Summary
Presentert her er en protokoll for berikende pachytene spermatocytter, runde via, og elongating via fra voksen mus testiklene bruker en usammenhengende storfe serum albumin tetthet gradient med standard laboratorieutstyr.
Abstract
For å karakterisere hvert trinn av spermatogenesis, må forskerne skille forskjellige subpopulasjoner av bakterieceller fra testiklene. Imidlertid er isolere diskrete populasjoner utfordrende, fordi den voksne testikkel inneholder en kompleks blanding av bakterieceller fra alle trinn av spermatogenesis sammen med visse populasjoner av somatiske celler. I løpet av de siste ti årene, ulike teknikker som sentrifugal elutriation, fluorescens-aktivert celle sortering (FACS), og STA-PUT har blitt brukt til isolering av bakterieceller. En ulempe er at de alle krever dedikerte enheter og spesialisert trening. Følgende prinsipper underliggende STA-PUT metoden, en enkel protokoll har blitt utviklet for isolering av pachytene spermatocytter, runde via, og elongating via fra mus testiklene. Etter å ha forberedt en enkelt celle suspensjon av testikkel celler, er spesifikke celle populasjoner beriket av tyngdekraften sedimentering gjennom en usammenhengende storfe serum albumin (BSA) tetthet gradient. Celle fraksjoner blir deretter manuelt innsamlet og mikroskopisk analysert. Denne endrede tettheten gradient for runde via (MDR) sedimentering protokollen kan bli mye brukt, fordi det krever bare standard laboratorieutstyr. Videre krever protokollen minimalt med start materialer, og reduserer kostnadene og bruken av forsøksdyr.
Introduction
Mye er fortsatt ukjent om den molekylære og biologiske hendelser som finner sted i løpet av pattedyr spermatogenesis, en kompleks prosess der spermatogonial stamceller forvandle seg til svært spesialiserte spermatozoa1,2. Spermatogenesis finner sted inne i sæd tubuli av testikkel. Tubuli inneholder en blanding av bakterieceller fra hvert trinn av differensiering, inkludert spermatogonial stamceller, mitotically dele spermatogoniene, meiotic spermatocytter, og postmeiotic via (som gjennomgår haploide differensiering fra runde via til elongating via, og til slutt å modne spermatozoa). Somatiske celler av testikkel inkluderer Sertoli celler som er blandet med bakterieceller inne i sæd tubuli, peritubular myoid celler som danner vegger av tubuli, og testosteron-produserende Leydig celler i interstitiell mellomrom mellom tubuli.
Studere molekylære og biokjemiske prosesser under spermatogenesis krever ofte separasjon av distinkte bakterie celle populasjoner fra en kompleks blanding av testikkel celler. Mange forskjellige strategier er utviklet for celle berikelse. De mest vellykkede metodene er sta-Put Velocity sedimentering av Unit Gravity3,4,5,6, sentrifugal elutriation basert på motstrøm sentrifugering7,8, og fluorescens celle sortering (FACS) som skiller celler i henhold til DNA-innhold og/eller spesifikke markører. Disse metodene er ofte brukt blant spermatogenesis forskere og gir mulighet for effektiv berikelse av spesifikke bakterie celletyper. Men en begrensning av disse teknikkene er at de krever spesialisert, kostbar maskinvare som krever ekspertise.
Presentert her er en enkel og rimelig protokoll for å isolere beriket bestander av de tre mest tallrike celle populasjoner av mus testiklene: runde via, pachytene spermatocytter, og elongating via. Denne protokollen er referert til som modifisert tetthet gradient for runde via (MDR), fordi det fungerer spesielt godt for berikende runde via. MDR-metoden er basert på de samme prinsippene som STA-PUT Velocity-sedimentering, men det krever bare standard laboratorieutstyr. Levende celler har lov til å sediment gjennom en manuelt forberedt usammenhengende storfe serum albumin (BSA) tetthet gradient i en standard 50 mL rør under jordens tyngdefelt. Større celler bevege seg raskere gjennom gradient, som skiller ulike populasjoner av bakterieceller. Etter sedimentering, er beriket brøkdeler av de tre celletyper manuelt samlet inn. Renheten av disse beriket celle populasjoner er sammenlignbare med de som oppnås ved STA-PUT og sentrifugal elutriation.
I tillegg til å dekke konstruksjonen og bruken av BSA-graderingen for hastighets sedimentering, beskriver protokollen også en fordøyelse metode for å frigi testikkel celler fra sæd tubuli. Protokollen ble modifisert fra den som ble utviklet av Romrell et al.9 og inkluderer sekvensiell digestions med kollagenase IV og Trypsin. Sekvensiell digestions kombinert med bruk av en bikarbonat buffer (dvs. den Krebs løsning) har vist til stor styrke separasjon og levedyktighet av Bakteriecellene9.
