Summary
这里介绍的是一个协议，用于使用标准实验室设备，使用不连续的牛血清白蛋白密度梯度，丰富白细胞、圆形精子和从成年小鼠睾人身上拉长精子。
Abstract
为了描述精子的产生的每一个步骤，研究人员必须从睾体中分离不同的生殖细胞亚群。然而，分离离散种群具有挑战性，因为成人睾体包含来自精子生成所有步骤的生殖细胞与某些体细胞群体的复杂混合。在过去的几十年中，不同的技术，如离心电镀、荧光活性细胞分类（FACS）和STA-PUT已经成功地应用于生殖细胞的分离。缺点是它们都需要专用设备和专门培训。遵循STA-PUT方法背后的原则，开发了一个简单的方案，用于分离帕基滕特精子细胞、圆形精子和从小鼠睾体内拉长精子。在制备睾丸细胞的单细胞悬浮液后，通过不连续的牛血清白蛋白（BSA）密度梯度通过重力沉淀富集特定细胞群。然后手动收集细胞分数并进行微观分析。这种圆形精子（MDR）沉降方案的改性密度梯度可以广泛应用，因为它只需要标准的实验室设备。此外，该协议要求最少的起始材料，降低其成本和实验室动物的使用。
Introduction
关于哺乳动物精子生成过程中发生的分子和生物学事件，仍有很多未知数，这是一个复杂的过程，精子干细胞在过程过程中转化为高度专业化的精子1，2。精子发生发生在睾的小管内。管状包含从分化的每一步的生殖细胞的混合物，包括精子干细胞，线粒分离精子，中度精子细胞，和后美形精细胞（从圆形进行单倍体分化精子以拉长精子，最后成熟精子。睾体的体细胞包括与分管内生殖细胞混合的Sertoli细胞，形成管状细胞壁的管状体细胞，以及小管间间空间中产生睾丸激素的Leydig细胞。
研究精子生成过程中的分子和生化过程通常需要将不同的生殖细胞群体从睾丸细胞的复杂混合物中分离出来。已经为细胞富集制定了许多不同的策略。最成功的方法是STA-PUT速度沉积单位重力3，4，5，6，离心电离电，基于反流量离心7，8，荧光激活细胞分类（FACS），根据DNA含量和/或特定标记分离细胞。这些方法常用于精子生成研究人员，并允许有效富集特定的生殖细胞类型。但是，这些技术的一个限制是它们需要需要专业知识的专用、昂贵的硬件。
这里介绍的是一个简单和廉价的协议，用于分离小鼠睾剂三个最丰富的细胞群的丰富种群：圆形精子、pachytene精子细胞和拉长精子。该协议被称为圆形精子（MDR）的修饰密度梯度，因为它特别适用于丰富圆形精子。MDR 方法基于与 STA-PUT 速度沉积相同的原理，但它只需要标准实验室设备。活细胞通过人工制备的不连续牛血清白蛋白（BSA）密度梯度在地球引力场下的标准50 mL管内沉积。较大的细胞在梯度中移动得更快，梯度分离不同的生殖细胞群体。沉淀后，手动收集三种细胞类型的丰度。这些富集细胞群的纯度与STA-PUT和离心性脱氧核糖核化获得的纯度相当。
除了涵盖BSA梯度的构造和使用速度沉积外，该协议还描述了一种从精细胞小管中释放睾丸细胞的消化方法。该协议从Romrell等人9开发的方案进行了修改，包括胶原酶IV和胰蛋白酶的连续消化。顺序消化结合使用碳酸氢盐缓冲液（即Krebs溶液）已被证明能大大提高生殖细胞的分离和生存能力9。
在MDR浓缩期间，细胞在精透管环境外一起花费约4小时，不受压力机械力的影响，从而可以收集高度可行的细胞分数进行下游分析。此外，与离心电镀和STA-PUT类似，MDR协议不需要对细胞进行任何化学处理或贴标签，这也有助于维持细胞的生存能力。重要的是，只要两个成年小鼠睾号就足以进行MDR分离，因此，一只成年小鼠为RNA和蛋白质分析提供了足够的富集细胞。标准STA-PUT协议建议使用多达12只成年小鼠进行细胞分离6;虽然，根据以往的经验，众所周知，成功的分离可以从三到四个成年小鼠。据报道，足以进行离心性电镀的起始材料量最低，为6只小鼠睾（3只小鼠）8。因此，除了消除对昂贵的专用设备的需求外，MDR 协议还减少了所需的实验室动物数量。
Protocol
根据有关照料和使用实验动物的准则和条例，对实验鼠进行维持和所有实验。
1. 设备和试剂设置
- 将水浴温度设置为 37°C。
- 将细胞培养箱设置为34°C，5%CO2，95%湿度。将管旋转器放入培养箱内。
