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Developmental Biology

मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग कर माउस टेस्ट से Pachytene शुक्राणुकोशिकाओं और शुक्राणुओं का संवर्धन

doi: 10.3791/60271 Published: September 17, 2019
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ प्रस्तुत pachytene spermatocytes, गोल शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, और वयस्क माउस testes से बढ़ते शुक्राणुओं मानक प्रयोगशाला उपकरण ों के साथ एक discontinuous गोवाइन सीरम एल्बुमिन घनत्व ढाल का उपयोग कर.

Abstract

शुक्राणुजनन के प्रत्येक चरण की विशेषता के लिए, शोधकर्ताओं को रोगाणु कोशिकाओं के विभिन्न उप-जनसंख्या को वृषणों से अलग करना चाहिए। हालांकि, अलग अलग आबादी को अलग करना चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि वयस्क वृषण में कायिक कोशिकाओं की कुछ आबादी के साथ शुक्राणुजनन के सभी चरणों से रोगाणु कोशिकाओं का एक जटिल मिश्रण होता है। पिछले कुछ दशकों में, विभिन्न तकनीकों जैसे केन्द्रापसारक उन्मूलन, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस), और एसटीए-PUT को रोगाणु कोशिकाओं के अलगाव के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। एक दोष यह है कि वे सभी समर्पित उपकरणों और विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है. एसटीए-PUT विधि अंतर्निहित सिद्धांतों के बाद, pachytene spermatocytes के अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल विकसित किया गया है, गोल spermatids, और माउस testes से लंबे शुक्राणु. वृषण कोशिकाओं के एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के बाद, विशिष्ट सेल आबादी एक discontinuous गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) घनत्व ढाल के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण अवसादन से समृद्ध हैं. कोशिका अंश तो मैन्युअल रूप से एकत्र कर रहे हैं और सूक्ष्म विश्लेषण किया. गोल शुक्राणुओं के लिए यह संशोधित घनत्व ढाल (एमडीआर) अवसादन प्रोटोकॉल व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है, क्योंकि यह केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणकी आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल कम से कम शुरू सामग्री की आवश्यकता है, इसकी लागत और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग को कम करने.

Introduction

स्तनधारी शुक्राणुजनन के दौरान होने वाली आणविक और जैविक घटनाओं के बारे में बहुत कुछ पता नहीं है, एक जटिल प्रक्रिया जिसमें शुक्राणुजनक स्टेम कोशिकाएं अत्यधिक विशिष्ट शुक्राणुजोआ1,2में परिवर्तित हो जाती हैं . शुक्राणुजनन वृषण के अर्धनीफेरस नलिकाओं के अंदर होता है। नलिकाओं में विभेद के प्रत्येक चरण से रोगाणु कोशिकाओं का मिश्रण होता है, जिसमें शुक्राणुजनक स्टेम सेल, माइटोटिक रूप से शुक्राणुओं को विभाजित करना, मेरियोटिक शुक्राणुकोशिकाएं, और डािमियोटिक शुक्राणुओं (जो गोल से अगुणित विभेदक होते हैं) शुक्राणुओं को लंबा करने के लिए शुक्राणु, और अंत में परिपक्व शुक्राणुजोआ के लिए). वृषण की कायिक कोशिकाओं में सेर्तोली कोशिकाओं को शामिल किया गया है जो अर्धनारीश्य नलिकाओं के अंदर रोगाणु कोशिकाओं के साथ intermingled हैं, peritubular myoid कोशिकाओं है कि ट्यूब्यूल की दीवारों के रूप में, और टेस्टोस्टेरोन का उत्पादन Leydig कोशिकाओं ट्यूब्यूल्स के बीच अंतरालीय अंतरिक्ष में.

शुक्राणुजनन के दौरान आणविक और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का अध्ययन अक्सर वृषण कोशिकाओं के एक जटिल मिश्रण से अलग रोगाणु कोशिकाओं की जुदाई की आवश्यकता है. सेल संवर्धन के लिए कई अलग-अलग कार्यनीतियां विकसित की गई हैं। सबसे सफल तरीके हैं एसटीए-पुट वेग अवसादन इकाई गुरुत्वाकर्षण3,4,5,6, केन्द्रापसारक उन्मूलन के आधार पर प्रतिप्रवाह केन्द्रीकरण7,8, और फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) जो डीएनए सामग्री और/या विशिष्ट मार्कर के अनुसार कोशिकाओं को अलग करता है। इन तरीकों आमतौर पर शुक्राणुजनन शोधकर्ताओं के बीच उपयोग किया जाता है और विशिष्ट रोगाणु सेल प्रकार के कुशल संवर्धन के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि, इन तकनीकों की एक सीमा है कि वे विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है कि विशेष, महंगा हार्डवेयर की आवश्यकता है.

यहाँ प्रस्तुत माउस testes के तीन सबसे प्रचुर मात्रा में सेल आबादी की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल है: दौर शुक्राणुओं, pachytene spermatocytes, और लंबी spermatids. इस प्रोटोकॉल दौर spermatids (एमडीआर) के लिए संशोधित घनत्व ढाल के रूप में जाना जाता है, क्योंकि यह दौर spermatids को समृद्ध करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करता है. एमडीआर विधि एसटीए-पुट वेग अवसादन के रूप में एक ही सिद्धांतों पर आधारित है, अभी तक यह केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है. जीवित कोशिकाओं को पृथ्वी के गुरुत्वाकर्षण क्षेत्र के तहत एक मानक 50 एमएल ट्यूब के अंदर मैन्युअल रूप से तैयार discontinuous विच्छिन्न सीरम एल्बुमिन (BSA) घनत्व ढाल के माध्यम से तलछट करने के लिए अनुमति दी जाती है। बड़ी कोशिकाएं प्रवणता के माध्यम से तेजी से गति करती हैं, जो रोगाणु कोशिकाओं की विभिन्न आबादियों को अलग करती हैं। अवसादन के बाद, तीन सेल प्रकारों के समृद्ध अंश मैन्युअल रूप से एकत्र किए जाते हैं। इन समृद्ध कोशिका ओंपियों की शुद्धता एसटीए-PUT और केन्द्रापसारक उन्मूलन द्वारा प्राप्त की गई आबादी के बराबर है।

