Summary
Præsenteret her er en protokol til berigelse af pachytene spermatocytter, runde spermatids, og aflange spermatids fra voksne mus testiklerne ved hjælp af en diskontinuerlig kvægserum albumin tæthed gradient med Standardlaboratorieudstyr.
Abstract
For at karakterisere hvert trin af spermatogenesen, skal forskerne adskille forskellige delpopulationer af kimceller fra testiklerne. Men isolerende diskrete populationer er udfordrende, fordi den voksne testikel indeholder en kompleks blanding af kimceller fra alle trin af spermatogenese sammen med visse populationer af somatiske celler. I løbet af de sidste par årtier, forskellige teknikker såsom centrifugal elutriation, fluorescens-aktiverede celle sortering (FACS), og STA-PUT er blevet anvendt med succes til isolering af kimceller. En ulempe er, at de alle kræver dedikerede enheder og specialiseret uddannelse. Følgende principper underliggende STA-PUT metode, en simpel protokol er blevet udviklet til isolering af pachytene spermatocytter, runde spermatids, og aflange spermatids fra mus testiklerne. Efter klargøring af en enkelt cellesuspension af testikel celler, er specifikke cellepopulationer beriget af tyngdekraften sedimentering gennem en diskontinuerlig kvægserum albumin (BSA) tæthed gradient. Celle brøker indsamles derefter manuelt og mikroskopisk analyseres. Denne modificerede tætheds gradient for rund spermatids (MDR) sedimenterings protokol kan anvendes bredt, fordi det kun kræver Standardlaboratorieudstyr. Desuden kræver protokollen minimale udgangsmaterialer, hvilket reducerer omkostningerne og brugen af forsøgsdyr.
Introduction
Der er stadig meget ukendt for de molekylære og biologiske hændelser, der finder sted under pattedyrs spermatogenese, en kompleks proces, hvor sædceller omdannes til højt specialiserede spermatozoer1,2. Spermatogenesen finder sted inde i de seminiferøse tubuler af testierne. Tubuderne indeholder en blanding af kimceller fra hvert trin af differentiering, herunder spermatogoniale stamceller, mitotisk dividere spermatogonia, meiotiske spermatocytter, og postmeiotiske spermatids (som gennemgår haploide differentiering fra runde spermatids til langstrakt spermatids, og endelig til modne spermatozoer). Somatiske celler i testikel omfatter Sertoli celler, der er sammenblandet med kimceller inde i sædkanaler tubuler, peritubular myoid celler, der danner vægge af tubuler, og testosteron-producerende Leydig celler i den interstitielle rum mellem tubuler.
Studere molekylære og biokemiske processer under spermatogenese kræver ofte adskillelse af særskilte kimcelle populationer fra en kompleks blanding af testikel celler. Mange forskellige strategier er udviklet til celle berigelse. De mest vellykkede metoder er Sta-Put hastighed sedimentering efter enhed tyngdekraften3,4,5,6, centrifugal elutriation baseret på modstrøms centrifugering7,8, og fluorescens-aktiverede celle sortering (FACER), der adskiller cellerne efter DNA-indhold og/eller specifikke markører. Disse metoder er almindeligt anvendt blandt spermatogenesen forskere og give mulighed for en effektiv berigelse af specifikke kimcelle typer. Men, en begrænsning af disse teknikker er, at de kræver specialiseret, dyre hardware, der kræver ekspertise.
Præsenteret her er en enkel og billig protokol til at isolere beriget populationer af de tre mest rigelige cellepopulationer af mus testiklerne: runde spermatids, pachytene spermatocytter, og aflange spermatids. Denne protokol betegnes som den modificerede densitet gradient for runde spermatids (MDR), fordi det virker særligt godt for berigende runde spermatider. MDR-metoden er baseret på de samme principper som STA-PUT-hastigheds sedimentering, men kræver kun Standardlaboratorieudstyr. Levende celler får lov til at sediment gennem en manuelt forberedt diskontinuert kvægserum albumin (BSA) tæthed gradient inde i en standard 50 mL rør under jordens gravitationsfelt. Større celler bevæger sig hurtigere gennem gradienten, som adskiller forskellige populationer af kimceller. Efter sedimentering indsamles der manuelt berigede fraktioner af de tre celletyper. Renheden af disse berigede cellepopulationer kan sammenlignes med dem, der opnås ved STA-PUT og centrifugal elutriation.
Ud over at dække opførelsen og brugen af BSA gradient for hastighed sedimentering, protokollen også beskriver en fordøjelse metode til at frigive testikel celler fra sædkanaler tubuler. Protokollen blev ændret fra den, der er udviklet af romrell et al.9 og omfatter sekventiel digestions med kollagenase IV og trypsin. Sekventiel digestions kombineret med brug af en bicarbonat buffer (dvs., krebs opløsning) har vist sig at i høj grad øge adskillelsen og levedygtighed af kimceller9.
