Summary
Представлен протокол для обогащения пахитена сперматоцитов, круглых сперматозоидов и удлинение сперматозоидов от взрослых яичек мыши с использованием прерывистой бычьей сыворотки альбумина градиент плотности с стандартным лабораторным оборудованием.
Abstract
Чтобы охарактеризовать каждый шаг сперматогенеза, исследователи должны отделить различные субпопуляции зародышевых клеток от яичек. Тем не менее, изоляция дискретных популяций является сложной задачей, потому что взрослый яичек содержит сложную смесь зародышевых клеток со всех этапов сперматогенеза вместе с определенными популяциями соматических клеток. За последние несколько десятилетий, различные методы, такие как центробежная элутриация, флуоресценция активированной сортировки клеток (FACS), и STA-PUT были успешно применены к изоляции зародышевых клеток. Недостатком является то, что все они требуют специальных устройств и специализированной подготовки. Следуя принципам, лежащим в основе метода STA-PUT, был разработан простой протокол для изоляции сперматозоидов пахитена, круглых сперматозоидов и удлинений сперматозоидов из яичек мыши. После подготовки одноклеточной суспензии яичек, конкретные популяции клеток обогащаются гравитационным осадочным отложением через прерывистый градиент плотности сыворотки крупного рогатого скота (BSA). Затем фракции клеток собираются вручную и микроскопически анализируются. Этот модифицированный градиент плотности для круглых сперматозоидов (MDR) протокол осадка может быть широко применен, потому что он требует только стандартного лабораторного оборудования. Кроме того, протокол требует минимальных исходных материалов, снижая его стоимость и использование лабораторных животных.
Introduction
Многое до сих пор неизвестно о молекулярных и биологических событий, происходящих во время сперматозоидов сперматогенеза, сложный процесс, в котором сперматогоиальные стволовые клетки превращаются в узкоспециализированные сперматозоиды1,2. Сперматогенез происходит внутри семено-полуплодовых трубяков яичка. Трубочки содержат смесь зародышевых клеток с каждого шага дифференциации, включая сперматогольные стволовые клетки, митотически разделяющие сперматого, мейотические сперматозии и постмейотические сперматозоиды (которые проходят гаплоидную дифференциацию от круглых сперматозоидов для удлинения сперматозоидов, и, наконец, созреть сперматозоиды). Соматические клетки яичка включают клетки Sertoli, которые переплетаются с зародышевыми клетками внутри полуниферовых труб, перитубулярных миоидных клеток, которые образуют стенки труб, и тестостерон-производящих клеток Лейдига в интерстициальном пространстве между трубами.
Изучение молекулярных и биохимических процессов во время сперматогенеза часто требует отделения различных популяций зародышевых клеток от сложной смеси яичек. Было разработано много различных стратегий для обогащения клеток. Наиболее успешными методами являются ОСАДОчные отложения скорости STA-PUT единицей гравитации3,4,5,6,центробежная элевация на основе центрифугации противотуманных7,8, и сортировка клеток, активированных флуоресценцией (FACS), которая отделяет клетки в зависимости от содержания ДНК и/или конкретных маркеров. Эти методы широко используются среди исследователей сперматогенеза и позволяют эффективное обогащение конкретных типов зародышевых клеток. Однако ограничение этих методов заключается в том, что они требуют специализированного дорогостоящего оборудования, требуя опыта.
Здесь представлен простой и недорогой протокол для изоляции обогащенных популяций трех наиболее распространенных клеточных популяций мышечных яичек: круглых сперматозоидов, пахитена сперматоцитов и удлиненных сперматозоидов. Этот протокол называют модифицированным градиентом плотности для круглых сперматозоидов (MDR), потому что он особенно хорошо работает для обогащения круглых сперматозоидов. Метод MDR основан на тех же принципах, что и осадок скорости STA-PUT, но требует только стандартного лабораторного оборудования. В стандартных 50 мл трубки под гравитационным полем Земли можно провести отложения через вручную подготовленный прерывистый доблиновый альбумин (BSA) градиент плотности крупного рогатого скота (BSA). Большие клетки движутся быстрее через градиент, который разделяет различные популяции зародышевых клеток. После отложений, обогащенные фракции трех типов клеток собираются вручную. Чистота этих обогащенных популяций клеток сравнима с теми, которые получают STA-PUT и центробежная универсалия.