Under MDR berikelse, celler tilbringer rundt 4 h sammen utenfor miljøet av sæd tubuli og er ikke utsatt for stressende mekaniske krefter, som gjør det mulig for innsamling av svært levedyktig mobilnettet fraksjoner for nedstrøms analyse. I tillegg, i likhet med sentrifugal elutriation og STA-PUT, krever ikke MDR-protokollen noen kjemisk behandling eller merking av celler, noe som også bidrar til å opprettholde levedyktigheten. Viktigere, så lite som to voksen mus testiklene er tilstrekkelig for MDR isolasjon og derfor, en voksen mus gir nok beriket celler for både RNA og proteinanalyse. Standard STA-PUT-protokoll anbefaler bruk av så mange som 12 voksne mus for celle isolasjon6; Men, basert på tidligere erfaringer, er det kjent at vellykket isolasjon kan gjøres fra tre til fire voksne mus. Den laveste mengden av Start materiale rapportert å være tilstrekkelig for sentrifugal elutriation er seks mus testiklene (tre mus)8. Derfor, foruten å eliminere behovet for kostbart spesialisert utstyr, vil MDR-protokollen redusere antallet laboratoriedyr som kreves.
Protocol
Vedlikehold av laboratoriemus og alle eksperimenter ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter for Stell og bruk av forsøksdyr.
1. utstyr og reagens oppsett
- Sett vannbadet til 37 ° c.
- Sett cellekultur inkubator til 34 ° c, 5% CO2, 95% fuktighet. Sett røret Rotator inne i inkubator.
Merk: Inkubatorer krever lang tid å endre indre temperatur. Hvis en inkubator konstant satt til 34 ° c ikke er tilgjengelig, sett en opp 1 dag før eksperimentet. - Forbered og Merk riktig mengde mikroskopi glass lysbilder. Tegn en ring på ~ 1 cm i diameter med en fett penn og la fettet tørke.
- Klargjør 1x Krebs buffer, pH 7,8 (tabell 1). Sett to koniske rør med 50 mL 1x Krebs til 34 ° c til forvarming for trinn 2,5 − 2,8. Oppbevar resten av 1x-Krebs ved 4 ° c eller på is.
- Forbered BSA-løsninger. Forbered først 25 mL 10% (w/v) BSA-oppløsning i Krebs ved å oppløse 2,5 g av BSA i 1x Krebs buffer til et endelig volum på 25 mL. Fortynne den 10% BSA-løsningen med 1x Krebs buffer for å oppnå forskjellige BSA-konsentrasjoner (tabell 2). Oppbevar alle BSA-løsninger ved 4 ° c.
Merk: Forbered løsninger samme dag av prosedyren og oppbevar ved 4 ° c til bruk. - Klargjør fordøyelsen enzymer ved veiing riktig mengde Trypsin og kollagenase til 50 mL koniske rør (tabell 3).
2. Animal disseksjon og utarbeidelse av bakterie celle suspensjon
Merk: Dette tar omtrent 1 time å fullføre.
- Ofre en voksen mannlig mus (7 uker eller eldre, testikkel som veier 80 − 120 mg avhengig av belastning og alder) via cervical forvridning eller CO2 kvelning.
- Spray den ventrale magen på musen med 70% etanol. Åpne abdominopelvic hulrom med saks, og gjør en V-formet åpning.
- Trekke på epididymale fett pad med pinsett, finne testiklene og fjerne dem med saks. Unngå å forstyrre tunika albuginea. Plasser testiklene på en 6 cm Petri parabolen inneholder 1x Krebs.
- Decapsulate testiklene og kast tunika albuginea. Litt spre sæd tubuli ved å erte dem forsiktig fra hverandre med pinsett.
- Bruk tang til å overføre sæd tubuli til et 50 mL konisk rør som inneholder 2 mL nylaget kollagenase løsning (tabell 3).
- Ruge tubuli i vannbadet på 37 ° c i 3 min. agitere forsiktig ved å gynge røret.
Merk: Fritt flytende tubuli bør skje innen 3 min på grunn av fjerning av interstitiell celler. Den fysiologiske temperaturen for testikkel celler er 34 ° c; Derfor er lange digestions vanligvis gjøres ved denne temperaturen. Imidlertid kan den korte 3 min fordøyelsen gjennomføres ved 37 ° c (anbefalt temperatur av produsenten). Merk at hvis 34 ° c brukes, bør fordøyelsen tid være re-optimalisert. - Tilsett minst 40 mL varm 1x Krebs og la tubuli til sediment (~ 1 min) ved romtemperatur (RT). Fjern supernatanten og gjenta 1x.
- Tilsett 25 mL nylaget Trypsin løsning (tabell 3), plasser slangen på røret Rotator inne i 34 ° c inkubator, og ruge for 15 − 20 min (~ 15 RPM). Sjekk av og til tubuli status. Når løsningen blir overskyet og bare små biter av tubuli forblir, plasserer røret på isen og umiddelbart videre til neste trinn.
Merk: For å unngå overdigestion og cellelyse, gå raskt til følgende vasketrinn. Noen protokoller inkluderer deaktivering av Trypsin av Foster storfe serum (FBS). I denne protokollen, FBS behandling er utelatt, og i stedet, Trypsin fjernes ved umiddelbar sentrifugering og påfølgende vasker med kald 1x Krebs. - Filtrer løsningen gjennom en 40 μm celle sil til en ny 50 mL konisk slange på isen.
- Sentrifuger 600 x g i 5 min ved 4 ° c til pellet cellene.
Merk: Sentrifugering med for sterk av en kraft kan skade cellene. - Fjern supernatanten ved å helle det forsiktig ut.
- Trykk på celle pellet for å resuspend cellene i resten av 1x Krebs.
- Tilsett minst 40 mL kald 1x Krebs til de resuspendert cellene.
- Gjenta trinn 2,10 og 2,11.
- Trykk på røret med celle pellet for å resuspend cellene. Tilsett 1 mL 0,5% BSA i 1x Krebs og med et kutt pipette spissen resuspend cellene ved å pipettering løsningen opp og ned. Unngå å lage bobler.
- Tilsett til slutt 1 − 3 mL 0,5% BSA i 1x Krebs, slik at det endelige volumet er ~ 3 mL. Filtrer den bakterie celle suspensjonen gjennom en 40 μm celle sil og Fortsett umiddelbart å laste cellene på BSA gradient.
3. separasjon av bakterieceller gjennom usammenhengende BSA gradient
Merk: Denne delen tar ca 2 timer å fullføre. Begynn å klargjøre den usammenhengende BSA-graderingen under vaske trinnene (trinn 2.10 − 2.14) for å laste cellene så snart forbehandling er klar.
- Romme en 50 mL rør vertikalt på isen, slik at det er mulig å se den ene siden av røret. Alternativt, kjøre protokollen i et kaldt rom ved 4 ° c, i så fall ingen is er nødvendig.
- Klipp tuppen av en 10 mL serologisk pipette ca 5 − 10 mm fra spissen for å få en større blenderåpning (figur 1a), og Monter den på pipette kontrolleren (figur 1C).
Merk: Dette vil redusere hastigheten under pipettering, noe som forenkler stabling av de ulike BSA-løsningene. Alternativt kan du bruke en 1 mL mekanisk pipette med et jevnt stempel og kutte pipette tuppene med en blenderåpning på ca 3 mm i diameter (figur 1B). - Begynn med å pipettering 5 mL 5% BSA-oppløsning til bunnen av 50 mL røret.
- Sakte Pipet 5 mL 4% BSA-løsning på toppen av 5%-løsningen. Begynn med å forsiktig berøre overflaten på 5% løsningen med kutt spissen på pipette og lag de to løsningene, samtidig som du opprettholder kontakten med overflaten, slik at Pipet spissen ikke blir nedsenket.
Merk: En klar linje skal være synlig mellom de to lagene på slutten av dette trinnet. - Gjenta trinn 3,4 med de andre BSA-løsningene for å få en usammenhengende gradering fra 5% opp til 1% (figur 1D).
- Forsiktig laste enkelt celle suspensjon på toppen av gradient uten å forstyrre. La cellene sediment gjennom gradient for 1,5 h ved 4 ° c eller på is.
4. samling av beriket bakterie celle fraksjoner
Merk: Denne delen tar ca 30 min å fullføre.
- Monter en 1 mL pipette spissen på en 1 mL mekanisk pipette og kutt spissen slik at blenderåpningen er ~ 3 mm i diameter (figur 1B).
- Samle inn ~ 1 mL fraksjoner nøye i separate 1,5 mL rør, fra toppen av BSA-graderingen og oppbevar dem på is. Number rørene i samme rekkefølge som fraksjoner vil bli samlet.
Merk: På dette punktet, bør det være en serie på ~ 28 rør som inneholder celle suspensjoner. Bruk en 1 mL mekanisk pipette med et jevnt stempel og kutt pipette tipsene for å minimere risikoen for å forstyrre BSA-graderingen. - Sentrifuger bakterie celle fraksjoner ved 600 x g i 10 min ved 4 ° c.
- Pass på at du ikke forstyrrer pellet, kast det meste av supernatanten og resuspend celle pellet ved å sveipe røret. Tilsett 1 mL iskald 1x Krebs buffer til hvert rør og gjenta sentrifugering.
Merk: Gjenta vaske trinnet hvis BSA forstyrrer nedstrøms analysen. - Kast det meste av supernatanten, men la ~ 100 μL etter siste vask. Resuspend celle pellet forsiktig.
Merk: Blanding cellene nøye for å sikre at prøven som tas fra denne løsningen, representerer alle cellene i den gitte fraksjonen. Hold cellen suspensjoner på isen mens du forbereder lysbildene.
5. analyse av celle fraksjoner
Merk: Analysen tar 2 timer å fullføre.
- En av gangen, Pipet 20 μL av 4% paraformaldehyde (PFA) inni hver fett penn ring på en nummerert mikroskopi Slide.
- Tilsett umiddelbart 2 μL av den resuspendert celle fjæringen fra den tilsvarende fraksjonen. Gjenta for hver brøk.
Merk: Mens du forbereder lysbilder, holde alle celle suspensjoner på isen. - Tørk lysbildene ved RT for 1 t til over natten (O/N).
Merk: I dette trinnet, etter å ha tatt en prøve fra hver brøk, kan cellene behandles for nedstrøms analyser eller lagring (avsnitt 6). - Skyll lysbildene en gang med 1x PBS og Monter med monterings medium med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (tabell med materialer).
- Analyser lysbildene under et fluorescens mikroskop for å anslå hvilken bestemt bakterie celle type som er beriket i hver brøk.
Merk: Ulike celletyper kan bli gjenkjent av sine karakteristiske kjernefysiske morfologi som er kjent av DAPI farging. Figur 2 A viser representative fraksjoner beriket med elongating via, runde via og pachytene spermatocytter. Den runde spermatid kjernen er liten (6 − 7 μm i diameter) og rund (figur 2A). Mouse runde spermatid kjerner er også preget av en enkelt, rund heterochromatin struktur kalt chromocenter. Kjerner av elongating via har en typisk langstrakt form og redusert kjernefysisk størrelse på grunn av kromatin kondens (figur 2a). Pachytene spermatocyte kjerner er mye større (diameter mer enn 10 μm) og mer uregelmessig i form, med områder med tett pakket kromatin distribuert gjennom (figur 2A). -
Om nødvendig, Utfør immunostaining i tillegg til DAPI farging for å støtte anerkjennelse av de forskjellige celle typene.
- I dette tilfellet spres 2 μL av celle suspensjon med 20 μL av en feste løsning (4% PFA og 0,1% ioniske overflateaktivt middel i PBS) inne i en fett penn ring. Etter tørking av lysbildene, Postfix cellene med 4% PFA i 10 min ved RT.
- Skyll med PBS, deretter permeabilize med 0,1% ioniske overflateaktivt middel i PBS i 5 min. skyll med PBS og Deaktiver eventuelle gjenværende PFA ved å incubating lysbilder i 100 mM NH4CL i 5 min.
- Skyll med PBS og Fortsett til en standard immunofluorescence protokoll bestående av blokkering og incubations med spesifikke primære antistoffer og fluorokromkonjugert sekundære antistoffer. Monter lysbildene med Antifade mountant med DAPI (tabell av materialer) og tillate dem å sette for 24 h.
Merk: Eksempler på nyttige markører for primær antistoff incubations inkluderer peanut agglutinin (PNA; 1:2000 i blokkerings løsning) som flekker på acrosome i runde og elongating via, anti-DDX4 antistoff (1:200 i blokkerings løsning) som merker en enkelt cytoplasmatiske granule i runde via, og anti-γH2AX antistoff (1:100 i blokkerende løsning) som gjenkjenner kjønnsorganer i pachytene spermatocytter. Se representative resultater og figur 2C, D for eksempler på immunofluorescence analyse av fraksjoner.
6. behandling av gjenværende prøver for lagring
Merk: § 6 tar ca 20 min å fullføre.
- Når en prøve fra hver brøk er tatt for et mikroskopi lysbilde, tilsett 1 mL iskald 1x Krebs til hver brøk og sentrifuger cellene ned på 600 − 13000 x g i 10 min ved 4 ° c.
Merk: En lavhastighets sentrifugering resulterer i en løs pellet som gjør det vanskelig å fjerne 1x Krebs helt, mens en høyhastighets sentrifugering kan skade cellene. Velg sentrifugering hastighet i henhold til spesifikke krav i nedstrøms protokollen. - Fjern og kast supernatanten og fortsett med den foretrukne nedstrøms analysen.
Merk: På dette punktet, kan cellene være snap-frosset i flytende nitrogen og oppbevares ved-70 ° c. Når kjent med denne teknikken, er det mulig å fortsette med nedstrøms protokollen av preferanse direkte, men det er alltid tilrådelig å ta en prøve og sikre renheten av hver brøkdel. Total RNA kan trekkes ut, kvantifisert og analyseres ved metoder som omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (PCR) og RNA-sekvenser. Totalt protein ekstrakter kan også tilberedes som immunutfelling eller vestlig blotting analyse kan utføres (Figur 3).
Representative Results
Tilstrekkelig berikelse av en bakterie celle type er vanligvis ansett for å være over 80%6. MDR-protokollen fungerer spesielt godt for berikende runde via. Et høyt antall > 90% ren runde via kan rutinemessig fås ved hjelp av denne teknikken. Optimale fraksjoner av pachytene spermatocytter og elongating via er beriket med henholdsvis ~ 75% og ~ 80%. Elongating via tendens til å holde på toppen av gradient og er samlet med den første fraksjonen. I eksempelet vist, brøkdel 1 inneholdt ~ 80% av elongating via (figur 2B). De fleste elongating via oppnådd med denne teknikken har kondensert kjerner, mens ikke-kondensert tidlig elongating via er knappe (figur 2A). Følgende fraksjoner inneholder beriket runde via. I eksempelet, var den berikelse av runde via mer enn 90% i fraksjoner 2, 3 og 4, og berikelse over 80% ble sett helt i syv fraksjoner (2 − 8) (figur 2B). På grunn av sin store størrelse, pachytene spermatocytter sediment raskere og samles sist. I rensing eksempel var berikelse rundt 75% i fraksjoner 14 og 15 (figur 2B).
Mens kjernefysisk morfologi, DAPI flekker, vanligvis tilstrekkelig for anerkjennelse av cellene, kan immunofluorescence analyse utføres for å støtte analysen. PNA flekker den utviklende acrosomes av runde og elongating via, og acrosomal utseende kan utnyttes til ytterligere å kategorisere runde via i trinn 1 − 8 av differensiering10. Å skille ut PNA-farget elongating og rund via er avhengig av forskjellene i deres kjernefysiske form (figur 2C, venstre panel). Anti-DDX4 antistoff er en nyttig markør for den runde spermatid fraksjoner siden det visualiserer en enkelt DDX4-positive perinukleære antinøytrofile granule, chromatoid kroppen (CB), i cytoplasma av hver runde spermatid. Denne CB-spesifikke flekker er lett å skille fra mer utbredt distribuert cytoplasmatiske farging i spermatocytter (figur 2C, midtre panel). Pachytene spermatocytter kan gjenkjennes av anti-γH2AX antistoff som merker at den kjernefysiske kjønnsorgan spesielt vises i den Pachytene fasen av den første meiotic divisjon (figur 2C, høyre panel). I denne rensing, PNA farging avslørte at MDR beriket runde spermatid fraksjoner inneholdt en blanding av runde via på ulike trinn av differensiering, alle inneholder deres signatur struktur, den DDX4-positive CB (figur 2D, RS brøk). Anti-γH2AX ytterligere validert berikelse pachytene spermatocytter i brøkdel 16 (figur 2D, PSpc brøk).
Celle tellingen avslørte at antall celler i den runde spermatid og pachytene spermatocyte fraksjoner er tilstrekkelig for ulike nedstrøms analyser. Rund spermatid fraksjoner (5 − 8) hver inneholdt rundt 2,5 x 106 celler. Derfor, ved pooling disse fraksjoner, er det mulig å få mer enn 10 000 000 celler. Pachytene spermatocyte fraksjoner (14 og 15) inneholdt vanligvis noe færre celler. Rundt 1,5 − 2,0 x 106 celler per brøk ble i denne isolasjonen telt. Den første fraksjonen inneholdt 0,75 x 106 elongating via.
Som vist i Figur 3A, ble det totale RNA-beløpet fra flertallet av fraksjoner varierte fra 0,5 − 2,5 μg, noe som er tilstrekkelig for nedstrøms RNA-analyser, slik som omvendt transkripsjon PCR, RNA-sekvensering, eller visualisering av RNA på en gel. Mengden protein som hentes fra hver brøk, varierer vanligvis fra 20 − 140 μg (Figur 3B), som er tilstrekkelig for flere vestlige blots. Hele celle lysater ble fremstilt fra innsamlede fraksjoner, og Western Blot analyse ble utført ved hjelp av antistoffer oppdage DDX4, PIWIL1, og PIWIL2, som alle er svært uttrykt i pachytene spermatocytter og runde via samt overalt uttrykt glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH).
I denne protokollen var 10% av proteinet lysater avledet fra enkelt fraksjoner tilstrekkelig til å tydelig oppdage alle disse proteinene på en standard Western Blot innstilling (Figur 3C). Mengden protein i en brøk var også vist å være tilstrekkelig for immunutfelling ved hjelp av et antistoff mot PIWIL1, så vel som for påvisning av co-immunoprecipitated PIWIL2 (Figur 3D). Videre har denne protokollen blitt brukt til å skaffe beriket fraksjoner av pachytene spermatocytter og runde via fra kontroll og genmodifiserte mus for nedstrøms applikasjoner som kvantitativ omvendt transkripsjon PCR11 og høy GJENNOMSTRØMMING RNA sekvensering12.
Figur 1: utarbeidelse av en USAMMENHENGENDE BSA-gradering. (A) en 5 ml serologisk pipette spissen for utarbeidelse av gradient. (B) en 1 ml pipette spissen for utarbeidelse av gradient og samling av bakterie celle fraksjoner etter sedimentering. (C) utstyret som trengs for utarbeidelse av gradient. (D) lateral visning av usammenhengende BSA tetthet gradient fra 5% (nederst) til 1% (topp) BSA løsning; den 2% og 4% BSA løsninger er blå i fargen for bedre visualisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative bilder av den innsamlede cellen fraksjoner og berikelse analyse. (A) DAPI-farget testikkel celler. Den øverste raden viser testikkel celler i intakt sæd epitel av en PFA-fast, parafin-embedded testikkel delen (venstre) eller i suspensjon (til høyre). Den nederste raden viser brøkdeler av beriket elongating via (ES), rund via (RS), eller pachytene spermatocytter (PSpc). Vektstenger = 20 μm for den øverste raden og 10 μm for inn data på den nedre raden. (B) relativ kvantifisering av ulike bakterie celletyper i hver brøk. Celler ble manuelt telles ved hjelp av ImageJ programvare og klassifisert i RS, ES, PSpc, Sertoli celler, og andre celler. Brøk tallene og de respektive prosentene av BSA i graderingen er angitt på x-aksen. (C) Immunofluorescence analyse av testikkel celler. Venstre panel: rhodamine-merket PNA flekker acrosome i både ES (gul pil) og RS (hvit pil). Midtre panel: DDX4 antistoff flekker en enkelt perinukleære antinøytrofile granule i RS, som er lett å skille fra de mer diffuse cytoplasmatiske signal i spermatocytter (blå pil). Ingen DDX4-signaler oppdages i ES (oransje pil). Høyre panel: γH2AX antistoff anerkjenner den karakteristiske Atom kjønns legemet til stede bare i pachytene spermatocytter (γH2AX-negative celler markert med en hvit stjerne). Skala stolper = 10 μm. (D) MDR beriket celle fraksjoner ble merket med PNA (RS brøkdel), anti-DDX4 (RS brøkdel) og anti-ΓH2AX (PSpc brøkdel) for å ytterligere validere celle berikelse i hver brøk. Skala bars = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: nedstrøms analyser etter MDR-celle berikelse. (A) RNA ble trukket ut fra hver brøk etter en representant for en typisk MDR-celle berikelse og kvantifisert. Brøk tallene og de respektive prosentene av BSA i graderingen er angitt på x-aksen. (B) proteiner ble Hentet fra hver brøk ved lysering cellen pellet i radioimmunoprecipitation ANALYSEN (RIPA) buffer deretter kvantifisert. (C) hel celle protein ekstrakter ble fremstilt og analysert av vestlige blotting ved hjelp av ANTISTOFFER mot DDX4, PIWIL1, PIWIL2 og GAPDH. 10% av lysat ble lastet fra hver indikerte brøk. (D) immunutfelling ble utført fra indikerte fraksjoner ved hjelp av anti-PIWIL1 etterfulgt av vestlige blotting med anti-PIWIL1 og anti-PIWIL2 antistoffer. Input prøven inneholder en blanding av protein lysater fra forskjellige fraksjoner, og kontroll immunutfelling (IP) ved hjelp av kanin IgG ble også utført fra en blandet lysat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk representasjon av MDR-protokollen og tiden som kreves for å fullføre hvert trinn. Starter materiale består av to testiklene fra en voksen mus. Gjennomsnittlig antall celler og hvor mye RNA og protein som oppnås fra en brøk er indikert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer | Reagenser | Forberedelse | Lagring |
| Krebs buffer (10x) | 3,26 g KH2PO4 | Bring til 2 L med H2O, Filtrer 0,22 μm og autoklav. | Kan oppbevares ved 4 ° c i flere måneder |
| 139,5 g NaCl | |||
| 5,89 g MgSO4 •7H2O | |||
| 50 g druesukker | |||
| 3,78 g CaCl2•2h2O | |||
| 7,12 g KCl | |||
| Krebs buffer (1x) | 4,24 g NaHCO3 | Oppløse NaHCO3 til 100 ml av H2O, tilsett 200 ml 10x Krebs buffer, og Bring til 2 L med H2O. | Å være forberedt fersk |
| 200 mL 10x Krebs buffer |
Tabell 1: utarbeidelse av Krebs-buffer.
| BSA-konsentrasjon (w/v) | 10% BSA-løsning | 1x Krebs buffer |
| 0,50 prosent | 0,5 mL | 9,5 mL |
| 1 | 1 mL av | 9 mL |
| 2 | 2 mL med | 8 mL |
| 3 | 3 mL | 7 mL |
| 4 | 4 mL av | 6 mL |
| 5 | 5 mL | 5 mL |
Tabell 2: utarbeidelse av BSA-løsninger.
| Fordøyelsen løsning | Arbeids konsentrasjon | Reagenser | Forberedelse |
| Kollagenase | 1 mg/mL | Kollagenase IV | Veie 2 mg kollagenase IV til en 50 mL konisk slange, og tilsett 2 mL varm 1x Krebs buffer rett før fordøyelsen (trinn 2,3). |
| Trypsin | 0,6 mg/mL | Trypsin | Veie 15 mg Trypsin til en 50 mL konisk slange, og tilsett 25 mL varm 1x KREBS buffer og 40 μL av DNase jeg rett før fordøyelsen (trinn 2,6). |
| > 3.2 ku/mL | DNase jeg |
Tabell 3: utarbeidelse av fordøyelsen enzymer.
Discussion
Presentert her er en enkel og rimelig protokoll for å isolere beriket populasjoner av runde via, pachytene spermatocytter, og elongating via bruker standard laboratorieutstyr (oversikt over protokollen som vises i Figur 4). Selv om ingen kompetanse eller dyre maskiner er nødvendig, er det noen kritiske skritt som må vurderes under vev fordøyelse, bygging av gradient, og lasting av cellen suspensjon på gradient.
Bakterieceller frigis fra sæd tubuli av to påfølgende enzymatisk digestions. Den første fordøyelsen med kollagenase IV skiller sæd tubuli ved å fjerne interstitiell celler. Forlenget fordøyelse tid kan skade tubuli og føre til tap av via, som (hvis den slippes fra tubuli under dette trinnet) de vil bli forkastet i følgende trinn. Den andre fordøyelsen trinn med Trypsin utgivelser bakterieceller fra sæd tubuli. Det kan være sporadisk cellelyse og typisk noen klumper form på grunn av utgitt genomisk DNA. Overstiger den foreslåtte varigheten eller temperaturen på fordøyelsen er ikke anbefalt, da dette kan føre til dårligere levedyktighet, økt cellelyse, og klumper. Hvis mild klumper forekommer, kan klumper ignoreres. Men i tilfeller av betydelig klumper og tap av celler, Trypsin fordøyelsen tid eller konsentrasjon bør reduseres. Det bør også bemerkes at enzymatisk aktivitet av Trypsin kan variere mellom partier og under lengre tider med lagring. Mengden av DNase jeg under Trypsin fordøyelsen kan også økes for å fjerne overflødig klumper, men dette bør betraktes som en sekundær løsning. Det er viktig å få en homogen enkelt celle suspensjon på slutten av pre-behandling, siden klumpet seg celler vil sediment raskere, forurensende fraksjoner og forstyrre gradient.
Bygge gradient kan kreve litt øvelse. Hvis det er ubehag ved hjelp av en 5 mL pipette med en pipette-kontroller, anbefales det å bruke en vanlig 1 mL mekanisk pipette med et jevnt stempel og deretter kutte pipette tips til en blenderåpning på ~ 3 mm i diameter (figur 1B). En bredere blenderåpning og jevn lasting av BSA-løsningene vil redusere risikoen for å blande graderingen. Når det er riktig forberedt, er det mulig å se grensene mellom tilstøtende BSA-løsninger på grunn av deres ulike brytnings indekser. Graderingen skal produseres direkte før bruk. Det bør også bemerkes at noen små risting eller vibrasjoner kan forstyrre gradient, så gradient bør settes i et miljø der det ikke vil bli forstyrret.
Lasting av cellen suspensjon på gradient må gjøres veldig nøye. Etter lasting, bør cellen suspensjonen holde på toppen av gradient, som cellene vil langsomt begynne å sediment gjennom det første laget. Hvis store grupper av celler blir sett beveger seg raskt gjennom gradient, var cellene sannsynligvis ikke resuspendert forsiktig eller det er overflødig klumper. Hvis cellene ikke holde på toppen av usammenhengende BSA gradient ved lasting, men umiddelbart synke mellom 1% og 2% BSA lag (trinn 3,6), er cellen suspensjonen trolig for tett. Denne protokollen er optimalisert ved hjelp av to testiklene av en voksen mus (80-120 mg/testikkel) som starter materiale; Selv om det er utført vellykkede isolasjoner med reduserte mengder Start materiale. For å oppskalere protokollen og få mer beriket bakterieceller fra høyere antall testiklene, mer 50 mL rør med gradient bør innføres.
Protokollen ble opprinnelig utviklet og optimalisert for å berike haploide runde via fra voksen mus testiklene, og renheten av runde spermatid fraksjoner er forventet å være mer enn 90%. I tillegg til svært ren runde spermatid fraksjoner, tilfredsstillende resultater for berikelse av pachytene spermatocytter og elongating via ble innhentet. Det bør bemerkes at erytrocytter kan forurense elongating spermatid fraksjoner, og ytterligere tiltak for å eliminere dem bør tas hvis deres tilstedeværelse er forventet å forstyrre nedstrøms analyser. Vi har ikke kunnet berike andre celletyper som premeiotic eller tidlige meiotic celler (før pachytene fase) fra voksne mus som bruker MDR-protokollen.
I tillegg STA-PUT sedimentering har blitt brukt til å skaffe beriket fraksjoner av spermatogoniene eller preleptotene, leptotene, og zygotene spermatocytter bruker juvenile testiklene samlet på gitte tidspunkter etter fødselen13. Denne tilnærmingen utnytter utseendet på disse celle typene under den første bølgen av spermatogenesis. Den samme tilnærmingen kan trolig brukes til MDR berikelse, men det har ennå ikke blitt testet i praksis. En annen metode som er et godt alternativ for rensing av premeiotic og meiotic celler på bestemte stadier av differensiering er FACS, som har den viktige fordelen av å tillate isolering av spesifikke celletyper basert på tilstedeværelsen spesifikke markører14 ,15,16,17.
Overall, fungerer MDR hastighet sedimentering som en nyttig metode for bakterie celle berikelse. Selv om denne metoden ikke er bedre enn andre veletablerte metoder i forhold til renhet eller mengde beriket celler, dens klare fordeler er dens enkelhet og lave sette opp kostnadene. Dette, sammen med den lave mengden av nødvendige starter materialer, gjengi denne protokollen et flott alternativ for forskere i spermatogenesis feltet og de i andre felt som kanskje ikke ønsker å investere i spesialisert maskinvare eller store grupper av dyr.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke alle Kotaja Lab medlemmer for deres bidrag under utviklingen av protokollen, og den aktive bruk og testing av protokollen i sine forskningsprosjekter. Spesielt vi setter pris på bidraget fra Jan Lindström for hjelp til å optimalisere protokollen. Denne studien ble støttet av Academy of Finland, Sigrid Jusélius Foundation, og Turku doktorgradsprogram for molekylær medisin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
| AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
| Dextrose | Preference of researcher | ||
| DNase I | Worthington | LS006355 | |
| GAPDH | HyTest | 5G4 | |
| HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
| HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
| KCl | Preference of researcher | ||
| KH2PO4 | Preference of researcher | ||
| MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
| NaCl | Preference of researcher | ||
| NaHCO3 | Preference of researcher | ||
| NH4Cl | Preference of researcher | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
| PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
| PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
| Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
| Rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
| Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
| TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
| Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
| γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| 0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1.5 mL or 2 mL tubes | Preference of researcher | ||
| 40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
| 5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
| Cell culture incubator | Preference of researcher | ||
| Centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
| Microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| Microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
| Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Water bath | Preference of researcher | ||
| Widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |
References
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Advances in Experimental Medicine and Biology. 636, 1-15 (2008).
- Lehtiniemi, T., Kotaja, N. Germ granule-mediated RNA regulation in male germ cells. Reproduction. 155 (2), R77-R91 (2018).
- Lam, D. M., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 65 (1), 192-199 (1970).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Experimental Cell Research. 79 (1), 213-227 (1973).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 279-297 (2009).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. Journal of Cellular Physiology. 86 (1), 177-189 (1975).
- Barchi, M., Geremia, R., Magliozzi, R., Bianchi, E. Isolation and analyses of enriched populations of male mouse germ cells by sedimentation velocity: the centrifugal elutriation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 558, 299-321 (2009).
- Romrell, L. J., Bellvé, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Developmental Biology. 49 (1), 119-131 (1976).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Da Ros, M., et al. FYCO1 and autophagy control the integrity of the haploid male germ cell-specific RNP granules. Autophagy. 13 (2), 302-321 (2017).
- Bellvé, A. R., et al. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization. The Journal of Cell Biology. 74 (1), 68-85 (1977).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biology of Reproduction. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Suter, L., Koch, E., Bechter, R., Bobadilla, M. Three-parameter flow cytometric analysis of rat spermatogenesis. Cytometry. 27 (2), 161-168 (1997).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biology of Reproduction. 95 (4), 85-85 (2016).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 65 (1), 40-49 (2005).