वेग अवसादन के लिए बीएसए ढाल के निर्माण और उपयोग को कवर करने के अलावा, प्रोटोकॉल भी अर्द्धनीफेरस ट्यूब्यूल से वृषण कोशिकाओं को जारी करने के लिए एक पाचन विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल कि Romrell एट अल9 द्वारा विकसित से संशोधित किया गया था और collagenase चतुर्थ और trypsin के साथ अनुक्रमिक पाचन भी शामिल है. एक बाइकार्बोनेट बफर (अर्थात, क्रेब्स समाधान) के उपयोग के साथ संयुक्त अनुक्रमिक पाचनों को रोगाणु कोशिकाओं की पृथक्करण और व्यवहार्यता को बहुत अधिक बढ़ाने के लिए दर्शाया गयाहै 9।

एमडीआर संवर्धन के दौरान, कोशिकाओं के आसपास खर्च 4 ज एक साथ seminiferous tubules के वातावरण के बाहर और तनावपूर्ण यांत्रिक बलों के अधीन नहीं हैं, जो बहाव विश्लेषण के लिए अत्यधिक व्यवहार्य सेलुलर अंशों के संग्रह के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, केन्द्रापसारक उन्मूलन और एसटीए-PUT के समान, एमडीआर प्रोटोकॉल में कोशिकाओं के किसी भी रासायनिक उपचार या लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है, जो उनकी व्यवहार्यता को बनाए रखने में भी मदद करता है। महत्वपूर्ण बात, के रूप में छोटे रूप में दो वयस्क माउस testes एमडीआर अलगाव के लिए पर्याप्त हैं और इसलिए, एक वयस्क माउस दोनों आरएनए और प्रोटीन विश्लेषण के लिए पर्याप्त समृद्ध कोशिकाओं प्रदान करता है. मानक STA-PUT प्रोटोकॉल सेलअलगाव6 के लिए के रूप में कई के रूप में 12 वयस्क चूहों के उपयोग की सिफारिश की; हालांकि, पूर्व अनुभव के आधार पर, यह ज्ञात है कि सफल अलगाव तीन से चार वयस्क चूहों से किया जा सकता है. केन्द्रापसारक एल्यूट्रेशन के लिए पर्याप्त होने की सूचना दी प्रारंभिक सामग्री की सबसे कम मात्रा छह माउस testes (तीन चूहों)8है. इसलिए, महंगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता को समाप्त करने के अलावा, एमडीआर प्रोटोकॉल आवश्यक प्रयोगशाला पशुओं की संख्या को कम कर देता है।

Protocol

प्रयोगशाला चूहों के रखरखाव और सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए प्रासंगिक दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.

1. उपकरण और अभिकर्मक सेट-अप

  1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी स्नान सेट करें।
  2. सेल कल्चर इनक्यूबेटर को 34 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता पर सेट करें। इनक्यूबेटर के अंदर ट्यूब रोटेटर रखो।
    नोट: इनक्यूबेटर को आंतरिक तापमान को बदलने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है। यदि कोई इन्क्यूबेटर लगातार 34 डिग्री सेल्सियस पर सेट होता है, तो प्रयोग से 1 दिन पहले सेट करें.
  3. माइक्रोस्कोपी कांच स्लाइड की उचित मात्रा को तैयार और लेबल करें। एक तेल कलम के साथ व्यास में 1 सेमी की एक अंगूठी ड्रा और तेल सूखी.
  4. 1x क्रेब्स बफर तैयार करें, पीएच 7.8 (सारणी 1)। चरण 2.5 डिग्री 2.8 के लिए पूर्व गर्म करने के लिए 34 डिग्री सेल्सियस के लिए 1x Krebs के 50 एमएल के साथ दो शंकु ट्यूब रखो. 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर 1x Krebs के बाकी स्टोर.
  5. बीएसए समाधान तैयार करें। सबसे पहले 10% (w/v) बीएसए समाधान के 25 एमएल को 25 एमएल के अंतिम खंड में 1x Krebs बफर में 2.5 ग्राम भंग करके क्रेब्स में तैयार करें। विभिन्न बीएसए सांद्रता प्राप्त करने के लिए 1x Krebs बफर के साथ 10% बीएसए समाधान को हल करें (तालिका 2)। सभी बीएसए समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: प्रक्रिया के उसी दिन समाधान तैयार करें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. 50 एमएल शंकु-ट्यूबों (सारणी 3) को ट्रिप्सिन और कोलाजनेस की सही मात्रा का वजन करके पाचन एंजाइमों को तैयार करें।

