Summary
여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.
Abstract
정자 발생의 각 단계를 특성화하기 위해, 연구원은 고환에서 세균 세포의 다른 하위 집단을 분리해야합니다. 그러나, 성인 고환은 체세포의 특정 인구와 더불어 정자 발생의 모든 단계에서 생식 세포의 복잡한 혼합을 포함하기 때문에, 분리인구를 고립시키는 것은 도전적입니다. 지난 수십 년 동안 원심 용해, 형광 활성화 세포 선별(FACS) 및 STA-PUT과 같은 다양한 기술이 생식 세포의 격리에 성공적으로 적용되었습니다. 단점은 모두 전용 장치와 전문 교육이 필요하다는 것입니다. STA-PUT 방법의 기초가 되는 원리에 따라, 간단한 프로토콜은 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자의 격리를 위해 개발되었습니다. 고환 세포의 단일 세포 현탁액을 준비 한 후, 특정 세포 집단은 불연속 소 혈청 알부민을 통해 중력 침전에 의해 풍부 (BSA) 밀도 구배. 그런 다음 셀 분획을 수동으로 수집하고 현미경으로 분석합니다. 둥근 정자 (MDR) 침전 프로토콜에 대한이 수정 된 밀도 구배는 표준 실험실 장비만 필요하기 때문에 널리 적용 될 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 최소한의 시작 재료가 필요, 비용과 실험실 동물의 사용을 감소.
Introduction
포유류 정자 형성 중에 일어나는 분자 및 생물학적 사건에 대해서는 아직 알려지지 않았으며, 정자 줄기 세포가 고도로 전문화된 정자1,2로변하는 복잡한 과정. 정자 발생은 고환의 반분부 관 내부에서 일어난다. 관은 정자 줄기 세포, 유사하게 분할 정자, meiotic 정자 세포 및 후 meioiotic 정자 (라운드에서 haploid 분화를 겪는)를 포함하여 분화의 각 단계에서 세균 세포의 혼합물을 포함합니다 정자를 길쭉하게 하고, 마침내 정자를 성숙시게 한다). 고환의 체세포는 유월성 관 안쪽에 세균 세포와 섞여 있는 Sertoli 세포, 관의 벽을 형성하는 경막 하 근체 세포, 및 tubules 사이 간질 공간에 있는 테스토스테론 생산 Leydig 세포를 포함합니다.
정자 발생 동안 분자 및 생화학 적 과정을 연구하는 것은 종종 고환 세포의 복잡한 혼합물에서 별개의 생식 세포 집단의 분리를 필요로한다. 세포 농축을 위해 많은 다른 전략이 개발되었습니다. 가장 성공적인 방법은 단위중력에의해 STA-PUT 속도 침전3,4,5,6,역류 원심 분리7,8에따라 원심 용해, DNA 함량 및/또는 특정 마커에 따라 세포를 분리하는 형광 활성화 세포 선별(FACS). 이 방법은 정자 발생 연구원 중 일반적으로 사용되 고 특정 생식 세포 유형의 효율적인 농축을 허용. 그러나 이러한 기술의 한계는 전문지식이 필요한 고가의 특수 하드웨어가 필요하다는 것입니다.
여기에 제시된 마우스 고환의 3개의 가장 풍부한 세포 인구의 풍부하게 한 인구를 격리하는 간단하고 저렴한 프로토콜입니다: 둥근 정자, pachytene 정자 세포, 및 길쭉한 정자. 이 프로토콜은 둥근 정자를 풍부하게 하는 데 특히 잘 작동하기 때문에 둥근 정자 (MDR)에 대한 수정 된 밀도 구배로 불립니다. MDR 방법은 STA-PUT 속도 침전과 동일한 원리를 기반으로하지만 표준 실험실 장비만 필요합니다. 살아있는 세포는 지구의 중력장 하에서 표준 50 mL 튜브 내부의 수동으로 제조 된 불연속 혈청 알부민 (BSA) 밀도 그라데이션을 통해 퇴적할 수 있습니다. 더 큰 세포는 배아 세포의 다른 인구를 분리하는 그라데이션을 통해 더 빨리 움직입니다. 침전 후, 세 가지 세포 유형의 농축 분획이 수동으로 수집됩니다. 이러한 농축 된 세포 집단의 순도는 STA-PUT 및 원심 용활화에 의해 수득 된 것과 비교된다.
