1: מערכת התצוגה החיידקית לבחירת בירה. (א) המערכת התבססה על הביטוי המשותף של 2 מרכיבים: בירה ו-ecpx התמזגו עם ה פפטיד המאשר (AP). ecpx מועבר אל פני השטח, אם משתנה בירה הביוטיטים את נקודת הגישה, ה-ביוטין (אדום B) המחובר ל-ecpx-AP מוצג על פני השטח. (ב) המערכת באה לידי ביטוי מהפלסטלינה-בירה-ECPX-ap, כאשר ביטוי בירה נשלט על ידי יזם arabinose-inducible וביטוי ECPX-AP מונע על ידי היזם T7. (ג) לאחר יצירת ספריה מוטציה באקראי של משתני בירה (שלב 1), ביטוי ולביטוי ECPX-AP הושרה (שלב 2). חיידקים היו מואבקים עם מגיב אהדה (שלב 3), חיידקים לא מאוגדים נמחקו (שלב 4) וחיידקים שנבחרו הוגברה (שלב 5). דמות זו השתנתה מגרהאני ואח '9אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות הנציג מבחירת דגם עם pbad-בירה-ecpx-Ap ו-pbad-בירה-ecpx-ap (K10A). (א) על ידי בלוק המערבי, ECPX-ap נצפתה להיות biotinylated בחיידקים שאינם מושרה והמושרה, בעוד ביולציה של ECPX-AP (K10A) זוהה גם לאחר אינדוקציה של בירה. ביטוי בירה זוהה על ידי אנטי-6xHis נוגדן שלו. * מצביע על חלבון streptavidin מסוים שאינו מגיב כאשר בירה המושרה. (ב) תרבויות חיידקי עם ביטוי המושרה של בירה ו ECPX-AP לצבור במהירות לאחר הוספת streptavidin-חרוזים מגנטיים (חץ), בעוד מצבור לא נצפתה ב-AP (K10A) חיידקים. (ג) בירה היה נוכח בחיידק המבטא ecpx-Ap ו ecpx-AP (K10A) לפני thestreptavidin-למטה (קלט), אבל רק בירה ב ECPX-AP ביטוי חיידקים היתה משכה על ידי streptavidin. בהסכם, (ד) חיידקים בר קיימא היו כרות יעיל ב ecpx-ap, אבל לא ecpx-AP (K10A), ביטוי חיידקים. דמות זו השתנתה מגרהאני ואח '9אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פריימר עיצוב ושילוב של רצף הקוד פפטיד היעד לתוך Pbad-בירה-ECPX-AP על ידי PCR. (א) דוגמה לעיצוב התחל המשמש לשילוב רצף פפטיד שנגזר מ-αENaC אל מסוף ה-ecpx. הביוטין המקבל ליזין מוצג באדום. רצף פפטיד היעד היה לאחור מתורגם ל-DNA, ו קדימה והפוך התחל עוצבו על ידי הבטחת בסיס ~ 15 חפיפה בין התחל. (ב) הנציגה האגגית הג של ה-PCR עם pbad-בירה-ECPX-AP כתבנית ומוגדרת כעיצוב מיוחד עבור α, β, ו γ-enac רצפי פפטיד נגזר, בהתאמה. מוצר DNA ברור וחזק ב ~ 5900 bp היה מעיד על ה-PCR מוצלח. "M" מציין את מסלול הסימון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות הנציג מהבחירה והאפיון של חיידקים המציגים פפטידים. חיידקים המציגים פפטיד שנגזר (א) tagrfp הראו העשרה ברור לאחר שלושה סיבובים בחירה, בעוד פפטיד נגזר (ב) egfp לא הראה העשרה של חיידקים מאוגדים streptavidin גם לאחר 4 סיבובים בחירה. (ג) 10 שיבוטים של חיידקים המציגים פפטיד מ γENaC דרך 5 מבחר סיבובים נבדקו עבור יכולתם להיות בbiotinylate אוחר γENaC-פפטיד. כל 10 שיבוטים הראה הלהקה streptavidin-הגיבה בעקביות עם גודל eCPX-AP, המציין כי שיבוטים מבודדים מכילים משתני בירה כי biotinylate איחור פפטיד מוצגים. כמו כן נצפו להקות מstreptavidin נוספות, המצביעות על כך שחלבונים אחרים, מלבד הפפטיד המוצג, היו גם ביוטיליס. * מעיד על ביודוגני חלבון החיידק ביולוגי על ידי בירה. דמות זו השתנתה מגרהאני ואח '9אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

באשר לכל שיטות הבחירה, החשיבות הרבה ביותר היא לשטוף את צעדי הכביסה. מאז חיידקים לא צריך להיות חומק מן החרוזים לפני הגברה של שיבוטים שנבחרו, כריכת זיקה גבוהה בין ביוטין ו streptavidin יכול לשמש במקום באמצעות avidins אהדה נמוכה, כפי שנעשה בעבר עם מערכת התצוגה phage, עבור מבחר משתני בירה7,8. הדבר מבטיח כי נבחרו שיבוטים נדירים וכי חיידקים שאינם biotinylated נמחקים. יתרון נוסף של שימוש בתצוגה בקטריאלי, לעומת התצוגה phage, הוא כי התצוגה החיידקית היא כמותית11 , ולכן, מאפשר את הבחירה של החיידקים מבוסס על פעילות אנזימטית.