2. पशु विच्छेदन और जेर्म सेल निलंबन की तैयारी

नोट: यह पूरा करने के लिए लगभग 1 h लेता है।

  1. एक वयस्क पुरुष माउस बलिदान (उम्र 7 सप्ताह या पुराने, वृषण वजन 80"120 तनाव और उम्र के आधार पर मिलीग्राम) गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ2 asphyxiation के माध्यम से.
  2. 70% इथेनॉल के साथ माउस के अधर पेट स्प्रे. कैंची का उपयोग कर abdominopelvic गुहा खोलें, एक वी के आकार का उद्घाटन कर रही है.
  3. संदंश के साथ epididymal वसा पैड पर खींच, testes का पता लगाने और उन्हें कैंची से हटा दें. ट्यूनिका एल्बुजिनिया को परेशान करने से बचें। 1x Krebs युक्त एक 6 सेमी पेट्री पकवान पर testes प्लेस.
  4. परीक्षणों को कम करें और ट्यूनिका एल्बुजिनिया को त्याग दें। थोड़ा उन्हें forceps के साथ अलग चिढ़ा द्वारा semineniferous नलिका फैलाने.
  5. अर्द्धनग्न नलिकाओं को 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करने के लिए बलका प्रयोग करें जिसमें 2 एमएल ताजा तैयार कोलैनेस विलयन(सारणी 3)है।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबल को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब को हिलाकर धीरे से उत्तेजित करें।
    नोट: स्वतंत्र रूप से अस्थायी नलिकाएं अंतरालीय कोशिकाओं को हटाने के कारण 3 मिनट के भीतर होना चाहिए। वृषण कोशिकाओं के लिए शारीरिक तापमान 34 डिग्री सेल्सियस है; इसलिए, लंबे पाचन आमतौर पर इस तापमान पर किया जाता है। हालांकि, कम 3 मिनट पाचन 37 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जा सकता है (निर्माता द्वारा अनुशंसित तापमान)। ध्यान दें कि अगर 34 डिग्री सेल्सियस का उपयोग किया जाता है, तो पाचन समय को फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  7. गर्म 1x Krebs के कम से कम 40 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर तलछट ($ 1 मिनट) के लिए tubules अनुमति देते हैं। supernatant निकालें और 1x दोहराएँ.
  8. ताजा तैयार ट्रिप्सिन विलयन(तालिका 3)का 25 एमएल जोड़ें , ट्यूब को 34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर ट्यूब रोटेटर पर रखें, और 15 डिग्री 20 मिनट ($15 आरपीएम) के लिए इनक्यूबेट करें। छिटपुट रूप से नलिकाओं की स्थिति की जांच करें। एक बार जब समाधान बादल हो जाता है और केवल ट्यूब के छोटे टुकड़े रहते हैं, बर्फ पर ट्यूब जगह है और तुरंत अगले कदम के लिए आगे बढ़ना.
    नोट: अतिअप और सेल lysis से बचने के लिए, निम्नलिखित धोने के चरणों में तेजी से ले जाएँ। कुछ प्रोटोकॉल भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) द्वारा trypsin के निष्क्रियकरण शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल में, FBS उपचार छोड़ दिया जाता है, और इसके बजाय, trypsin तत्काल centrifugation द्वारा हटा दिया जाता है और बाद में ठंड 1x Krebs के साथ washes.
  9. एक 40 डिग्री मीटर सेल छलनी के माध्यम से बर्फ पर एक नया 50 एमएल शंकु ट्यूब में समाधान फ़िल्टर.
  10. कोशिकाओं को गोली करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज 600 x ग्राम।
    नोट: एक बल के बहुत मजबूत के साथ सेंट्रीफ्यूगेशन कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है।
  11. इसे सावधानी से बाहर डालने से supernatant निकालें.
  12. 1x Krebs के शेष में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए सेल गोली टैप करें.
  13. पुनः निलंबित कोशिकाओं के लिए ठंड 1x Krebs के कम से कम 40 एमएल जोड़ें.
  14. चरणों को दोहराएँ 2.10 और 2.11.
  15. कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए सेल गोली के साथ ट्यूब टैप करें। 1x Krebs में 0.5% बीएसए के 1 एमएल जोड़ें और एक कट पिपेट टिप के साथ ऊपर और नीचे समाधान pipeting द्वारा कोशिकाओं resuspend. बुलबुले बनाने से बचें।
  16. अंत में, 1x Krebs में 0.5% बीएसए के 1 "3 एमएल जोड़ें ताकि अंतिम मात्रा $ 3 एमएल है। 40 डिग्री मीटर सेल छलनी के माध्यम से रोगाणु सेल निलंबन को दर्ज करें और बीएसए ढाल पर कोशिकाओं को लोड करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

3. निरंतर बीएसए ग्रेडिएंट के माध्यम से जेर्म कोशिकाओं का पृथक्करण

नोट: यह अनुभाग पूरा करने के लिए लगभग 2 h लेता है। धोने के चरणों के दौरान discontinuous BSA ग्रेडिएंट तैयार करना शुरू करें (कदम 2.10 $2.14) जैसे ही pretreatment तैयार है कोशिकाओं को लोड करने के लिए।

  1. बर्फ पर एक 50 एमएल ट्यूब खड़ी हो ताकि यह ट्यूब के एक तरफ देखने के लिए संभव है। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडे कमरे में प्रोटोकॉल चलाते हैं, जो मामले में कोई बर्फ की जरूरत है।
  2. एक बड़ा एपर्चर प्राप्त करने के लिए टिप से लगभग 5 डिग्री 10 मिमी के बारे में 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट की नोक को काटें (चित्र 1) और इसे पिपेट नियंत्रक पर माउंट करें (चित्र 1) ।
    नोट: यह पाइपिंग के दौरान वेग कम हो जाएगा, जो विभिन्न बीएसए समाधान के स्टैकिंग की सुविधा. वैकल्पिक रूप से, एक चिकनी पिस्टन के साथ एक 1 एमएल यांत्रिक पिपेट का उपयोग करें और व्यास में लगभग 3 मिमी के एपर्चर के साथ पिपेट युक्तियों को काट ें (चित्र 1)।
  3. 50 एमएल ट्यूब के नीचे करने के लिए 5% बीएसए समाधान के 5 एमएल पाइपिंग द्वारा शुरू करो।
  4. धीरे धीरे 5% समाधान के शीर्ष पर 4% बीएसए समाधान के 5 एमएल पाइप। पिपेट की कट टिप के साथ 5% समाधान की सतह को धीरे से छूकर शुरू करें और दो समाधानों को परत करें, जबकि ध्यान से सतह के साथ संपर्क बनाए रखने, पाइप टिप को डूबने की अनुमति नहीं देना सुनिश्चित करना।
    नोट: इस चरण के अंत में दो परतों के बीच एक स्पष्ट रेखा दिखाई देनी चाहिए.
  5. अन्य बीएसए समाधानों के साथ चरण 3-4 दोहराएँ 5% से 1% तक एक विच्छिन्न प्रवणता प्राप्त करते हैं (चित्र 1D)।
  6. बिना किसी परेशान किए ग्रेडिएंट के शीर्ष पर एकल-सेल निलंबन को सावधानीपूर्वक लोड करें. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर 1.5 ज के लिए प्रवणता के माध्यम से तलछट दें।

4. समृद्ध जर्म सेल अंशों का संग्रह

नोट: इस अनुभाग को पूरा करने के लिए लगभग 30 मिनट लेता है।

  1. 1 एमएलएल पिपेट टिप को 1 एमएल यांत्रिक पिपेट पर माउंट करें और टिप को काट लें ताकि एपर्चर व्यास में 3 मिमी है (चित्र 1) ।
  2. ध्यान से अलग 1.5 एमएल ट्यूबमें $ 1 एमएल अंशों को इकट्ठा, बीएसए ढाल के ऊपर से शुरू, और उन्हें बर्फ पर स्टोर. भिन्नों के रूप में एक ही क्रम में ट्यूबों संख्या एकत्र किया जाएगा.
    नोट: इस बिंदु पर, सेल निलंबन युक्त $ 28 ट्यूबों की एक श्रृंखला होनी चाहिए। एक चिकनी पिस्टन के साथ एक 1 एमएल यांत्रिक पिपेट का प्रयोग करें और बीएसए ढाल परेशान करने के जोखिम को कम करने के लिए पिपेट युक्तियों में कटौती करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर रोगाणु कोशिका भिन्न होता है।
  4. सावधान गोली परेशान नहीं करने के लिए, supernatant के अधिकांश त्याग और ट्यूब flicking द्वारा सेल गोली resuspend. प्रत्येक ट्यूब के लिए बर्फ ठंडा 1x Krebs बफर के 1 एमएल जोड़ें और centrifugation दोहराएँ.
    नोट: जब बीएसए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में हस्तक्षेप करते हैं तो वाशिंग चरण दोहराएँ.
  5. अधिकांश supernatant छोड़ दें, लेकिन अंतिम धोने के बाद $ 100 $L छोड़ दें। कोशिका गोली को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें.
    नोट: कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक निलंबित करना यह सुनिश्चित करता है कि इस समाधान से लिया गया नमूना दिए गए अंश के सभी कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है। स्लाइड तैयार करते समय बर्फ पर सेल निलंबन रखें।