В дополнение к покрытию конструкции и использования градиента BSA для отложений скорости, протокол также описывает метод пищеварения для того чтобы выпустить яички клетки от seminiferous трубок. Протокол был изменен с того, что разработан Ромрелл и др.9 и включает в себя последовательные пищеварения с коллагеназом IV и трипсином. Последовательное пищеварение в сочетании с использованием буфера бикарбоната (т.е. растворки Кребса) значительно повышает разделение и жизнеспособность зародышевых клеток9.
Во время обогащения МЛУ, клетки проводят около 4 ч вместе вне окружающей среды полуниферных труб и не подвергаются стрессовым механическим силам, что позволяет для сбора высокожизнеспособных клеточных фракций для анализа вниз по течению. Кроме того, подобно центробежной универсации и STA-PUT, протокол MDR не требует какой-либо химической обработки или маркировки клеток, что также помогает поддерживать их жизнеспособность. Важно отметить, что всего лишь два взрослых мычек мыши достаточно для изоляции МДР и, следовательно, одна взрослая мышь обеспечивает достаточно обогащенных клеток для РНК и анализа белка. Стандартный протокол STA-PUT рекомендует использовать целых 12 взрослых мышей для изоляции клеток6; хотя, основываясь на предыдущем опыте, известно, что успешная изоляция может быть сделано от трех до четырех взрослых мышей. Наименьшее количество исходного материала, как сообщается, достаточно для центробежной элутриации шесть мышей яичек (три мыши)8. Поэтому, помимо устранения необходимости в дорогостоящем специализированном оборудовании, протокол МДР сокращает количество необходимых лабораторных животных.
Protocol
Поддержание лабораторных мышей и все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами ухода и использования лабораторных животных.
1. Установка оборудования и реагентов
- Установите водяную ванну до 37 градусов по Цельсию.
- Установите инкубатор клеточной культуры до 34 градусов по Цельсию, 5% CO2,95% влажности. Поместите ротатор трубки внутрь инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубаторы требуют длительного времени для изменения внутренней температуры. Если инкубатор постоянно устанавливается на уровне 34 градусов по Цельсию не доступен, установите один за 1 день до эксперимента. - Подготовьте и пометьте соответствующее количество микроскопических стеклянных слайдов. Нарисуйте кольцо диаметром 1 см с жиром и дайте смазке высохнуть.
- Подготовка 1x Кребс буфер, рН 7,8(Таблица 1). Положите две конические трубки с 50 мл 1x Кребс до 34 градусов по Цельсию, чтобы предварительно согреться для шагов 2.5'2.8. Храните остальные 1x Кребс на 4 кв/ или на льду.
- Подготовьте решения BSA. Сначала подготовьте 25 мл 10% (w/v) раствора BSA в Кребсе путем растворения 2,5 г буфера BSA в 1x Кребс буфера до окончательного объема 25 мл. Разбавить 10% раствор BSA с 1x Кребс буфер для получения различных концентраций BSA (Таблица 2). Храните все решения BSA при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте решения в тот же день процедуры и храните при 4 градусах По Цельсию до использования. - Подготовка ферментов пищеварения, взвешивая правильное количество трипсина и коллагеназы до 50 мл конических трубок(Таблица 3).
2. Вскрытие животных и подготовка подвески зародышевых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает около 1 ч для завершения.
- Пожертвуйте взрослой мужской мышью (в возрасте 7 недель и старше, яичка весом 80–120 мг в зависимости от штамма и возраста) через вывих шейки матки или удушение CO2.
- Спрей брюшной брюшной полости мыши с 70% этанола. Откройте абдоминопелвийской полости ножницами, сделав V-образное отверстие.
- Тяговая на эпидидимальной жировой подушечки с щипками, найти яички и удалить их с ножницами. Избегайте нарушения туники albuginea. Поместите яички на 6 см Петри блюдо, содержащее 1x Кребс.
- Разгрузить яички и отбросить туника albuginea. Слегка разогнать полуниферные трубки, нежно дразня их друг от друга с щипками.
- Используйте щипцы для передачи полуниферовых труб в коническую трубку 50 мл, содержащую 2 мл свежеприготовленного раствора коллагеназы(Таблица 3).
- Инкубировать трубки в 37 градусов воды в течение 3 мин. Агитировать осторожно, качая трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свободно плавающие трубки должны возникать в течение 3 минут из-за удаления интерстициальных клеток. Физиологическая температура для яичек составляет 34 градуса Цельсия; поэтому, длинные пищеварения, как правило, делается при такой температуре. Тем не менее, короткий 3 мин пищеварения может быть проведена при температуре 37 градусов по Цельсию (рекомендуемая температура производителем). Обратите внимание, что при использовании 34 градусов по Цельсию время пищеварения должно быть повторно оптимизировано. - Добавьте не менее 40 мл теплого 1x Кребса и дайте трубам осадок (1 мин) при комнатной температуре (RT). Удалите супернатант и повторите 1x.