Under MDR-berigelse bruger cellerne omkring 4 timer sammen uden for miljøet i de seminiferøse tubuler og udsættes ikke for stressende mekaniske kræfter, hvilket giver mulighed for indsamling af meget levedygtige celle fraktioner til downstream-analyse. Derudover kræver MDR-protokollen, svarende til centrifugal elutriering og STA-PUT, ingen kemisk behandling eller mærkning af celler, hvilket også bidrager til at bevare deres levedygtighed. Vigtigere er, så lidt som to voksne mus testiklerne er tilstrækkelige til MDR isolation og derfor, en voksen mus giver nok berigede celler til både RNA og proteinanalyse. Standard STA-PUT-protokollen anbefaler brug af så mange som 12 voksne mus til celle isolation6; selv om, baseret på tidligere erfaring, det er kendt, at en vellykket isolation kan gøres fra tre til fire voksne mus. Den laveste mængde af udgangsmateriale rapporteret at være tilstrækkelig til centrifugal elutriation er seks mus testiklerne (tre mus)8. Ud over at eliminere behovet for dyrt specialiseret udstyr nedsætter MDR-protokollen derfor antallet af påkrævede forsøgsdyr.
Protocol
Vedligeholdelse af laboratorie mus og alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og forskrifter for pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. udstyr og reagens opsætning
- Sæt vandbad til 37 °C.
- Indstil celle kulturinkubator til 34 °C, 5% CO2, 95% fugtighed. Sæt rørrotator inde i inkubator.
Bemærk: Inkubatorer kræver lang tid til at ændre den indvendige temperatur. Hvis en inkubator konstant indstillet til 34 °C ikke er tilgængelig, sæt en op 1 dag før eksperimentet. - Forbered og mærk den passende mængde mikroskopi glas slides. Tegn en ring på ~ 1 cm i diameter med en fedtpen, og lad fedtet tørre.
- Forbered 1x Krebs buffer, pH 7,8 (tabel 1). Sæt to koniske rør med 50 mL 1x Krebs til 34 °C for at forvarme for trin 2.5 − 2,8. Opbevar resten af 1x Krebs ved 4 °C eller på is.
- Forbered BSA-løsninger. Forbered først 25 mL af 10% (w/v) BSA-opløsning i Krebs ved at opløse 2,5 g BSA i 1x Krebs buffer til en endelig volumen på 25 mL. Opløsningen fortyndes med 10% BSA med 1x Krebs buffer for at opnå forskellige BSA-koncentrationer (tabel 2). Opbevar alle BSA-opløsninger ved 4 °C.
Bemærk: Forbered opløsninger samme dag i proceduren og opbevares ved 4 °C indtil brug. - Fordøjelsesenzymerne forberedes ved vejning af den korrekte mængde trypsin og kollagenase til 50 mL koniske rør (tabel 3).
2. animalsk dissektion og fremstilling af kimcelle suspension
Bemærk: Det tager ca. 1 time at fuldføre.
- Ofrer en voksen mandlig mus (i alderen 7 uger eller ældre, testikel vejer 80 − 120 mg afhængigt af stammen og alder) via livmoderhals dislokation eller co2 kvælning.
- Spray den ventrale maven af musen med 70% ethanol. Åbn mave hulen ved hjælp af en saks, hvilket gør en V-formet åbning.
- Trække på epididymale fedt pad med pincet, lokalisere testiklerne og fjerne dem med en saks. Undgå at forstyrre tunica albuginea. Placer testiklerne på en 6 cm Petri skål indeholdende 1x krebs.
- Decapsulate testiklerne og kassere tunica albuginea. Let sprede de seminiferøse tubuler ved forsigtigt drilleri dem fra hinanden med tang.
- Brug pincet til at overføre de seminiferøse tubuler til et 50 mL konisk rør, der indeholder 2 mL frisklavet kollagenaseopløsning (tabel 3).
- Inkuber tubuler i 37 °C-vandbad i 3 min. rystes forsigtigt ved at Rocking røret.
Bemærk: Frit flydende tubuler bør ske inden for 3 minutter på grund af fjernelsen af interstitielle celler. Den fysiologiske temperatur for testikel celler er 34 °C; Derfor, lang digestions er normalt gøres ved denne temperatur. Dog kan den korte 3 min fordøjelse udføres ved 37 °C (anbefalet temperatur af producenten). Bemærk, at hvis 34 °C anvendes, skal Fordøjelsestiden optimeres igen. - Tilsæt mindst 40 mL varm 1x krebs og lad tubuler til sediment (~ 1 min) ved stuetemperatur (RT). Fjern supernatanten og Gentag 1x.
