Summary
여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.
Abstract
비오틴은 단백질의 분리 및 검출을 위한 강력한 태그를 제공하는 단백질의 매력적인 번역 후 변형입니다. 대장균 바이오틴 단백질 리가제 BirA에 의한 효소 생물학적 인화는 매우 특이적이며 그들의 모국 환경에서 표적 단백질의 생체 이식을 허용합니다. 그러나, 현재 BirA 매개 생물항화의 사용은 표적 단백질에 합성 수용기 펩티드(AP)의 존재를 요구한다. 따라서, 그 적용은 AP를 포함하도록 설계된 단백질로 제한된다. 본 프로토콜의 목적은 수정되지 않은 표적 단백질로부터 유래된 펩타이드의 세균 디스플레이를 사용하여 펩티드를 바이오티엔화하는 BirA 변이체를 선택하는 것입니다. 시스템은 세균 표면에 펩티드 디스플레이를 위한 스캐폴드와 함께 BirA 변이체의 공동 발현을 허용하는 단일 플라스미드를 기반으로 한다. 프로토콜은 디스플레이 스캐폴드 내로 표적 펩티드의 혼입, BirA 라이브러리의 생성, 활성 BirA 변이체의 선택 및 단리된 BirA 변이체의 초기 특성화에 대한 상세한 절차를 설명합니다. 이 방법은 복잡한 용액에서 기본 단백질을 바이오티엔화하는 비오틴 단백질 리가제의 추가 적인 진화에 사용될 수 있는 새로운 BirA 변이체의 분리를 위한 매우 효과적인 선택 시스템을 제공한다.
Introduction
단백질의 생체 화는 친화성 격리 및 검출을위한 강력한 태그를 만듭니다. 효소 단백질 생물항화는 비오틴 단백질 리가제에 의해 촉매작용된 고도로 특이적인 번역 후 변형이다. 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA는 매우 특이적이고 공유성 바이오티니레이트는 특정 리신 잔기에서 자연적으로 발생하는 단백질의 제한된 수에불과합니다 1. BirA 촉매 생물항화의 장점은 현재 표적 단백질을 작은 합성 15-아미노산 비오틴 수용기 펩타이드(AP)와 융합하여 효과적으로 생체티니레이팅2를 허용하고, 고도로 특이적이고 비라3,4,5의공동 발현 또는 첨가에 의한 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생체내 생물학적 인 효율적. 생체 내 및 시험관 내 BirA 촉매 비오틴 단백질 결찰은 매력적인 라벨링 전략이지만, 그 적용은 AP 융합 단백질을 포함하는 샘플로 제한된다. 이 방법의 목적은 선택적으로 네이티브 변형되지 않은 단백질을 생물항화하는 비오틴 단백질 리가제의 새로운 돌연변이체의 개발이며, 이에 따라 효소 생물항화 전략이 사용될 수 있는 응용 분야의 수를 확장합니다.
단백질 기능은 원하는 기능을 가진 유전자 변이체의 반복적인 라운드를 통해 진화될 수 있고, 유전자 변이체의 선택, 증폭. 강력하고 효율적인 선택 전략은 비오틴과 스트렙타비딘 및 그 호몰로그(homologs6)사이의 강한 결합으로 인해 지시된 진화 및 비오틴 단백질 리가제 활성이 용이하게 선택되기 위해 매우 중요하다. 파지 디스플레이 기술은 생체 연화 펩티드7,8을표시하는 파지의 선택을 허용한다. 단신 파지의 증폭은 세균 성 숙주의 감염을 필요로하기 때문에, 그러나, streptavidin를 가진 파지 선택은 streptavidin에 비오틴의 높은 친화도 결합이 비 이변의 밑에 사실상 돌이킬 수 없다는 점에서 병목 현상을 만듭니다 조건. 생체 면역 파지의 가역적 결합을 보장하기 위해, 낮은 친화력을 가진 단조로운 아비딘을 사용하였고, 그 결과 ~ 10 배 농축7. 우리는 최근에 선호도 매트릭스로부터 용출의 필요성을 제거하고 이에 따라 이전 BirA 선택 시스템9에서병목 현상을 제거하는 새로운 BirA 변이체의 분리를 위한 세균 표시 방법을 개발하였다. 실제로, 우리의 세균 디스플레이 시스템은 단일 선택 단계9에서활성 클론의 >1,000,000 배 농축을 허용하므로 새로운 BirA 변종의 지시 된 진화를위한 효과적인 선택 시스템을 제공합니다.