- Добавьте 25 мл свежеприготовленного раствора трипсина(таблица 3),поместите трубку на ротатор трубки внутри инкубатора 34 градусов по Цельсию и инкубируют в течение 15–20 мин (15 об/мин). Время от времени проверяйте состояние труб. Как только раствор станет облачным и останутся лишь маленькие кусочки труб, поместите трубку на лед и немедленно приступайте к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать переваривания желудка и клеточного лиза, быстро перейдите к следующим шагам стирки. Некоторые протоколы включают деактивацию трипсина сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS). В этом протоколе, FBS лечение опущено, и вместо этого, трипсин удаляется немедленноцентругации и последующих стирок с холодной 1x Кребс. - Фильтр раствора через 40 мкм ячейки ситечко в новый 50 мл конической трубки на льду.
- Центрифуга 600 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы гранулировать клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугация с слишком сильной силой может нанести вред клеткам. - Удалите супернатант, тщательно выливая его.
- Нажмите на клеточные гранулы, чтобы повторно приостановить работу клеток в оставшуюся часть 1x Кребс.
- Добавьте не менее 40 мл холодных 1x Кребса в новьоловые клетки.
- Повторите шаги 2.10 и 2.11.
- Нажмите трубку с клетками гранулы, чтобы вновь приостановить клетки. Добавьте 1 мл 0,5% BSA в 1x Кребс и с разрезанием пипетки отзыв resuspend клетки пайпеттинг решение вверх и вниз. Избегайте создания пузырей.
- Наконец, добавьте 1'3 мл 0,5% BSA в 1x Krebs, так что окончательный объем составляет 3 мл. Фильтруйте подвеску зародышевых клеток через 40 мкм-ситечко и немедленно приступайте к загрузке клеток на градиент BSA.
3. Разделение зародышевых клеток через прерывистый градиент BSA
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел занимает около 2 ч для завершения. Начните готовить прерывистый градиент BSA во время шагов стирки (шаги 2.10-2.14) для загрузки клеток, как только предварительная обработка будет готова.
- Разместить трубку 50 мл вертикально на льду, чтобы можно было увидеть одну сторону трубки. Кроме того, запустите протокол в холодной комнате при 4 градусах Цельсия, и в этом случае лед не нужен.
- Вырежьте кончик серологического пипетки калибра 10 мл от наконечника, чтобы получить большую диафрагму(рисунок 1А),и установите его на контроллер пипетки(рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит снизить скорость во время пипетки, что облегчает укладку различных решений BSA. Кроме того, используйте 1 мл механических пипетки с гладким поршенем и сократить пипетка советы с диафрагмой около 3 мм в диаметре(Рисунок 1B). - Начните с трубоукладки 5 мл 5% раствора BSA на дно трубки 50 мл.
- Медленно pipet 5 мл 4% раствора BSA поверх 5% раствора. Начните с нежного касания поверхности 5% раствора с отрезанным кончиком пипетки и слой двух растворов при тщательном поддержании контакта с поверхностью, гарантируя, что не позволит трубчатый кончик, чтобы погрузиться.
ПРИМЕЧАНИЕ: В конце этого шага должна быть видна четкая линия между двумя слоями. - Повторите шаг 3.4 с другими решениями BSA получить прерывистый градиент от 5% до 1%(рисунок 1D).
- Тщательно загрузите одноклеточную подвеску на верхней части градиента, не нарушая. Пусть клетки осадок через градиент в течение 1,5 ч при 4 градусах Цельсия или на льду.
4. Коллекция обогащенных фракций зародышевых клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел занимает около 30 минут.
- Установите 1 мл наконечник апперкот на 1 мл механической пипетки и сократить наконечник так, что диафрагма составляет 3 мм в диаметре(Рисунок 1B).
- Тщательно соберите фракции в 1 мл в отдельных трубах длиной 1,5 мл, начиная с верхней части градиента BSA, и храните их на льду. Номер труб в том же порядке, что и фракции, будет собран.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе должна быть серия из 28 трубок, содержащих клеточные суспензии. Используйте 1 мЛ механический пипетка с гладким поршенем и сократить пипетки советы, чтобы свести к минимуму риск нарушения градиента BSA. - Центрифуга фракций зародышевых клеток на 600 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- Осторожно, чтобы не беспокоить гранулы, отбросить большую часть супернатанта и resuspend клетки гранулы, щелкнув трубки. Добавьте 1 мл ледяного 1x буфера Кребса к каждой трубке и повторите центрифугацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг стирки, если BSA вмешивается в анализ вниз по течению. - Откажитесь от большей части супернатанта, но оставьте 100 евро после окончательной стирки. Тщательно приостановите действие клеточной гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная приостановка работы клеток гарантирует, что образец, взятый из этого раствора, представляет все ячейки данной фракции. Держите клеточные подвески на льду при подготовке слайдов.