注：孵化器需要很长时间才能改变内部温度。如果培养箱在34°C下不断设置不可用，则在实验前1天设置一个。 - 准备并标记适当数量的显微镜玻璃玻片。用润滑脂笔绘制直径 ±1 厘米的环，让润滑脂干燥。
- 准备 1x 克雷布斯缓冲液，pH 7.8 （表 1）。将两个锥形管，50 mL 的 1x Krebs 到 34°C，预热步骤 2.5×2.8。将其余 1x Krebs 储存在 4°C 或冰上。
- 准备 BSA 解决方案。首先在克雷布斯中制备 25 mL 的 10% （w/v） BSA 溶液，在 1x Krebs 缓冲液中溶解 2.5 g 的 BSA，最终体积为 25 mL。用1xKrebs缓冲液稀释10%BSA溶液，以获得不同的BSA浓度（表2）。将所有 BSA 解决方案保持在 4°C。
注：在手术当天准备溶液，并储存在4°C，直到使用。 - 通过将胰蛋白酶和胶原酶的量量称重至 50 mL 锥形管（表 3）制备消化酶。
2. 细菌细胞悬浮液的动物解剖和制备
注：这大约需要 1 小时才能完成。
- 通过宫颈脱位或CO2窒息牺牲成年雄性小鼠（7周或7周以上，睾号体重80-120毫克，取决于菌株和年龄）。
- 用70%乙醇喷洒小鼠腹腔。用剪刀打开腹腔，形成 V 形开口。
- 用钳子拉上表皮脂肪垫，找到睾丸，用剪刀取出。避免打扰图尼卡阿尔布吉纳。将睾号放在一个6厘米的培养皿上，里面含有1x克雷布斯。
- 去塞睾巴，丢弃图尼卡阿尔布吉内亚。用钳子轻轻戏弄小管，稍微分散小管。
- 使用钳子将小管转移到含有 2 mL 新鲜制备的胶原酶溶液的 50 mL 锥形管中（表 3 ）。
- 在 37°C 水浴中孵育小管 3 分钟，通过摇动管轻轻搅拌。
注：由于间质细胞的去除，自由浮动的管状应在3分钟内发生。睾丸细胞生理温度为34°C;因此，长时间的消化通常在这个温度下进行。然而，短3分钟的消化可以在37°C（由制造商推荐的温度）进行。请注意，如果使用 34°C，则应重新优化消化时间。 - 加入至少 40 mL 的暖 1x 克雷布斯，并在室温 （RT） 下将小管沉淀（±1 分钟）沉淀。取出上清液并重复 1 倍。
- 加入25 mL的新鲜制备的胰蛋白酶溶液（表3），将管放在34°C培养箱内的管旋转器上，孵育15~20分钟（±15 rpm）。偶尔检查小管的状态。一旦溶液变得浑浊，仅留下一小块小管，将管子放在冰上，然后立即进入下一步。
注：为了避免过度消化和细胞解长，请迅速操作以下洗涤步骤。一些方案包括胎儿牛血清（FBS）停用胰蛋白酶。在此协议中，FBS 治疗被省略，相反，胰蛋白酶通过立即离心和随后用冷 1x Krebs 进行处理而去除。 - 通过 40 μm 细胞滤网将溶液过滤到冰上新的 50 mL 锥形管中。
- 在4°C下将600 x g离心5分钟，以颗粒细胞。
注：力力过大的离心可能会损害细胞。 - 小心地将其倒出，取出上清液。
- 点击细胞颗粒，在1xKrebs的剩余部分重新悬浮细胞。
- 在重新悬浮的细胞中加入至少40 mL的冷1x克雷布斯。
- 重复步骤 2.10 和 2.11。
- 用细胞颗粒轻触管以重新悬浮细胞。在 1x Krebs 中加入 1 mL 的 0.5% BSA，并通过上下移液使溶液重新悬浮。避免制造气泡。
- 最后，在 1x Krebs 中添加 1⁄3 mL 的 0.5% BSA，使最终体积为 ±3 mL。通过40μm细胞过滤器过滤生殖细胞悬浮液，并立即在BSA梯度上加载细胞。
3. 通过不连续BSA梯度分离生殖细胞
注：完成此部分大约需要 2 小时。在洗涤步骤（步骤 2.10_2.14）期间开始准备不连续的 BSA 梯度，以便一旦预处理准备就绪，即可加载细胞。
- 在冰上垂直容纳一个 50 mL 的管，以便可以看到管的一侧。或者，在 4°C 的冷室中运行协议，在这种情况下不需要冰。
- 将 10 mL 的血清移液器的尖端从尖端切割约 5~10 mm，以获得更大的孔径（图 1A），并将其安装在移液器控制器上（图 1C）。
注：这将降低移液过程中的速度，从而促进不同 BSA 溶液的堆叠。或者，使用带光滑活塞的 1 mL 机械移液器，用直径约 3 mm 的孔径切割移液器吸头（图 1B）。 - 首先将 5 mL 的 5% BSA 溶液移液至 50 mL 管的底部。