우리의 세균 성 디스플레이 시스템은 두 가지 구성 요소로 구성, C 말단 6xHis 태그와 비계 단백질은 대상 펩티드의 표면 표시를 허용. 우리는 펩타이드의 효과적인 디스플레이가 N-및 C-테르미니10,11모두에서 관찰될 수 있기 때문에 스캐폴드 단백질강화된 원형 변막 단백질 X(eCPX)를 사용하였다. 표적 펩타이드 서열을 eCPX의 C-종점과 융합하면 활성 BirA 변이체를 발현하는 박테리아의 생체이식이 보장된다. 박테리아는 생체 연화 된 펩티드가 이제 표면에 표시됨에 따라 효과적인 스트렙타비딘 선택을 허용합니다(도 1a).
이 방법의 목적은 네이티브 단백질에 존재하는 펩티드 서열을 바이오티엔테인화하는 BirA의 새로운 변이체를 선택하는 것입니다. 시스템은 플라스미드 pBAD-BirA-eCPX-AP에 존재하는 유전자에 의해 인코딩되며, 이는 비라(araBAD)를 제어하는 아라비노스 유도 프로모터와 eCPX9를 제어하는 T7 프로모터를 함유한다(도1b). 본 프로토콜은 1) 표적 단백질에서 유래된 펩타이드를 eCPX의 C 말단에 혼입시키는 것에 대한 상세한 절차를 설명하고, 2) 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 의한 BirA의 돌연변이 라이브러리생성, 3) 스트렙타비딘 결합 박테리아의 선택에 의해 자기 활성화 세포 선별 (MACS), 4) 박테리아 농축의 정량화 및 5) 분리 된 클론의 초기 특성.
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Protocol
1. pBAD BirA-eCPX-AP에 펩타이드 코딩 시퀀스 삽입
참고: 네이티브 표적 단백질을 바이오티니레이팅하는 BirA 변이체를 선택하려면, 적어도 하나의 라이신(K) 잔기를 함유하는 단백질 1차 서열에서 15아미노산 펩티드 서열을 식별하는 것으로 시작한다.
- 시퀀스 조작 제품군12로이동합니다.
- 확인된 15개의 아미노산 펩타이드 서열을 FASTA 형식으로 입력 상자에 붙여넣고 제출을누릅니다.
- 펩티드 서열의 45 뉴클레오티드 역변환을 선택하고 복사한다.
- http://n2t.net/addgene:121907 pBAD-BirA-eCPX-AP에 대한 GenBank 파일을 다운로드합니다.
- 플라스미드 편집기(예: ApE)에 파일을 로드하고 피처 창에서 "AviTag(TM)"로 지정된 AP 시퀀스를 선택합니다.
- DNA 서열 창에서 강조 표시된 AP 시퀀스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 상황에 맞는 메뉴에서 Rev-Com 붙여넣기를 선택합니다.
참고: eCPX의 코딩 서열은 역방향이고 펩티드 코딩 서열은 역보편으로 붙여야 한다. - 강조 표시된 시퀀스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 새 기능을선택합니다.
- 삽입된 시퀀스의 설명 이름을 추가하고 확인을누릅니다.
- 수정된 파일을 저장하려면 파일 메뉴에서 대로 저장을 선택합니다.
- 펩티드 코딩 서열의 역보체의 마지막 30개의 뉴클레오티드를 포함하는 전방 프라이머를 설계하고 플라스미드 결합 뉴클레오티드 서열(3'-GCGGCCGCGCGC-5')을 5' 말단에 추가한다.
- 펩티드 코딩 서열의 역보체의 제1 30뉴클레오티드를 포함하는 역프라이머를 설계하고 플라스미드 결합 뉴클레오티드 서열(3'-CTTAGTAGTTAACGAATCGAG-5')을 5' 말단에 첨가한다.
- 표 1에 열거된 시약을 첨가하여 박막 PCR 튜브에 20 μL PCR 반응을 설정한다.
- 튜브를 열 사이클러로 옮기고 30초 동안 98°C에서 초기 변성하는 프로그램을 사용하여 PCR을 수행하고, 30사이클 [98°C에서 15s, 60°C에서 15s, 72°C에서 3분], 72°C에서 2분 동안 최종 연장하고 4°C에서 유지한다.
- 1% 아가로즈 겔상에서 PCR 반응의 5 μL을 실행하여 ~6 kb PCR 제품의 증폭을 확인하였다.