5. Анализ клеточных фракций
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ занимает 2 ч для завершения.
- Один за раз, пипетка 20 л 4% параформальдегида (PFA) внутри каждого кольца смазки пера на пронумерованном слайде микроскопии.
- Немедленно добавьте 2 злиц переподлоповаемых суспензии клетки от соответствующей фракции. Повторите для каждой фракции.
ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке слайдов, держать все клеточные суспензии на льду. - Сухие слайды на RT в течение 1 ч до ночи (O / N).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, после взятия образца из каждой фракции, клетки могут быть обработаны для анализа или хранения ниже по течению (раздел 6). - Промыть слайды один раз с 1x PBS и смонтировать с монтажом среды с 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (Таблица материалов).
- Проанализируйте слайды под флуоресцентным микроскопом, чтобы оценить, какой тип зародышевых клеток обогащается в каждой фракции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные типы клеток могут быть признаны по их характерной ядерной морфологии, визуализированной dAPI окрашивания. Рисунок 2 Показано репрезентативные фракции, обогащенные удлинениями сперматозоидов, круглыми сперматидами и пахитеном сперматоцитами. Круглое сперматозоидное ядро небольшое (6-7 мкм в диаметре) икруглое (рисунок 2А). Мышь круглые ядра сперматозоидов также характеризуется одной, круглой структуры гетерохроматина называется хромоцентр. Ядра удлиненных сперматозоидов имеют типичную удлиненную форму и уменьшенные ядерные размеры из-за конденсата хроматина(рисунок 2А). Pachytene сперматоцитов ядра гораздо больше (диаметр более 10 мкм) и более нерегулярной формы, с областями плотно упакованных хроматин распространяется по всей(Рисунок 2A). -
При необходимости, выполнять иммунопятнания в дополнение к DAPI окрашивания для поддержки признания различных типов клеток.
- В этом случае, распространение 2 злиец клеточной подвески с 20 зл иl фиксации раствора (4% PFA и 0,1% нонионического сурфактанта в PBS) внутри кольца смазки пера. После сушки слайдов, postfix клетки с 4% PFA в течение 10 минут на RT.
- Промыть pbS, затем permeabilize с 0,1% неионический сурфактант в PBS в течение 5 мин. Промыть pbS и отключить любые оставшиеся PFA путем инкубации слайдов в 100 мм NH4Cl в течение 5 мин.
- Промыть PBS и перейти к стандартному протоколу иммунофлуоресценции, состоящий из блокирования и инкубации с конкретными первичными антителами и флюорохром-метки вторичных антител. Смонтировать слайды с антифадейс маунтант с DAPI (Таблица материалов) и позволяют им установить на 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры полезных маркеров для первичных инкубаций антител включают арахис агглютинин (PNA; 1:2,000 в блокирующем растворе), который окрашивает акросому в круглые и удлиняющие сперматозоиды, анти-DDX4 антитела (1:200 в блокирующем растворе), который маркирует одиночный цитоплазматическая гранула в круглых сперматозоидах, а также анти-H2AX антитела (1:100 в блокирующем растворе), который распознает половые органы в пахитеновых сперматозитов. Примеры анализа иммунофлуоресценции фракций читайте в репрезентативных результатах и рисунке 2C.D.
6. Обработка оставшихся образцов для хранения
ПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 6 занимает около 20 минут, чтобы завершить.
- После того, как образец из каждой фракции был взят для микроскопии слайд, добавить 1 мл ледяной 1x Кребс к каждой фракции и центрифуги клетки вниз на 600-13000 х г в течение 10 минут при 4 кС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкоскоростная центрифугация приводит к рыхлой гранулы, что делает его трудно полностью удалить 1x Кребс, в то время как высокоскоростной центрифугирования может нанести вред клеткам. Выберите скорость центрифугирования в соответствии с конкретными требованиями протокола вниз по течению. - Удалите и отбросьте супернатант и продолжить предпочтительный анализ вниз по течению.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент клетки могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -70 градусов по Цельсию. После того, как знакомы с этим методом, можно продолжить с вниз по течению протокол предпочтения непосредственно, но это всегда целесообразно взять образец и обеспечить чистоту каждой фракции. Общая РНК может быть извлечена, количественно и проанализирована такими методами, как обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирование РНК. Всего белковых экстрактов также могут быть подготовлены, из которых иммунопреципции или западного анализа blotting может быть выполнена(рисунок 3).