- 在 5% 溶液之上缓慢移液 5 mL 的 4% BSA 溶液。首先，用移液器的切尖轻轻触摸 5% 溶液的表面，并分层两个溶液，同时小心地保持与表面的接触，确保不要让移液头浸没。
注：在此步骤结束时，两个图层之间应显示一条清晰的线。 - 与其他 BSA 解决方案重复步骤 3.4 可获得从 5% 到 1% 的不连续梯度（图 1D）。
- 小心地将单单元悬架加载到渐变顶部，而不会干扰。让细胞沉淀物在4°C或冰上通过梯度1.5小时。
4. 丰度细菌细胞分数的集合
注：完成此部分大约需要 30 分钟。
- 将 1 mL 移液器尖端安装到 1 mL 机械移液器上并切割吸头，使孔径直径为 ±3 mm（图 1B）。
- 小心地将 ±1 mL 分数收集到单独的 1.5 mL 管中，从 BSA 梯度的顶部开始，并将其储存在冰上。以与分数相同的顺序对管进行编号。
注：此时，应该有一系列含有细胞悬浮液的+28管。使用带光滑活塞的 1 mL 机械移液器并切割移液器尖端，以最大程度地降低干扰 BSA 梯度的风险。 - 在4°C下，在600 x g下将生殖细胞分数离心10分钟。
- 小心不要干扰颗粒，丢弃大部分上清液，并通过轻拂管重新悬浮细胞颗粒。在每个管中加入1 mL的冰冷1x Krebs缓冲液，并重复离心。
注：如果 BSA 干扰下游分析，请重复洗涤步骤。 - 丢弃大部分上清液，但最终洗涤后离开 ±100 μL。小心地重新悬浮细胞颗粒。
注：仔细重新悬浮细胞可确保从该溶液中抽取的样本表示给定分数的所有单元格。准备幻灯片时，将细胞悬架放在冰上。
5. 细胞分数分析
注：分析需要 2 小时才能完成。
- 一次一个，在编号显微镜幻灯片上，每个润滑脂笔环内移液20μL，4%的甲醛（PFA）。
- 立即从相应的分数中加入2μL的重新悬浮细胞悬浮液。对每个分数重复上述步骤。
注：准备幻灯片时，将所有细胞悬架放在冰上。 - 在 RT 处干燥幻灯片 1 小时至过夜 （O/N）。
注：在此步骤中，从每个分数中抽取样本后，可以处理细胞进行下游分析或存储（第 6 节）。 - 用 1x PBS 冲洗幻灯片一次，并安装带 4°，6-diamidino-2-phenyinole （DAPI） （材料表）的安装介质。
- 分析荧光显微镜下的幻灯片，估计每个分数中哪个特定的生殖细胞类型富集。
注：不同的细胞类型可以通过DAPI染色的可视化特征核形态来识别。图 2A显示了富含拉长精子、圆形精子和帕西特尼精子细胞的代表性分数。圆形精子核小（直径6~7微米）和圆形（图2A）。小鼠圆精子核还具有单一的圆形异异体素结构，称为染色体中心。拉长精子的核体具有典型的拉长形状，由于染色质凝结而减小了核尺寸（图2A）。帕西特内精子细胞核更大（直径超过10μm），形状更不规则，染色质密集分布于各地（图2A）。 -
如有必要，除了DAPI染色外，还进行免疫染色，以支持对不同细胞类型的识别。
- 在这种情况下，在润滑脂笔环内使用 20 μL 的固定溶液（PBS 中 4% PFA 和 0.1% 非离子表面活性剂）将 2 μL 的细胞悬浮液分散。干燥幻灯片后，在RT处用4%PFA将细胞固定10分钟。
- 用PBS冲洗，然后用0.1%非离子表面活性剂在PBS中渗透5分钟。用PBS冲洗，通过在100mM NH4Cl孵育幻灯片5分钟来停用任何剩余的PFA。
- 用PBS冲洗，并进入标准免疫荧光方案，包括用特定原抗体和含氟铬标记的二级抗体进行阻断和孵育。使用 DAPI（材料表）安装带防褪色的滑轨，并允许其设置为 24 小时。
注：初级抗体孵育的有用标记物示例包括花生凝乳素（PNA;1：2，000在阻断溶液中），在圆形和拉长的精子中染色的acrosome，抗DDX4抗体（1：200在阻断溶液中），标签单圆精子中的细胞质颗粒，以及抗βH2AX抗体（阻断溶液中的1：100），可识别在pachytene精子细胞中的性身体。有关分数的免疫荧光分析示例，请参阅代表性结果和图 2C，D。
6. 处理剩余样品进行存储
注：第 6 节大约需要 20 分钟才能完成。
- 从每个分数中抽取样本进行显微镜滑动后，在每个馏分中加入 1 mL 的冰冷 1x Krebs，并在 4°C 下以 600~13，000 x g将细胞离心 10 分钟。
