Summary
Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatien und lästigen Spermaatiden aus erwachsenen Maushoden mit einem diskontinuierlichen Rinderserum-Albumin-Dichtegradienten mit Standard-Laborgeräten.
Abstract
Um jeden Schritt der Spermatogenese zu charakterisieren, müssen die Forscher verschiedene Subpopulationen von Keimzellen von Hoden trennen. Die Isolierung diskreter Populationen ist jedoch eine Herausforderung, da der adulte Hoden eine komplexe Mischung von Keimzellen aus allen Stufen der Spermatogenese zusammen mit bestimmten Populationen somatischer Zellen enthält. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Techniken wie Zentrifugalelutriation, Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und STA-PUT erfolgreich auf die Isolierung von Keimzellen angewendet. Ein Nachteil ist, dass sie alle spezielle Geräte und spezielle Schulungen benötigen. Nach den Prinzipien, die der STA-PUT-Methode zugrunde liegen, wurde ein einfaches Protokoll für die Isolierung von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatiden und länden Spermaatiden aus Maushoden entwickelt. Nach der Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension von Hodenzellen werden bestimmte Zellpopulationen durch Gravitationssedimentation durch einen diskontinuierlichen Rinderserumalbumin (BSA) Dichtegradienten angereichert. Die Zellfraktionen werden dann manuell gesammelt und mikroskopisch analysiert. Dieser modifizierte Dichtegradient für runde Spermatien (MDR) Sedimentationsprotokoll kann weit verbreitet werden, da es nur Standard-Laborausrüstung erfordert. Darüber hinaus erfordert das Protokoll minimale Ausgangsmaterialien, wodurch die Kosten und der Einsatz von Labortieren reduziert werden.
Introduction
Vieles ist noch unbekannt über die molekularen und biologischen Ereignisse, die während der Spermatogenese von Säugetieren stattfinden, einem komplexen Prozess, bei dem sich Spermatogonialstammzellen in hochspezialisierte Spermatozoen1,2verwandeln. Die Spermatogenese findet in den seminiferen Tubuli der Hoden statt. Die Tubuli enthalten eine Mischung von Keimzellen aus jedem Schritt der Differenzierung, einschließlich spermatogonialer Stammzellen, mitotisch geteilter Spermatogonie, meiotischer Spermatozyten und postmeiotischer Spermatoide (die sich einer haploiden Differenzierung von runden Spermien zu länglichen Spermaatien und schließlich zu reifen Spermatozoen). Zu den somatischen Zellen der Hoden gehören Sertoli-Zellen, die sich mit Keimzellen in den seminiferen Tubuli vermischt, peritubululäre Myoidzellen, die Wände der Tubuli bilden, und Testosteron produzierende Leydig-Zellen im interstitiellen Raum zwischen Tubuli.
Die Untersuchung molekularer und biochemischer Prozesse während der Spermatogenese erfordert oft die Trennung von unterschiedlichen Keimzellpopulationen von einer komplexen Mischung von Hodenzellen. Für die Zellanreicherung wurden viele verschiedene Strategien entwickelt. Die erfolgreichsten Methoden sind STA-PUT-Geschwindigkeitssedimentation durch Einheitsgravitation3,4,5,6, Zentrifugalelutriation auf Basis der Gegenflusszentrifugation7,8, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), die Zellen nach DNA-Gehalt und/oder spezifischen Markern trennt. Diese Methoden werden häufig unter Spermatogenese-Forschern verwendet und ermöglichen eine effiziente Anreicherung bestimmter Keimzelltypen. Eine Einschränkung dieser Techniken besteht jedoch darin, dass sie spezialisierte, teure Hardware benötigen, die Fachwissen erfordert.
Präsentiert hier ist ein einfaches und kostengünstiges Protokoll, um angereicherte Populationen der drei am häufigsten vorkommenden Zellpopulationen von Maushoden zu isolieren: runde Spermatoide, Pachyten-Spermatozyten und längliche Spermatoide. Dieses Protokoll wird als modifizierter Dichtegradient für runde Spermaatien (MDR) bezeichnet, da es besonders gut zur Anreicherung von runden Spermaatiden geeignet ist. Die MDR-Methode basiert auf den gleichen Prinzipien wie die STA-PUT-Geschwindigkeitssedimentation, benötigt aber nur Standard-Laborgeräte. Lebende Zellen dürfen sich durch einen manuell vorbereiteten diskontinuierlichen Rinderserumalbumin (BSA) Dichtegradienten innerhalb eines Standard-50-ml-Rohrs unter dem Gravitationsfeld der Erde sedimentieren. Größere Zellen bewegen sich schneller durch den Gradienten, der verschiedene Populationen von Keimzellen trennt. Nach der Sedimentation werden angereicherte Fraktionen der drei Zelltypen manuell gesammelt. Die Reinheit dieser angereicherten Zellpopulationen ist vergleichbar mit denen, die durch STA-PUT und Zentrifugalelutriation erreicht werden.
Neben dem Aufbau und der Verwendung des BSA-Gradienten für die Geschwindigkeitssedimentation beschreibt das Protokoll auch ein Verdauungsverfahren zur Freisetzung von Hodenzellen aus seminiferen Tubuli. Das Protokoll wurde von dem von Romrell et al.9 entwickelt modifiziert und enthält sequentielle Verdauungen mit Kollagenase IV und Trypsin. Sequenzielle Verdauungen in Kombination mit einem Bicarbonatpuffer (d.h. der Krebs-Lösung) haben gezeigt, dass sie die Trennung und Lebensfähigkeit der Keimzellen erheblich verbessern9.