- Tilsæt 25 mL frisklavet trypsin-opløsning (tabel 3), Anbring røret på rørrotator i 34 °c-inkubatoren, og Inkuber i 15 − 20 minutter (~ 15 rpm). Sporadisk kontrollere status for tubuler. Når opløsningen bliver uklar, og der kun er små stykker af tubuler tilbage, skal du placere røret på isen og straks gå videre til næste trin.
Bemærk: For at undgå over fordøjelse og cellelyse, gå hurtigt til følgende vaske trin. Nogle protokoller omfatter deaktivering af trypsin med føtal kvægserum (FBS). I denne protokol er FBS-behandling udeladt, og i stedet fjernes trypsin ved øjeblikkelig centrifugering og efterfølgende skyller med kold 1x krebs. - Opløsningen filtreres gennem en 40 μm-cellefilter i et nyt 50 mL konisk rør på is.
- Centrifuge 600 x g i 5 minutter ved 4 °c for at pille cellerne.
Bemærk: Centrifugering med for stærk kraft kan beskadige cellerne. - Fjern supernatanten ved forsigtigt at hælde det ud.
- Tryk på celle pellet for at resuspendere cellerne i resten af 1x krebs.
- Tilsæt mindst 40 mL kold 1x Krebs til de resuspenderede celler.
- Gentag trin 2,10 og 2,11.
- Tap røret med celle pellet for at resuspendere cellerne. Tilsæt 1 mL 0,5% BSA i 1x krebs og med en skåret pipettespids resuspension cellerne ved at pipettere opløsningen op og ned. Undgå at lave bobler.
- Endelig tilsættes 1 − 3 mL 0,5% BSA i 1x Krebs, således at den endelige volumen er ~ 3 mL. Filtrat kimcelle suspensionen gennem en 40 μm celle si og Fortsæt straks for at indlæse cellerne på BSA gradient.
3. adskillelse af kimceller gennem den diskontinuerlig BSA-gradient
Bemærk: Dette afsnit tager ca. 2 timer at fuldføre. Begynd at tilberede den diskontinuerlig BSA-gradient under skylle trinene (trin 2.10 − 2.14) for at indlæse cellerne, så snart forbehandlingen er klar.
- Der er plads til et 50 mL rør lodret på isen, så det er muligt at se den ene side af røret. Alternativt kan du køre protokollen i et kølerum ved 4 °C, i hvilket tilfælde der ikke er behov for is.
- Spidsen af en 10 mL serologisk pipette skæres ca. 5 − 10 mm fra spidsen for at opnå en større blænde (figur 1a), og den monteres på pipette regulatoren (figur 1C).
Bemærk: Dette vil nedsætte hastigheden under pipettering, hvilket letter stabling af de forskellige BSA-opløsninger. Alternativt kan du bruge en 1 mL mekanisk pipette med et glat stempel og skære pipette spidserne med en blænde på ca. 3 mm i diameter (figur 1B). - Start med Pipettering af 5 mL 5% BSA-opløsning i bunden af 50 mL-røret.
- Pipet langsomt 5 mL 4% BSA opløsning oven på 5% opløsningen. Start med forsigtigt at berøre overfladen af 5% opløsningen med den afskårne spids af pipetten og lag de to opløsninger, mens du omhyggeligt bevarer kontakten med overfladen, hvilket sikrer, at pipet spidsen ikke bliver nedsænket.
Bemærk: En klar linje skal være synlig mellem de to lag i slutningen af dette trin. - Gentag trin 3,4 med de andre BSA opløsninger opnå en diskontinuerlig gradient fra 5% op til 1% (figur 1D).
- Læg forsigtigt enkelt cellesuspensionen oven på forløbet uden at forstyrre. Lad cellerne sediment gennem gradienten for 1,5 h ved 4 °C eller på is.
4. indsamling af beriget kimcelle fraktioner
Bemærk: Dette afsnit tager ca. 30 min. for at fuldføre.
- Monter en 1 mL pipettespids på en 1 mL mekanisk pipette, og skær spidsen, så blænden er ~ 3 mm i diameter (figur 1B).
- Saml forsigtigt ~ 1 mL fraktioner i separate 1,5 mL rør, startende fra toppen af BSA gradient, og opbevar dem på is. Tal rørene i samme rækkefølge, som brøker vil blive indsamlet.
Bemærk: På dette tidspunkt, der bør være en serie af ~ 28 rør indeholdende celle suspensioner. Brug en 1 mL mekanisk pipette med et glat stempel, og skær pipette spidserne for at minimere risikoen for at forstyrre BSA-gradienten. - Kimcelle fraktionerne centrifugeres ved 600 x g i 10 minutter ved 4 °c.
- Pas på ikke at forstyrre pellet, kassere det meste af supernatanten og resuspendere celle pellet ved at svirpe røret. Tilsæt 1 mL iskold 1x Krebs buffer til hvert rør og Gentag centrifugering.