Representative Results
Достаточное обогащение типа зародышевых клеток обычно считается выше 80%6. Протокол MDR работает особенно хорошо для обогащения круглых сперматозоидов. Большое количество чистокруглых сперматозоидов, которые обычно можно получить с помощью этой техники, можно получить. Оптимальные фракции сперматозоидов пахитена и удлинение сперматозоидов обогащаются до 75% и 80%, соответственно. Удлинение сперматозоидов, как правило, остаются на вершине градиента и собираются с первой фракции. В приведенном примере фракция 1 содержит 80% удлинений сперматозоидов(рисунок 2B). Большинство удлиненных сперматозоидов, полученных с помощью этой техники имеют конденсированные ядра, в то время как неконденсированные ранние удлинение сперматозоидов не хватает(рисунок 2A). Следующие фракции содержат обогащенные круглые сперматозоиды. В этом примере обогащение круглых сперматозоидов составило более 90% в фракциях 2, 3 и 4, а обогащение выше 80% было замечено в целом в семи фракциях(рисунок 2B). Из-за их большого размера, pachytene сперматозитов осадок быстрее и собираются последними. В примере очистки обогащение составило около 75% в фракциях 14 и 15(рисунок 2B).
В то время как ядерная морфология, визуализированная DAPI окрашивание, как правило, достаточно для распознавания клеток, иммунофлуоресценция анализ может быть выполнен для поддержки анализа. PNA окрашивает развивающиеся акромы круглых и удлиненных сперматозоидов, а акросомный вид может быть использован для дальнейшей классификации круглых сперматозоидов в шаги 1'8 дифференциации10. Отличительная ПНА-окрашенные удлиненные и круглые сперматозоиды зависит от различий в их ядерной форме(рисунок 2C, левая панель). Анти-DDX4 антитела является полезным маркером для круглых сперматозоидов фракций, поскольку он визуализирует один DDX4-положительный периядерный гранулы, хроматоидного тела (CB), в цитоплазме каждого раунда сперматида. Это CB-специфическое окрашивание легко различить от более широко распределенного цитоплазматического окрашивания в сперматоцитах(рисунок 2C,средняя панель). Pachytene сперматоцитов могут быть признаны анти-H2AX антитела, что этикетки ядерного тела секса специально появляются на фазе pachytene первого мейотического деления (Рисунок 2C, правая панель). В этой очистке, PNA окрашивания показали, что МДР обогащенные круглые сперматозоиды содержали смесь круглых сперматозоидов на различных этапах дифференциации, все содержащие их подпись структуры, DDX4-положительный CB (Рисунок 2D, RS фракция). Анти-H2AX далее подтвердил обогащение pachytene сперматоций в фракции 16(Рисунок 2D, PSpc фракции).
Подсчет клеток показал, что количество клеток в круглых сперматозоидных и пахитеновых сперматозичных фракциях является достаточным для различных анализов вниз по течению. Круглые сперматозоиды (5–8) содержали около 2,5 х 106 клеток. Таким образом, объединив эти фракции, можно получить более 10 миллионов клеток. Пахитена сперматоцитов фракций (14 и 15) обычно содержит несколько меньше клеток. В этой изоляции было подсчитано около 1,5–2,0 х 106 ячеек на одну фракцию. Первая фракция содержала 0,75 x 106 удлинение сперматозоидов.
Как показано на рисунке 3A, общее количество РНК, полученное из большинства фракций, колебалось от 0,5 до 2,5 мкг, что достаточно для анализа РНК вниз по течению, таких как обратная транскрипция ПЦР, покихани РНК или визуализация РНК на геле. Количество белка, полученного из каждой фракции, обычно колеблется от 20–140 мкг(рисунок 3В),что достаточно для нескольких западных помарки. Целые клеточные лисаты были подготовлены из собранных фракций, а западный анализ помок был проведен с использованием антител, обнаруживающих DDX4, PIWIL1 и PIWIL2, которые высоко выражены в сперматозиях пахитена и круглых сперматозоидах, а также повсеместно выраженный глицецеральдегид 3-фосфатдегеназы (GAPDH).