Während der MDR-Anreicherung verbringen Zellen rund 4 h zusammen außerhalb der Umgebung der seminiferen Tubuli und sind keinen belastenden mechanischen Kräften ausgesetzt, was die Sammlung hochlebensfähiger Zellfraktionen für die nachgelagerte Analyse ermöglicht. Darüber hinaus erfordert das MDR-Protokoll, ähnlich wie die Zentrifugalelutriation und STA-PUT, keine chemische Behandlung oder Kennzeichnung von Zellen, was auch dazu beiträgt, ihre Lebensfähigkeit zu erhalten. Wichtig ist, dass nur zwei erwachsene Maushoden für die MDR-Isolierung ausreichen und daher eine erwachsene Maus genügend angereicherte Zellen für die RNA- und Proteinanalyse bietet. Standard STA-PUT Protokoll empfiehlt die Verwendung von so viel wie 12 erwachsene Mäuse für die Zellisolation6; obwohl aufgrund früherer Erfahrungen bekannt ist, dass eine erfolgreiche Isolierung von drei bis vier erwachsenen Mäusen durchgeführt werden kann. Die niedrigste Menge an Ausgangsmaterial, die für die Zentrifugalelutriation ausreichend ist, sind sechs Maushogen (drei Mäuse)8. Das MDR-Protokoll reduziert daher nicht nur den Bedarf an teuren Spezialgeräten, sondern reduziert auch die Anzahl der benötigten Labortiere.
Protocol
Die Wartung von Labormäusen und alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
1. Ausrüstung und Reagenzien-Einrichtung
- Stellen Sie das Wasserbad auf 37 °C ein.
- Stellen Sie den Zellkultur-Inkubator auf 34 °C, 5%CO2,95% Luftfeuchtigkeit. Legen Sie den Rohrrotator in den Inkubator.
HINWEIS: Inkubatoren benötigen eine lange Zeit, um die Innentemperatur zu ändern. Wenn ein Ständig auf 34 °C eingestellter Inkubator nicht verfügbar ist, stellen Sie einen Tag vor dem Experiment ein. - Bereiten und beschriften Sie die entsprechende Menge an Mikroskopieglasfolien. Zeichnen Sie mit einem Fettstift einen Ring von 1 cm Durchmesser und lassen Sie das Fett trocknen.
- Vorbereiten 1x Krebspuffer, pH 7.8 (Tabelle 1). Zwei konische Rohre mit 50 ml 1x Krebs auf 34 °C vorwärmen für die Schritte 2,5 bis 2,8 vorwärmen. Den Rest des 1x Krebs bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren.
- Bereiten Sie BSA-Lösungen vor. Zunächst 25 ml 10% (w/v) BSA-Lösung in Krebs vorbereiten, indem 2,5 g BSA in 1x Krebspuffer auf ein Endvolumen von 25 ml aufgelöst werden. Verdünnen Sie die 10% BSA-Lösung mit 1x KrebsPuffer, um unterschiedliche BSA-Konzentrationen zu erhalten (Tabelle 2). Halten Sie alle BSA-Lösungen bei 4 °C.
HINWEIS: Bereiten Sie Lösungen am selben Tag des Verfahrens vor und lagern Sie bei 4 °C bis zur Anwendung. - Bereiten Sie die Verdauungsenzyme vor, indem Sie die richtige Menge an Trypsin und Kollagennase auf 50 ml konische Röhren wiegen (Tabelle 3).
2. Tierische Zerlegung und Vorbereitung der Keimzellsuspension
HINWEIS: Dies dauert ca. 1 h.
- Opfern Sie eine erwachsene männliche Maus (im Alter von 7 Wochen oder älter, Hoden mit einem Gewicht von 80 bis 120 mg je nach Stamm und Alter) durch Zervixdislokation oder CO2-Erstickung.
- Sprühen Sie den ventralen Bauch der Maus mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die abdominobeckende Kavität mit einer Schere, so dass eine V-förmige Öffnung.
- Ziehen Sie auf dem epididymalen Fettpolster mit Zange, lokalisieren Sie die Hoden und entfernen Sie sie mit einer Schere. Vermeiden Sie es, die Tunika albuginea zu stören. Legen Sie die Hoden auf eine 6 cm Petrischale mit 1x Krebs.
- Entkapseln Sie die Hoden und entsorgen Sie die Tunika albuginea. Die seminiferen Tubuli leicht zerstreuen, indem man sie sanft mit Zangen auseinander neckt.
- Verwenden Sie Zangen, um die seminiferen Tubuli in ein 50 ml konisches Rohr mit 2 ml frisch zubereiteter Kollagennaselösung zu übertragen (Tabelle 3).
- Die Tubuli im 37 °C-Wasserbad 3 min. bebrüten sanft durch Schaukeln der Röhre.
HINWEIS: Frei schwebende Tubuli sollten innerhalb von 3 min aufgrund der Entfernung von interstitiellen Zellen auftreten. Die physiologische Temperatur für Hodenzellen beträgt 34 °C; daher werden lange Verdauungen in der Regel bei dieser Temperatur durchgeführt. Die kurze 3 min Verdauung kann jedoch bei 37 °C durchgeführt werden (empfohlene Temperatur durch den Hersteller). Beachten Sie, dass bei Verwendung von 34 °C die Verdauungszeit neu optimiert werden sollte. - Fügen Sie mindestens 40 ml warmes 1x Krebs hinzu und lassen Sie die Tubuli bei Raumtemperatur (RT) sedimentieren (ca. 1 min). Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie 1x.