5. सेल भिन्नों का विश्लेषण

नोट: विश्लेषण को पूरा करने के लिए 2 एच लेता है।

  1. एक समय में, एक नंबरमाइक्रोस्कोपी स्लाइड पर प्रत्येक ग्रीज़ पेन रिंग के अंदर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का पाइप 20 डिग्री सेल्सियस।
  2. तुरंत इसी अंश से resuspended सेल निलंबन के 2 $L जोड़ें. प्रत्येक अंश के लिए दोहराएँ.
    नोट: स्लाइड बनाते समय, सभी सेल निलंबन को बर्फ पर रखें।
  3. रात भर के लिए 1 h के लिए RT पर स्लाइड सूखी (O/
    नोट: इस चरण के दौरान, प्रत्येक अंश से एक नमूना लेने के बाद, कोशिकाओं downstream विश्लेषण या भंडारण (अनुभाग 6) के लिए संसाधित किया जा सकता है।
  4. स्लाइड 1x पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला और 4 के साथ बढ़ते माध्यम के साथ माउंट,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (सामग्री की तालिका).
  5. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड का विश्लेषण करने के लिए अनुमान है जो विशेष रोगाणु सेल प्रकार प्रत्येक अंश में समृद्ध है.
    नोट: विभिन्न प्रकार के सेल उनकी विशेषता परमाणु आकृति विज्ञान DAPI धुंधला द्वारा कल्पना द्वारा पहचाना जा सकता है. चित्र 2 एक से पता चलता है प्रतिनिधि अंश लंबे शुक्राणुओं में समृद्ध, गोल शुक्राणु और pachytene शुक्राणु कोशिकाओं. गोल शुक्राणुक नाभिक छोटा होता है (6 र्7 उ व्यास में) तथा गोल(चित्र 2)। माउस गोल शुक्राणुनाभ नाभिक भी क्रोमोसेंटर नामक एक एकल, गोल हेटेरोक्रोमेटिन संरचना द्वारा विशेषता है। लंबे शुक्राणुओं के न्यूक्लिय का एक विशिष्ट लम्बी आकार होता है और क्रोमैटिन संघनन के कारण नाभिकीय आकार कम हो जाता है (चित्र 2)। पैकीन शुक्राणुकोशिका नाभिक बहुत बड़े होते हैं (व्यास 10 डिग्री सेल्सियस से अधिक) और अधिक अनियमित आकार में, घनी पैक क्रोमैटिन के क्षेत्रों के साथ पूरे भर में वितरित (चित्र 2)।
  6. यदि आवश्यक हो, विभिन्न प्रकार के सेल की मान्यता का समर्थन करने के लिए DAPI धुंधला के अलावा इम्यूनोस्टेनिंग करें।
    1. इस मामले में, एक तेल कलम की अंगूठी के अंदर एक फिक्सिंग समाधान (4% पीएफए और 0.1% nonionic surfactant) के 20 $L के साथ सेल निलंबन के 2 $L फैल गया। स्लाइड सुखाने के बाद, आरटी में 10 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ कोशिकाओं postfix.
    2. पीबीएस के साथ कुल्ला, तो 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% nonionic सर्फेक्टेंट के साथ permeibilize और 5 मिनट के लिए 100 एम एम एनएच4सीएल में स्लाइड इनक्यूबेट करके किसी भी शेष पीएफए निष्क्रिय।
    3. पीबीएस के साथ कुल्ला और एक मानक इम्यूनोफ्लोरेसींस प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ें जिसमें विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध और इनक्यूबेशन शामिल हैं। DAPI के साथ antifade mountant के साथ स्लाइड माउंट (सामग्री की तालिका) और उन्हें 24 ज के लिए सेट करने के लिए अनुमति देते हैं.
      नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के लिए उपयोगी मार्कर के उदाहरणों में मूंगफली एग्लूटिनिन (PNA; 1:2,000 को अवरुद्ध समाधान में) शामिल है जो एक्रोसोम को गोल और बढ़ाना शुक्राणुओं में दाग देता है, एंटी-DDX4 एंटीबॉडी (1:200 को अवरुद्ध करने में समाधान) जो एकल लेबल करता है कोशिकाद्रव्यी कणिका गोल शुक्राणुओं में, और एंटी-जेडएच 2एक्स एंटीबॉडी (1:100 घोल को अवरुद्ध करने में) जो पैकीटेन शुक्राणु कोशिकाओं में लिंग निकायों को पहचानता है। भिन्नों के इम्यूनोफ्लोरेसी विश्लेषण के उदाहरणों के लिए प्रतिनिधि परिणाम और चित्र 2C,D देखें.

6. भंडारण के लिए शेष नमूने प्रसंस्करण

नोट: धारा 6 को पूरा करने के लिए लगभग 20 मिनट लेता है।

  1. एक बार प्रत्येक अंश से एक नमूना एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड के लिए लिया गया है, प्रत्येक अंश के लिए बर्फ ठंडा 1x Krebs के 1 एमएल जोड़ें और नीचे कोशिकाओं को 600 डिग्री 13000 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर centrifuge.
    नोट: एक कम गति centrifugation एक ढीला गोली में परिणाम है, जो यह मुश्किल पूरी तरह से 1x Krebs को दूर करने के लिए बनाता है, जबकि एक उच्च गति centrifugation कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है. डाउनस्ट्रीम प्रोटोकॉल की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार अपकेंद्रण गति चुनें.
  2. निकालें और supernatant छोड़ें और पसंदीदा बहाव विश्लेषण के साथ जारी रखें।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोज़न किया जा सकता है और -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एक बार इस तकनीक से परिचित, यह सीधे वरीयता के बहाव प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने के लिए संभव है, लेकिन यह हमेशा एक नमूना लेने के लिए और प्रत्येक अंश की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए सलाह दी जाती है. कुल आरएनए निकाला जा सकता है, मात्रा निर्धारित, और रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) और आरएनए अनुक्रमण के रूप में तरीकों द्वारा विश्लेषण किया। कुल प्रोटीन अर्क भी तैयार किए जा सकते हैं जिनसे इम्यूनोप्रीसिप्शन या पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण किया जा सकता है (चित्र 3) ।

Representative Results

एक रोगाणु सेल प्रकार के पर्याप्त संवर्धन आमतौर पर 80%6से ऊपर माना जाता है . एमडीआर प्रोटोकॉल दौर शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करता है। की एक उच्च संख्या gt; 90% शुद्ध दौर spermatids नियमित रूप से इस तकनीक का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. पैकीटेन शुक्राणुकोशिकाओं और दीर्घों के शुक्राणुओं के इष्टतम अंश क्रमशः $75% और $80% तक समृद्ध होते हैं। शुक्राणुओं को बढ़ाना ढाल के शीर्ष पर रहता है और पहले अंश के साथ एकत्र किया जाता है। दिखाए गए उदाहरण में, अंश 1 में लंबा शुक्राणुओं का 80% था (चित्र 2ठ)। इस तकनीक के साथ प्राप्त अधिकांश दीर्घ शुक्राणुओं में संघनित नाभिक होते हैं, जबकि असंघनित शीघ्र दीर्घपरक शुक्राणु दुर्लभ होते हैं (चित्र 2)। निम्नलिखित भागों में समृद्ध गोल शुक्राणु होते हैं। उदाहरण में, गोल शुक्राणुओं का संवर्धन भिन्न 2, 3, और 4 में 90% से अधिक था और 80% से ऊपर संवर्धन को कुल सात भागों (2 $8) (चित्र 2) में देखा गया था। उनके बड़े आकार के कारण, पैकीटेन शुक्राणुओं तलछट तेजी से और पिछले एकत्र कर रहे हैं. शुद्धि उदाहरण में संवर्धन 14 तथा 15 भागों में लगभग 75% था (चित्र 2)।

जबकि परमाणु आकृति विज्ञान, DAPI धुंधला द्वारा कल्पना, आमतौर पर कोशिकाओं की मान्यता के लिए suffices, इम्यूनोफ्लोरेसींस विश्लेषण विश्लेषण का समर्थन करने के लिए किया जा सकता है. PNA गोल और लंबी शुक्राणुओं के विकासशील acrosomes दाग, और acrosomal उपस्थिति आगे भेदभाव10के कदम 1 में गोल spermatids वर्गीकृत करने के लिए शोषण किया जा सकता है. विशिष्ट PNA-सना हुआ लंबा और गोल शुक्राणु अपने परमाणु आकार में मतभेद पर निर्भर करता है (चित्र 2सी, बाएँ पैनल). विरोधी DDX4 एंटीबॉडी दौर spermatid अंशों के लिए एक उपयोगी मार्कर है क्योंकि यह एक एकल DDX4 सकारात्मक पेरिन्यूक्लियर ग्रेन्युल visualizes, क्रोमैटॉइड शरीर (सीबी), प्रत्येक दौर शुक्राणु के कोशिका द्रव्य में. यह सीबी-विशिष्ट अभिरंजन शुक्राणुकोशिकाओं में अधिक व्यापक रूप से वितरित कोशिकाद्रव्यी अभिरंजन से अंतर करना आसान है (चित्र 2ब्, मध्य फलक)। पैकीटेन शुक्राणु कोशिकाओं को एंटी-जेडएच 2एक्स एंटीबॉडी द्वारा मान्यता दी जा सकती है जो परमाणु लिंग शरीर को विशेष रूप से प्रथम मीओटिक विभाजन के पैकीटीन चरण में प्रदर्शित होने के लिए लेबल करती है (चित्र 2ब्, दायाँ पैनल)। इस शुद्धि में, पी.एन.ए. अभिरंजन से पता चला है कि एमडीआर समृद्ध गोल शुक्राणुभक्षी भिन्नों में विभेदकेपन के विभिन्न चरणों पर गोल शुक्राणुओं का मिश्रण होता है, जिसमें उनके हस्ताक्षर संरचना, DDX4-सकारात्मक सीबी (चित्र 2D, रुपये अंश). विरोधी $H2AX आगे अंश 16 में संवर्धन pachytene spermatocytes मान्य (चित्र 2डी, PSpc अंश).

कोशिका गणना से पता चला है कि दौर शुक्राणु और पैकीटेन शुक्राणुकोशिका भिन्न में कोशिकाओं की संख्या विभिन्न बहाव विश्लेषण के लिए पर्याप्त है. गोल शुक्राणु अंश (5 डिग्री 8) प्रत्येक 2.5 x 106 कोशिकाओं के आसपास निहित. इसलिए, इन भिन्नों को पूल करके, 10 मिलियन से अधिक कक्षों को प्राप्त करना संभव है. पैकीन शुक्राणुकोशिका भिन्न (14 और 15) आमतौर पर कुछ कम कोशिकाओं निहित. इस अलगाव में, लगभग 1.5 "2.0 x 106 कोशिकाओं प्रति अंश गिना गया. पहले अंश में 0.75 x 106 लम्बी शुक्राणु होते हैं।

जैसा कि चित्र 3में दर्शायागया है , अधिकांश भिन्नों से प्राप्त कुल आरएनए राशि 0ण्5$2.5 डिग्री ग्राम से होती है, जो डाउनस्ट्रीम आरएनए विश्लेषण ों के लिए पर्याप्त है जैसे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर, आरएनए अनुक्रमण, या जेल पर आरएनए को विज़ुअलाइज़ करना। प्रत्येक अंश से प्राप्त प्रोटीन की मात्रा आमतौर पर 20 ण्140ह(चित्र 3ठ)से होती है, जो कई पश्चिमी धब्बों के लिए पर्याप्त होती है। पूरे सेल lysates एकत्र अंशों से तैयार किए गए थे, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण DDX4, PIWIL1, और PIWIL2 का पता लगाने एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, जो सभी अत्यधिक pachytene spermatocytes और गोल spermatids में व्यक्त कर रहे हैं के रूप में अच्छी तरह से सर्वव्यापी ग्लाइसेरेल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीएपीडीएच)।

इस प्रोटोकॉल में, एकल भिन्नों से व्युत्पन्न प्रोटीन lysates का 10% एक मानक पश्चिमी धब्बा सेटिंग पर इन सभी प्रोटीनों का स्पष्ट रूप से पता लगाने के लिए पर्याप्त था (चित्र 3ब्) । एक अंश में प्रोटीन की मात्रा भी PIWIL1 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रतिरक्षा वर्षा के लिए पर्याप्त होना दिखाया गया था, साथ ही साथ सह-प्रतिरक्षा PIWIL2 का पता लगाने के लिए (चित्र 3डी)। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस तरह के मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर 11 के रूप में बहाव अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रण और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से pachytene spermatocytes और गोल शुक्राणुओं के समृद्ध अंश प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और उच्च थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण12.

Figure 1
चित्र 1: एक discontinuous बीएसए ढाल की तैयारी. (क)ग्रेडिएंट तैयार करने के लिए एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट टिप। (बी) अवसादन के बाद रोगाणु कोशिका भिन्नों की प्रवणता और संग्रह की तैयारी के लिए एक 1 एमएल पिपेट टिप। (ग)ग्रेडिएंट तैयार करने के लिए आवश्यक उपकरण। (घ)5% (नीचे) से 1% (ऊपर) बीएसए समाधान के लिए discontinuous बीएसए घनत्व ढाल के पार्श्व दृश्य; 2% और 4% बीएसए समाधान बेहतर दृश्य के लिए रंग में नीले हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एकत्र सेल भिन्नों और संवर्धन विश्लेषण के प्रतिनिधि छवियों. (ए) डीएपीआई से सना हुआ वृषण कोशिकाओं। ऊपरी पंक्ति एक पीएफए-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड वृषण अनुभाग (बाएं) या निलंबन (दाएं) के बरकरार अर्द्धनीफरस उपकला में वृषण कोशिकाओं को दिखाती है। निम्न पंक्ति समृद्ध दीर्घीकृत शुक्राणु (ES), गोल शुक्राणु (आरएस), या पैकीटेन शुक्राणुकोशिकाओं (पी एस पी सी) के अंशों को दर्शाती है। स्केल बार्स - ऊपरी पंक्ति के लिए 20 डिग्री और निचली पंक्ति के इनसेट के लिए 10 डिग्री मी। (ठ)प्रत्येक अंश में विभिन्न रोगाणु कोशिका प्रकारों का सापेक्ष परिमाणीकरण। कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गिना और रुपये, ES, PSpc, Sertoli कोशिकाओं, और अन्य कोशिकाओं में वर्गीकृत किया गया. ग्रेडिएंट में बीएसए की भिन्न संख्याएँ और संबंधित प्रतिशत x-अक्ष पर इंगित किए जाते हैं. (सी) वृषण कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। वाम पैनल: rhodamine लेबल PNA दोनों ES (पीला तीर) और आर एस (सफेद तीर) में acrosome दाग. मध्य पैनल: DDX4 एंटीबॉडी RS में एक एकल perinuclear ग्रेन्युल दाग, जो शुक्राणुकोशिकाओं में अधिक फैलाना कोशिका द्रव्य संकेत से भेद करने के लिए आसान है (नीले तीर). ES (नारंगी तीर) में कोई DDX4 संकेत का पता चला है। दाएँ फलक: [H2AX एंटीबॉडी विशेषता परमाणु सेक्स शरीर केवल pachytene spermatocytes में मौजूद पहचानता है ([H2AX-नकारात्मक कोशिकाओं एक सफेद तारांकन द्वारा चिह्नित). स्केल बार ] 10 m. (D) एमडीआर समृद्ध सेल अंश PNA (आरएस अंश), विरोधी DDX4 (आरएस अंश) के साथ लेबल किए गए थे, और प्रत्येक अंश में सेल संवर्धन को आगे मान्य करने के लिए एंटी-जेडएच2एक्स (PSpc अंश)। स्केल बार्स ] 10 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एमडीआर सेल संवर्धन के बाद डाउनस्ट्रीम विश्लेषण करता है। (क)एक प्रतिनिधि एमडीआर सेल संवर्धन और परिमाणित होने के बाद प्रत्येक अंश से आरएनए निकाला गया था। ग्रेडिएंट में बीएसए की भिन्न संख्याएँ और संबंधित प्रतिशत x-अक्ष पर इंगित किए जाते हैं. (ख)प्रोटीन रेडियोप्रतिकता परख (आरआईपीए) बफर में सेल गोली lysing द्वारा प्रत्येक अंश से निकाले गए थे तो मात्रा निर्धारित. (ग)पूरे सेल प्रोटीन अर्क तैयार किए गए और पश्चिमी सोख्ता द्वारा DDX4, PIWIL1, PIWIL2 और GAPDH के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। lysate के 10% प्रत्येक संकेत भिन्न से लोड किया गया था. (घ)पिआईडब्ल्यूआईएल1 और एंटी-पीआईडब्ल्यूआईएल2 एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके इंगित भिन्नों से इम्यूनो-अवपालनता की गई थी। इनपुट नमूना विभिन्न भागों से प्रोटीन lysates का एक मिश्रण भी शामिल है, और नियंत्रण इम्यूनोवेरीफ्ट (आईपी) खरगोश आईजीजी का उपयोग भी एक मिश्रित lysate से किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एमडीआर प्रोटोकॉल और प्रत्येक चरण को पूरा करने के लिए आवश्यक समय का Schematic प्रतिनिधित्व। शुरू सामग्री एक वयस्क माउस से दो testes से बना है. कोशिकाओं की औसत संख्या और आरएनए और एक अंश से प्राप्त प्रोटीन की मात्रा इंगित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बफ़र अभिकर्मकों तैयारी भंडारण
Krebs बफर (10x) 3.26 ग्राम KH2पीओ4 एच2 ओ के साथ 2 एल लाओ, 0.22 डिग्री मी और ऑटोक्लेव को फ़िल्टर करें। कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है
139.5 ग्राम नाक्कर
5ण्89 ह MgSO4 •7H2O
50 ग्राम डेक्सट्रोज
3.78 ग्राम CaCl22H2हे
7.12 ग्राम केसीएल
Krebs बफर (1x) 4.24 ग्राम नाहको3 नHको3 से 100 एमएल एच2व् को भंग करें, 10x क्रेब्स बफर के 200 एमएल जोड़ें, और एच2व् के साथ 2 एल तक लाएं। ताजा तैयार होना।
200 एमएल 10x क्रेब्स बफर

तालिका 1: Krebs बफर की तैयारी.

बीएसए एकाग्रता (w/ 10% बीएसए समाधान 1x क्रेब्स बफर
0.50% 0.5 एमएल 9.5 एमएल
1% 1 एमएल 9 एमएल
2% 2 एमएल 8 एमएल
3% 3 एमएल 7 एमएल
4% 4 एमएल 6 एमएल
5% 5 एमएल 5 एमएल

तालिका 2: बीएसए समाधान की तैयारी.

पाचन समाधान कार्य एकाग्रता अभिकर्मकों तैयारी
कोलाजनेज़ 1 मिलीग्राम/एमएल कोलाजनेज़ IV वजन 2 एक 50 एमएल शंकु ट्यूब के लिए collagenase चतुर्थ की मिलीग्राम, और पाचन से पहले गर्म 1x Krebs बफर सही के 2 एमएल जोड़ें (कदम 2.3).
ट्रिप्सिन 0.6 मिलीग्राम/एमएल ट्रिप्सिन वजन 15 trypsin के एक 50 एमएल शंकु ट्यूब के लिए मिलीग्राम, और जोड़ने के 25 एमएल गर्म 1x KREBS बफर और DNase के 40 $L मैं सही पाचन से पहले (चरण 2.6).
3.2 कु/ DNase मैं

तालिका 3: पाचन एंजाइमों की तैयारी.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल दौर शुक्राणुओं की समृद्ध आबादी को अलग करने के लिए है, pachytene spermatocytes, और मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग कर spermatids लंबा (चित्र4 में दिखाया प्रोटोकॉल का अवलोकन). हालांकि कोई विशेषज्ञता या महंगी मशीनरी की आवश्यकता है, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि ऊतक पाचन के दौरान विचार किया जाना चाहिए रहे हैं, ढाल के निर्माण, और ढाल पर सेल निलंबन की लोडिंग.

रोगाणु कोशिकाओं को लगातार एंजाइमी पाचनों द्वारा अर्धनाश नलिकाओं से जारी किया जाता है। कोलैजाज़ चतुर्थ के साथ पहला पाचन अंतरालीय कोशिकाओं को हटाने के द्वारा seminiferous ट्यूब्यूल अलग करता है। लंबे समय तक पाचन समय ट्यूबल को नुकसान पहुंचा सकता है और शुक्राणुओं की हानि का कारण बन सकता है, क्योंकि (यदि इस चरण के दौरान ट्यूबल से जारी किया जाता है) वे निम्न चरणों में छोड़ दिए जाएंगे। ट्रिप्सिन के साथ दूसरा पाचन चरण अर्धनीशुक्र नलिकाओं से रोगाणु कोशिकाओं को मुक्त करता है। वहाँ कभी कभी सेल lysis हो सकता है और आम तौर पर कुछ clumps जारी जीनोमिक डीएनए के कारण फार्म. पाचन की सिफारिश की अवधि या तापमान से अधिक की सलाह नहीं दी जाती है, क्योंकि इससे गरीब व्यवहार्यता, सेल lysis में वृद्धि हो सकती है, और क्लंपिंग हो सकती है। यदि हल्के clumping होता है, clumps नजरअंदाज किया जा सकता है. हालांकि, महत्वपूर्ण clumping और कोशिकाओं की हानि के मामलों में, trypsin पाचन समय या एकाग्रता कम किया जाना चाहिए. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्रिप्सिन की एंजाइमी गतिविधि बैचों के बीच और भंडारण के लंबे समय के दौरान भिन्न हो सकती है। Trypsin पाचन के दौरान DNase मैं की मात्रा भी अतिरिक्त clumps को दूर करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह एक माध्यमिक समाधान माना जाना चाहिए. पूर्व-उपचार के अंत में एक समरूप एकल सेल निलंबन प्राप्त करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि क्लंप्ड कोशिकाएं तेजी से तलछट करेंगी, भिन्नों को दूषित करेंगी और ढाल को बाधित करेंगी।

ग्रेडिएंट का निर्माण करने के लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है. यदि एक पिपेट नियंत्रक के साथ एक 5 एमएल पिपेट टिप का उपयोग कर परेशानी है, यह एक चिकनी पिस्टन के साथ एक सामान्य 1 एमएल यांत्रिक पिपेट का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है तो व्यास में $ 3 मिमी के एक एपर्चर के लिए पिपेट युक्तियों में कटौती (चित्र 1बी)। बीएसए समाधान की एक व्यापक एपर्चर और चिकनी लोडिंग ढाल मिश्रण का खतरा कम हो जाएगा। जब ठीक से तैयार किया जाता है, तो उनके विभिन्न अपवर्तक सूचकांकों के कारण आसन्न बीएसए समाधानों के बीच की सीमाओं को देखना संभव है। ग्रेडिएंट का उपयोग करने से पहले सीधे उत्पादित किया जाना चाहिए। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोई भी छोटा मिलाते हुए या कंपन ढाल को परेशान कर सकता है, इसलिए ढाल को ऐसे वातावरण में स्थापित किया जाना चाहिए जहां इसे परेशान नहीं किया जाएगा।

ग्रेडिएंट पर सेल निलंबन की लोडिंग बहुत सावधानी से की जानी चाहिए। लोड करने के बाद, सेल निलंबन ढाल के शीर्ष पर रहना चाहिए, जिसमें से कोशिकाओं को धीरे-धीरे पहली परत के माध्यम से तलछट करने के लिए शुरू कर देंगे। यदि कोशिकाओं के बड़े समूहों को ग्रेडिएंट के माध्यम से तेजी से आगे बढ़ते हुए देखा जाता है, तो कोशिकाओं को संभवतः सावधानी से पुन: निलंबित नहीं किया गया था या अतिरिक्त झुरमुट है। यदि कोशिकाओं लोड हो रहा है पर discontinuous बीएसए ढाल के शीर्ष पर नहीं रहते हैं, लेकिन तुरंत 1% और 2% बीएसए परतों (चरण 3.6) के बीच सिंक, सेल निलंबन की संभावना भी घने है. इस प्रोटोकॉल एक वयस्क माउस के दो testes का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है (80-120 mg/testis) प्रारंभिक सामग्री के रूप में; हालांकि, शुरू सामग्री की कम मात्रा का उपयोग कर सफल isolations किया गया है. प्रोटोकॉल upscale और testes की उच्च संख्या से अधिक समृद्ध रोगाणु कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, ढाल के साथ अधिक 50 एमएल ट्यूब शुरू किया जाना चाहिए.