В этом протоколе, 10% лизатов белка, полученных из отдельных фракций было достаточно, чтобы четко обнаружить все эти белки на стандартной западной настройки пятно(Рисунок 3C). Было также показано, что количество белка в одной фракции достаточно для иммунопреципиции с использованием антитела против PIWIL1, а также для обнаружения совместного иммунопромцибилизированного PIWIL2(рисунок 3D). Кроме того, этот протокол был успешно использован для получения обогащенных фракций сперматозоидов pachytene и круглых сперматозоидов от контрольных и генетически модифицированных мышей для применения ниже по течению, таких как количественную обратную транскрипцию PCR11 и высокая пропускная способность РНК секвенирования12.
Рисунок 1: Подготовка прерывистого градиента BSA. (A) Наконечник серологического пипетки 5 мл для подготовки градиента. (B) 1 мл пипетки отзыв для подготовки градиента и сбора фракций зародышевых клеток после осадка. (C) Оборудование, необходимое для подготовки градиента. (D) Боковой вид прерывистого градиента плотности BSA от 5% (внизу) до 1% (сверху) решения BSA; 2% и 4% BSA решения синего цвета для лучшей визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения собранных клеточных фракций и анализ обогащения. (A) DAPI-окрашенные яички яичек. Верхний ряд показывает яички в нетронутом семиниферном эпителии PFA-фиксированной, парафина-встроенный яичка раздел (слева) или в подвеске (справа). Нижний ряд показывает фракции обогащенных удлиненных сперматозоидов (ES), круглых сперматозоидов (RS), или пахитена сперматоцитов (PSpc). Шкала баров 20 мкм для верхнего ряда и 10 мкм для вставки нижнего ряда. (B) Относительная количественная оценка различных типов зародышевых клеток в каждой фракции. Ячейки были вручную подсчитаны с помощью программного обеспечения ImageJ и классифицированы в RS, ES, PSpc, Sertoli и другие ячейки. На оси x указаны цифры фракции и соответствующие проценты BSA в градиенте. (C) Иммунофлуоресценция анализ яичек клеток. Левая панель: родамина помечены PNA пятна акросомы в обоих ES (желтая стрелка) и RS (белая стрелка). Средняя панель: Антитела DDX4 окрашивает один перинуклеарный гранул у РС, который легко отличить от более диффузного цитоплазмического сигнала в сперматоцитах (синяя стрелка). Сигнал DDX4 не обнаружен в ES (оранжевая стрелка). Правая панель: антитела H2AX распознает характерное ядерное половое тело, присутствующее только в сперматоцитах pachytene (H2AX-отрицательные клетки, отмеченные белой звездочкой). Шкала баров No 10 мкм. (D) MDR обогащенных клеточных фракций были помечены PNA (RS фракции), анти-DDX4 (RS фракции), и анти-H2AX (PSpc фракции) для дальнейшей проверки обогащения клеток в каждой фракции. Шкала баров 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализы вниз по течению после обогащения клеток МДР. (A) РНК была извлечена из каждой фракции после репрезентативного обогащения клеток МДР и количественно. На оси x указаны цифры фракции и соответствующие проценты BSA в градиенте. (B) Белки были извлечены из каждой фракции путем выдвижения клеточной гранулы в радиоиммунопреционно-анализ (RIPA) буфер затем количественно. (C) Экстракт белка цельного клетки были подготовлены и проанализированы западными blotting используя антитела против DDX4, PIWIL1, PIWIL2, и GAPDH. 10% лизата было загружено с каждой указанной фракции. (D) Иммунопрецифасьция была выполнена из указанных фракций с использованием анти-PIWIL1 следуют западные blotting с анти-PIWIL1 и анти-PIWIL2 антител. Входный образец включает в себя смесь белковых лисатов из различных фракций, а контрольиммунорезации (ИС) с использованием кролика IgG также был выполнен из смешанного лизата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схематическое представление протокола MDR и времени, необходимого для завершения каждого шага. Исходный материал состоит из двух яичек от взрослой мыши. Показано среднее количество клеток и количество РНК и белка, полученных из одной фракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Буфера | Реагентов | Подготовка | Хранения |
| Буфер Кребса (10x) | 3,26 г KH2PO4 | Доведите до 2 л с H2O, фильтр 0,22 мкм и автоклав. | Может храниться при 4 градусах по Цельсию в течение нескольких месяцев |
| 139,5 г NaCl | |||
| 5,89 г MgSO4 "7H2O | |||
| 50 г декстроза | |||
| 3,78 г CaCl2-2H2O | |||
| 7,12 г KCl | |||
| Буфер Кребса (1x) | 4.24 г NaHCO3 | Растворите NaHCO от3 до 100 мл H2O, добавьте 200 мл 10x буфера Кребса и доведите до 2 л с H2O. | Чтобы быть готовым свежим |
| 200 мл 10x Кребс буфер |
Таблица 1: Подготовка буфера Кребса.