Bemærk: Gentag vaske trinnet, hvis BSA interfererer med downstream-analyse. - Kassér det meste af supernatanten, men Efterlad ~ 100 μL efter den sidste vask. Resuspendér celle pellet forsigtigt.
Bemærk: Resuspension af cellerne sikrer omhyggeligt, at prøven udtaget fra denne opløsning repræsenterer alle celler i den givne fraktion. Hold celle suspensionerne på isen, mens du forbereder slides.
5. analyse af celle fraktioner
Bemærk: Analyse tager 2 h at fuldføre.
- En ad gangen, pipet 20 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) inde i hver fedt pen ring på en nummereret mikroskopi slide.
- Tilsæt straks 2 μL af den opslæmmede cellesuspension fra den tilsvarende fraktion. Gentag for hver brøk.
Bemærk: Mens du forbereder slides, skal du holde alle celle suspensioner på is. - Tør slidene på RT i 1 time til natten (O/N).
Bemærk: Under dette trin kan cellerne efter at have taget en prøve fra hver fraktion forarbejdes til downstream-analyser eller opbevaring (afsnit 6). - Skyl slides én gang med 1x PBS og monter med monterings medium med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (tabel over materialer).
- Analysér diasene under et fluorescens mikroskop for at anslå, hvilken bestemt kimcelle type der er beriget i hver fraktion.
Bemærk: Forskellige celletyper kan genkendes af deres karakteristiske nukleare morfologi visualiseret af DAPI farvning. Figur 2 A viser repræsentative fraktioner beriget i langstrakte spermatiker, runde spermatids og pachytene spermatocytter. Den runde spermatid-kerne er lille (6 − 7 μm i diameter) og rund (figur 2A). Mus runde spermatid kerner er også karakteriseret ved en enkelt, rund heterokromatin struktur kaldet kromocenter. Kerner af aflange spermatier har en typisk aflang form og reduceret nukleare størrelse på grund af kromatin kondensation (figur 2a). Pachytene spermatocyte kerner er meget større (diameter mere end 10 μm) og mere uregelmæssig i form, med områder med tætpakket kromatin fordelt i hele (figur 2A). -
Hvis det er nødvendigt, skal du udføre immun farvning ud over DAPI-farvning for at understøtte anerkendelsen af de forskellige celletyper.
- I dette tilfælde spredes 2 μL cellesuspension med 20 μL af en fikserings opløsning (4% PFA og 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS) inde i en fednings ring. Efter tørring af slides, Postfix cellerne med 4% PFA for 10 min på RT.
- Skyl med PBS, derefter permeabilize med 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS i 5 min. Skyl med PBS og Deaktiver eventuelle resterende PFA ved at inkube dias i 100 mM NH4CL i 5 min.
- Skyl med PBS og Fortsæt til en standard immunofluorescenprotokol bestående af blokering og inkubationer med specifikke primære antistoffer og fluorchrom-mærkede sekundære antistoffer. Monter diasene med antifade-montering med DAPI (tabel over materialer), og lad dem indstille til 24 timer.
Bemærk: Eksempler på nyttige markører for primære antistof inkubationer omfatter jordnødde kold (PNA; 1:2000 i blokerende opløsning), der pletter akkært i runde og langstrakte spermatids, anti-DDX4 antistof (1:200 i blokerende opløsning), der mærker en enkelt cytoplasmisk granulet i runde spermatids, og anti-γH2AX antistof (1:100 i blokerende opløsning), der genkender kønsorganer i pachytene spermatocytter. Se de repræsentative resultater og figur 2C, D for eksempler på immunofluorescens analyse af fraktionerne.
6. behandling af de resterende prøver til opbevaring
Bemærk: Afsnit 6 tager ca. 20 min. for at fuldføre.
- Når en prøve fra hver fraktion er taget til en mikroskopi slide, tilsættes 1 mL iskold 1x Krebs til hver fraktion og centrifugeres cellerne ned ved 600 − 13000 x g i 10 min ved 4 °c.
Bemærk: En lav hastighed centrifugering resulterer i en løs pellet, hvilket gør det vanskeligt at helt fjerne 1x Krebs, mens en hurtig centrifugering kan skade cellerne. Vælg centrifugeringshastigheden i henhold til de specifikke krav i downstream-protokollen. - Fjern og kassér supernatanten, og Fortsæt med den foretrukne downstream-analyse.