참고: PCR 제품이 관찰되지 않으면 제조업체의 지침에 따라 PCR 상태를 최적화하십시오. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - PCR 반응에 DpnI 1 μL을 추가하고 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 유능한 대장균을 2 μL의 DpnI 소화 된 PCR 반응과 리소 제닉 국물 (LB)/ 앰프 플레이트에 접시로 변형시킵니다. 37 °C에서 하룻밤 배양.
- 단일 콜로니로 100 μg/mL 암피실린을 함유한 5 mL LB를 접종합니다. 200 rpm에서 흔들어 37 °C에서 밤새 배양.
참고: 적어도 6 개의 식민지를 테스트하는 것이 좋습니다. - 배양에 글리세롤을 최종 농도15%에 첨가하여 각 야간 배양물의 850 μL의 동결 주식을 만듭니다. -80 °C에서 보관하십시오.
- 미니 프렙 DNA 추출 키트에 의해 나머지 4 mL 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출한다.
- T7 말단 프라이머(GCTAGTTATTGCTCAGCGG)를 사용하여 DNA 시퀀싱에 의한 펩티드 코딩 서열의 정확한 삽입을 확인한다.
2. 비라 도서관 의 생성
참고: 초기 BirA 돌연변이라이브러리(그림 1c,단계 1)는 오류가 발생하기 쉬운 PCR에 의해 생성됩니다. BirA 돌연변이 라이브러리를 생성하는 다른 방법도 작동할 가능성이 높습니다.
- 비라-6xHis 포워드(ATGAATATAACACGGCC)와 역방향(TCAATAtAtAtGATGGTTT) 프라이머를 대상으로 펩타이드 서열(1.20단계에서 제조 및 확인)을 템플릿및 35PCR 주기로 사용하여 돌연변이 메가프라이머를 합성합니다. 제조업체의 지시에 따라 60 °C의 어닐링 온도로.
- 984 bp PCR 생성물의 증폭을 확인하기 위해 1% 아가로즈 겔상에서 증폭 반응의 5 μL을 실행한다.
- 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 증폭 반응의 나머지 45 μL로부터 PCR 제품을 정화하고 분광광도계를 사용하여 DNA 수율을 정량화한다.
참고: 단일 45 μL 증폭 반응으로부터의 정제는 일반적으로 충분한 수율(>250 ng)을 생성한다. - 표 2에열거된 시약을 추가하여 얇은 벽PCR 튜브에서 시료 반응을 준비한다.
- 열 사이클러에 반응 혼합물을 전송하고 다음 매개 변수를 사용하여 단계 2.3에서 제조 된 돌연변이 메가 프라이머와 PCR을 실행 : 95 °C에서 95 °C에서 1 분 및 95 °C에서 50 s의 25 사이클, 60 °C에서 50 s 및 68 °C에서 12 분. 반응을 4°C에서 저장한다.
- 증폭 반응에 직접 DpnI 제한 효소 1 μL을 넣고 부드럽게 섞습니다.
- 반응 혼합물을 스핀다운하고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- DpnI 반응의 2 μL로 T7 익스프레스 lysY/Iq 유능한 대장균 세포를 변환합니다.
- 형질전환된 세포와 함께 100 μg/mL ampicillin을 함유하는 100 mL LB를 접종하고 200 rpm에서 흔들어 37°C에서 밤새 배양한다.
- 15% 글리세롤로 LB에서 하룻밤 배양의 10 mL로 냉동고 주식을 만들고 -80 °C에 보관하십시오.
3. 생체 생리 펩티드를 발현하는 박테리아의 선택
참고: 프로토콜의 이 부분은 그림 1 c의2-5단계를 다룹니다. 선택 방법은 pBAD-BirA-eCPX-AP 및 pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)를 양수 및 음수 컨트롤로 설정하는 것이 좋습니다.
- 1% 포도당과 100 μg/mL 암피실린을 함유한 LB의 100 mL을 BirA 라이브러리1 mL로 접종하고 200 rpm에서 흔들어 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 1% 포도당 및 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB의 5 mL을 밤새 배양한 100 μL로 접종하였다.
- 배양이 약 0.5의 OD600에 도달할 때까지 2 시간 및 30 분 동안 배양한다.
- eCPX 및 BirA 발현을 0.2% w/v L-아라비노스, 100 μM 이소프로필 β-D-1-티오갈라코피라노사이드(IPTG) 및 100 μM 비오틴으로 유도하고 37°C에서 1시간 동안 200 rpm에서 배양을 흔든다.