注：低速离心导致松散的颗粒，这使得它很难完全去除1x克雷布斯，而高速离心可能会损害细胞。根据下游协议的具体要求选择离心速度。 - 移除并丢弃上清液，然后继续进行首选的下游分析。
注：此时，细胞可卡合在液氮中，并储存在-70°C。熟悉此技术后，可以直接继续使用下游的偏好协议，但始终建议取样并确保每个分数的纯度。总RNA可以通过逆转录聚合酶链反应（PCR）和RNA测序等方法进行提取、定量和分析。总蛋白提取物也可以准备，从免疫沉淀或西方印迹分析可以执行（图3）。
Representative Results
生殖细胞类型的充分富集通常被认为高于80%6。MDR 协议对于丰富圆形精子特别有效。使用这种技术可以经常获得大量 >90% 纯圆形精子。pachytene精细胞和拉长精细胞的最佳部分分别浓缩到+75%和+80%。拉长精子往往停留在梯度的顶部，并与第一个分数收集。在所示的示例中，分数 1 包含 +80% 的加长精子（图 2B）。用这种技术获得的大多数拉长精子具有浓缩核，而非凝聚的早期拉长精子是稀缺的（图2A）。以下分数包含丰富的圆形精子。在示例中，在分数 2 、 3 和 4 中，圆形的富集率超过 90% ，在 7 个分数（ 2+8 ）中共看到 80% 以上的富集（图 2B）。由于其体积大，pachytene精子细胞沉淀得更快，最后被收集。在纯化示例中，富集率约为 75%，分数为 14 和 15（图 2B）。
虽然由DAPI染色可视化的核形态通常足以识别细胞，但可以进行免疫荧光分析来支持分析。PNA染色的圆形和拉长精子的发育的杂技，和杂技外观可以利用进一步分类圆形精子到步骤1-8的分化10。区分PNA染色的拉长和圆形精子取决于其核形状的差异（图2C，左面板）。抗DDX4抗体是圆形精子分数的有用标记，因为它在每轮精子的细胞质中可视化单个DDX4阳性围核颗粒，即色谱体（CB）。这种CB特异性染色很容易与精子细胞中分布更为广泛的细胞质染色区分开来（图2C，中间面板）。Pachytene精子细胞可以通过抗βH2AX抗体来识别，抗体标记在第一个微体分裂阶段的细胞内专门出现的核性身体（图2C，右侧面板）。在本次纯化中， PNA 染色表明 MDR 富集圆形分馏分含有不同分化步骤的圆形精原混合物，所有成分均含有其特征结构 DDX4 阳性 CB （图 2D ，RS 分数）。抗βH2AX进一步验证了富集的pachytene精细胞在分数16（图2D，PSpc分数）。
细胞计数显示，圆形精子和pachytene精子细胞中的细胞数量足以进行各种下游分析。圆形精子分数（5+8）每个包含约2.5 x 106细胞。因此，通过汇集这些分数，有可能获得超过1000万个细胞。帕西特内精子细胞部分（14和15）通常含有较少的细胞。在此隔离中，每分数计算约 1.5±2.0 x 106个细胞。第一个分数包含 0 . 75 x 106长。
如图3A所示，从大多数分数中获得的总RNA量范围为0.5~2.5微克，足以用于下游RNA分析，如逆转录PCR、RNA测序或凝胶上电图RNA。从每个分数中获得的蛋白质量通常介于20~140μg（图3B）之间，这足以用于几个西方血泡。全细胞解液是从收集的馏分中制备的，西方的斑点分析是使用检测DDX4、PIWIL1和PIWIL2的抗体进行的，它们都高度地表达在pachytene精子细胞和圆形精子中，以及无处不在的精子中表达甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。
在这个协议中，从单馏分中提取的10%的蛋白质乳酸足以在标准的西方污点设置上清楚地检测所有这些蛋白质（图3C）。一个比例的蛋白质量也证明足以使用针对PIWIL1的抗体进行免疫沉淀，以及检测共免疫沉淀PIWIL2（图3D）。此外，该协议还成功地用于从对照和转基因小鼠获得富集的pachytene精子细胞和圆形精子的富集部分，用于下游应用，如定量逆转录PCR11和高通量RNA测序12。