Bemærk: På dette tidspunkt kan cellerne fastfryses i flydende nitrogen og opbevares ved-70 °C. Når bekendt med denne teknik, er det muligt at fortsætte med downstream-protokollen af præference direkte, men det er altid tilrådeligt at tage en prøve og sikre renheden af hver fraktion. Total RNA kan ekstraheres, kvantificeres og analyseres ved metoder såsom reverse transkriptionen af polymerase-kædereaktion (PCR) og RNA-sekvensering. Samlede proteinekstrakter kan også fremstilles, hvorfra immunopræcipitation eller Western blotting analyse kan udføres (figur 3).
Representative Results
Tilstrækkelig berigelse af en kimcelle type anses normalt for at være over 80%6. MDR-protokollen fungerer særligt godt for berigende rund spermatier. Et stort antal > 90% rene runde spermatider kan rutinemæssigt opnås ved hjælp af denne teknik. Optimale fraktioner af pachytene spermatocytter og aflange spermatiker er beriget til ~ 75% og ~ 80%, hhv. Aflange spermatiker tendens til at bo på toppen af gradient og er indsamlet med den første fraktion. I eksemplet viste fraktion 1 ~ 80% af langstrakte spermatiker (figur 2B). De fleste aflange spermatider opnået med denne teknik har kondenseret kerner, mens ikke-kondenserede tidlige langstrakte spermatids er knappe (figur 2A). Følgende fraktioner indeholder berigede rund spermatiker. I eksemplet var berigning af rund spermatiker mere end 90% i fraktionerne 2, 3 og 4, og tilsætning på over 80% blev totalt set i syv fraktioner (2 − 8) (figur 2B). På grund af deres store størrelse, pachytene spermatocytter sediment hurtigere og opsamles sidst. I rensnings eksemplet var tilsætning ca. 75% i fraktionerne 14 og 15 (figur 2B).
Mens nuklear morfologi, visualiseret af DAPI farvning, normalt er tilstrækkeligt til anerkendelse af cellerne, immunofluorescens analyse kan udføres for at understøtte analysen. PNA pletter de udviklende acrosomes af runde og langstrakte spermatier, og det aksomale udseende kan udnyttes til yderligere at kategorisere runde spermatider i trin 1 − 8 i differentiering10. Skelne PNA-farvede aflange og runde spermatids bygger på forskellene i deres nukleare form (figur 2C, venstre panel). Anti-DDX4 antistof er en nyttig markør for de runde spermatid fraktioner, da det visualiserer en enkelt DDX4-positiv perinukleære granule, kromatoid kroppen (CB), i cytoplasmaet af hver runde spermatid. Denne CB-specifikke farvning er let at skelne fra mere bredt distribueret cytoplasmisk farvning i spermatocytter (figur 2C, midterste panel). Pachytene spermatocytter kan genkendes ved anti-γh2ax-antistof, der mærker den nukleare kønsorgan specifikt optræder på pachytene fase af den første meiotiske division (figur 2C, højre panel). I denne rensning afslørede PNA-farvning, at MDR-beriget runde spermatid-fraktioner indeholdt en blanding af runde spermatiker ved forskellige differentierings trin, der alle indeholder deres signatur struktur, DDX4-positive CB (figur 2D, R-fraktion). Anti-γH2AX validerede yderligere berignings-pachytene-spermatocytterne i fraktion 16 (figur 2D, pspc-fraktion).
Celle tællingen afslørede, at antallet af celler i de runde spermatid-og pachytenspermatocyt-fraktioner er tilstrækkeligt til forskellige downstream-analyser. Runde spermatid fraktioner (5 − 8) hver indeholdt omkring 2,5 x 106 celler. Ved at samle disse fraktioner er det derfor muligt at opnå mere end 10.000.000 celler. Pachytene spermatocyte fraktioner (14 og 15) indeholdt normalt noget færre celler. I denne isolation blev omkring 1,5 − 2,0 x 106 celler pr. fraktion talt. Den første fraktion indeholdt 0,75 x 106 aflange spermatiker.
Som vist i figur 3Avarierede det samlede RNA-beløb fra de fleste fraktioner fra 0,5 − 2,5 μg, hvilket er tilstrækkeligt til downstream-RNA-analyser såsom reverse transkriptionspcr, RNA-SEKVENSERING eller visualisering af RNA på en gel. Mængden af protein opnået fra hver fraktion spænder typisk fra 20 − 140 μg (figur 3B), hvilket er tilstrækkeligt for flere vestlige blots. Hele celle lysater blev fremstillet af indsamlede fraktioner, og Western blot analyse blev udført ved hjælp af antistoffer, der detekterer DDX4, PIWIL1 og PIWIL2, som alle er stærkt udtrykt i pachytene spermatocytter og runde spermatids samt den allestedsnærværende udtrykt glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH).