- 5,000 x g에서 10 분 동안 배양하고 상류를 제거하십시오.
- 5 분 동안 5,000 x g에서 얼음 차가운 PBS 및 원심 분리기의 1 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.
- 상급체를 버리고 400 μL의 얼음 차가운 PBS에서 세포를 다시 중단하고 얼음에 세포를 저장합니다.
- 10 μL의 재중단 된 세포를 제거하고 "입력"이라고 표시된 1.5 mL 튜브에 얼음에 보관하십시오.
- 20 μL의 스트렙타비딘 자기 구슬을 얼음 차가운 PBS 1 mL에 씻고 관을 벤치 상단 자기 입자 분리기에 놓고 조심스럽게 상판을 제거하십시오.
- 얼음 차가운 PBS의 20 μL에서 스트렙타비딘 자기 구슬을 다시 중단하고 3.8 단계에서 390 μL의 재중단 된 세포로 옮김.
- 부드럽게 파이펫팅하여 혼합한 다음 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 이 세포를 lyse 수 있습니다 소용돌이 하지 마십시오. 구슬의 응집은 종종 생체 연화 된 펩티드를 나타내는 박테리아의 높은 풍부와 함께 관찰된다. - 자기 입자 분리기에 강자성 구가있는 열을 놓고 얼음 차가운 PBS 5 mL로 씻으하십시오.
- 분리기에 부착된 컬럼에 세포 및 스트렙타비딘 자기 비드를 전달한다.
- 기둥 저장소가 비어 있으면 500 μL의 얼음 차가운 PBS를 추가하고 컬럼이 총 5 mL의 얼음 차가운 PBS로 세척 될 때까지 반복합니다.
- 분리기에서 컬럼을 제거하고 1.5mL 튜브에 놓습니다.
- 얼음-차가운 PBS의 피펫 1 mL을 컬럼상에 및 열과 함께 제공된 플런저를 도면서 자기 표지된 세포를 용출한다.
- 1.5 mL 튜브를 벤치 탑 분리기로 옮기고 1 mL의 얼음 차가운 PBS로 자기 표지 된 셀을 씻습니다.
- "출력"이라고 표시된 1.5 mL 튜브에 재서스펜션10 μL을 제거하고 저장하기 전에 얼음 차가운 PBS의 1 mL에서 자기 표지된 세포를 부드럽게 다시 일시 중단합니다.
- 1% 포도당 과 100 μg/mL 암피실린을 포함하는 LB의 100 mL를 자기 표지된 세포로 접종하고 200 rpm에서 흔들어 37°C에서 밤새 배양한다.
- 다음날, 10 mL의 하룻밤 배양을 사용하여 LB에 세포와 함께 냉동고 스톡을 15% 글리세롤로 만들고 다음 라운드 선택, 즉 3.2 단계 동안 -80°C 및 1 mL의 야간 배양에 저장한다.
참고: 일반적으로, 선택의 3-5 라운드는 스트렙 타 비딘 바인딩 박테리아의 농축을 위해 권장됩니다.
4. 농축정량화
참고: "입력" 및 "출력" 샘플에서 살아있는 박테리아의 정량화는 샘플의 직렬 희석 및 콜로니 형성 단위(CFUs)의 후속 계수에 의해 각 선택 라운드 후에 수행된다.
- 입력(3.8단계)과 출력(3.18단계)에 990 μL 얼음 냉간 PBS를 추가하고 튜브 "입력10-2"및 "출력10-2"를각각 라벨을 붙입니다.
- 입력 샘플에서 10-10의 최종 희석이 입력 샘플에서10-10에 도달할 때까지 얼음-차가운 PBS에서 "입력10-2"및 "출력10-2"샘플의10배 직렬 희석을 합니다.
- 플레이트 100 μL에서 샘플의 "입력10-6","입력10-8","입력10-10","출력10-2","출력10-3"과"출력10-4"에서LB / Amp 플레이트에서 하룻밤 배양 37 °C에서.
- 명확하게 분리 된 식민지와 접시에 식민지의 수를 계산합니다. 콜로니 수를 희석 인자와 곱하여 세균 농도 수/100 μL을 얻습니다.
- 입력 및 출력 샘플에서 총 세균 수를 입력(400 μL) 및 출력 볼륨(1 mL)으로 각각 곱하여 입력 셀 수와 나누어 농축을 추정합니다.
참고: 3-5선발 후 상당한 보강이 가시화되어야 합니다.
