Summary
Aquí presentamos un método para seleccionar nuevas variantes de la E. coli biotin-protein ligase BirA que biotinyla un péptido objetivo específico. El protocolo describe la construcción de un plásmido para la visualización bacteriana del péptido objetivo, la generación de una biblioteca BirA, la selección y caracterización de variantes BirA.
Abstract
La biotina es una atractiva modificación post-traduccional de proteínas que proporciona una potente etiqueta para el aislamiento y detección de proteínas. La biotinylación enzimática por la E. coli biotin-protein ligase BirA es muy específica y permite la biotinylación de proteínas diana en su entorno nativo; sin embargo, el uso actual de biotinilación mediada por BirA requiere la presencia de un péptido aceptador sintético (AP) en la proteína diana. Por lo tanto, su aplicación se limita a las proteínas que han sido diseñadas para contener el AP. El propósito del presente protocolo es utilizar la visualización bacteriana de un péptido derivado de una proteína diana no modificada para seleccionar las variantes de BirA que biotinylates el péptido. El sistema se basa en un único plásmido que permite la co-expresión de variantes BirA junto con un andamio para la visualización de péptidos en la superficie bacteriana. El protocolo describe un procedimiento detallado para la incorporación del péptido objetivo en el andamio de la pantalla, la creación de la biblioteca BirA, la selección de variantes de BirA activas y la caracterización inicial de las variantes aisladas de BirA. El método proporciona un sistema de selección altamente eficaz para el aislamiento de nuevas variantes BirA que se pueden utilizar para la evolución más dirigida de ligasas biotina-proteína que biotinylan una proteína nativa en soluciones complejas.
Introduction
La biotinylación de una proteína crea una etiqueta poderosa para su aislamiento y detección de afinidad. La biotinylación de proteínas enzimáticas es una modificación post-traduccional altamente específica catalizada por ligasas de biotina y proteína. La E. coli biotin-protein ligase BirA es extremadamente específica y covalentemente biotinyla sólo un número restringido de proteínas de origen natural en residuos específicos de lisina1. Las ventajas de la biotinilación catalizada por BirA se aprovechan actualmente fusionando la proteína diana con un pequeño péptido sintético de 15 aminoácidos que acepta la biotina (AP) que se biotintiza eficazmente2 y permite el altamente específico y biotinylación eficiente in vivo e in vitro por coexpresión o adición de BirA3,4,5. Aunque la ligadura biotina-proteína catalizada in vivo e in vitro de BirA es una estrategia de etiquetado atractiva, su aplicación se limita a muestras que contienen proteínas fusionadas con AP. El propósito de este método es el desarrollo de nuevos mutantes de ligasas biotina-proteína que biotinylan selectivamente proteínas nativas no modificadas y, de este modo, ampliar el número de aplicaciones en las que se puede utilizar la estrategia de biotintinación enzimática.
La función proteica se puede evolucionar a través de rondas iterativas de la mutación genética, selección y amplificación de variantes genéticas con la función deseada. Una estrategia de selección fuerte y eficiente es crucial para la evolución dirigida y la actividad de la ligasa de proteína sin biotina se selecciona fácilmente debido a la fuerte unión entre la biotina y la estreptavidina y sus homólogos6. Las tecnologías de visualización de Phage permiten la selección de fagos que muestran péptidos biotinilados7,8. Dado que la amplificación de fagos aislados requiere la infección de un huésped bacteriano, sin embargo, la selección del fago con estreptavidina crea un cuello de botella en el que la unión de alta afinidad de biotina a la estreptavidina es prácticamente irreversible bajo la no desnaturalización Condiciones. Para garantizar la unión reversible de fagos biotinilados, se utilizaron ávidinas monoméricas con menor afinidad que dieron lugar a un modesto enriquecimiento de10veces 7 . Recientemente hemos desarrollado un método de visualización bacteriana para el aislamiento de nuevas variantes BirA que elimina la necesidad de la elución de la matriz de afinidad y por lo que elimina un cuello de botella de los sistemas de selección BirA anteriores9. De hecho, nuestro sistema de visualización bacteriana permite un enriquecimiento de 1.000.000 de clones activos en un solo paso de selección9,proporcionando así un sistema de selección eficaz para la evolución dirigida de las nuevas variantes BirA.
Nuestro sistema de visualización bacteriana consta de dos componentes, BirA con una etiqueta C-terminal 6xHis y una proteína de andamio que permite la visualización superficial de un péptido objetivo. Utilizamos la proteína andamio mejorada circularmente permutada proteína de membrana externa X (eCPX) ya que la visualización efectiva de péptidos se puede observar tanto en el N- y C-termini10,11. La fusión de la secuencia de péptidos diana con el Término C de eCPX asegura la biotinilación de bacterias que expresan variantes activas de BirA. Las bacterias permiten la selección efectiva de la estreptavidina, ya que el péptido biotintilado ahora se muestra en la superficie(Figura 1a).
El propósito de este método es seleccionar para nuevas variantes de BirA que biotinylates secuencias de péptidos presentes en proteínas nativas. El sistema está codificado por genes presentes en el plásmido pBAD-BirA-eCPX-AP, que contiene un promotor inducible de arabinosa que controla BirA (araBAD), y un promotor T7 que controla eCPX9 (Figura 1b). El presente protocolo describe el procedimiento detallado para 1) la incorporación de un péptido derivado de una proteína diana en el terminal C de eCPX, 2) la creación de una biblioteca mutacional de BirA mediante PCR propensa a errores, 3) selección de bacterias de unión a la estreptavidina por clasificación celular activada magnéticamente (MACS), 4) cuantificación del enriquecimiento de bacterias y 5) caracterización inicial de clones aislados.
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Protocol
1. Inserción de la secuencia de secuenciación de codificación de péptidos en pBAD BirA-eCPX-AP
NOTA: Para seleccionar las variantes de BirA que biotinylan una proteína diana nativa, comience por identificar una secuencia de péptidos de 15 aminoácidos en la secuencia primaria de proteínas que contiene al menos un residuo de lisina (K).
- Vaya a la suite de manipulación desecuencias 12.
- Pegue la secuencia de péptidos de aminoácidos identificada de 15 en la caja de entrada en formato FASTA y pulse Enviar.
- Seleccione y copie la traducción inversa de 45 nucleótidos de la secuencia de péptidos.
- Descargue el archivo GenBank para pBAD-BirA-eCPX-AP desde http://n2t.net/addgene:121907.
- Cargue el archivo en un editor de plásmidos (por ejemplo, ApE) y, en la ventana de características, seleccione la secuencia AP designada "AviTag(TM)".
- Haga clic con el botón derecho en la secuencia DE AP resaltada en la ventana de secuencia de ADN y seleccione Pegar Rev-Com en el menú contextual.
NOTA: La secuencia de codificación de eCPX está en la dirección inversa y la secuencia de codificación de péptidos debe, por lo tanto, pegarse como un complemento inverso. - Haga clic con el botón derecho en la secuencia resaltada y seleccione Nueva función.
- Agregue un nombre descriptivo de la secuencia insertada y pulse OK.
- Seleccione Guardar como en el menú Archivo para guardar el archivo modificado.
- Diseñar la imprimación delantera para incluir los últimos 30 nucleótidos del complemento inverso de la secuencia de codificación de péptidos y añadir la secuencia de nucleótidos de unión plásmido (3'-GCGGCCGCCTGC-5') a su extremo de 5').
- Diseñar la imprimación inversa para incluir los primeros 30 nucleótidos del complemento inverso de la secuencia de codificación de péptidos y añadir la secuencia de nucleótidos de unión plásmido (3'- CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5') a su extremo de 5').
- Configure una reacción de PCR de 20 l en un tubo de PCR de paredes delgadas añadiendo los reactivos enumerados en la Tabla 1.
- Transfiera el tubo a un ciclor térmico y realice la PCR utilizando un programa con una desnaturalización inicial a 98 oC durante 30 s, 30 ciclos de [15 s a 98 oC, 15 s a 60 oC y 3 min a 72 oC], extensión final durante 2 min a 72 oC y mantener a 4 oC.
- Ejecutar 5 l de la reacción de PCR en un gel de agarosa del 1% para confirmar la amplificación de un producto PCR de 6 kb.
NOTA: Si no se observa ningún producto PCR, optimice la condición de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El protocolo se puede pausar aquí. - Añadir 1 l de DpnI a la reacción de PCR e incubar durante 1 h a 37 oC
- Transforme el E. coli competente con 2 l de reacción de PCR digerida dpnI y placa en caldo lysogénico (LB)/placas de amperio. Incubar durante la noche a 37oC.
- Inocular 5 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con una sola colonia. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 200 rpm.
NOTA: Se recomienda probar al menos 6 colonias. - Hacer poblaciones de congelación de 850 l de cada cultivo nocturno añadiendo glicerol a una concentración final del 15% al cultivo. Conservar a -80oC.
- Extraiga el ADN plásmido del cultivo restante de 4 ml mediante un kit de extracción de ADN mini-preparación.
- Confirmar la correcta inserción de la secuencia de codificación de péptidos mediante secuenciación de ADN utilizando la imprimación de terminal T7 (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).
2. Generación de una Biblioteca BirA
NOTA: La biblioteca mutacional inicial de BirA(Figura 1c, paso 1) es creada por PCR propensa a errores. Es probable que otros métodos para generar la biblioteca mutacional de BirA también funcionen.
- Sintetizar los megaprimers mutantes con BirA-6xHis hacia adelante (ATAGAGGATAACACCGTGCC) y inverso (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) imprimaciones usando 1 ng de pBAD-BirA-eCPX con la secuencia de péptidos objetivo (preparado y confirmado en el paso 1.20) como plantilla y 35 ciclos de PCR con una temperatura de recocido de 60 oC según las instrucciones del fabricante.
- Ejecutar 5 l de la reacción de amplificación en un gel de agarosa del 1% para verificar la amplificación de un producto PCR de 984 bp.
- Purificar el producto PCR de los 45 s l restantes de la reacción de amplificación utilizando un kit de purificación de PCR comercial y utilice un espectrofotómetro para cuantificar el rendimiento del ADN.
NOTA: La purificación a partir de una sola reacción de amplificación de 45 s generalmente produce un rendimiento suficiente (>250 ng). - Prepare la reacción de la muestra en un tubo pcR de paredes delgadas añadiendo los reactivos enumerados en la Tabla 2.
- Transfiera la mezcla de reacción a un ciclor térmico y ejecute la PCR con los megaprimers mutantes preparados en el paso 2.3 utilizando los siguientes parámetros: 1 min a 95 oC y 25 ciclos de 50 s a 95 oC, 50 s a 60 oC y 12 min a 68 oC. Conservar la reacción a 4oC.
- Añadir 1 l de enzima de restricción dpnI directamente a la reacción de amplificación y mezclar suavemente.
- Esgire la mezcla de reacción e incubar durante 2 h a 37oC.
- Transformar T7 Express lisY/Iq células competentes de E. coli con 2 l de la reacción DpnI.
- Inocular 100 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con las células transformadas e incubadurante durante la noche a 37 oC con agitación a 200 rpm.
- Hacer existencias de congelador con 10 ml del cultivo nocturno en LB con 15% de glicerol y almacenar a -80 oC.
3. Selección de bacterias que expresan péptido biotinilado
NOTA: Esta parte del protocolo cubre el paso 2-5 de la Figura 1c. Se recomienda encarecidamente que el enfoque de selección se configure utilizando pBAD-BirA-eCPX-AP y pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) como controles positivos y negativos.
- Inocular 100 ml de LB que contiene 1% de glucosa y 100 g/ml de ampicilina con 1 ml de la biblioteca BirA e incubar durante la noche a 37 oC con temblores a 200 rpm.
- Inocular 5 ml de LB que contienen 1% de glucosa y 100 g/ml de ampicilina con 100 ml del cultivo nocturno.
- Incubar durante 2 h y 30 min hasta que el cultivo alcance una OD600 de aproximadamente 0,5.
- Inducir la expresión de eCPX y BirA con 0,2% p/v L-arabinose, 100 m de isopropilo-D-1-tiogalactopiranoside (IPTG) y biotina de 100 oM y agitar el cultivo a 200 rpm durante 1 h a 37 oC.
- Centrifugar la cultura durante 10 min a 5.000 x g y eliminar el sobrenadante.
- Resuspenda las células en 1 ml del PBS helado y centrífuga a 5.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 400 ml de PBS helado y almacene las células en el hielo.
- Retire 10 l de células resuspendidas y guárdelas en el hielo en un tubo de 1,5 ml etiquetado como "Entrada".
- Lavar 20 ml de perlas magnéticas de estreptavidina en 1 ml de PBS helado y colocar el tubo en un separador de partículas magnéticas de sobremesa antes de retirar cuidadosamente el sobrenadante.
- Resuspenda las perlas magnéticas de estreptavidina en 20 ml de PBS helado y transfiera a los 390 oL de células resuspendidas desde el paso 3.8.
- Mezcle pipeteando suavemente y luego incubar durante 30 min a 4 oC.
NOTA: No vórtice ya que esto puede atislar las células. La agregación de perlas se observa a menudo con una gran abundancia de bacterias que muestran un péptido biotinulado. - Coloque una columna con esferas ferromagnéticas en un separador de partículas magnéticas y lávela con 5 ml de PBS helado.
- Transfiera las células y los perlas magnéticas de estreptavidina a la columna conectada en el separador.
- Una vez que el depósito de la columna esté vacío, añadir 500 l de PBS helado y repetir hasta que la columna se haya lavado con un volumen total de 5 ml de PBS helado.
- Retire la columna del separador y colóquela en un tubo de 1,5 ml.
- Pipetear 1 ml del PBS helado en la columna y eluir las células etiquetadas magnéticamente aplicando el émbolo suministrado con la columna.
- Transfiera el tubo de 1,5 ml a un separador de sobremesa y lave la celda etiquetada magnéticamente con 1 ml de PBS helado.
- Resuspenda suavemente las células etiquetadas magnéticamente en 1 ml del PBS helado antes de retirar y almacenar 10 ml de la resuspensión en un tubo de 1,5 ml etiquetado como "Salida".
- Inocular 100 ml de LB que contiene 1% de glucosa y 100 g/ml de ampicilina con las células etiquetadas magnéticamente e incubadurante durante la noche a 37 oC con temblores a 200 rpm.
- Al día siguiente, utilice 10 ml del cultivo nocturno para hacer existencias de congelador con células en LB con 15% de glicerol y almacenar a -80 oC y 1 ml del cultivo nocturno para la siguiente ronda de selección, es decir, paso 3.2.
NOTA: Generalmente, 3-5 rondas de selección se recomiendan para el enriquecimiento de bacterias de unión a la estreptavidina.
4. Cuantificación del enriquecimiento
NOTA: La cuantificación de las bacterias vivas en las muestras de "entrada" y "salida" se realiza después de cada ronda de selección mediante el revestimiento de diluciones en serie de las muestras y el posterior recuento de unidades formadoras de colonias (Unidades formadoras de colonias).
- Agregue muestras de PBS heladas de 990 l a las muestras de entrada (del paso 3.8) y de salida (del paso 3.18) y etiquete los tubos "Entrada 10-2"y "Salida 10-2",respectivamente.
- Realice 10 diluciones seriales de las muestras "Entrada 10-2"y "Salida 10-2"en PBS helado hasta que se alcance una dilución final de 10-10 en la muestra de entrada y 10-4 en la muestra de salida.
- Placa 100 l de muestras de "Entrada 10-6","Entrada 10-8","Entrada 10-10","Salida 10-2","Salida 10-3"y "Salida 10-4"en placas LB/Amp e incubar durante la noche a 37oC.
- Cuente el número de colonias en las placas con colonias claramente separadas. Multiplique el recuento de colonias con el factor de dilución para obtener el recuento de concentración bacteriana/100 l.
- Calcule el recuento bacteriano total en las muestras de entrada y salida multiplicando la concentración de celda con el volumen de entrada (400 sL) y el volumen de salida (1 ml), respectivamente, y calcule el enriquecimiento dividiendo la salida con el recuento de celdas de entrada.
NOTA: Un enriquecimiento significativo debe ser visible después de 3-5 rondas de selección
5. Caracterización de la variante BirA seleccionada
NOTA: La caracterización se puede realizar después de seleccionar variantes BirA de la primera biblioteca BirA; sin embargo, las variantes de BirA generalmente tienen baja actividad hacia el péptido. Por lo tanto, también se puede realizar una ronda adicional de mutación y selección antes de la caracterización. Por lo general, 10 clones de la ronda de selección final se aíslan para su posterior caracterización.
- Inocular 5 ml LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con clones seleccionados de la ronda de selección final. Además, inocular 5 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con T7 Express lysY/Iq E. coli transformada con pBAD-BirA-eCPX-AP, que se utilizará como un control positivo para la mancha occidental descrita a continuación.
- Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 200 rpm.
- Hacer poblaciones de congelación de 850 l de cada cultivo nocturno añadiendo glicerol a una concentración final del 15% al cultivo. Conservar a -80oC.
- Inocular 5 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con 100 ml de cultivo durante la noche e incubar a 37 oC con agitación a 200 rpm durante 2 h.
- Extraiga el ADN plásmido del cultivo restante de 4 ml mediante el kit de extracción de ADN de minipreparación comercial. Realizar la secuencia de ADN en direcciones directas e inversas de las variantes BirA con imprimaciones pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) y pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG).
- Añadir 0,2% p/v L-arabinose y 100 oM de IPTG y biotina de 100 m a los cultivos del paso 5.4 y agitar el cultivo a 200 rpm durante 1 h a 37 oC para inducir la expresión de las variantes eCPX y BirA.
- Transfiera 65 ml del cultivo a tubos de 1,5 ml que contengan 25 ml del tampón de carga de la muestra y 10 ml del agente reductor.
- Incubar a 95oC durante 5 min.
- Cargue la muestra (incluido el control positivo) en un gel de poliacrilamida SDS al 12% junto con un marcador de tamaño y realice electroforesis de gel a 200 V durante aproximadamente 45 minutos hasta que las bandas estándar de 20, 25 y 37 kDa estén claramente separadas.
- Suelte el gel del cassette y monte el sándwich para la hinchazón del gel en una membrana PVDF.
- Electroblot a 35 V durante 2 h sobre hielo.
- Retire la membrana PVDF e incubar en tampón de bloqueo [PBS, 0.05% Tween-20, 3% Skim Milk Powder] durante 1 h a temperatura ambiente con temblor.
- Prepare la solución de detección de biotina diluyendo streptavidina-HRP 1:1,000 en PBST.
NOTA: El tampón de bloqueo contiene biotina y, por lo tanto, no debe utilizarse como tampón de dilución para la estreptavidina-HRP. - Deseche el tampón de bloqueo, lave la membrana rápidamente en PBST [PBS, 0.05% Tween-20] y agregue la solución de detección de biotina. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente con agitación.
- Deseche la solución de detección de biotina y lave bien la membrana en PBST durante 5 minutos dos veces y 10 minutos una vez con un suave temblor a temperatura ambiente.
- Deseche el PBST, agregue la mezcla ECL de 2 ml e incuba durante 1 min con la agitación.
- Seque la membrana rápidamente en un papel tisú y desarrolle la imagen en una película de rayos X o en un sistema digital de imágenes de gel.
NOTA: En el carril cargado con el control positivo, dos bandas de reacción de estreptavidina distintas deben ser claramente visibles: una proteína de 30 kDa biotinilada con expresada endógenamente y la banda eCXP-AP de 22 kDa. Si las 10 colonias seleccionadas pueden biotinylar el péptido mostrado, una banda de 22 kDa debe ser visible. La intensidad de estas bandas es generalmente menor que el control positivo y, por lo tanto, puede requerir tiempos de exposición más largos.
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Representative Results
La mancha occidental de bacterias que expresan pBAD-BirA-eCPX-AP produce una banda de reacción de estreptavidina de 22 kDa consistente con el peso molecular de eCPX(Figura 2a). A diferencia de BirA-6xHis, eCPX-AP biotintida estaba presente en cultivos no inducidos e inducidos(Figura 2a) debido a un pequeño grado de actividad promotora de T7 incluso en cultivos no inducidos y posterior biotinylación de la AP por BirA endógeno. En los cultivos de expresión BirA-eCPX-AP(K10A), no se detectó ninguna banda eCPX biotinilada(Figura 2a). La biotinilación de superficie fuerte en la bacteria que expresa eCPX-AP provoca la agregación tras la adición de perlas magnéticas de estreptavidina y la formación de un pellet en la parte inferior de un tubo(Figura 2b). En la bacteria de la expresión eCPX-AP(K10A), no se observó la agregación y precipitación de estreptavidina-perlas (Figura 2b). El análisis del precipitado de la extracción de estreptavidina, muestra una banda clara de 22 kDa de reacción de estreptavidina y anti-6xHis en las muestras de cultivos eCPX-AP, pero no de cultivos eCPX-AP(K10A) (Figura 2c). Del mismo modo, el recuento de bacterias unidas a las perlas de estreptavidina fue significativamente mayor en el eCPX-AP que los cultivos eCPX-AP(K10A)(Figura 2d).
Para seleccionar las variantes de BirA que biotinylan un péptido diana, su secuencia de ADN se incorporó al terminal C de eCPX por PCR utilizando las imprimaciones diseñadas en los pasos 1.10 y 1.11. En la Figura 3a.se muestra un ejemplo de las imprimaciones diseñadas para la incorporación de una secuencia de péptidos derivadas de la subunidad de la subunidad de la na+ epitelial (ENaC). Después de la PCR, se analizó una alícuota de 5-L mediante electroforesis de gel de agarosa y se observó una banda clara y fuerte a 5900 bp(Figura 3b).
Después de la generación de la biblioteca de mutaciones BirA, se inició la selección de variantes de BirA activas. Se esperaba un bajo grado de bacterias de entrada ligadas a estreptavidina frente a bacterias de entrada después de la primera ronda de selección. Sin embargo, después de las rondas deselección 2y 3 a se observó un claro enriquecimiento en el grado de bacterias ligadas a la estreptavidina Figura 4a). Si no se detecta un enriquecimiento claro(Figura 4b),es indicativo de la incapacidad de las variantes de BirA para biotinylar el péptido y, por lo tanto, se debe probar otra secuencia de péptidos.
Después de la ronda de selección final, 10 clones se caracterizaron por la hincha occidental por su capacidad para biotinylate el péptido mostrado(Figura 4c). En el control positivo (es decir, AP), se observó una banda de 22 kDa correspondiente al eCPX-AP biotintilado en una mancha occidental sondeada con streptavidina-HRP(Figura 4c). En los clones probados, una banda de tamaño similar era indicativa de la biotinylación del péptido mostrado fusionado con eCPX(Figura 4c). La intensidad de las bandas de 22 kDa fue inferior a la intensidad de la banda eCPX-AP en el control positivo, lo que indica una menor actividad de las variantes aisladas de BirA. Por lo tanto, los clones aislados pueden utilizarse como plantilla para otra ronda de mutaciones y selección, produciendo clones altamente activos. Las bandas adicionales indican que los clones aislados no eran específicos para el péptido mostrado y que también se biotinylaron objetivos adicionales(Figura 4c).
| Reactivo | volumen (L) |
| 5x Búfer de reacción | 4 |
| 10 mM dNTP | 0.4 |
| Primer delantero de 10 m | 1 |
| Primer inverso de 10 m | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Variable (25 ng) |
| Polimerasa de ADN de alta fidelidad | 0.20 |
| Agua libre de nucleasas | a 20 |
Tabla 1: Reactivos de PCR. Las unidades y los volúmenes pueden variar entre fabricantes.
| Reactivo | volumen (L) |
| 2x Mezcla de enzimas | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP con secuencia de péptidoobjetivo objetivo* | Variable (50 ng) |
| Megaprimer mutante | 250 ng |
| Búfer | 3 |
| Agua libre de nucleasas | a 50 |
Tabla 2: Reactivos pcR propensos a errores. Las unidades y los volúmenes pueden variar entre fabricantes. * preparado en la sección 1 del protocolo.
Figura 1: El sistema de visualización bacteriana para laselección de BirA. (a) El sistema se basó en la coexpresión de 2 componentes: BirA y eCPX fusionados con el péptido de aceptación (AP). eCPX se transporta a la superficie y, si la variante BirA biotinyla el AP, la biotina (rojo B) conectada al eCPX-AP se muestra en la superficie. b) El sistema se expresó a partir del plásmido pBAD-BirA-eCPX-AP, donde la expresión birA está controlada por un promotor inducible de la arabinosa y la expresión eCPX-AP es impulsada por el promotor T7. (c) Después de la generación de una biblioteca mutada aleatoriamente de variantes BirA (paso 1), se indujo la expresión BirA y eCPX-AP (paso 2). Las bacterias fueron incubadas con reactivo de afinidad (paso 3), las bacterias no unidas fueron desechadas (paso 4) y se amplificaron las bacterias seleccionadas (paso 5). Esta figura ha sido modificada de Granh-j et al.9Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de laselección de modelos con pBAD-BirA-eCPX-AP y pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A). (a) Por hincha occidental, se observó que eCPX-AP era biotintilado en bacterias no inducidas e inducidas, mientras que no se detectó biotinilación de eCPX-AP(K10A) incluso después de la inducción de BirA. La expresión de BirA fue detectada por anticuerpoanti-6xHis. * Indica una proteína inespecífica que reacciona a la estreptavidina cuando se indujo BirA. (b) Los cultivos bacterianos con expresión inducida de BirA y eCPX-AP se agregan rápidamente después de la adición de perlas magnéticas de estreptavidina (flecha), mientras que no se observó agregación en la bacteria AP(K10A). (c) BirA estaba presente en bacterias que expresan eCPX-AP y eCPX-AP(K10A) antes de la streptavidina-pulldown (entrada), pero sólo BirA en eCPX-AP que expresaba bacterias fue arrastrada por la estreptavidina. De acuerdo,(d) las bacterias viables se precipitaron eficaces en eCPX-AP, pero no en eCPX-AP(K10A), expresando bacterias. Esta figura ha sido modificada de Granh-j et al.9Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diseño de imprimación e incorporación de la secuencia de codificación depéptidos objetivo en pBAD-BirA-eCPX-AP por PCR. (a) Un ejemplo del diseño de imprimaciones utilizado para la incorporación de una secuencia de péptidos derivadas de la secuencia de péptidos de la eNaC en el terminal C de eCPX. La biotina que acepta lisina se muestra en rojo. La secuencia de péptidos objetivo se tradujo inversamente en ADN, y las imprimaciones hacia adelante y hacia atrás fueron diseñadas asegurando una superposición de base de 15 euros entre las imprimaciones. (b) Electroforesis representativa del gel de agarosa de PCR con pBAD-BirA-eCPX-AP como plantilla y imprimaciones específicas para secuencias de péptidos derivados de la pBAD-BirA-eCPX-AP, respectivamente. Un producto de ADN claro y fuerte a 5900 bp era indicativo de un PCR exitoso. "M" indica el carril del marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de laselección y caracterización de bacterias que muestran péptidos. Las bacterias que mostraban un péptido derivado de (a) TagRFP mostraron un claro enriquecimiento después de 3 rondas de selección, mientras que un péptido derivado de (b) EGFP no mostró ningún enriquecimiento de bacterias ligadas a estreptavidina incluso después de 4 rondas de selección. (c) 10 clones de bacterias que muestran un péptido de eAnaC a través de 5 rondas de selección fueron probados para su capacidad para biotinylar el péptido de ENaC. Los 10 clones mostraron una banda de reacción de estreptavidina consistente con el tamaño de eCPX-AP, lo que indica que los clones aislados contienen variantes de BirA que biotinylan el péptido mostrado. También se observaron bandas adicionales de reacción de la estreptavidina, lo que indica que otras proteínas, además del péptido mostrado, también fueron biotiladas. * Indica una proteína E. coli endógena biotinilada por BirA. Esta figura ha sido modificada de Granh-j et al.9Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En cuanto a todos los métodos de selección, la rigela de los pasos de lavado es de suma importancia. Dado que las bacterias no necesitan ser eluted de las perlas antes de la amplificación de los clones seleccionados, la alta afinidad de unión entre la biotina y la estreptavidina se puede utilizar en lugar de utilizar ávidanos de menor afinidad, como se hizo anteriormente con el sistema de visualización de fago, para la selección de las variantes BirA7,8. Esto garantiza que se seleccionen clones raros y que se descarten bacterias no biotinyladas. Otra ventaja de utilizar la visualización bacteriana, en comparación con la pantalla de fago, es que la visualización bacteriana es cuantitativa11 y, por lo tanto, permite la selección de las bacterias en función de la actividad enzimática.
En el protocolo, utilizamos MACS para seleccionar para las bacterias que crean un sistema de selección binaria basado en la presencia o ausencia de biotina en la superficie. Sin embargo, mediante el uso de fluorescencia cuantitativa activada clasificación celular, en su lugar, debe ser posible seleccionar para las bacterias que expresan las variantes más activas de BirA. Esto será importante en el desarrollo futuro de las nuevas variantes BirA, ya que permitirá una selección efectiva para las variantes BirA más activas.
Hasta el momento, hemos utilizado la visualización bacteriana de 14 péptidos diferentes y, de ellos, 13 hemos producido un claro enriquecimiento9,lo que indica que nuestro sistema de selección proporciona un método robusto para seleccionar para las nuevas variantes BirA. En la configuración actual, sólo hemos probado la selección de variantes BirA que están activas hacia péptidos de 15 aminoácidos y, por lo que seleccionamos preferentemente para las variantes BirA que están activas hacia la secuencia primaria de la proteína diana. La lisina dirigida puede, sin embargo, ser enterrado dentro de la estructura 3D de una proteína o no ser accesible de otra manera para BirA, produciendo variantes de BirA que no son activas contra su proteína objetivo. Una posible solución sería mostrar el fragmento de proteína más grande en eCPX. El andamio eCPX es versátil con respecto a la pantalla depéptidos 11; sin embargo, no se sabe si se pueden mostrar proteínas más grandes.
Utilizamos el sistema de selección para aislar una variante BirA que biotinylates nativo TagRFP9. La variante BirA probada específicamente biotinylated TagRFP en las lisinas objetivo, pero la actividad de la variante aislada fue baja9. Por lo tanto, se deben realizar nuevas rondas de evolución dirigida para mejorar su actividad. El péptido objetivo se encuentra en el término C de TagRFP, donde la similitud estructural entre el péptido mostrado y la región proteica es más probable. El análisis bioinformático de todas las proteínas humanas y de ratón muestra que el 75% de las proteínas contienen una o más lisina en su primer y/o último 30 aminoácidos9. Por lo tanto, el sistema de visualización bacteriana de los péptidos se puede utilizar potencialmente para aislar las variantes activas de BirA hacia una gran fracción de proteínas nativas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Mohamed Abdullahi Ahmed la asistencia de los técnicos expertos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Lundbeck, la Fundación Novo Nordisk, la Asociación Danesa del Riñón, la Fundación Aase og Ejnar Danielsen, la Fundación A.P. M'ller para el Avance de la Ciencia Médica, y Knud y Edith Eriksen Fundación Memorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
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