속도 침전을 위한 BSA 그라데이션의 구성 및 사용을 덮는 것 외에도, 프로토콜은 또한 반분엽 관에서 고환 세포를 방출하는 소화 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 Romrell et al.9에 의해 개발된 것으로부터 수정되었으며 콜라게나아제 IV 및 트립신을 함유한 순차적 소화를 포함한다. 중탄산염 완충제(즉, 크렙스 용액)의 사용과 결합된 순차적 소화는 배아 세포의 분리 및 생존능력을 크게 향상시키는 것으로나타났다(9)
MDR 농축 동안, 세포는 반분부 관의 환경 밖에서 함께 약 4 시간을 보내고 하류 분석을위한 매우 실행 가능한 세포 분획의 수집을 허용하는 스트레스가 많은 기계적 힘을 받지 않습니다. 또한, 원심 용해 및 STA-PUT과 유사하게, MDR 프로토콜은 세포의 어떠한 화학적 처리 또는 라벨링을 필요로 하지 않으며, 이는 또한 그들의 생존가능성을 유지하는 데 도움이 된다. 중요한 것은, 2개의 성인 마우스 고환이 MDR 격리를 위해 충분하고 그러므로, 1개의 성인 마우스는 RNA와 단백질 분석 둘 다를 위한 충분한 농축된 세포를 제공합니다. 표준 STA-PUT 프로토콜은 세포 격리를 위해 12명의 성인 마우스를 사용하는 것을권장합니다 6; 비록, 이전 경험에 따라, 그것은 성공적인 격리 3 ~ 4 성인 쥐에서 수행 될 수 있는 것으로 알려져 있다. 원심용해수기에 충분하다고 보고된 최저 자극물질은 6개의 마우스 고환(3마우스)이다8. 따라서 MDR 프로토콜은 고가의 특수 장비에 대한 필요성을 제거하는 것 외에도 필요한 실험실 동물의 수를 줄입니다.
Protocol
실험실 마우스및 모든 실험의 유지관리는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.
1. 장비 및 시약 설정
- 수조를 37°C로 설정합니다.
- 세포 배양 인큐베이터를 34°C, 5%CO2,95% 습도로 설정합니다. 튜브 회전자를 인큐베이터 내부에 넣습니다.
참고: 인큐베이터는 내부 온도를 변경하는 데 오랜 시간이 필요합니다. 34°C에서 지속적으로 설정된 인큐베이터를 사용할 수 없는 경우, 실험 1일 전에 인큐베이터를 설정합니다. - 적절한 양의 현미경 유리 슬라이드를 준비하고 라벨을 붙입니다. 그리스 펜으로 직경 ~1cm의 링을 그린 후 그리스를 건조시고 말립니다.
- 1x 크렙스 버퍼, pH 7.8을 준비합니다(표1). 1x 크렙의 50 mL의 원추형 튜브 2개를 34°C로 넣고 2.5-2.8단계를 위해 미리 데우십시오. 나머지 1x 크렙스를 4°C 또는 얼음 위에 보관하십시오.
- BSA 솔루션을 준비합니다. 먼저 25 mL의 10 % (w / v) BSA 용액을 1 x Krebs 버퍼에서 2.5 g의 BSA를 25 mL의 최종 부피에 용해시킴으로써 준비합니다. 10% BSA 용액을 1x 크레브 완충액으로 희석하여 다른 BSA 농도를얻었다(표 2). 모든 BSA 솔루션을 4°C로 유지하십시오.
참고: 시술 당일 용액을 준비하고 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오. - 50 mL 원추형 튜브에 트립신과 콜라게나아제의 정확한 양을 칭량하여 소화 효소를 준비한다(표3).
2. 동물 해부 및 세균 세포 현탁액의 준비
참고: 완료하는 데 약 1시간이 걸립니다.
- 자궁 경부 탈구 또는CO2 질식을 통해 성인 남성 마우스 (7 주 이상, 균주와 나이에 따라 80-120 mg의 무게)를 희생하십시오.
- 마우스의 복부 복부에 70 % 에탄올을 뿌린다. 가위를 사용하여 복부 골반 구멍을 열고 V 자 형 개구부를 만듭니다.
- 집게와 부고 환부 지방 패드에 당겨, 고환을 찾아 가위로 제거. 튜니카 알부기네아를 방해하지 마십시오. 고환을 1x 크렙스가 들어있는 6cm 페트리 접시에 놓습니다.
- 고환을 캡슐화하고 튜니카 알부기네아를 버립니다. 유임으로 부드럽게 따로 따로 괴롭히는 하여 반분면 튜브를 약간 분산시면 됩니다.
- 포셉을 사용하여 반분세관을 50 mL의 원추형 튜브로 옮기고 2 mL의 갓 제조된 콜라게나아제 용액을 함유한다(표3).
- 37°C 수조에서 3분간 튜브를 배양합니다.
참고: 자유롭게 부동 관은 간질 세포의 제거로 인해 3 분 이내에 발생해야합니다. 고환 세포의 생리적 온도는 34°C; 따라서, 긴 소화는 일반적으로이 온도에서 이루어집니다. 그러나, 짧은 3 분 소화는 37 °C (제조 업체에 의해 권장 온도)에서 수행 될 수있다. 34°C를 사용하는 경우 소화 시간을 다시 최적화해야 합니다. - 따뜻한 1x 크렙스의 적어도 40 mL를 추가하고 실온 (RT)에서 침전물 (~ 1 분)에 튜브를 허용합니다. 상급체를 제거하고 1x를 반복합니다.
- 갓 준비된 트립신 용액 25mL(표 3)을넣고 튜브를 34°C 인큐베이터 내부에 놓고 15-20분(~15rpm)동안 배양합니다. 산발적으로 튜블의 상태를 확인합니다. 용액이 흐리고 작은 튜브 조각만 남아 있으면 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 다음 단계로 진행하십시오.
참고: 과소화와 세포 용해를 피하려면 다음 세척 단계로 신속하게 이동하십시오. 일부 프로토콜은 태아 소 혈청 (FBS)에 의해 트립신의 비활성화를 포함한다. 이 프로토콜에서, FBS 치료는 생략되고, 대신, 트립신은 즉각적인 원심분리 및 차가운 1x 크레브로 후속 세차함으로써 제거된다. - 40 μm 셀 스트레이너를 통해 용액을 얼음 위에 있는 새로운 50 mL 원엽 튜브로 필터링합니다.
- 원심분리기 600 x g에서 4°C에서 5분 동안 펠렛 세포를.
참고: 힘이 너무 강한 원심 분리는 세포에 해를 끼칠 수 있습니다. - 조심스럽게 부어 서상한을 제거하십시오.
- 1 x Krebs의 나머지에 있는 세포를 다시 중단하는 세포 펠릿을 누릅니다.
- 적어도 40 mL의 차가운 1 x Krebs를 다시 일시 중단 된 세포에 추가하십시오.
- 2.10 단계와 2.11단계를 반복합니다.
- 셀 펠릿으로 튜브를 탭하여 세포를 다시 일시 중단합니다. 1 x Krebs에 0.5 % BSA의 1 mL을 추가하고 절단 피펫 팁으로 용액을 위아래로 파이펫팅하여 셀을 다시 일시 중단하십시오. 거품을 만들지 마십시오.
- 마지막으로, 최종 부피가 ~ ~ 3 mL되도록 1 x Krebs에 0.5 % BSA의 1-3 mL을 추가합니다. 40 μm 세포 스트레이너를 통해 배아 세포 현탁액을 여과하고 BSA 구배상에서 세포를 즉시 로딩하도록 진행한다.
3. 불연속 BSA 그라데이션을 통해 생식 세포의 분리
참고: 이 섹션을 완료하는 데 약 2시간이 걸립니다. 전처리가 준비되는 즉시 셀을 로드하기 위해 세척 단계(단계 2.10−2.14)동안 불연속 BSA 그라데이션을 준비하기 시작합니다.
- 튜브의 한쪽면을 볼 수 있도록 얼음에 수직으로 50 mL 튜브를 수용하십시오. 또는 4°C의 차가운 방에서 프로토콜을 실행하여 얼음이 필요하지 않습니다.
- 더 큰 조리개를 얻기 위해 팁에서 약 5-10mm의 10 mL 혈청 학적 파이펫의 끝을 잘라(그림 1A),파이펫 컨트롤러에 장착(그림 1C).
참고: 이렇게 하면 파이펫팅 중에 속도가 감소하여 다른 BSA 솔루션의 적층이 용이합니다. 또는 부드러운 피스톤이 있는 1mL 기계식 파이펫을 사용하고 직경 약 3mm의 조리개로 파이펫 팁을 잘라냅니다(그림1B). - 50 mL 튜브의 바닥에 5 % BSA 용액의 5 mL을 파이펫팅하여 시작합니다.
- 천천히 5 % 솔루션의 상단에 4 % BSA 솔루션의 5 mL을 피펫. 파이펫의 절단 팁으로 5% 용액의 표면에 부드럽게 닿은 다음 두 솔루션을 겹쳐서 표면과의 접촉을 신중하게 유지하면서 파이펫 팁이 침지되지 않도록 합니다.
참고: 이 단계의 끝에 있는 두 레이어 사이에 명확한 선이 표시되어야 합니다. - 다른 BSA 솔루션과 함께 3.4 단계를 반복하여 5%에서 최대 1%까지의 불연속 그라데이션을 얻을 수있습니다(도 1D).
- 단셀 서스펜션을 방해 하지 않고 그라데이션 위에 조심스럽게 로드합니다. 세포가 4°C 또는 얼음상에서 1.5시간 동안 그라데이션을 통해 침전하게 한다.
4. 농축 된 생식 세포 분획의 수집
참고: 이 섹션을 완료하는 데 약 30분이 걸립니다.
- 1 mL 파이펫 팁을 1 mL 기계식 파이펫에 장착하고 조리개가 직경 ~ 3mm가되도록 팁을 잘라냅니다(그림 1B).
- 조심스럽게 BSA 그라데이션의 상단에서 시작, 별도의 1.5 mL 튜브에서 ~ 1 mL 분획을 수집하고 얼음에 저장합니다. 분수와 동일한 순서로 튜브번호를 수집합니다.
참고: 이 시점에서, 세포 현탁액을 포함하는 ~28 개의 튜브의 시리즈가 있어야합니다. 매끄러운 피스톤이 있는 1mL 기계식 파이펫을 사용하고 피펫 팁을 잘라 BSA 그라데이션을 방해할 위험을 최소화합니다. - 4°C에서 10분 동안 600 x g에서 배아 세포 분획을 원심분리기.
- 펠릿을 방해하지 않도록주의, 상류물의 대부분을 폐기하고 튜브를 가볍게하여 세포 펠릿을 다시 중단. 각 튜브에 얼음차가운 1x 크렙스 버퍼 1 mL을 넣고 원심분리를 반복합니다.
참고: BSA가 다운스트림 분석을 방해하는 경우 세척 단계를 반복합니다. - 상한자의 대부분을 폐기하지만 최종 세척 후 ~ 100 μL을 둡니다. 세포 펠릿을 조심스럽게 다시 놓습니다.
참고: 셀을 다시 일시 중단하면 이 솔루션에서 가져온 샘플이 지정된 분획의 모든 셀을 나타내는지 확인합니다. 슬라이드를 준비하는 동안 얼음에 셀 현탁액을 유지합니다.
5. 세포 분획 분석
참고: 분석을 완료하는 데 2시간이 걸립니다.
- 한 번에 하나씩, 번호가 매겨진 현미경 슬라이드상에 각 그리스 펜 링 내부에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 파이펫 20 μL.
- 즉시 해당 분획으로부터 재중단된 셀 현탁액의 2 μL을 추가한다. 각 분수에 대해 반복합니다.