- Fügen Sie 25 ml frisch zubereitete Trypsinlösung hinzu (Tabelle 3), legen Sie das Rohr auf den Rohrrotator im 34 °C-Inkubator und brüten sie für 15 bis 20 min (ca. 15 U/min). Sporadisch den Status der Tubuli überprüfen. Sobald die Lösung trüb wird und nur noch kleine Tubules übrig bleiben, legen Sie die Röhre auf Eis und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
HINWEIS: Um Überverdauung und Zelllyse zu vermeiden, bewegen Sie sich schnell zu den folgenden Waschschritten. Einige Protokolle umfassen die Deaktivierung von Trypsin durch fetales Rinderserum (FBS). In diesem Protokoll wird die FBS-Behandlung weggelassen, stattdessen wird Trypsin durch sofortige Zentrifugation und nachfolgende Wäbungen mit kaltem 1x Krebs entfernt. - Filtern Sie die Lösung durch ein 40-m-Zellsieb in ein neues 50 ml konisches Rohr auf Eis.
- Zentrifuge 600 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pellet.
HINWEIS: Zentrifugation mit zu starker Kraft kann den Zellen schaden. - Entfernen Sie Denobtant, indem Sie ihn vorsichtig ausgießen.
- Tippen Sie auf das Zellpellet, um die Zellen im Rest von 1x Krebs wieder auszusetzen.
- Fügen Sie den resuspendierten Zellen mindestens 40 ml kaltes 1x Krebs hinzu.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.10 und 2.11.
- Tippen Sie auf das Rohr mit dem Zellpellet, um die Zellen wieder aufzuhängen. Fügen Sie 1 ml 0,5% BSA in 1x Krebs hinzu und mit einer geschnittenen Pipettenspitze die Zellen durch Pipettieren der Lösung nach oben und unten wieder aufhängen. Vermeiden Sie Blasen zu machen.
- Fügen Sie schließlich 1 x 3 ml 0,5% BSA in 1x Krebs hinzu, so dass das Endvolumen 3 ml beträgt. Filtrieren Sie die Keimzellsuspension durch ein 40-m-Zellsieb und laden Sie die Zellen sofort auf den BSA-Gradienten.
3. Trennung von Keimzellen durch den diskontinuierlichen BSA-Gradienten
HINWEIS: Dieser Abschnitt dauert ca. 2 h. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des diskontinuierlichen BSA-Gradienten während der Waschschritte (Schritte 2.10-2.14), um die Zellen zu laden, sobald die Vorbehandlung bereit ist.
- Beherbergen Sie ein 50 ml Rohr vertikal auf Eis, so dass es möglich ist, eine Seite des Rohres zu sehen. Alternativ können Sie das Protokoll in einem Kühlraum bei 4 °C ausführen, in diesem Fall wird kein Eis benötigt.
- Schneiden Sie die Spitze einer 10 ml serologischen Pipette ca. 5 x 10 mm von der Spitze, um eine größere Blende zu erhalten (Abbildung 1A), und montieren Sie sie auf der Pipettensteuerung (Abbildung 1C).
HINWEIS: Dadurch wird die Geschwindigkeit beim Pipetieren verringert, was das Stapeln der verschiedenen BSA-Lösungen erleichtert. Alternativ können Sie eine 1 ml mechanische Pipette mit einem glatten Kolben verwenden und die Pipettenspitzen mit einer Blende von ca. 3 mm Durchmesser schneiden(Abbildung 1B). - Beginnen Sie mit der Pipettierung von 5 ml 5% BSA-Lösung an den Boden des 50 ml Rohres.
- Langsam Pipetten 5 ml von 4% BSA Lösung auf der 5% Lösung. Beginnen Sie mit dem sanften Berühren der Oberfläche der 5%-Lösung mit der geschnittenen Spitze der Pipette und schichten Sie die beiden Lösungen, während Sie den Kontakt mit der Oberfläche sorgfältig aufrechterhalten, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze nicht eingetaucht wird.
HINWEIS: Am Ende dieses Schritts sollte eine klare Linie zwischen den beiden Ebenen sichtbar sein. - Wiederholen Sie Schritt 3.4 mit den anderen BSA-Lösungen erhalten Sie einen diskontinuierlichen Gradienten von 5% bis 1%(Abbildung 1D).
- Laden Sie die einzellige Aufhängung vorsichtig auf den Gradienten, ohne zu stören. Lassen Sie die Zellen durch den Gradienten für 1,5 h bei 4 °C oder auf Eis sedimentieren.
4. Sammlung von angereicherten Keimzellfraktionen
HINWEIS: Dieser Abschnitt dauert ca. 30 min.
- Montieren Sie eine 1 ml Pipettenspitze auf eine 1 ml mechanische Pipette und schneiden Sie die Spitze so, dass die Blende einen Durchmesser von 3 mm hat(Abbildung 1B).
- Sammeln Sie vorsichtig 1 ml-Fraktionen in separaten 1,5 ml-Rohren, beginnend von der Oberseite des BSA-Gradienten, und lagern Sie sie auf Eis. Nummeren Sie die Rohre in der gleichen Reihenfolge wie die Fraktionen gesammelt werden.