| Концентрация BSA (w/v) | 10% решение BSA | 1x Кребс буфер |
| 0.50% | 0,5 мл л. | 9,5 мл л. |
| 1% | 1 мл | 9 мл |
| 2% | 2 мл | 8 мл |
| 3% | 3 мл | 7 мл |
| 4% | 4 мл | 6 мл |
| 5% | 5 мл | 5 мл |
Таблица 2: Подготовка решений BSA.
| Раствор пищеварения | Рабочая концентрация | Реагентов | Подготовка |
| Коллагенеза | 1 мг/мл | Коллагенеза IV | Взвесьте 2 мг коллагеназы IV к конической трубке 50 мл и добавьте 2 мл теплого буфера 1x Krebs прямо перед пищеварением (шаг 2.3). |
| Трипсин | 0,6 мг/мл | Трипсин | Взвесьте 15 мг трипсина в коническую трубку 50 мл и добавьте 25 мл теплого 1x буфера KREBS и 40 л DNase I прямо перед пищеварением (шаг 2.6). |
| 3,2 ку/мл | DNase I |
Таблица 3: Подготовка ферментов пищеварения.
Discussion
Представлен простой и недорогой протокол для изоляции обогащенных популяций круглых сперматозоидов, пахитена сперматоцитов и удлиненных сперматозоидов с использованием стандартного лабораторного оборудования (обзор протокола показан на рисунке 4). Хотя нет опыта или дорогостоящего оборудования не требуется, Есть некоторые критические шаги, которые должны быть рассмотрены во время пищеварения тканей, строительство градиента, и загрузка подвески клетки на градиент.
Зародыш клетки высвобождаются из семено-полуплодовые трубки двумя последовательными ферментативными пищеварениями. Первое пищеварение с коллагеназой IV отделяет полуниферные трубки, удаляя интерстициальные клетки. Длительное время пищеварения может повредить трубочки и привести к потере сперматозоидов, так как (если они будут освобождены из труб во время этого шага) они будут отброшены в следующих шагах. Второй шаг пищеварения с трипсином выпускает зародышевые клетки из семеноплодных труб. Там может быть случайные лиза клетки и, как правило, некоторые скопления форме из-за выпустила геномной ДНК. Превышение предлагаемой продолжительности или температуры пищеварения не рекомендуется, так как это может привести к более низкой жизнеспособности, увеличение лиза клеток, и слипания. Если мягкий слипания происходит, сгустки могут быть проигнорированы. Однако, в случаях значительного слипания и потери клеток, время пищеварения трипсина или концентрация должна быть сокращена. Следует также отметить, что ферментативная активность трипсина может варьироваться между партиями и в течение длительного времени хранения. Количество DNase I во время пищеварения трипсина также может быть увеличена, чтобы удалить избыток сгустков, но это следует рассматривать как вторичное решение. Важно получить однородную одноклеточную суспензию в конце предварительной обработки, так как слипшиеся клетки будут отложения быстрее, загрязняя фракции и нарушая градиент.
Создание градиента может потребовать определенной практики. Если есть дискомфорт с помощью 5 мл пипетки отзыв с контроллером пипетки, рекомендуется использовать нормальный 1 мл механических пипетки с гладким поршенем затем сократить пипетка советы к диафрагм ю 3 мм в диаметре(Рисунок 1B). Более широкая диафрагма и плавная загрузка решений BSA уменьшит риск смешивания градиента. При правильной подготовке можно увидеть границы между смежными решениями BSA из-за их различных рефракционных индексов. Градиент должен быть произведен непосредственно перед использованием. Следует также отметить, что любая небольшая встряхивания или вибрации может нарушить градиент, поэтому градиент должен быть установлен в среде, где он не будет нарушен.
Загрузка клеточной подвески на градиент должна быть выполнена очень осторожно. После загрузки клеточная подвеска должна оставаться на верхней части градиента, от которого клетки будут медленно начинать осадки через первый слой. Если большие группы ячеек видны движущиеся быстро через градиент, клетки, скорее всего, не resuspended тщательно или есть избыток слипания. Если клетки не остаются на верхней части прерывистого градиента BSA при загрузке, но сразу же опускаются между слоями 1% и 2% BSA (шаг 3.6), то суспензия клетки, скорее всего, слишком плотная. Этот протокол был оптимизирован с использованием двух яичек взрослой мыши (80-120 мг/тести) в качестве исходного материала; хотя, успешные изоляции с использованием меньшего количества исходного материала было выполнено. Для высококлассного протокола и получения более обогащенных зародышевых клеток из большего количества яичек, более 50 мл труб с градиентом должны быть введены.