5. 선택한 비라 변형의 특성화
참고: 특성화는 첫 번째 BirA 라이브러리에서 BirA 변형을 선택한 후 수행할 수 있습니다. 그러나, BirA 변이체는 일반적으로 펩티드쪽으로 낮은 활성을 가지고 있다. 따라서 특성화 전에 추가적인 돌연변이 및 선택을 수행할 수도 있습니다. 일반적으로 최종 선택 라운드에서 10개의 복제본이 추가 특성화를 위해 격리됩니다.
- 최종 선택 라운드에서 선택한 클론과 함께 100 μg/mL ampicillin을 포함하는 5 mL LB를 접종하십시오. 또한, 100 μg/mL ampicillin을 함유하는 5 mL LB를 T7 익스프레스 lysY/Iq E. 대장균으로 pBAD-BirA-eCPX-AP로 변형시켰으며, 이는 아래에 설명된 서부 블롯에 대한 포지티브 컨트롤로 사용될 것이다.
- 200 rpm에서 흔들어 37 °C에서 밤새 배양.
- 배양에 글리세롤을 최종 농도15%에 첨가하여 각 야간 배양물의 850 μL의 동결 주식을 만듭니다. -80 °C에서 보관하십시오.
- 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB의 5 mL을 밤새 배양한 100 μL로 접종하고 2시간 동안 200 rpm에서 흔들어 37°C에서 배양한다.
- 플라스미드 DNA를 상업적으로 미니 프렙 DNA 추출 키트에 의해 나머지 4 mL 배양물로부터 추출한다. pBAD (ATGCCATAGCATTTATCC) 및 pTrcHis 레브 (CTTCTGCGTTCTGATTTTAtTG) 프라이머와 비라 변이체의 전진 및 역 방향으로 DNA 서열을 수행합니다.
- 0.2% w/v L-아라비노스 및 100 μM IPTG 및 100 μM 비오틴을 5.4단계에서 배양에 넣고 37°C에서 1시간 동안 200 rpm에서 배양을 흔들어 eCPX 및 BirA 변이체의 발현을 유도한다.
- 배양의 65 μL을 시료 로딩 버퍼의 25 μL 및 환원제의 10 μL을 함유하는 1.5 mL 튜브로 이송한다.
- 95°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 샘플(양성 대조군 포함)을 크기 마커와 함께 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 20, 25 및 37 kDa 표준 대역이 명확하게 분리될 때까지 약 45분 동안 200V에서 겔 전기 영동을 수행합니다.
- 카세트에서 젤을 방출하고 PVDF 멤브레인에 젤을 블롯하기 위해 샌드위치를 조립합니다.
- 얼음에 2 시간 동안 35V에서 전기 블롯.
- PVDF 멤브레인을 제거하고 블로킹 버퍼 [PBS, 0.05% 트웬-20, 3% 탈지 분유]를 실온에서 1시간 동안 흔들어 서 배양한다.
- PBST에서 스트렙타비딘-HRP 1:1,000을 희석하여 비오틴 검출 솔루션을 준비합니다.
참고: 차단 버퍼는 비오틴을 포함하므로 스트렙타비딘-HRP에 대한 희석 버퍼로 사용해서는 안 됩니다. - 차단 버퍼를 버리고, 멤브레인을 PBST [PBS, 0.05% Tween-20]에서 신속하게 세척하고 비오틴 검출 용액을 첨가한다. 흔들림과 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 비오틴 검출 용액을 버리고 PBST에서 멤브레인을 5 분 2 회 및 10 분 동안 실온에서 부드럽게 흔들어 서 완전히 씻어 내십시오.
- PBST를 버리고, 2 mL ECL 믹스를 추가하고 흔들림으로 1 분 동안 배양하십시오.
- 막을 티슈 페이퍼에 신속하게 건조시키고 X선 필름 이나 디지털 젤 이미징 시스템에서 이미지를 개발합니다.
참고: 양성 대조군으로 적재된 차선에서, 두 개의 뚜렷한 스트렙타비딘 반응 밴드는 명확하게 볼 수 있어야 합니다: 30 kDa 생생화 내생 단백질및 ~22 kDa eCXP-AP 대역. 10개의 선택된 콜로니가 표시된 펩티드를 바이오티니어할 수 있다면, ~22 kDa의 밴드가 표시되어야 한다. 이들 밴드의 강도는 일반적으로 양성 대조군보다 낮으며, 따라서 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있다.