图 1：制备不连续的 BSA 梯度。（A） 一个5 mL的血清移液器尖端，用于制备梯度。（B） 沉积后制备细菌细胞成分梯度和收集的1 mL移液器尖端。（C） 准备梯度所需的设备.（D） 从 5%（底部）到 1%（顶部）BSA 溶液的不连续 BSA 密度梯度的横向视图;2% 和 4% 的 BSA 解决方案为蓝色，可实现更好的可视化效果。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：收集的细胞分数和富集分析的代表性图像。（A） DAPI 染色睾丸细胞.上一行显示在PFA固定，石蜡嵌入睾丸部分（左）或悬浮（右）的完整上皮内睾丸细胞。下一行显示富集的拉长精子 （ES）、圆形精子 （RS） 或 pachytene 精子细胞 （PSpc） 的分数。刻度条 = 上行的 20 μm，下行的内分的 10 μm。（B） 每个分数中不同生殖细胞类型的相对定量。使用 ImageJ 软件手动计数细胞，并分为 RS、ES、PSpc、Sertoli 细胞和其他单元格。梯度中 BSA 的分数数和相应百分比在 x 轴上指示。（C） 睾丸细胞的免疫荧光分析.左面板：标有红胺标签的PNA在ES（黄色箭头）和RS（白色箭头）中都污渍了杂技。中间面板：DDX4抗体在RS中染色单个核状颗粒，这很容易与精子细胞中较漫射的细胞质信号（蓝色箭头）区分开来。在 ES 中未检测到 DDX4 信号（橙色箭头）。右面板：βH2AX抗体识别仅在pachytene精细胞中存在的特征核性体（用白色星号标记的βH2AX阴性细胞）。刻度条 = 10 μm. （D） MDR 富集细胞分数标有 PNA （RS 分数）、抗 DDX4 （RS 分数） 和反 +H2AX （PSpc 分数），以进一步验证每个馏分中的细胞富集。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：MDR细胞富集后的下游分析。（A） RNA在具有代表性的MDR细胞富集并量化后从每个分数中提取。梯度中 BSA 的分数数和相应百分比在 x 轴上指示。（B） 蛋白质通过裂解放射性免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液中的细胞颗粒从每个分数中提取，然后量化。（C） 全细胞蛋白提取物由西方印迹制备和分析，使用抗体对抗DDX4、PIWIL1、PIWIL2和GAPDH。10% 的莱沙从每个指示的分数中加载。（D） 免疫沉淀使用抗PIWIL1的指定分数进行，然后用抗PIWIL1和抗PIWIL2抗体进行西方印迹。输入样本包括不同成分的蛋白质莱沙的混合物，使用兔子IgG进行对照免疫沉淀（IP）也来自混合莱沙。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：MDR 协议的原理表表示形式以及完成每个步骤所需的时间。起始材料由来自成年小鼠的两个睾体组成。指示从一个分数中获得的细胞的平均数量和RNA和蛋白质的量。请点击此处查看此图的较大版本。
| 缓冲区 | 试剂 | 制备 | 存储 |
| 克雷布斯缓冲器 （10x） | 3.26 g KH2PO4 | 带 H2O、过滤 0.22 μm 和高压灭菌器，可至 2 L。 | 可在4°C下储存数月 |
| 139.5 克纳Cl | |||
| 5.89 克镁SO4×7H2O | |||
| 50克德克斯罗斯 | |||
| 3.78 g CaCl2=2H2O | |||
| 7.12 g KCl | |||
| 克雷布斯缓冲器 （1x） | 4.24 克 NaHCO3 | 溶解 H2O 的 NaHCO3至 100 mL，加入 200 mL 的 10x 克雷布斯缓冲液，用 H2O 将 2 L 引入。 | 准备新鲜 |
| 200 mL 10x 克雷布斯缓冲器 |
表1：克雷布斯缓冲器的准备。
| BSA 浓度（带）数 | 10% BSA 解决方案 | 1x 克雷布斯缓冲器 |
| 0.50% | 0.5 mL | 9.5 mL |
| 1% | 1 mL | 9 mL |
| 2% | 2 mL | 8 mL |
| 3% | 3 mL | 7 mL |
| 4% | 4 mL | 6 mL |
| 5% | 5 mL | 5 mL |
表2：BSA解决方案的准备。
| 消化解决方案 | 工作浓度 | 试剂 | 制备 |
| 胶原 酶 | 1毫克/升 | 胶原酶IV | 将2毫克胶原酶IV称重至50 mL锥形管中，并在消化前加入2 mL的温热1x Krebs缓冲液（步骤2.3）。 |