HINWEIS: An dieser Stelle sollte es eine Reihe von 28 Tuben geben, die Zellsuspensionen enthalten. Verwenden Sie eine 1 ml mechanische Pipette mit einem glatten Kolben und schneiden Sie die Pipettenspitzen, um das Risiko einer Störung des BSA-Gradienten zu minimieren. - Zentrifugieren Sie die Keimzellfraktionen bei 600 x g für 10 min bei 4 °C.
- Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, entsorgen Sie den größten Teil des Überstandes und suspendieren Sie das Zellpellet durch Flicken des Rohres. Fügen Sie 1 ml eiskalten 1x Krebspuffer in jedes Rohr und wiederholen Zentrifugation.
HINWEIS: Wiederholen Sie den Waschschritt, wenn BSA die nachgeschaltete Analyse beeinträchtigt. - Entsorgen Sie den größten Teil des Überstandes, lassen Sie aber nach der letzten Wäsche 100 L.L.. Setzen Sie das Zellpellet sorgfältig aus.
HINWEIS: Das Resuspendieren der Zellen stellt sorgfältig sicher, dass die aus dieser Lösung entnommene Probe alle Zellen des angegebenen Bruchs darstellt. Halten Sie die Zellsuspensionen auf Eis, während Sie die Dias vorbereiten.
5. Analyse von Zellfraktionen
HINWEIS: Die Analyse dauert 2 h.
- Nacheinander, Pipetten 20 l von 4% Paraformaldehyd (PFA) in jedem Fettstiftring auf einem nummerierten Mikroskop-Dia.
- Fügen Sie sofort 2 l der resuspendierten Zellsuspension aus dem entsprechenden Bruch hinzu. Wiederholen Sie dies für jeden Bruch.
HINWEIS: Halten Sie bei der Vorbereitung von Dias alle Zellsuspensionen auf Eis. - Trocknen Sie die Rutschen bei RT für 1 h bis über Nacht (O/N).
HINWEIS: In diesem Schritt können die Zellen nach der Entnahme einer Probe aus jeder Fraktion für nachgelagerte Analysen oder Lagerungen verarbeitet werden (Abschnitt 6). - Spülen Sie die Dias einmal mit 1x PBS und montieren Sie mit Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) (Tabelle der Materialien).
- Analysieren Sie die Dias unter einem Fluoreszenzmikroskop, um abzuschätzen, welcher bestimmte Keimzelltyp in jeder Fraktion angereichert ist.
HINWEIS: Verschiedene Zelltypen können an ihrer charakteristischen Kernmorphologie erkannt werden, die durch DAPI-Färbung visualisiert wird. Abbildung 2 A zeigt repräsentative Fraktionen, angereichert mit lästigen Spermaatiden, runden Spermaatiden und Pachyten-Spermatozyten. Der runde Spermakern ist klein (Durchmesser 6 x 7 m) und rund (Abbildung 2A). Maus runde Spermakerne zeichnen sich auch durch eine einzige, runde Heterochromatin-Struktur, das Chromocenter, aus. Kerne von länglichen Spermaatiden haben eine typische länglichen Form und reduzierte Kerngröße durch Chromatinkondensation (Abbildung 2A). Pachytene Spermatozytenkerne sind viel größer (Durchmesser mehr als 10 m) und unregelmäßiger in der Form, mit Bereichen von dicht gepacktem Chromatin verteilt durch (Abbildung 2A). -
Führen Sie bei Bedarf zusätzlich zur DAPI-Färbung eine Immunfärbung durch, um die Erkennung der verschiedenen Zelltypen zu unterstützen.
- In diesem Fall 2 l Zellsuspension mit 20 l einer Befestigungslösung (4% PFA und 0,1% nichtionisches Tensid in PBS) in einem Fettstiftring verteilen. Nach dem Trocknen der Dias, postfixieren Sie die Zellen mit 4% PFA für 10 min bei RT.
- Mit PBS abspülen, dann mit 0,1% nichtionischem Tensid in PBS für 5 min permeabilisieren und alle verbleibenden PFA deaktivieren, indem sie Dias in 100 mM NH4Cl für 5 min inkubieren.
- Spülen Sie mit PBS und gehen Sie zu einem Standard-Immunfluoreszenzprotokoll, das aus Blockierung und Inkubationen mit spezifischen primären Antikörpern und fluorchrom-markierten sekundären Antikörpern besteht. Montieren Sie die Dias mit Antifade-Mountant mit DAPI (Tabelle der Materialien) und lassen Sie sie für 24 h einstellen.
HINWEIS: Beispiele für nützliche Marker für primäre Antikörper-Inkubationen sind Erdnussagglutinin (PNA; 1:2.000 in Blockierlösung), die das Akrosom in runden und länglichen Spermaatiden färbt, Anti-DDX4-Antikörper (1:200 in Blockierlösung), der eine einzelne zytoplasmatisches Granulat in runden Spermatien und Anti-H2AX-Antikörper (1:100 in Blockierlösung), der Geschlechtskörper in Pachyten-Spermatozyten erkennt. Beispiele für die Immunfluoreszenzanalyse der Fraktionen finden Sie in den repräsentativen Ergebnissen und Abbildung 2C,D.
6. Verarbeitung der verbleibenden Proben für die Lagerung
HINWEIS: Abschnitt 6 dauert ca. 20 min.
- Nachdem eine Probe aus jeder Fraktion für einen Mikroskop-Dia entnommen wurde, fügen Sie 1 ml eiskaltem 1x Krebs zu jeder Fraktion hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 x 13.000 x g für 10 min bei 4 °C.