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Representative Results
pBAD-BirA-eCPX-AP 발현 박테리아의 서쪽 얼룩은 eCPX의 분자량과 일치하는 ~22 kDa 스트렙타비딘 반응 밴드를 생성한다(도2a). BirA-6xHis와는 달리, 생체티닐화된 eCPX-AP는 유도되지 않은 배양물 및 유도된 배양물 모두에서 존재하였다(도2a)내인성 비라에 의한 AP의 유도되지 않은 배양 및 후속 생물항화에서도 T7 프로모터 활성의 작은 정도로 인해. 비라-eCPX-AP(K10A)에서 배양어를 발현하는 경우, 생체화된 eCPX 대역은 검출되지않았다(도 2a). eCPX-AP 발현 박테리아에서 강한 표면 생체형성은 스트렙타비딘 자기 비드를 첨가하고 튜브의 바닥에 펠릿을 형성하면 응집을일으킨다(그림 2b). eCPX-AP(K10A) 발현 박테리아에서, 스트렙타비딘-비드 응집 및 침전은 관찰되지않았다(도 2b). 스트렙타비딘 풀다운으로부터의 침전물의 분석은, eCPX-AP 배양물로부터의 샘플에서 명확한 22-kDa 스트렙타비딘 반응 및 항-6xHis 밴드를 표시하지만, eCPX-AP(K10A) 배양물(그림2c)은아니다. 유사하게, 스트렙타비딘 비드에 결합된 박테리아의 수는 eCPX-AP(K10A) 배양체보다 eCPX-AP에서 유의하게높았다(도 2d).
표적 펩티드를 바이오티니레이팅하는 BirA 변이체를 선택하기 위해, DNA 서열은 1.10 단계 및 1.11단계에서 설계된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 eCPX의 C 말단에 통합되었다. 상피Na+ 채널(ENaC)의 α-서브유닛으로부터 유래된 펩티드 서열의 혼입을 위해 설계된 프라이머의 예는 도3a에도시되어 있다. PCR 후, 5-μL aliquot를 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하고 ~5900 bp에서 명확하고 강한 밴드를 관찰하였다(도3b).
BirA 돌연변이 라이브러리의 생성 후, 활성 BirA 변이체의 선택이 시작되었다. 첫 번째 선발 라운드 후 스트렙타비딘 바운드 대 입력 박테리아의 낮은 정도가 예상되었다. 그러나,2차 및3회 선발 라운드 후 스트렙타비딘 결합 균도도 4a)에서명확한 농축이 관찰되었다. 명확한 농축이 검출되지 않는경우(도 4b),펩티드를 바이오티미를 하는 BirA 변이체의 실패를 나타내고 다른 펩티드 서열은 따라서, 시험되어야 한다.
최종 선발 라운드 후, 10개의 클론은 표시된 펩티드를 바이오티니레이팅하는 능력에 대한 웨스턴 블로팅을 특징으로하였다(도 4c). 양성 대조군(즉, AP)에서, 생체티니에이징된 eCPX-AP에 상응하는 ~22 kDa 대역은 스트렙타비딘-HRP로 조사된 서부 블롯에서 관찰되었다(도4c). 시험된 클론에서, 유사한 크기의 대역은 eCPX에 융합된 표시된 펩티드의 생체측화를 나타내고있었다(도 4c). ~22 kDa 대역의 강도는 양성 대조군에서 eCPX-AP 대역의 강도보다 낮았으며, 이는 단리된 BirA 변이체의 낮은 활성을 나타낸다. 따라서 분리된 클론은 또 다른 돌연변이 및 선택을 위한 템플릿으로 사용될 수 있으며, 매우 활동적인 클론을 생성합니다. 추가의 밴드는 단리된 클론이 표시된 펩티드를 향해 특이적이지 않았으며 추가의 표적도 생체티니에이치(도4c)를나타낸다.
| 시약 | 볼륨(μL) |
| 5x 반응 버퍼 | 4 |
| 10 mM dNTP | 0.4 |
| 10 μM 포워드 프라이머 | 1 |
| 10 μM 리버스 프라이머 | 1 |
| pBAD-비라-eCPX-AP | 가변(~25ng) |
| 고충실도 DNA 폴리머라제 | 0.20 |
| 뉴클레아제 없는 물 | ~ 20 |
표 1: PCR 시약. 장치 와 볼륨은 제조업체마다 다를 수 있습니다.
| 시약 | 볼륨(μL) |
| 효소 믹스 2x | 25 |
| 표적 펩타이드 서열을 가진 pBAD-BirA-eCPX-AP* | 가변(~50ng) |
| 돌연변이 메가프라이머 | 250 ng |
| 버퍼 | 3 |
| 뉴클레아제 없는 물 | 최대 50 |
표 2: 오류가 발생하기 쉬운 PCR 시약. 장치 와 볼륨은 제조업체마다 다를 수 있습니다. * 프로토콜의 섹션 1에서 준비.