Протокол был первоначально разработан и оптимизирован для обогащения гаплоидных круглых сперматозоидов из яичек для взрослых мышей, а чистота круглых сперматозоидов, как ожидается, составит более 90%. В дополнение к очень чистым круглым сперматозоидам были получены удовлетворительные результаты для обогащения сперматозитов пахитена и удлинений сперматозоидов. Следует отметить, что эритроциты могут загрязнять удлинение сперматозоидов, и дальнейшие шаги по их устранению должны быть приняты, если их присутствие, как ожидается, мешает вниз по течению анализов. Мы не смогли обогатить другие типы клеток, такие как премейотические или ранние мейотические клетки (до фазы пахитена) от взрослых мышей, используя протокол MDR.
Кроме того, STA-PUT отложения была успешно использована для получения обогащенных фракций сперматогония или прелептотена, лепоттена и зиготена сперматозитов с использованием ювенильных яичек, собранных в данный тайм-пойнты после рождения13. Этот подход использует появление этих типов клеток во время первой волны сперматогенеза. Такой же подход, вероятно, может применяться к обогащению МЛУ, однако он еще не опробован на практике. Другой метод, который является хорошим вариантом для очистки премейотических и мейотических клеток на определенных стадиях дифференциации является FACS, который имеет важное преимущество, позволяя изоляции конкретных типов клеток на основе присутствия конкретных маркеров14 ,15,16,17.
В целом, осадок скорости МДР служит полезным методом для обогащения зародышевых клеток. Хотя этот метод не превосходит другие устоявшиеся методы с точки зрения чистоты или количества обогащенных клеток, его явными преимуществами являются его простота и низкие затраты на настройку. Это, вместе с низким количеством необходимых исходных материалов, сделать этот протокол отличным вариантом для исследователей в области сперматогенеза и тех, в других областях, которые не хотят инвестировать в специализированное оборудование или большие группы животных.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников лаборатории Kotaja за их вклад в разработку протокола, а также за активное использование и тестирование протокола в их исследовательских проектах. В частности, мы высоко ценим вклад Яна Линдстрёма в оптимизацию протокола. Это исследование было поддержано Академией Финляндии, Фондом Сигрида Джуселиуса и докторской программой молекулярной медицины Турку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
| AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
| Dextrose | Preference of researcher | ||
| DNase I | Worthington | LS006355 | |
| GAPDH | HyTest | 5G4 | |
| HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
| HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
| KCl | Preference of researcher | ||
| KH2PO4 | Preference of researcher | ||
| MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
| NaCl | Preference of researcher | ||
| NaHCO3 | Preference of researcher | ||
| NH4Cl | Preference of researcher | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
| PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
| PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
| Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
| Rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
| Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
| TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
| Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
| γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| 0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1.5 mL or 2 mL tubes | Preference of researcher | ||
| 40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
| 5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
| Cell culture incubator | Preference of researcher | ||
| Centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
| Microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| Microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
| Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Water bath | Preference of researcher | ||
| Widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |
References
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Advances in Experimental Medicine and Biology. 636, 1-15 (2008).
- Lehtiniemi, T., Kotaja, N. Germ granule-mediated RNA regulation in male germ cells. Reproduction. 155 (2), R77-R91 (2018).
- Lam, D. M., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 65 (1), 192-199 (1970).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Experimental Cell Research. 79 (1), 213-227 (1973).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 279-297 (2009).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. Journal of Cellular Physiology. 86 (1), 177-189 (1975).
- Barchi, M., Geremia, R., Magliozzi, R., Bianchi, E. Isolation and analyses of enriched populations of male mouse germ cells by sedimentation velocity: the centrifugal elutriation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 299-321 (2009).
- Romrell, L. J., Bellvé, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Developmental Biology. 49 (1), 119-131 (1976).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Da Ros, M., et al. FYCO1 and autophagy control the integrity of the haploid male germ cell-specific RNP granules. Autophagy. 13 (2), 302-321 (2017).
- Bellvé, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. The Journal of Cell Biology. 74 (1), 68-85 (1977).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biology of Reproduction. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Suter, L., Koch, E., Bechter, R., Bobadilla, M. Three-parameter flow cytometric analysis of rat spermatogenesis. Cytometry. 27 (2), 161-168 (1997).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biology of Reproduction. 95 (4), 85-85 (2016).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 65 (1), 40-49 (2005).