בפרוטוקול, השתמשנו ב-מקינטוש כדי לבחור עבור חיידקים יצירת מערכת בחירה בינארית המבוססת על נוכחות או העדר ביוטין על פני השטח. עם זאת, באמצעות מיון תאים המופעל באופן כמותי, במקום זאת, יש לבחור עבור חיידקים המבטאים את הווריאנטים הפעילים ביותר של בירה. זה יהיה חשוב בהתפתחות העתידית של משתני בירה הרומן, שכן היא תאפשר בחירה אפקטיבית עבור משתני הבירה הפעילים ביותר.

יש לנו, עד כה, השתמשו בתצוגה החיידקית של 14 פפטידים שונים, וכאלה, 13 הפיקוהעשרהברורה, המציינת כי מערכת הבחירה שלנו מספקת שיטה איתנה לבחירת המשתנים החדשניים של בירה. בכיוונון הנוכחי, בדקנו רק את המבחר של משתני בירה הפעילים כלפי הפפטידים בחומצות אמינו, ובכך אנו מעדיפים לבחור את משתני הבירה הפעילים לקראת הרצף העיקרי של חלבון היעד. ליזין ממוקד יכול, עם זאת, להיקבר בתוך מבנה 3D של חלבון או לא להיות נגיש בדרך אחרת עבור בירה, מניב משתני בירה שאינם פעילים נגד חלבון היעד שלהם. פתרון פוטנציאלי יהיה להציג את רסיס חלבון גדול יותר ב-eCPX. הגרדום של eCPX הוא רב-תכליתי ביחס לתצוגה פפטיד11; עם זאת, לא ידוע אם ניתן להציג חלבונים גדולים יותר.

השתמשנו במערכת הבחירה כדי לבודד משתנה של בירה אשר ביולוגי מקורי TagRFP9. משתנה הבירה הנבדק במיוחד באמצעות TagRFP באופן מכוון, אך הפעילות של המשתנה המבודד הייתה נמוכה9. לכן יש לבצע סבבים נוספים של אבולוציה מכוונת כדי לשפר את פעילותה. פפטיד היעד הוא C הטרמינוס של TagRFP, שבו הדמיון מבניים בין הפפטיד המוצג ואזור החלבון הוא סביר יותר. ניתוח ביולוגי של כל החלבונים האנושיים והעכברים מראה כי ~ 75% של החלבונים להכיל אחד או יותר ליזין בתוך 30 הראשון ו/או האחרון שלהם חומצות אמינו9. כך, מערכת התצוגה החיידקית של פפטידים יכולים לשמש לבידוד משתני בירה פעילים לקראת חלקיק גדול של חלבונים מקומיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים למוחמד ליוהי אחמד על הסיוע של טכנאי מומחה. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מקרן לוננבק, קרן נובו נורדיסק, אגודת הכליות הדנית, קרן הכליה והDanielsen, הקרן לקידום מדעי הרפואה וקנוד ואדית אריקסן . קרן הזיכרון

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561033
Ampicilin Sigma-Aldrich A1593
ApE - A plasmid editor v2.0 NA NA downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Biotin Sigma-Aldrich B4501
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DPBS (10x), no calcium, no magnesium ThermoFischer Scientific 14200083
DpnI restriction enzyme New England BioLabs R0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFischer Scientific 65001
GenElute Plasmid Miniprep Kit Sigma-Aldrich PLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit Agilent Technologies 200552
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immobilon-P PVDF Membrane Millipore IPVH15150
IPTG Sigma-Aldrich I6758
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NEB 5-alpha Competent E. coli New England BioLabs C2987
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) ThermoFischer Scientific NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) ThermoFischer Scientific NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP Addgene 121907 Used a template and positive control
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) Addgene 121908 negative control
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491 For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
Skim Milk Powder Sigma-Aldrich 70166
Streptavidin-HRP Agilent Technologies P0397
T7 Express lysY/Iq Competent E. coli New England BioLabs C3013
Tryptone Millipore T9410
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Western Lightning Plus-ECL PerkinElmer NEL103001EA
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
  2. Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  3. de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
  4. Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
  5. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  6. Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
  7. Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
  8. Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
  9. Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
  10. Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
  11. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
  12. Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 152 מונחה אבולוציה מוטזיס אקראי תיוג הנדסת חלבונים חלבון-biotin ligase חלבון תג
התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Granhøj, J., Dimke, H.,More

Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes. J. Vis. Exp. (152), e60266, doi:10.3791/60266 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter