Summary
Här presenterar vi en metod att välja för nya varianter av E. coli biotin-proteinligase bira att biotinylates en specifik mål peptid. Protokollet beskriver byggandet av en Plasmid för bakteriell visning av målet peptid, generering av ett BirA bibliotek, urval och karakterisering av BirA varianter.
Abstract
Biotin är en attraktiv post-Translational modifiering av proteiner som ger en kraftfull tagg för isolering och detektion av protein. Enzymatisk biotinylering av E. coli biotin-proteinligase bira är mycket specifik och möjliggör biotinylering av målproteiner i sin inhemska miljö; emellertid, den nuvarande användningen av BirA medierad biotinylation kräver förekomst av en syntetisk acceptor peptid (AP) i målproteinet. Därför är dess tillämpning begränsad till proteiner som har konstruerats för att innehålla AP. Syftet med detta protokoll är att använda bakteriell visning av en peptid som härstammar från ett icke modifierat målprotein för att välja BirA-varianter som biotinylerar peptiden. Systemet är baserat på en enda plasmid som gör det möjligt för co-uttryck av BirA varianter tillsammans med en byggnadsställning för peptid displayen på bakteriefloran. Protokollet beskriver ett detaljerat förfarande för införlivande av mål peptiden i displayställningen, skapandet av BirA-biblioteket, val av aktiva BirA-varianter och initial karakterisering av de isolerade BirA-varianterna. Metoden ger ett mycket effektivt urvalssystem för isolering av nya BirA-varianter som kan användas för den vidare riktade utvecklingen av biotin-proteinligaser som biotinylerar ett inhemskt protein i komplexa lösningar.
Introduction
Biotinylation av ett protein skapar en kraftfull tagg för dess tillhörighet isolering och detektion. Enzymatisk proteinbiotinylering är en mycket specifik posttranslationell modifiering som katalyseras av biotin-proteinligaser. E. coli biotin-proteinligase bira är ytterst specifik och kovalent biotinylates endast ett begränsat antal naturligt förekommande proteiner vid specifika lysin rester1. Fördelarna med bira katalyseras biotinylation är för närvarande utnyttjas genom att fixera målproteinet med en liten syntetisk 15-Amino-Acid biotin acceptor peptid (AP) som effektivt en2 och möjliggör den mycket specifika och effektiv in vivo-och in vitro-biotinylering genom samtidig Expression eller tillsats av bira3,4,5. Även om in vivo och in vitro BirA katalyseras biotin-proteinligering är en attraktiv märknings strategi, dess tillämpning är begränsad till prover som innehåller AP-smält proteiner. Syftet med denna metod är utvecklingen av nya mutanter av biotin-proteinligaser som selektivt biotinylate infödda oförändrade proteiner och därmed utöka antalet tillämpningar där den enzymatiska biotinylation strategi kan användas.
Protein funktion kan utvecklas genom iterativa rundor av genmutation, urval, och förstärkning av genvarianter med önskad funktion. En stark och effektiv urvals strategi är avgörande för den riktade evolutionen och biotin-proteinligasaktiviteten är lätt utvald på grund av den starka bindningen mellan biotin och konjugerat och dess homologs6. Fagdisplayteknik möjliggör val av Fager som visar en peptider7,8. Eftersom amplifiering av isolerade Fager kräver infektion av en bakteriell värd, emellertid, den fagselektion med konjugerat skapar en flaskhals i att hög affinitet bindningen av biotin till konjugerat är praktiskt taget oåterkallelig under icke-denaturering Villkor. För att säkerställa reversibel bindning av biotinylerade Fager, monomer avidins med lägre affinitet användes som resulterade i en blygsam ~ 10-faldig anrikning7. Vi utvecklade nyligen en bakteriell visningsmetod för isolering av nya BirA varianter som eliminerar behovet av eluering från affinitetsmatrisen och därmed tar bort en flaskhals från tidigare BirA urvalssystem9. Faktum är att vårt bakteriella displaysystem möjliggör en > 1, 000, 000-faldig anrikning av aktiva kloner i ett enda urval steg9, vilket ger ett effektivt urvalssystem för den riktade utvecklingen av nya bira-varianter.
Vårt bakteriella displaysystem består av två komponenter, bira med en C-Terminal 6xhis tag och ett byggnadsställning protein som gör det möjligt för ytan visning av en mål peptid. Vi använde byggnadsställning protein förstärkt cirkulärt perdämpad yttre membranprotein X (ecpx) eftersom effektiv visning av peptider kan observeras vid både N-och C-Termini10,11. Fusionen av målet peptid sekvens till C-terminus eCPX säkerställer biotinylation av bakterier som uttrycker aktiva BirA varianter. Bakterierna tillåter det effektiva konjugerat urvalet som en peptid visar nu på ytan (figur 1a).
Syftet med denna metod är att välja för nya varianter av BirA att biotinylates peptid sekvenser som finns i inhemska proteiner. Systemet kodas av gener som finns på plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP, som innehåller en arabinose-inducerbar promotor som kontrollerar BirA (araBAD), och en T7-promotor som kontrollerar eCPX9 (figur 1b). Det nuvarande protokollet beskriver det detaljerade förfarandet för 1) införlivande av en peptid som härrör från ett målprotein i C-terminalen i ecpx, 2) skapandet av ett Mutations bibliotek av bira av felbenägna PCR, 3) val av streptavidin-bindande bakterier genom magnetisk aktiverad cell sortering (Mac), 4) kvantifiering av bakterie anrikning, och 5) initial karakterisering av isolerade kloner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. införande av peptid kodning sekvensering sekvens i pBAD BirA-eCPX-AP
Anmärkning: För att välja för BirA varianter att biotinylate ett naturligt målprotein, börja med att identifiera en 15-Amino Acid peptid sekvens i de proteiner primära sekvens som innehåller minst en lysin (K) rester.
- Gå till sekvensen manipulation Suite12.
- Klistra in den identifierade 15 Amino Acid peptid sekvens i inmatningsrutan i FASTA format och tryck på Skicka.
- Välj och kopiera 45 nukleotid omvänd översättning av peptidsekvensen.
- Hämta GenBank-filen för pBAD-BirA-eCPX-AP från http://n2t.net/addgene:121907.
- Ladda filen i en Plasmid-redigerare (t. ex. ApE) och välj i funktionsfönstret den AP- sekvens som är utsedd till "avitag (TM)".
- Högerklicka på den markerade AP-sekvensen i fönstret DNA-sekvens och välj Klistra in rev-com i kontextmenyn.
Anmärkning: Kodnings ordningen för eCPX är i omvänd riktning och peptidkodningssekvens bör därför klistras in som ett omvänt komplement. - Högerklicka på den markerade sekvensen och välj ny funktion.
- Lägg till ett beskrivande namn på den infogade sekvensen och tryck på OK.
- Välj Spara som i Arkiv -menyn för att spara den modifierade filen.
- Designa framåt primer för att inkludera de senaste 30 nukleotider av omvänd komplement till peptiden kodning sekvens och tillsätt plasmid bindande nukleo tid sekvens (3 '-GCGGCCGCCTGC-5 ') till dess 5 ' End.
- Designa omvänd primer för att inkludera de första 30 nukleotider av omvänd komplement till peptiden kodning sekvens och tillsätt plasmid bindande nukleo tid sekvens (3 '-CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5 ') till dess 5 '.
- Ställ in en 20 μL PCR-reaktion i ett tunnväggiga PCR-rör genom att tillsätta de reagens som anges i tabell 1.
- Överför röret till en termisk apparat och utför PCR med ett program med en initial denaturering vid 98 ° c i 30 s, 30 cykler av [15 s vid 98 ° c, 15 s vid 60 ° c och 3 min vid 72 ° c], slutlig förlängning för 2 min vid 72 ° c och håll vid 4 ° c.
- Kör 5 μL av PCR-reaktionen på en 1% agaros gel för att bekräfta förstärkningen av en ~ 6 KB PCR-produkt.
Anmärkning: Om ingen PCR-produkt observeras optimerar du PCR-villkoret enligt tillverkarens anvisningar. Protokollet kan pausas här. - Tillsätt 1 μL DpnI till PCR-reaktionen och inkubera i 1 h vid 37 ° c
- Omvandla den behöriga E. coli med 2 μl av DPNI-smält PCR-reaktion och platta på Lysogena buljong (lb)/amp plattor. Inkubera över natten vid 37 ° c.
- Inokulera 5 mL LB innehållande 100 μg/mL ampicillin med en enda koloni. Inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 200 rpm.
Anmärkning: Det rekommenderas att testa minst 6 kolonier. - Gör fryslager av 850 μL av varje natt kultur genom att lägga till glycerol till en slutlig koncentration av 15% till kulturen. Förvaras vid-80 ° c.
- Extrahera plasmid-DNA från resterande 4 mL kultur genom mini-prep DNA Extraction Kit.
- Bekräfta korrekt skär av peptid kodning sekvens av DNA-sekvensering med T7 Terminal primer (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).
2. generering av ett BirA-bibliotek
Anmärkning: Den initiala bira Mutations Library (figur 1c, steg 1) skapas av felbenägna PCR. Andra metoder för att generera bira Mutations Library kommer sannolikt att fungera också.
- Syntetisera muterade megaprimers med BirA-6xHis framåt (ATGAAGGATAACACCGTGCC) och omvänd (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) primers med 1 ng av pBAD-BirA-eCPX med målet peptid sekvens (beredd och bekräftad i steg 1,20) som en mall och 35 PCR cykler med en glödgnings temperatur på 60 ° c enligt tillverkarens anvisningar.
- Kör 5 μL av amplifieringsreaktionen på en 1% aguppkom gel för att kontrollera amplifiering av en 984 BP PCR-produkt.
- Rena PCR-produkten från de återstående 45 μL av amplifieringsreaktionen med hjälp av en kommersiell PCR-renings sats och Använd en spektrofotometer för att kvantifiera DNA-avkastningen.
Anmärkning: Rening från en enda 45 μL amplifiering reaktion ger i allmänhet en tillräcklig avkastning (> 250 ng). - Bered prov reaktionen i ett tunnväggiga PCR-rör genom att tillsätta de reagenser som anges i tabell 2.
- Överför reaktionsblandningen till en termisk apparat och kör PCR med de muterade megaprimers som bereds i steg 2,3 med hjälp av följande parametrar: 1 min vid 95 ° c och 25 cykler av 50 s vid 95 ° c, 50 s vid 60 ° c och 12 min vid 68 ° c. Förvara reaktionen vid 4 ° c.
- Tillsätt 1 μL av DpnI-restriktionsenzymer direkt till amplifieringsreaktionen och blanda försiktigt.
- Snurra reaktionsblandningen och inkubera i 2 timmar vid 37 ° c.
- Omvandla T7 Express lysY/IQ kompetenta E. coli -celler med 2 μl av DPNI-reaktionen.
- Inokulera 100 mL LB innehållande 100 μg/mL ampicillin med de transformerade cellerna och inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 200 rpm.
- Gör fryslager med 10 mL av natten kulturen i LB med 15% glycerol och lagra vid-80 ° c.
3. Val av bakterier som uttrycker Biotinylerad peptid
Anmärkning: Denna del av protokollet omfattar steg 2-5 i figur 1c. Det rekommenderas starkt att urvalsmetoden är setup med hjälp av pBAD-BirA-eCPX-AP och pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) som positiva och negativa kontroller.
- Inokulera 100 mL LB innehållande 1% glukos och 100 μg/mL ampicillin med 1 mL BirA-bibliotek och inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 200 rpm.
- Inokulera 5 mL LB innehållande 1% glukos och 100 μg/mL ampicillin med 100 μL av natt kulturen.
- Inkubera i 2 h och 30 min tills kulturen når en OD600 på cirka 0,5.
- Inducera eCPX och BirA uttryck med 0,2% w/v L-arabinose, 100 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) och 100 μM biotin och skaka kulturen vid 200 RPM för 1 h vid 37 ° c.
- Centrifugera kulturen i 10 min vid 5 000 x g och ta bort supernatanten.
- Omsuspendera cellerna i 1 mL av den iskalla PBS och centrifugera vid 5 000 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i 400 μL av iskall PBS och lagra celler på isen.
- Ta bort 10 μL resuspenderade celler och förvara på isen i ett 1,5 mL-rör märkt "input".
- Tvätta 20 μl av de magnetiska pärlorna av konjugerat i 1 ml iskall PBS och placera röret i en magnet partikel separator för bänkskiva innan du försiktigt avlägsnar supernatanten.
- Omsuspendera de konjugerat magnetiska pärlorna i 20 μl av iskall PBS och överför till 390 μl av återupphängande celler från steg 3,8.
- Blanda genom att försiktigt Pipettera och inkubera sedan i 30 min vid 4 ° c.
Anmärkning: Vortexblanda inte eftersom det kan lysera cellerna. Aggregering av pärlor observeras ofta med en hög förekomst av bakterier som visar en en peptid. - Placera en kolonn med ferromagnetiska sfärer i en magnetisk partikel avskiljare och tvätta med 5 mL iskall PBS.
- Överför celler och konjugerat magnetiska pärlor till kolonnen fäst i separatorn.
- När kolonnens reservoar är tom, tillsätt 500 μL iskall PBS och upprepa tills kolonnen har tvättats med en total volym på 5 mL iskall PBS.
- Ta bort kolonnen från separatorn och placera den i en 1,5 mL tub.
- Pipettera över 1 mL av den iskalla PBS till kolonnen och eluera de magnetiskt märkta cellerna genom att använda den kolv som medföljer kolonnen.
- Överför 1,5 mL-röret till en bänk avskiljare och tvätta den magnetiskt märkta cellen med 1 mL iskall PBS.
- Omsuspendera de magnetiskt märkta cellerna försiktigt i 1 mL av den iskalla PBS innan du avlägsnar och lagrar 10 μL av resuspension i ett 1,5 mL-rör märkt "output".
- Inokulera 100 mL LB innehållande 1% glukos och 100 μg/mL ampicillin med de magnetiskt märkta cellerna och inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 200 rpm.
- Nästa dag, Använd 10 mL av natten kulturen att göra frysen bestånd med celler i LB med 15% glycerol och lagra vid-80 ° c och 1 mL av natten kultur för nästa omgång av urval, dvs steg 3,2.
Anmärkning: Allmänt, 3-5 rundor av urval rekommenderas för berikning av konjugerat bindande bakterier.
4. kvantifiering av berikning
Anmärkning: Kvantifiering av levande bakterier i "input" och "output" prover utförs efter varje urvals runda genom bordläggningen av seriella utspädningar av proverna och efterföljande räkning av kolonin bildar enheter (CFUs).
- Tillsätt 990 μL iskall PBS till ingången (från steg 3,8) och utdata (från steg 3,18) och märk rören "input 10-2" respektive "output 10-2".
- Gör 10-faldigt seriella utspädningar av "input 10-2"-och "output 10-2"-proverna i iskall PBS tills en slutlig utspädning på 10-10 uppnås i det ingående provet och 10-4 i det utgående provet.
- Platta 100 μL prover från "ingång 10-6", "ingång 10-8", "ingång 10-10", "utgång 10-2", "utgång 10-3" och "utgång 10-4" på lb/amp-plattor och inkubera över natten vid 37 ° c.
- Räkna antalet kolonier på plattorna med tydligt separerade kolonier. Multiplicera antalet kolonier med utspädningsfaktorn för att erhålla bakterie koncentrationen/100 μL.
- Beräkna det totala antalet bakterier i in-och utmatnings proven genom att multiplicera cellkoncentrationen med ingången (400 μL) respektive utflödes volymen (1 mL) och uppskatta berikningen genom att dividera produktionen med antalet indatacell.
Anmärkning: En betydande berikning bör synas efter 3-5 urvals rundor
5. karakterisering av vald BirA-variant
Anmärkning: Karakteriseringen kan utföras efter val av BirA-varianter från det första BirA-biblioteket; emellertid, BirA varianter har i allmänhet låg aktivitet mot peptiden. Därför kan en ytterligare omgång av mutation och urval också utföras före karakteriseringen. Vanligtvis är 10 kloner från den slutliga urvalsrundan isolerade för ytterligare karakterisering.
- Inokulera 5 mL LB innehållande 100 μg/mL ampicillin med utvalda kloner från den slutliga urvalsrundan. Dessutom, Inokulera 5 mL LB innehållande 100 μg/mL ampicillin med T7 Express lysY/IQ E. coli omvandlas med Pbad-bira-ECPX-AP, som kommer att användas som en positiv kontroll för Western blot beskrivs nedan.
- Inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 200 rpm.
- Gör fryslager av 850 μL av varje natt kultur genom att lägga till glycerol till en slutlig koncentration av 15% till kulturen. Förvaras vid-80 ° c.
- Inokulera 5 mL LB innehållande 100 μg/mL ampicillin med 100 μL över natten kultur och inkubera vid 37 ° c med skakning vid 200 RPM för 2 h.
- Extrahera plasmid-DNA från resterande 4 mL kultur av s kommersiellt mini-prep DNA Extraction Kit. Utför DNA-sekvensen i framåt och bakåt riktningar av BirA varianter med pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) och pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) primers.
- Tillsätt 0,2% w/v L-arabinose och 100 μM IPTG och 100 μM biotin till kulturer från steg 5,4 och skaka kulturen vid 200 RPM för 1 h vid 37 ° c för att inducera uttrycket av eCPX och BirA varianter.
- Överför 65 μL av kulturen till 1,5 mL-rör som innehåller 25 μL av provets lastbuffert och 10 μL av reduktions medlet.
- Inkubera vid 95 ° c i 5 min.
- Fyll på provet (inklusive den positiva kontrollen) på en 12% SDS-polyakrylamidgel tillsammans med en storleks markör och utför gel-elektrofores vid 200 V i ca 45 min tills 20, 25 och 37 kDa-standardbanden är tydligt separerade.
- Släpp gelen från kassetten och montera smörgås för blotting av gelen på en PVDF membran.
- Electroblot på 35 V för 2 h på is.
- Ta bort PVDF-membranet och inkubera i blockeringsbuffert [PBS, 0,05% Tween-20, 3% skummjölkspulver] för 1 h vid rumstemperatur med skakning.
- Bered biotin-detekterings lösningen genom att späda streptavidin-HRP 1:1000 i PBST.
Anmärkning: Blockeringsbufferten innehåller biotin och bör därför inte användas som utspädnings buffert för streptavidin-HRP. - Kassera blockeringsbufferten, tvätta membranet snabbt i PBST [PBS, 0,05% Tween-20] och tillsätt biotin-detekterings lösningen. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur med skakning.
- Kassera biotin-detekterings lösningen och tvätta membranet grundligt i PBST i 5 min två gånger och 10 min en gång med skonsam skakning vid rumstemperatur.
- Kassera PBST, tillsätt 2 mL ECL-blandning och inkubera i 1 min med skakning.
- Torka membranet snabbt på ett mjukpapper och utveckla bilden på en röntgenfilm eller i ett digitalt gel avbildningssystem.
Anmärkning: I körfältet med den positiva kontrollen, två distinkta streptavidin-reaktionsband bör vara tydligt synlig: en 30 kDa en endogent uttryckt protein och ~ 22 kDa ecxp-AP band. Om de 10 utvalda kolonierna kan biotinylate den visade peptiden, bör ett band på ~ 22 kDa vara synlig. Intensiteten i dessa band är i allmänhet lägre än den positiva kontrollen och kan därför kräva längre exponeringstider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Western blot av pBAD-BirA-eCPX-AP uttrycker bakterier producerar en ~ 22 kDa streptavidin-reacting band överensstämmer med molekylvikt eCPX (figur 2a). Till skillnad från bira-6xvar hans, en ecpx-AP närvarande i både icke-inducerad och inducerad kulturer (figur 2a) på grund av en liten grad av T7 promotor aktivitet även i uninduced kulturer och efterföljande biotinylation av AP av endogena bira. I BirA-eCPX-AP (K10A) som uttrycker kulturer upptäcktes inget biotinylerat eCPX-band (figur 2a). Den starka ytan biotinylation i ecpx-AP uttrycker bakterier orsakar aggregering vid tillsättning av konjugerat magnetiska pärlor och bildandet av en pellet på botten av ett rör (figur 2b). I eCPX-AP (K10A) uttryck bakterier, streptavidin-pärla aggregering och nederbörd observerades inte (figur 2b). Analys av fällning från konjugerat PULLDOWN, visar en tydlig 22-kDa konjugerat-reagera och anti-6xhis band i proverna från ecpx-AP kulturer, men inte ecpx-AP (K10A) kulturer (figur 2c). På samma sätt var antalet bakterier som binds till streptavidin-pärlorna signifikant högre i eCPX-AP än eCPX-AP (K10A)-kulturerna (figur 2d).
För att välja för BirA varianter att biotinylate en mål peptid, dess DNA-sekvens införlivades i C-terminalen eCPX av PCR med primers konstruerade i steg 1,10 och 1,11. Ett exempel på primers som utformats för att inkorporera en peptidsekvens som härleds från α-subenheten i epitelial na+ -kanalen (ENAC) visas i figur 3a. Efter PCR, en 5-μL alikvot analyserades av agaros gel elektrofores och ett tydligt och starkt band på ~ 5900 BP observerades (figur 3b).
Efter genereringen av BirA-mutationsbiblioteket initierades urvalet av aktiva BirA-varianter. En låg grad av streptavidin-bunden kontra input bakterier förväntades efter den första urvalsrundan. Men efter 2nd och 3RD val rundor en tydlig berikning observerades i graden av streptavidin-bundna bakterier figur 4a). Om en tydlig anrikning inte upptäcks (figur 4b), är det ett tecken på att bira-varianterna inte biotinylerar peptiden och en annan peptidsekvens bör därför testas.
Efter den sista urvalsrundan, 10 kloner kännetecknades av västerländska blotting för deras förmåga att biotinylate den visade peptiden (figur 4c). I den positiva kontrollen (dvs. AP), ~ 22 kDa band som motsvarar en ecpx-AP observerades i en västerländsk blot sonderade med streptavidin-HRP (figur 4c). I de testade klonerna var ett band med likartad storlek indikativt för biotinylering av den visade peptiden som sammansmälts med eCPX (figur 4c). Intensiteten i ~ 22 kDa banden var lägre än intensiteten i eCPX-AP-bandet i den positiva kontrollen, vilket indikerar en lägre aktivitet av de isolerade BirA-varianterna. De isolerade klonerna kan därför användas som en mall för en annan omgång av mutationer och urval, vilket ger mycket aktiva kloner. Ytterligare band indikerar att de isolerade klonerna inte var specifika mot den visade peptiden och att ytterligare mål också var biotinylerade (figur 4c).
| Reagens | volym (μL) |
| 5x reaktionsbuffert | 4 |
| 10 mM dNTP | 0,4 |
| 10 μM framåt primer | 1 |
| 10 μM omvänd primer | 1 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Variabel (~ 25 ng) |
| High-Fidelity DNA-polymeras | 0,20 |
| Nukleasfritt vatten | till 20 |
Tabell 1: PCR-reagens. Enheter och volymer kan variera mellan olika tillverkare.
| Reagens | volym (μL) |
| 2x Enzymblandning | 25 |
| pBAD-BirA-eCPX-AP med mål peptid sekvens * | Variabel (~ 50 ng) |
| Mutant megaprimer | 250 ng |
| Buffert | 3 |
| Nukleasfritt vatten | till 50 |
Tabell 2: felbenägna PCR-reagenser. Enheter och volymer kan variera mellan olika tillverkare. * upprättad i avsnitt 1 i protokollet.
Bild 1: det bakteriella displaysystemet för val av bira. a) systemet baserades på två beståndsdelar: bira och ecpx, som sammansmälts med acceptorpeptiden (AP). eCPX transporteras till ytan och om BirA-varianten biotinylerar AP, visas biotin (röd B) fäst vid eCPX-AP på ytan. bsystemet har uttryckts från plasmid Pbad-bira-ECPX-AP, där bira-uttrycket styrs av en arabinose-inducerbar promotor och ECPX-AP-uttrycket drivs av T7-promotorn. (c) efter generering av ett slumpmässigt muterat bibliotek med bira-varianter (steg 1) inducerades bira-och ecpx-AP-uttrycket (steg 2). Bakterierna inkuberades med affinitet reagens (steg 3), obundna bakterier kastades bort (steg 4) och utvalda bakterier amplifierades (steg 5). Denna siffra har modifierats från Granhøj et al.9vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat från val av modell med Pbad-bira-ecpx-AP och Pbad-bira-ecpx-AP (K10A). a) genom västerländsk blotting observerades ECPX-AP som biotinylerad i både icke-inducerade och inducerade bakterier, medan ingen biotinylering av ecpx-AP (K10A) upptäcktes även efter induktion av bira. BirA-uttrycket upptäcktes av anti-6xHis antikropp. * Indikerar ett ospecifikt streptavidin-reagerande protein när BirA inducerades. (b) bakteriekulturer med inducerat uttryck av bira och ecpx-AP aggregat snabbt efter tillsats av magnetiska streptavidin-pärlor (pil), medan ingen aggregering OBSERVERADES i AP (K10A) bakterier. (c) bira var närvarande i bakterier som uttrycker ECPX-AP och ecpx-AP (K10A) innan de streptavidin-PULLDOWN (input), men endast bira i ECPX-AP uttrycker bakterier drogs ner av streptavidin. I samförstånd, (d) livskraftiga bakterier fälldes ut effektivt i ECPX-AP, men inte ECPX-AP (K10A), som uttrycker bakterier. Denna siffra har modifierats från Granhøj et al.9vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: primer design och inkorporering av mål peptid kodning sekvens i Pbad-bira-ECPX-AP av PCR. aett exempel på den primers-konstruktion som används för att inkorporera en peptidsekvens som härleds från αENaC till Ecpx C-Terminal. Den biotin acceptera lysin visas i rött. Målet peptidsekvensen var omvänd översatt till DNA, och framåt och omvänd primers utformades genom att säkerställa en ~ 15 bas överlappning mellan primers. b) representativ agaros gel-elektrofores av PCR med Pbad-bira-ECPX-AP som mall och primers som är specifika för α-, β-och γ-ENAC-härledda peptidsekvenser. En tydlig och stark DNA-produkt på ~ 5900 BP var indikativt för en lyckad PCR. "M" indikerar markör körfält. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat från urval och karakterisering av bakterier som visar peptider. Bakterier som uppvisar en peptid som härrör från (a) tagrfp visade en klar berikning efter 3 urvals rundor, medan en peptid som härrör från (b) egfp visade ingen anrikning av streptavidin-bundna bakterier även efter 4 urvals rundor. c) 10 kloner av bakterier som uppvisar en peptid från γenac till 5 urvals rundor testades för deras förmåga att biotinylera den γenac-peptiden. Alla 10 kloner visade ett streptavidin-reagerande band som överensstämmer med storleken på eCPX-AP, vilket indikerar att de isolerade klonerna innehåller BirA-varianter som biotinylerar den visade peptiden. Ytterligare streptavidin-reacting band observerades också, vilket indikerar att andra proteiner, förutom den visade peptiden, var också biotinylated. * Indikerar ett endogent E. coli -protein biotinylerat av bira. Denna siffra har modifierats från Granhøj et al.9vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När det gäller alla urvalsmetoder, är stränghet av tvätt stegen av yttersta vikt. Eftersom bakterier inte behöver elueras från pärlorna innan amplifiering av de valda klonerna, kan den höga affinitetsbindningen mellan biotin och konjugerat användas i stället för att använda lägre affinitet avidins, som tidigare gjorts med phage display system, för urvalet av bira-varianter7,8. Detta säkerställer att sällsynta kloner väljs och att icke-biotinylerade bakterier kasseras. En annan fördel med att använda bakteriell display, jämfört med fagdisplay, är att bakteriell Display är kvantitativ11 och, därför, möjliggör val av bakterierna baserat på enzymatisk aktivitet.
I protokollet använde vi Mac-datorer för att välja bakterier som skapade ett binärt urvalssystem baserat på närvaron eller frånvaron av biotin på ytan. Men genom att använda kvantitativ fluorescensaktiverad cell sortering bör det istället vara möjligt att välja för bakterier som uttrycker de mest aktiva varianterna av BirA. Detta kommer att vara viktigt i den framtida utvecklingen av de nya BirA varianter eftersom det kommer att möjliggöra ett effektivt urval för de mest aktiva BirA varianter.
Vi har hittills använt bakteriell visning av 14 olika peptider och av dessa har 13 producerat en tydlig berikning9, vilket indikerar att vårt urvalssystem ger en robust metod att välja för de nya bira-varianterna. I den nuvarande installationen har vi bara testat urvalet av BirA varianter som är aktiva mot 15-Amino Acid peptider och därmed vi valt företrädesvis för BirA varianter som är aktiva mot den primära sekvensen av målproteinet. Den riktade lysin kan dock begravas inuti 3D-strukturen av ett protein eller inte vara annars tillgänglig för BirA, vilket ger BirA varianter som inte är aktiva mot deras målprotein. En potentiell lösning skulle vara att visa större proteinfragment på eCPX. ECPX-ställningen är mångsidig med avseende på peptiddisplayen11; Det är dock inte känt om större proteiner kan visas.
Vi använde urvals systemet för att isolera en BirA variant som biotinylates infödda TagRFP9. Den testade bira-varianten specifikt en tagrfp på riktade lysines, men aktiviteten av den isolerade varianten var låg9. Därför bör ytterligare rundor av riktad evolution utföras för att förbättra dess aktivitet. Målet peptid är i C-terminus i TagRFP, där den strukturella likheten mellan den visade peptiden och protein regionen är mer sannolikt. Bioinformatisk analys av alla mänskliga och mus proteiner visar att ~ 75% av proteinerna innehåller en eller flera lysin inom deras första och/eller sista 30 aminosyror9. Således kan det bakteriella displaysystemet av peptider potentiellt användas för att isolera aktiva BirA-varianter mot en stor del av inhemska proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Mohamed Abdullahi Ahmed för expert teknikern hjälp. Detta arbete stöddes av bidrag från Lundbecks stiftelse, Novo Nordisk stiftelse, danska njurföreningen, Aase og Ejnar Danielsen stiftelsen, A.P. Møller Stiftelsen för främjande av medicinsk vetenskap, och Knud och Edith Eriksen Memorial Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE - A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
References
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme's Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