HINWEIS: Eine Low-Speed-Zentrifugation führt zu einem lockeren Pellet, was es schwierig macht, 1x Krebs vollständig zu entfernen, während eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation die Zellen schädigen kann. Wählen Sie die Zentrifugationsgeschwindigkeit entsprechend den spezifischen Anforderungen des Downstream-Protokolls aus. - Entfernen und verwerfen Sie den Überstand, und fahren Sie mit der bevorzugten Downstream-Analyse fort.
HINWEIS: An dieser Stelle können die Zellen in flüssigem Stickstoff einrastet und bei -70 °C gelagert werden. Sobald Sie mit dieser Technik vertraut sind, ist es möglich, mit dem nachgeschalteten Präferenzprotokoll direkt fortzufahren, aber es ist immer ratsam, eine Probe zu nehmen und die Reinheit jeder Fraktion zu gewährleisten. Die gesamte RNA kann mit Methoden wie Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (PCR) und RNA-Sequenzierung extrahiert, quantifiziert und analysiert werden. Es können auch Proteinextrakte insgesamt hergestellt werden, aus denen Immunpräzipitation oder Western-Blotting-Analyse durchgeführt werden kann (Abbildung 3).
Representative Results
Eine ausreichende Anreicherung eines Keimzelltyps wird in der Regel als über 80%6angesehen. Das MDR-Protokoll eignet sich besonders gut zur Anreicherung von runden Spermien. Eine hohe Anzahl von >90% reine runde Spermaatien können routinemäßig mit dieser Technik erhalten werden. Optimale Fraktionen von Pachyten-Spermatozyten und länglichen Spermatoren werden auf 75 % bzw. 80 % angereichert. Länder Spermaatien neigen dazu, auf dem Gradienten zu bleiben und werden mit der ersten Fraktion gesammelt. Im gezeigten Beispiel enthielt Fraktion 1 80 % der langenlassenden Spermaatiden (Abbildung 2B). Die meisten länglichen Spermatoren, die mit dieser Technik erhalten wurden, haben kondensierte Kerne, während nicht kondensierte früh längliche Spermaatien knapp sind (Abbildung 2A). Die folgenden Fraktionen enthalten angereicherte runde Spermaatiden. Im Beispiel betrug die Anreicherung von runden Spermien mehr als 90% in den Fraktionen 2, 3 und 4, und die Anreicherung über 80% wurde insgesamt in sieben Fraktionen (2-8) beobachtet(Abbildung 2B). Aufgrund ihrer großen Größe sedimentieren pachytene Spermatozyten schneller und werden zuletzt gesammelt. Im Reinigungsbeispiel betrug die Anreicherung in den Fraktionen 14 und 15 rund 75 % (Abbildung 2B).
Während die kerntechnische Morphologie, die durch DAPI-Färbung visualisiert wird, in der Regel für die Erkennung der Zellen ausreicht, kann eine Immunfluoreszenzanalyse durchgeführt werden, um die Analyse zu unterstützen. PNA färbt die sich entwickelnden Akrosomen von runden und länglichen Spermatoren, und das akrosomale Aussehen kann ausgenutzt werden, um runde Spermatade weiter in die Schritte 1-8 der Differenzierung10zu kategorisieren. Die Unterscheidung von PNA-gefärbten länsigen und runden Spermaatiden beruht auf den Unterschieden in ihrer kerntechnischen Form(Abbildung 2C, linkes Panel). Anti-DDX4-Antikörper ist ein nützlicher Marker für die runden Spermafraktionen, da er ein einzelnes DDX4-positives perinukleares Granulat, den Chromatoidkörper (CB), im Zytoplasma jedes runden Spermatien visualisiert. Diese CB-spezifische Färbung ist leicht von weiter verbreiteten zytoplasmatischen Färbungen in Spermatozyten zu unterscheiden(Abbildung 2C, Mittelplatte). Pachytene Spermatozyten können durch Anti-H2AX-Antikörper erkannt werden, der den nuklearen Geschlechtskörper kennzeichnet, der speziell in der Pachytenphase der ersten meiotischen Teilung erscheint (Abbildung 2C, rechtes Panel). Bei dieser Reinigung ergab die PNA-Färbung, dass MDR-angereicherte runde Spermienfraktionen eine Mischung von runden Spermien bei verschiedenen Differenzierungsschritten enthielten, die alle ihre Signaturstruktur, das DDX4-positive CB enthielten (Abbildung 2D, RS-Fraktion). Anti-H2AX validierte ferner die Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten in Fraktion 16(Abbildung 2D, PSpc-Fraktion).
Die Zellzählung ergab, dass die Anzahl der Zellen in den runden Spermaatien- und Pachyten-Spermatozytenfraktionen für verschiedene nachgeschaltete Analysen ausreichend ist. Runde Spermienfraktionen (5 x 8) enthielten jeweils etwa 2,5 x 106 Zellen. Daher ist es möglich, durch die Bündelung dieser Fraktionen mehr als 10 Millionen Zellen zu erhalten. Pachytene Spermatozytenfraktionen (14 und 15) enthielten in der Regel etwas weniger Zellen. In dieser Isolation wurden etwa 1,5 bis 2,0 x 106 Zellen pro Fraktion gezählt. Die erste Fraktion enthielt 0,75 x 106 längende Spermaatiden.
Wie in Abbildung 3Adargestellt, reichte die gesamtrna-Menge, die aus der Mehrheit der Fraktionen gewonnen wurde, zwischen 0,5 und 2,5 g, was für nachgeschaltete RNA-Analysen wie Reverse-Transkription PCR, RNA-Sequenzierung oder Visualisierung von RNA auf einem Gel ausreicht. Die Menge an Protein, die aus jeder Fraktion gewonnen wird, reicht in der Regel von 20 bis 140 g (Abbildung 3B), was für mehrere westliche Flecken ausreicht. Ganze Zelllysate wurden aus gesammelten Fraktionen hergestellt, und die Western-Blot-Analyse wurde mit Antikörpern durchgeführt, die DDX4, PIWIL1 und PIWIL2 detektieren, die alle in Pachyten-Spermatozyten und runden Spermatien sowie den allgegenwärtigen exprimierte Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH).
In diesem Protokoll reichten 10 % der aus einzelnen Fraktionen gewonnenen Proteinlysate aus, um alle diese Proteine auf einer Standardeinstellung für Westernblot eindeutig zu detektieren (Abbildung 3C). Die Proteinmenge in einer Fraktion erwies sich auch als ausreichend für die Immunpräzipation mit einem Antikörper gegen PIWIL1 sowie für den Nachweis von mitimmunpräzipiertem PIWIL2 (Abbildung 3D). Darüber hinaus wurde dieses Protokoll erfolgreich verwendet, um angereicherte Fraktionen von Pachyten-Spermatozyten und runden Spermatoiden aus Kontroll- und genetisch veränderten Mäusen für nachgelagerte Anwendungen wie quantitative Reverse-Transkription PCR 11 zu erhalten. und hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung12.
Abbildung 1: Vorbereitung eines diskontinuierlichen BSA-Gradienten. (A) Eine 5 ml serologische Pipettenspitze zur Vorbereitung des Gradienten. (B) Eine 1 ml Pipettenspitze zur Vorbereitung des Gradienten und zur Sammlung der Keimzellfraktionen nach Sedimentation. (C) Die für die Vorbereitung des Gefälles benötigte Ausrüstung. (D) Seitenansicht des diskontinuierlichen BSA-Dichtegradienten von 5 % (unten) bis zur 1% (oberen) BSA-Lösung; Die 2% und 4% BSA-Lösungen sind blau in der Farbe für eine bessere Visualisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der gesammelten Zellfraktionen und der Anreicherungsanalyse. (A) DAPI-gefleckte Hodenzellen. Die obere Reihe zeigt Hodenzellen im intakten Seminiferepithel eines PFA-festen, paraffineingebetteten Hodenabschnitts (links) oder in Suspension (rechts). Die untere Reihe zeigt Fraktionen von angereicherten länden Spermaatiden (ES), runden Spermaatiden (RS) oder Pachyten-Spermatozyten (PSpc). Skalenbalken = 20 m für die obere Reihe und 10 m für Einschube der unteren Reihe. (B) Relative Quantifizierung der verschiedenen Keimzelltypen in jeder Fraktion. Zellen wurden manuell mit der ImageJ-Software gezählt und in RS-, ES-, PSpc-, Sertoli-Zellen und andere Zellen klassifiziert. Die Bruchzahlen und die jeweiligen Prozentsätze von BSA im Farbverlauf werden auf der x-Achse angezeigt. (C) Immunfluoreszenzanalyse von Hodenzellen. Linkes Panel: Rhodamine-beschriftet PNA färbt das Akrosom sowohl in ES (gelber Pfeil) als auch in RS (weißer Pfeil). Mittleres Panel: DDX4-Antikörper färbt ein einzelnes perinukleares Granulat in RS, das leicht vom diffuseren zytoplasmatischen Signal in Spermatozyten (blauer Pfeil) zu unterscheiden ist. In ES (orangefarbener Pfeil) wird kein DDX4-Signal erkannt. Rechtes Panel: Der Antikörper h2AX erkennt den charakteristischen kernkraftgeschlechtlichen Körper, der nur in pachytene spermatozyten vorhanden ist ( H2AX-negative Zellen, die durch ein weißes Sternchen gekennzeichnet sind). Skalenstäbe = 10 m (D) MDR angereicherte Zellfraktionen wurden mit PNA (RS-Fraktion), Anti-DDX4 (RS-Fraktion) und Anti-H2AX (PSpc-Fraktion) gekennzeichnet, um die Zellanreicherung in jeder Fraktion weiter zu validieren. Skalenbalken = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nachgelagerte Analysen nach MDR-Zellanreicherung. (A) Rna wurde aus jeder Fraktion nach einer repräsentativen MDR-Zellanreicherung extrahiert und quantifiziert. Die Bruchzahlen und die jeweiligen Prozentsätze von BSA im Farbverlauf werden auf der x-Achse angezeigt. (B) Proteine wurden aus jeder Fraktion extrahiert, indem das Zellpellet im Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer (RIPA) lysiert und dann quantifiziert wurde. (C) Vollzellproteinextrakte wurden durch Western-Blotting mit Antikörpern gegen DDX4, PIWIL1, PIWIL2 und GAPDH hergestellt und analysiert. 10% des Lysats wurde aus jedem angegebenen Bruch geladen. (D) Immunpräzipitation wurde aus indizierten Fraktionen mit Anti-PIWIL1 gefolgt von western blotting mit Anti-PIWIL1 und Anti-PIWIL2 Antikörpern durchgeführt. Die Eingangsprobe enthält eine Mischung von Proteinlysaten aus verschiedenen Fraktionen, und die Kontrollimmunpräzipitation (IP) mit Kaninchen IgG wurde auch aus einem gemischten Lysat durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung des MDR-Protokolls und zeitgemäß für den Abschluss der einzelnen Schritte. Das Ausgangsmaterial besteht aus zwei Hoden aus einer erwachsenen Maus. Die durchschnittliche Anzahl der Zellen und die Menge an RNA und Protein aus einer Fraktion sind angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| stoßdämpfer | Reagenzien | vorbereitung | lagerung |
| Krebspuffer (10x) | 3,26 g KH2PO4 | Bringen Sie auf 2 L mit H2O, Filter 0,22 m und Autoklav. | Kann bei 4 °C für mehrere Monate gelagert werden |
| 139,5 g NaCl | |||
| 5,89 g MgSO4•7H2O | |||
| 50 g Dextrose | |||
| 3,78 g CaCl2•2H2O | |||
| 7,12 g KCl | |||
| Krebspuffer (1x) | 4,24 g NaHCO3 | NaHCO3 bis 100 ml H2O auflösen, 200 ml 10x Krebspuffer hinzufügen und mit H2O auf 2 L bringen. | Frisch zubereitet werden |
| 200 ml 10x Krebspuffer |
Tabelle 1: Vorbereitung des Krebspuffers.
| BSA-Konzentration (w/v) | 10% BSA-Lösung | 1x Krebspuffer |
| 0.50% | 0,5 ml | 9,5 ml |
| 1% | 1 ml | 9 ml |
| 2% | 2 mL | 8 mL |
| 3% | 3 mL | 7 ml |
| 4% | 4 ml | 6 ml |
| 5% | 5 mL | 5 mL |
Tabelle 2: Vorbereitung von BSA-Lösungen.
| Verdauungslösung | Arbeitskonzentration | Reagenzien | vorbereitung |
| Kollagenase | 1 mg/ml | Kollagenase IV | Wiegen Sie 2 mg Kollagennase IV in ein 50 ml konisches Rohr und fügen Sie 2 ml warmen 1x Krebspuffer direkt vor der Verdauung hinzu (Schritt 2.3). |
| Trypsin | 0,6 mg/ml | Trypsin | Wiegen Sie 15 mg Trypsin in ein 50 ml konisches Rohr, und fügen Sie 25 ml warmen 1x KREBS Puffer und 40 l DNase I direkt vor der Verdauung hinzu (Schritt 2.6). |
| >3,2 ku/ml | DNase I |
Tabelle 3: Herstellung der Verdauungsenzyme.
Discussion
Hier wird ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Isolierung angereicherter Populationen von runden Spermaatiden, Pachyten-Spermatozyten und länglichen Spermaatiden mit Standard-Laborgeräten vorgestellt (Übersicht über das Protokoll in Abbildung 4). Obwohl keine Fachkenntnisse oder teure Maschinen erforderlich sind, gibt es einige kritische Schritte, die bei der Gewebeverdauung, der Konstruktion des Gradienten und der Belastung der Zellsuspension auf den Gradienten berücksichtigt werden müssen.
Keimzellen werden durch zwei aufeinander folgende enzymatische Verdauungen aus seminiferen Tubuli freigesetzt. Die erste Verdauung mit Kollagenase IV trennt seminiferöse Tubuli durch Entfernung von interstitiellen Zellen. Längere Verdauungszeit kann die Tubuli schädigen und zum Verlust von Spermaatiden führen, da (wenn sie während dieses Schritts aus den Tubuli entlassen werden) sie in den folgenden Schritten verworfen werden. Der zweite Verdauungsschritt mit Trypsin setzt Keimzellen aus seminiferen Tubuli frei. Es kann gelegentliche Zelllyse und in der Regel einige Klumpen bilden sich aufgrund der freigesetzten genomischen DNA. Eine Überschreitung der vorgeschlagenen Dauer oder Temperatur der Verdauung wird nicht empfohlen, da dies zu einer schlechteren Lebensfähigkeit, erhöhter Zelllyse und Klumpenbildung führen kann. Wenn leichte Klumpen auftreten, können die Klumpen ignoriert werden. Jedoch, in Fällen von signifikanten Klumpen und Verlust von Zellen, Trypsin Verdauungszeit oder Konzentration sollte reduziert werden. Es sollte auch beachtet werden, dass die enzymatische Aktivität von Trypsin zwischen Chargen und während längerer Lagerzeiten variieren kann. Die Menge an DNase I während der Trypsin-Verdauung kann auch erhöht werden, um überschüssige Klumpen zu entfernen, aber dies sollte als sekundäre Lösung betrachtet werden. Es ist wichtig, am Ende der Vorbehandlung eine homogene einzellige Suspension zu erhalten, da verklumpte Zellen schneller sedimentieren, die Fraktionen kontaminieren und den Gradienten stören.
Das Erstellen des Farbverlaufs kann einige Übung erfordern. Wenn es Beschwerden mit einer 5 ml Pipettenspitze mit einem Pipettenregler gibt, wird empfohlen, eine normale 1 ml mechanische Pipette mit einem glatten Kolben zu verwenden und dann die Pipettenspitzen auf eine Öffnung von 3 mm Durchmesser zu schneiden (Abbildung 1B). Eine breitere Blende und eine gleichmäßige Beladung der BSA-Lösungen verringern das Risiko, den Gradienten zu mischen. Bei sachgemäßer Vorbereitung ist es aufgrund der unterschiedlichen Brechungsindizes möglich, die Grenzen zwischen benachbarten BSA-Lösungen zu sehen. Der Farbverlauf sollte direkt vor der Verwendung erstellt werden. Es sollte auch beachtet werden, dass jedes kleine Schütteln oder Vibrationen den Gradienten stören kann, so dass der Gradient in einer Umgebung eingestellt werden sollte, in der er nicht gestört wird.
Die Beladung der Zellsuspension auf den Farbverlauf muss sehr sorgfältig erfolgen. Nach dem Beladen sollte die Zellsuspension auf dem Gradienten bleiben, von dem aus die Zellen langsam beginnen, sich durch die erste Schicht zu sedimentieren. Wenn große Gruppen von Zellen gesehen werden, die sich schnell durch den Gradienten bewegen, wurden die Zellen wahrscheinlich nicht sorgfältig resuspendiert oder es gibt übermäßige Verklumpungen. Wenn die Zellen beim Laden nicht oben im diskontinuierlichen BSA-Gradienten bleiben, sondern sofort zwischen den 1% und 2% BSA-Schichten (Schritt 3.6) sinken, ist die Zellsuspension wahrscheinlich zu dicht. Dieses Protokoll wurde mit zwei Hoden einer erwachsenen Maus (80-120 mg/Testis) als Ausgangsmaterial optimiert; obwohl erfolgreiche Isolierungen mit reduzierten Mengen an Ausgangsmaterial durchgeführt wurden. Um das Protokoll zu erweitern und mehr angereicherte Keimzellen aus höheren Hodenzahlen zu erhalten, sollten mehr 50 ml-Rohre mit dem Gradienten eingeführt werden.
Das Protokoll wurde ursprünglich entwickelt und optimiert, um haploide runde Spermaatien aus erwachsenen Maushoden zu bereichern, und die Reinheit der runden Spermadosen wird voraussichtlich mehr als 90% betragen. Neben hochreinen runden Spermienfraktionen wurden zufriedenstellende Ergebnisse für die Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und lästigen Spermaatiden erzielt. Es sollte beachtet werden, dass Erythrozyten die länglichen Spermafraktionen kontaminieren können, und es sollten weitere Schritte unternommen werden, um sie zu beseitigen, wenn erwartet wird, dass ihre Anwesenheit die nachgelagerten Analysen beeinträchtigt. Wir waren nicht in der Lage, andere Zelltypen wie prämeiotische oder frühe meiotische Zellen (vor der Pachytenphase) von erwachsenen Mäusen mit dem MDR-Protokoll anzureichern.
Zusätzlich, STA-PUT Sedimentation wurde erfolgreich verwendet, um angereicherte Fraktionen von Spermatogonie oder Preleptoten, Leptotene, und Zygoten Spermatozyten mit juvenilen Hoden zu bestimmten Zeitpunkten nach der Geburtgesammelt 13zu erhalten. Dieser Ansatz nutzt das Auftreten dieser Zelltypen während der ersten Welle der Spermatogenese. Derselbe Ansatz kann wahrscheinlich auf die MDR-Anreicherung angewendet werden, aber er wurde noch nicht in der Praxis getestet. Eine weitere Methode, die eine gute Option für die Reinigung von prämetiotischen und meiotischen Zellen in bestimmten Stadien der Differenzierung ist FACS, die den wichtigen Vorteil hat, die Isolierung bestimmter Zelltypen auf der Grundlage der anwesenheitsspezifischen Marker zu ermöglichen14 ,15,16,17.
Insgesamt dient die MDR-Geschwindigkeitssedimentation als nützliche Methode zur Keimzellanreicherung. Während diese Methode anderen etablierten Methoden in Bezug auf die Reinheit oder Menge der angereicherten Zellen nicht überlegen ist, sind ihre klaren Vorteile ihre Einfachheit und niedrige Einrichtungskosten. Zusammen mit der geringen Menge an benötigten Ausgangsmaterialien ist dieses Protokoll eine großartige Option für Forscher im Bereich der Spermatogenese und für diejenigen in anderen Bereichen, die möglicherweise nicht in spezialisierte Hardware oder große Gruppen von Tieren investieren möchten.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken allen Kotaja-Labormitgliedern für ihre Beiträge bei der Entwicklung des Protokolls und für die aktive Nutzung und Erprobung des Protokolls in ihren Forschungsprojekten. Besonders schätzen wir den Beitrag von Jan Lindström für die Hilfe bei der Optimierung des Protokolls. Diese Studie wurde von der Akademie Finnlands, der Sigrid Jusélius Foundation und dem Turku Doctoral Programme of Molecular Medicine unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
| AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
| Dextrose | Preference of researcher | ||
| DNase I | Worthington | LS006355 | |
| GAPDH | HyTest | 5G4 | |
| HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
| HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
| KCl | Preference of researcher | ||
| KH2PO4 | Preference of researcher | ||
| MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
| NaCl | Preference of researcher | ||
| NaHCO3 | Preference of researcher | ||
| NH4Cl | Preference of researcher | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
| PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
| PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
| Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
| Rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
| Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
| TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
| Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
| γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| 0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1.5 mL or 2 mL tubes | Preference of researcher | ||
| 40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
| 5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
| Cell culture incubator | Preference of researcher | ||
| Centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
| Microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| Microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
| Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Water bath | Preference of researcher | ||
| Widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |
References
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