प्रोटोकॉल शुरू में विकसित किया गया था और वयस्क माउस testes से अगुणित दौर शुक्राणुओं को समृद्ध करने के लिए अनुकूलित, और दौर spermatid अंशों की शुद्धता से अधिक होने की उम्मीद है 90%. अत्यधिक शुद्ध दौर spermatid अंशों के अलावा, pachytene spermatocytes और लंबी spermatids के संवर्धन के लिए संतोषजनक परिणाम प्राप्त किए गए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एरिथ्रोसाइट्स लंबे शुक्राणुओं के अंशों को दूषित कर सकते हैं, और उन्हें खत्म करने के लिए आगे कदम उठाए जाने चाहिए यदि उनकी उपस्थिति से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में हस्तक्षेप करने की उम्मीद की जाती है। हम एमडीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर वयस्क चूहों से premeiotic या जल्दी meiotic कोशिकाओं (pachytene चरण के लिए पूर्व) के रूप में अन्य सेल प्रकार को समृद्ध करने में सक्षम नहीं किया गया है.

इसके अतिरिक्त, एसटीए-PUT अवसादन सफलतापूर्वक जन्म13के बाद दिए गए समय बिंदु पर एकत्र किशोर testes का उपयोग कर शुक्राणुगोनिया या preleptotene, लेप्टोटेन, और युग्मनज शुक्राणु कोशिकाओं के समृद्ध अंश प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण शुक्राणुजनन की पहली लहर के दौरान इन कोशिका प्रकारों की उपस्थिति का लाभ लेता है। एक ही दृष्टिकोण की संभावना एमडीआर संवर्धन के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह अभी तक व्यवहार में परीक्षण नहीं किया गया है. एक अन्य विधि है कि भेदभाव के विशिष्ट चरणों में premeiotic और meiotic कोशिकाओं की शुद्धि के लिए एक अच्छा विकल्प है FACS है, जो उपस्थिति विशिष्ट मार्करों के आधार पर विशिष्ट कोशिकाओं प्रकार के अलगाव की अनुमति का महत्वपूर्ण लाभ है14 ,15,16,17.

कुल मिलाकर, एमडीआर वेग अवसादन रोगाणु सेल संवर्धन के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में कार्य करता है। हालांकि इस विधि की शुद्धता या समृद्ध कोशिकाओं की मात्रा के मामले में अन्य अच्छी तरह से स्थापित तरीकों से बेहतर नहीं है, इसके स्पष्ट लाभ अपनी सादगी और कम सेट अप लागत हैं. यह, एक साथ आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की कम राशि के साथ, इस प्रोटोकॉल spermatogenesis क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक बढ़िया विकल्प प्रदान करते हैं और अन्य क्षेत्रों में जो विशेष हार्डवेयर या जानवरों के बड़े समूहों में निवेश करने की इच्छा नहीं हो सकता है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उनके योगदान के लिए सभी कोटाजा प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, और सक्रिय उपयोग और उनके अनुसंधान परियोजनाओं में प्रोटोकॉल के परीक्षण. विशेष रूप से हम प्रोटोकॉल के अनुकूलन में मदद के लिए जन Lindstrm के योगदान की सराहना करते हैं. इस अध्ययन फिनलैंड की अकादमी द्वारा समर्थित किया गया था, सिग्रिड Jus-lius फाउंडेशन, और आणविक चिकित्सा के Turku डॉक्टरेट कार्यक्रम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde Preference of researcher
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A-21206
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A-31571
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647
CaCl2·2H2O Preference of researcher
Collagenase IV Sigma C5138
Complete protease inhibitor cocktail Roche 11836145001
DDX4 antibody Abcam ab13840
Dextrose Preference of researcher
DNase I Worthington LS006355
GAPDH HyTest 5G4
HRP-linked anti-mouse IgG GE Healthcare Life Sciences NA931
HRP-linked anti-rabbit IgG GE Healthcare Life Sciences NA934
KCl Preference of researcher
KH2PO4 Preference of researcher
MgSO4·7H2O Preference of researcher
NaCl Preference of researcher
NaHCO3 Preference of researcher
NH4Cl Preference of researcher
Pierce BCA protein assay kit Life Technologies 23227
PIWIL1 Cell Signaling Technology G82
PIWIL2, clone 13E-3 Millipore MABE363
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36962 for Alexa Fluor immunostainings
Rabbit IgG Neomarkers NC-100-P
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) Vector Laboratories RL-1072
RIPA buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT
TRIsure Bioline BIO-38033
Triton X-100 Preference of researcher nonionic surfactant
Trypsin Worthington LS003703
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 for standard DAPI analysis of cell fractions
γH2AX antibody Millipore 05-636
0.22 µm filter Sartorius Sartolab BT 180C6 or equivalent
1 mL mechanical pipette Preference of researcher
1.5 mL or 2 mL tubes Preference of researcher
40 µm cell sieves for 50 mL tubes Greiner Bio-One 542040 or equivalent cell strainer
5 mL serological pipettes Sarstedt 86.1254.001 or equivalent
50 mL conical tubes Preference of researcher
6 cm Petri dishes Preference of researcher
Cell culture incubator Preference of researcher
Centrifuge for 50 mL tubes Preference of researcher
Grease pen for microscopy glass slides Preference of researcher
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D or equivalent cell rotator
Microdissection forcepts Preference of researcher
Microdissection scissors Preference of researcher
Microscopy glass slides and coverslips Preference of researcher
Nanodrop 1000 Thermo Scientific
Pipetboy Acu 2 Integra 155 000 or equivalent pipette controller
Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes Preference of researcher
Tips for 1 mL mechanical pipette Preference of researcher
Water bath Preference of researcher
Widefield fluorescence microscope Preference of researcher

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References

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मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग कर माउस टेस्ट से Pachytene शुक्राणुकोशिकाओं और शुक्राणुओं का संवर्धन
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Da Ros, M., Lehtiniemi, T., Olotu, O., Meikar, O., Kotaja, N. Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment. J. Vis. Exp. (151), e60271, doi:10.3791/60271 (2019).More

Da Ros, M., Lehtiniemi, T., Olotu, O., Meikar, O., Kotaja, N. Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment. J. Vis. Exp. (151), e60271, doi:10.3791/60271 (2019).

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