| 胰蛋白酶 | 0.6毫克/升 | 胰蛋白酶 | 将15毫克胰蛋白酶称重至50 mL锥形管中，并在消化前加入25 mL的暖1x KREBS缓冲液和40μL的DNase I（步骤2.6）。 |
| >3.2 ku/mL | DNase I |
表3：消化酶的制备。
Discussion
这里介绍的是一个简单和廉价的协议，用于使用标准实验室设备分离丰丰的圆形精子群、pachytene精子细胞和拉长精子（图4所示的协议概述）。虽然不需要专业知识或昂贵的机械，但有一些关键步骤，必须考虑在组织消化，梯度的构造，和加载细胞悬浮到梯度。
生殖细胞通过两个连续的酶消化从精嫩小管中释放。第一次消化与胶原酶 IV 通过去除间质细胞分离小管。长时间的消化时间可能会损害小管并导致精子损失，因为（如果在这一步中从小管中释放出来），它们将在以下步骤中被丢弃。胰蛋白酶的第二个消化步骤从精氨酸小管中释放生殖细胞。可能偶尔有细胞解说，通常由于释放的基因组DNA而形成一些团块。不建议超过建议的消化持续时间或温度，因为这可能导致较差的生存能力、增加的细胞解结和结块。如果确实发生轻度结块，可以忽略结块。然而，在细胞严重聚集和损失的情况下，胰蛋白酶的消化时间或浓度应减少。还应注意的是，胰蛋白酶的酶活性可能因批次和储存时间过长而异。胰蛋白酶消化期间的DNase I的量也可以增加以去除多余的团块，但这应被视为二次溶液。在预处理结束时获得同质单细胞悬浮液非常重要，因为结块细胞会更快地沉淀，污染分数并破坏梯度。
构建渐变可能需要一些练习。如果使用带移液器控制器的 5 mL 移液器尖端有不适，建议使用带光滑活塞的正常 1 mL 机械移液器，然后将移液器吸头切割到直径为 ±3 mm 的孔径（图 1B）。更大的孔径和平滑的BSA溶液负载将降低混合梯度的风险。如果准备得当，可以看到相邻 BSA 解决方案之间的边界，因为它们具有不同的折射率。渐变应在使用前直接生成。还应注意的是，任何小的震动或振动都可能干扰梯度，因此梯度应设置在不受干扰的环境中。
必须非常小心地将电池悬架加载到梯度上。加载后，细胞悬浮液应停留在梯度的顶部，从梯度中，细胞将缓慢地开始通过第一层沉淀。如果看到大群细胞在梯度中快速移动，细胞可能不会被小心地重新悬浮，或者有多余的聚集。如果细胞在加载时不停留在不连续的 BSA 梯度的顶部，但会立即在 1% 和 2% BSA 层之间下沉（步骤 3.6），则细胞悬浮液可能过于密集。该协议已使用两个成人小鼠的睾号（80-120毫克/睾号）作为起始材料进行优化;但是，使用减少起始材料量的成功隔离已经执行。为了扩大协议，从更多的睾体内获得更丰富的生殖细胞，应引入具有梯度的50 mL管。
该协议初步开发并优化，以丰富成年小鼠睾体内的单倍体圆形精子，预计圆形精子分馏的纯度为90%以上。除了高度纯的圆形精子分馏分外，还获得了富集乳酸盐精细胞和拉长精子的满意结果。应当指出，红细胞可能会污染细长的精子分数，如果红细胞的存在预计会干扰下游分析，则应采取进一步措施消除它们。我们未能利用MDR协议从成年小鼠中丰富其他细胞类型，如前介细胞或早期介体细胞（在pachytene阶段之前）。
此外，STA-PUT沉淀已经成功地用于利用在出生13后的给定时间点收集的幼鱼睾细胞获得精原体或前乳酸酯、瘦素和酶氨酸精子细胞的丰富部分。这种方法利用了这些细胞类型在第一波精子生成期间的外观。同样的方法可能也适用于MDR浓缩，但尚未在实践中得到测试。另一种在分化特定阶段纯化前细胞和中微细胞的良选是FACS，它的重要优点是允许基于存在特定标记物分离特定细胞类型14 ，15，16，17.
总体而言，MDR速度沉淀是生殖细胞富集的有用方法。虽然这种方法在富集细胞的纯度或数量方面并不优于其他成熟的方法，但其明显的优点是简单，设置成本低。再加上所需的起始材料量少，使该协议成为精子产生领域的研究人员和可能不希望投资于专用硬件或大型动物群的其他领域的研究人员的绝佳选择。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢所有Kotaja实验室成员在协议开发过程中的贡献，以及在其研究项目中积极使用和测试该协议。我们尤其感谢扬·林德斯特伦在优化协议方面的贡献。这项研究得到了芬兰科学院、西格丽德·尤塞柳斯基金会和图尔库分子医学博士项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
| AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
| Dextrose | Preference of researcher | ||
| DNase I | Worthington | LS006355 | |
| GAPDH | HyTest | 5G4 | |
| HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
| HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
| KCl | Preference of researcher | ||
| KH2PO4 | Preference of researcher | ||
| MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
| NaCl | Preference of researcher | ||
| NaHCO3 | Preference of researcher | ||
| NH4Cl | Preference of researcher | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
| PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
| PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
| Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
| Rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
| Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
| TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
| Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
| γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| 0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1.5 mL or 2 mL tubes | Preference of researcher | ||
| 40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
| 5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
| Cell culture incubator | Preference of researcher | ||
| Centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
| Microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| Microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
| Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Water bath | Preference of researcher | ||
| Widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |
References
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