그림 1: BirA 선택을 위한 박테리아 표시 시스템입니다. (a)시스템은 2성분의 공동 발현을 기초로 하였다: 비라 및 eCPX와 수용체 펩티드(AP)가 융합되었다. eCPX는 표면으로 이송되고, BirA 변이체가 AP를 생체로 분류하는 경우, eCPX-AP에 부착된 비오틴(빨간색 B)이 표면에 표시된다. (b)시스템은 플라스미드 pBAD-BirA-eCPX-AP로부터 발현되었고, 여기서 비라 발현은 아라비노스 유도 성 프로모터에 의해 제어되고 eCPX-AP 발현은 T7 프로모터에 의해 구동된다. (c)BirA 변이체(1단계)의 임의로 돌연변이된 라이브러리의 생성 후, BirA 및 eCPX-AP 발현이 유도되었다(단계 2). 박테리아를 친화성 시약(단계 3)으로 배양하고, 언바운드 박테리아를 폐기(단계 4) 및 선택된 박테리아를 증폭시켰다(단계 5). 이 그림은 Granhøj 등에서수정되었습니다. 9이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: pBAD-BirA-eCPX-AP 및 pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)를 갖춘 모델 선택에서 의한 대표적인 결과. (a)서쪽 블로팅에 의해, eCPX-AP는 비라의 유도 후에도 eCPX-AP(K10A)의 생체이식이 검출되지 않은 반면, 유도되지 않은 박테리아 및 유도된 박테리아 모두에서 생체측화되는 것으로 관찰되었다. BirA 발현은 항-6xHis 항체에 의해 검출되었다. * BirA가 유도되었을 때 특이하지 않은 스트렙타비딘 반응 단백질을 나타냅니다. (b)비라 및 eCPX-AP 골재의 유도된 발현을 가진 세균 배양체는 자성 스트렙타비딘 비드(화살표)를 첨가한 후 급속히 응집되지 않은 반면 AP(K10A) 박테리아에서 응집이 관찰되지 않았다. (c)BirA는 eCPX-AP 및 eCPX-AP(K10A)를 발현하는 박테리아에 존재하였으나, eCPX-AP 발현 박테리아에서 비라만이 스트렙타비딘에 의해 당겨졌다. 합의에서,(d)생존 가능한 박테리아는 eCPX-AP에서 유효하지만, eCPX-AP(K10A)는 아니지만, 박테리아를 발현하였다. 이 그림은 Granhøj 등에서수정되었습니다. 9이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PCR에 의한 pBAD-BirA-eCPX-AP에 표적 펩타이드 코딩 서열을 프라이머 설계 및 통합. (a)αENaC로부터 유래된 펩타이드 서열의 혼입에 사용되는 프라이머 설계의 예는 eCPX의 C-단말내로 한다. 리신을 받아들이는 비오틴은 빨간색으로 나타난다. 표적 펩티드 서열은 DNA로 역전환되었고, 전진 및 역프라이머는 프라이머 들 사이에 ~15염기 중첩을 보장함으로써 설계되었다. (b)α, β 및 γ-ENaC 유래 펩티드 서열에 특이적인 템플릿 및 프라이머로서 pBAD-BirA-eCPX-AP를 가진 PCR의 대표적인 아가로즈 겔 전기영동. ~5900 bp에서 명확하고 강한 DNA 생성물은 성공적인 PCR을 나타내고 있었다. "M"은 마커 레인을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 펩티드를 표시하는 박테리아의 선택 및 특성화에서 대표적인 결과. (a)TagRFP로부터 유래된 펩티드를 나타내는 박테리아는 3회 선택 라운드 후 명확한 농축을 보였으며,(b)EGFP로부터 유래된 펩티드는 4회 선택 라운드 후에도 스트렙타비딘 결합 박테리아의 농축을 나타내지 않았다. (c)γENaC로부터 5회 선택 라운드를 통해 펩티드를 나타내는 박테리아의 10개의 클론이 γENaC-펩티드를 생체티니어화하는 능력에 대해 시험하였다. 모든 10개의 클론은 eCPX-AP의 크기와 일치하는 스트렙타비딘 반응 밴드를 보였으며, 이는 분리된 클론에 표시된 펩티드를 생물항화하는 BirA 변이체를 함유하고 있음을 나타낸다. 추가 스트렙타비딘 반응 밴드는 또한 관찰되었다, 다른 단백질을 나타내는, 표시된 펩티드 외에, 또한 생체 티니화되었다. * 비라에 의해 생성된 내인성 대장균 단백질을 나타냅니다. 이 그림은 Granhøj 등에서수정되었습니다. 9이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