I denne protokol var 10% af protein lysaterne afledt af enkelt fraktioner tilstrækkelige til klart at påvise alle disse proteiner på en standard Western blot-indstilling (figur 3C). Mængden af protein i en fraktion viste sig også at være tilstrækkelig til immunopræcipitation ved hjælp af et antistof mod PIWIL1 samt til påvisning af co-immunoprecipiteret PIWIL2 (figur 3D). Desuden er denne protokol med held blevet anvendt til at fremskaffe berigede fraktioner af pachytenspermatocytter og rund spermatider fra kontrol og genetisk modificerede mus til downstream-applikationer såsom kvantitativ reverse transkription PCR11 og højt gennemløb af RNA-sekvensering12.
Figur 1: klargøring af en diskontinuerlig BSA gradient. A) en 5 ml serologisk pipettespids til fremstilling af gradient. B) en 1 ml pipettespids til fremstilling af gradient og opsamling af kimcelle fraktioner efter sedimentering. C) det nødvendige udstyr til fremstilling af gradient. D) lateral visning af den DISKONTINUERLIGE BSA-massefylde gradient fra 5% (bund) til 1% (top) BSA-opløsning de 2% og 4% BSA løsninger er blå i farve for bedre visualisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative billeder af de indsamlede celle fraktioner og berignings analysen. (A) dapi-farvede testikel celler. Den øverste række viser testikel celler i den intakte sædkanaler epitel i en PFA-Fixed, paraffin-indlejret testikel sektion (venstre) eller i suspension (højre). Den nederste række viser fraktioner af berigede, langstrakte spermatids (ES), rund spermatider (RS) eller pachytene spermatocytter (pspc). Skala stænger = 20 μm for den øverste række og 10 μm for Indsæt af den nederste række. B) relativ kvantificering af de forskellige kimcelle typer i hver fraktion. Celler blev manuelt talt ved hjælp af ImageJ software og klassificeret i RS, ES, PSpc, Sertoli celler, og andre celler. Brøk tallene og de respektive procentdele af BSA i forløbet er angivet på x-aksen. C) immunofluorescens analyse af testikel celler. Venstre panel: rhodamine-mærket PNA pletter den acrosome i både ES (gul pil) og RS (hvid pil). Midterste panel: DDX4 antistof pletter et enkelt perinukleært granul i RS, som er let at skelne fra det mere diffuse cytoplasmatiske signal i spermatocytter (blå pil). Der er ikke fundet DDX4 signal i ES (orange pil). Højre panel: γH2AX antistof genkender den karakteristiske nukleare kønsorgan kun til stede i pachytene spermatocytter (γH2AX-negative celler markeret med en hvid Asterisk). Skala stænger = 10 μm.d) mdr-berigede celle fraktioner blev mærket med PNA (RS-fraktion), anti-DDX4 (RS-fraktion) og anti-γH2AX (pspc-fraktion) for yderligere at validere celle berigelse i hver fraktion. Skala stænger = 10 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: downstream-analyser efter mdr-celle berigelse. (A) RNA blev udvundet fra hver fraktion efter en repræsentativ mdr-celle berigelse og kvantificeret. Brøk tallene og de respektive procentdele af BSA i forløbet er angivet på x-aksen. (B) proteiner blev udvundet fra hver fraktion ved at lyserende celle pellet i fulgt assay (Ripa) buffer derefter kvantificeret. C) hele celleprotein ekstrakter blev fremstillet og analyseret af Western blotting ved hjælp af antistoffer mod DDX4, PIWIL1, PIWIL2 og gapdh. 10% af lysbilledet blev indlæst fra hver indikeret fraktion. (D) immunopræcipitation blev udført fra indikerede fraktioner ved hjælp af anti-PIWIL1 efterfulgt af Western blotting med anti-PIWIL1 og anti-PIWIL2 antistoffer. Indgangs prøven indeholder en blanding af proteinlysater fra forskellige fraktioner, og kontrol immunopcipitation (IP) ved hjælp af kanin IgG blev også udført fra et blandet lysstof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk gengivelse af mdr-protokollen og den tid, der kræves for at fuldføre hvert trin. Udgangsmaterialet består af to testikler fra en voksen mus. Det gennemsnitlige antal celler og mængden af RNA og protein opnået fra en fraktion er indiceret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Reagenser | Under forberedelse | Opbevaring |
| Krebs buffer (10x) | 3,26 g KH2po4 | Medbring 2 L med H2O, Filtrer 0,22 μm og autoklave. | Kan opbevares ved 4 °C i flere måneder |
| 139,5 g NaCl | |||
| 5,89 g MgSO4 •7h2O | |||
| 50 g dextrose | |||
| 3,78 g CaCl2•2H2O | |||
| 7,12 g KCl | |||
| Krebs buffer (1x) | 4,24 g NaHCO3 | NaHCO3 til 100 ml h2o opløses, tilsættes 200 ml 10x Krebs buffer og bringes til 2 L med h2o. | At være forberedt frisk |
| 200 mL 10x Krebs buffer |
Tabel 1: fremstilling af krebs buffer.
| BSA-koncentration (w/v) | 10% BSA-opløsning | 1x Krebs buffer |
| 0,50% | 0,5 mL | 9,5 mL |
| 1 | 1 mL | 9 mL |
| 2 | 2 mL | 8 mL |
| 3 | 3 mL | 7 mL |
| 4 | 4 mL | 6 mL |
| 5 | 5 mL | 5 mL |
Tabel 2: klargøring af BSA-opløsninger.
| Fordøjelsesvæske | Arbejds koncentration | Reagenser | Under forberedelse |
| Kollagenase | 1 mg/mL | Collagenase IV | 2 mg kollagenase IV afvejes til et 50 ml konisk rør, og der tilsættes 2 ml varm 1x Krebs buffer lige før fordøjelsen (trin 2,3). |
| Trypsin | 0,6 mg/mL | Trypsin | 15 mg trypsin vejes til et 50 mL konisk rør, og der tilsættes 25 mL varm 1x KREBS buffer og 40 μL DNase I lige før fordøjelsen (trin 2,6). |
| > 3,2 KU/mL | DNase I |
Tabel 3: klargøring af fordøjelsesenzymer.
Discussion
Præsenteret her er en enkel og billig protokol til at isolere beriget populationer af runde spermatider, pachytene spermatocytter, og aflange spermatids ved hjælp af Standardlaboratorieudstyr (oversigt over den protokol, der er vist i figur 4). Selvom ingen ekspertise eller dyre maskiner er påkrævet, der er nogle kritiske trin, der skal overvejes under vævs fordøjelse, opførelse af gradient, og lastning af cellen suspension på gradient.
Kimceller frigives fra seminiferøse tubuler ved to på hinanden følgende enzymatiske digestions. Den første fordøjelse med kollagenase IV adskiller seminiferøse tubuler ved at fjerne interstitielle celler. Forlænget fordøjelsestid kan beskadige tubuderne og føre til tab af spermatid, som (hvis frigivet fra tubuderne i dette trin) de vil blive kasseret i de følgende trin. Det andet fordøjelses trin med trypsin frigiver kimceller fra seminiferøse tubuler. Der kan være lejlighedsvis cellelyse og typisk nogle klumper form på grund af frigivet genomisk DNA. Overskridelse af den foreslåede varighed eller temperatur af fordøjelsen ikke tilrådes, da dette kan føre til dårligere levedygtighed, øget cellelyse, og clumping. Hvis der opstår mild sammenklumpning, kan klumper ignoreres. I tilfælde af signifikant sammenklumpning og tab af celler bør trypsin fordøjelsestid eller koncentration dog nedsættes. Det skal også bemærkes, at trypsins enzymatiske aktivitet kan variere mellem batcher og under længere tids opbevaring. Mængden af DNase I under fordøjelsen af trypsin kan også øges for at fjerne overskydende klumper, men dette bør betragtes som en sekundær opløsning. Det er vigtigt at opnå en homogen enkelt cellesuspension i slutningen af forbehandlingen, da klumpede celler vil sediment hurtigere, kontaminere fraktioner og forstyrre gradient.
Opbygning af gradient kan kræve nogle praksis. Hvis der er ubehag ved hjælp af en 5 mL pipettespids med en pipette regulator, anbefales det at anvende en normal 1 mL mekanisk pipette med et glat stempel og derefter skære pipette spidserne til en blænde på ~ 3 mm i diameter (figur 1B). En større blændeåbning og problemfri indlæsning af BSA-opløsninger vil nedsætte risikoen for at blande forløbet. Når det er korrekt forberedt, er det muligt at se grænserne mellem tilstødende BSA-løsninger på grund af deres forskellige brydnings indekser. Gradient skal produceres direkte før brug. Det skal også bemærkes, at enhver lille rystelser eller vibration kan forstyrre gradient, så gradient bør indstilles i et miljø, hvor det ikke vil blive forstyrret.
Indlæsning af cellesuspensionen på gradient skal ske meget omhyggeligt. Efter lastning, bør cellesuspensionen forblive på toppen af gradient, hvorfra cellerne langsomt vil begynde at sediment gennem det første lag. Hvis store grupper af celler ses bevæger sig hurtigt gennem gradient, cellerne var sandsynligvis ikke resuspenderet omhyggeligt eller der er overskydende clumping. Hvis cellerne ikke forbliver på toppen af den diskontinuerlige BSA gradient ved lastning, men straks synke mellem 1% og 2% BSA lag (trin 3,6), cellesuspensionen er sandsynligvis for tæt. Denne protokol er blevet optimeret ved hjælp af to testiklerne af en voksen mus (80-120 mg/testis) som udgangsmateriale; Selvom der er udført vellykkede isoleringer med reducerede mængder af udgangsmateriale. For at opskalere protokollen og opnå mere berigede kimceller fra et højere antal testikler, bør der indføres mere 50 mL rør med gradient.
Protokollen blev oprindeligt udviklet og optimeret til at berige haploide runde spermatids fra voksne mus testiklerne, og renheden af runde spermatid fraktioner forventes at være mere end 90%. Ud over meget rene rund spermatik fraktioner blev der opnået tilfredsstillende resultater for tilsætning af pachytene spermatocytter og langstrakte spermatiker. Det skal bemærkes, at erythrocytter kan kontaminere den forlængede spermatid fraktioner, og yderligere skridt til at eliminere dem bør tages, hvis deres tilstedeværelse forventes at forstyrre downstream analyser. Vi har ikke været i stand til at berige andre celletyper såsom premeiotiske eller tidlige meiotiske celler (før pachytene fase) fra voksne mus ved hjælp af MDR-protokollen.
Desuden har Sta-Put sedimentering med succes været anvendt til at opnå berigede fraktioner af spermatogonier eller preleptoten, leptoten og zygotene spermatocytter ved hjælp af Juvenile testikler indsamlet på givne tidspunkter efter fødslen13. Denne fremgangsmåde udnytter udseendet af disse celletyper under den første bølge af spermatogenesen. Den samme fremgangsmåde kan sandsynligvis anvendes på MDR-berigelse, men den er endnu ikke afprøvet i praksis. En anden metode, der er en god mulighed for rensning af præmeiotiske og meiotiske celler på bestemte stadier af differentiering er FACS, som har den store fordel at tillade isolering af specifikke celler typer baseret på tilstedeværelsen specifikke markører14 ,15,16,17.
Samlet set, MDR hastighed sedimentering tjener som en nyttig metode til kimcelle berigelse. Selv om denne metode ikke er bedre end andre veletablerede metoder med hensyn til renheden eller mængden af berigede celler, er dens klare fordele dens enkelhed og lave opspændings omkostninger. Dette, sammen med den lave mængde af nødvendige udgangsmaterialer, gøre denne protokol en stor mulighed for forskere i spermatogenesen felt og dem i andre områder, der måske ikke ønsker at investere i specialiseret hardware eller store grupper af dyr.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke alle Kotaja Lab medlemmer for deres bidrag i løbet af udviklingen af protokollen, og den aktive brug og afprøvning af protokollen i deres forskningsprojekter. Især vi sætter pris på bidraget fra Jan Lindström for at hjælpe med at optimere protokollen. Denne undersøgelse blev støttet af det finske akademi, Sigrid Jusélius Foundation, og Turku doktorale program for Molekylær medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
| AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
| Dextrose | Preference of researcher | ||
| DNase I | Worthington | LS006355 | |
| GAPDH | HyTest | 5G4 | |
| HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
| HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
| KCl | Preference of researcher | ||
| KH2PO4 | Preference of researcher | ||
| MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
| NaCl | Preference of researcher | ||
| NaHCO3 | Preference of researcher | ||
| NH4Cl | Preference of researcher | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
| PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
| PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
| Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
| Rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
| Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
| TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
| Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
| γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| 0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1.5 mL or 2 mL tubes | Preference of researcher | ||
| 40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
| 5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
| Cell culture incubator | Preference of researcher | ||
| Centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
| Microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| Microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
| Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Water bath | Preference of researcher | ||
| Widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |
References
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Advances in Experimental Medicine and Biology. 636, 1-15 (2008).
- Lehtiniemi, T., Kotaja, N. Germ granule-mediated RNA regulation in male germ cells. Reproduction. 155 (2), R77-R91 (2018).
- Lam, D. M., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 65 (1), 192-199 (1970).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Experimental Cell Research. 79 (1), 213-227 (1973).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 279-297 (2009).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. Journal of Cellular Physiology. 86 (1), 177-189 (1975).
- Barchi, M., Geremia, R., Magliozzi, R., Bianchi, E. Isolation and analyses of enriched populations of male mouse germ cells by sedimentation velocity: the centrifugal elutriation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 299-321 (2009).
- Romrell, L. J., Bellvé, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Developmental Biology. 49 (1), 119-131 (1976).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Da Ros, M., et al. FYCO1 and autophagy control the integrity of the haploid male germ cell-specific RNP granules. Autophagy. 13 (2), 302-321 (2017).
- Bellvé, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. The Journal of Cell Biology. 74 (1), 68-85 (1977).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biology of Reproduction. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Suter, L., Koch, E., Bechter, R., Bobadilla, M. Three-parameter flow cytometric analysis of rat spermatogenesis. Cytometry. 27 (2), 161-168 (1997).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biology of Reproduction. 95 (4), 85-85 (2016).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 65 (1), 40-49 (2005).