모든 선택 방법에 관해서는, 세척 단계의 엄격성이 가장 중요합니다. 박테리아는 선택된 클론의 증폭 전에 구슬에서 용출될 필요가 없기 때문에, 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 높은 친화도 결합은 이전에 파지 디스플레이 시스템과 마찬가지로 낮은 친화도 아비딘을 사용하는 대신 사용될 수 있습니다. BirA 변종7,8의선택 . 이것은 희귀 한 클론이 선택되고 비 생체 박테리아가 폐기되도록합니다. 파지 디스플레이와 비교하여 세균 디스플레이를 사용하는 또 다른 장점은 세균 디스플레이가 정량적11이며, 따라서 효소 활성에 기초하여 박테리아의 선택을 허용한다는 것입니다.
프로토콜에서, 우리는 표면에 비오틴의 존재 또는 부재에 기초하여 이진 선택 시스템을 만드는 박테리아를 선택하는 MACS를 사용했다. 그러나, 정량형 형광 활성화 세포 선별을 사용하여, 대신, BirA의 가장 활성 변이체를 발현하는 박테리아를 선택할 수 있어야 한다. 이것은 가장 활동적인 BirA 변종에 대한 효과적인 선택을 허용하기 때문에 소설 BirA 변종의 향후 개발에 중요 할 것입니다.
우리는, 지금까지, 14개의 다른 펩티드의 세균 성 표시를 사용하고, 그 중, 13은 명확한 농축9를일으켰습니다, 우리의 선택 시스템이 새로운 BirA 변이체를 위해 선택하는 강력한 방법을 제공한다는 것을 나타내는. 현재 설정에서, 우리는 단지 15 아미노산 펩티드를 향해 활성화되는 BirA 변이체의 선택을 시험하고, 따라서 우리는 우선적으로 표적 단백질의 1 차 적인 순서를 향해 활성화되는 BirA 변이체를 위해 선택했습니다. 표적 리신은, 그러나, 단백질의 3D 구조물 안쪽에 묻혀 있거나 BirA를 위해 달리 접근할 수 없습니다, 그들의 표적 단백질에 대하여 활성화되지 않는 BirA 이체를 산출할 수 있습니다. 잠재적인 해결책은 eCPX에 더 큰 단백질 단편을 표시하는 것입니다. eCPX 스캐폴드는 펩타이드디스플레이(11)에대하여 다재다능하다; 그러나, 더 큰 단백질이 표시될 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다.
우리는 선택 시스템을 사용하여 네이티브 TagRFP9을biotinylates 하는 BirA 변종을 분리했습니다. 시험된 BirA 변이체는 표적 리신에 대해 구체적으로 생체활성TagRFP를 지정했지만, 단리된 변이체의 활성은9. 따라서, 그 활동을 향상시키기 위해 지시 진화의 추가 라운드를 수행해야합니다. 표적 펩티드는 표기된 펩티드와 단백질 영역 사이의 구조적 유사성이 더 가능성이 높은 TagRFP의 C-말단에 있다. 모든 인간 및 마우스 단백질의 생물 정보학적 분석은 단백질의 ~75%가 그들의 첫번째 및/또는 마지막 30개의 아미노산9안에 하나 이상의 리신을 함유하고 있음을 보여줍니다. 따라서, 펩티드의 세균 진찰 시스템은 잠재적으로 활성 BirA 변이체를 네이티브 단백질의 큰 분획으로 격리하는데 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 전문 기술자 지원에 대한 모하메드 압둘라흐리 아메드 감사. 이 작품은 룬드벡 재단, 노보 노디스크 재단, 덴마크 신장 협회, 아세 og Ejnar 다니엘센 재단, 의학 발전을위한 A.P. Møller 재단, 그리고 크누드와 에디스 에릭센의 보조금에 의해 지원되었다 기념 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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