참고: 슬라이드를 준비하는 동안 모든 셀 현탁액을 얼음 위에 두십시오. - RT에서 1시간에서 1박(O/N)으로 슬라이드를 건조시면 됩니다.
참고: 이 단계에서, 각 분획으로부터 샘플을 채취한 후, 셀들은 다운스트림 분석 또는 저장을 위해 처리될 수 있다(섹션 6). - 슬라이드를 1x PBS로 한 번 헹구고 장착 매체에 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(재료 표)로장착하십시오.
- 형광 현미경의 슬라이드를 분석하여 각 분획에서 어떤 특정 생식 세포 유형이 풍부해지는지 추정합니다.
참고: 다른 세포 유형은 DAPI 염색에 의해 시각화 된 그들의 특징적인 핵 형태에 의해 인식 될 수있다. 그림 2 A는 길쭉한 정자, 둥근 정자 및 파키텐 정자 세포에서 풍요로운 대표적인 분수를 보여줍니다. 둥근 정자 핵은 작은 (직경 6-7 μm) 및 둥근(그림 2A). 마우스 둥근 정자 핵은 또한 염색체센터에게 불린 단 하나, 둥근 이종으로마틴 구조물에 의해 특징입니다. 길쭉한 정자의 핵은 염색질 응축으로 인한 전형적인 길쭉한 모양과 감소된 핵 크기를갖는다(그림 2A). 파키텐 정자 핵은 훨씬 더 크고 (직경이 10 μm 이상) 모양이 더 불규칙하며, 조밀하게 포장 된 염색질 영역이 전체에 분포합니다(그림 2A). -
필요한 경우, 상이한 세포 유형의 인식을 지원하기 위해 DAPI 염색 이외에 면역 염색을 수행한다.
- 이 경우, 그리스 펜 링 내부에 2 μL의 세포 현탁액을 20 μL의 고정 액액(4% PFA 및 PBS에서 0.1% nonionic 계면활성제)으로 확산시켰다. 슬라이드를 건조 한 후 RT에서 10 분 동안 4 % PFA로 세포를 접두사로 고정하십시오.
- PBS로 헹구고, PBS에서 0.1% 난오계면활성제로 5분 동안 농어계면활성제를 5분 동안 헹구고, 100 mM NH4Cl에서 슬라이드를 5분 동안 인큐베이팅하여 남은 PFA를 비활성화한다.
- PBS로 헹구고 특정 1차 항체 및 불소 표지된 이차 항체를 가진 차단 및 배양으로 구성된 표준 면역형광 프로토콜로 진행한다. DAPI(재료표)가있는 안티페이드 마운트로 슬라이드를 장착하고 24시간 동안 설정할 수 있습니다.
참고: 1 차적인 항체 배양을 위한 유용한 마커의 보기는 단단 을 고가의 정액에 있는 곡체를 얼룩지게 하는 땅콩 agglutinin (PNA; 1:2,000 차단 해결책에 있는) 포함합니다, 반대로 DDX4 항체 (차단 해결책에 있는 1:200) 단일 표지 둥근 정자의 세포질 과립, 및 안티 γH2AX 항체 (차단 용액에서 1 :100) 파시텐 정자 세포에서 섹스 시체를 인식. 분획의 면역형광 분석의 대표적인 결과 및 도 2C,D를 참조하십시오.
6. 저장을 위한 나머지 견본 처리
참고: 섹션 6을 완료하는 데 약 20분이 걸립니다.
- 현미경 슬라이드를 위해 각 분획에서 샘플을 채취하면, 각 분획에 얼음 차가운 1x Krebs 1 mL을 추가하고 4 °C에서 10 분 동안 600-13,000 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
참고: 저속 원심분리는 느슨한 펠릿을 생성하여 1 x Krebs를 완전히 제거하기가 어렵고 고속 원심 분리는 세포에 해를 끼칠 수 있습니다. 다운스트림 프로토콜의 특정 요구 사항에 따라 원심 분리 속도를 선택합니다. - 상급체를 제거하고 폐기하고 선호하는 다운스트림 분석을 계속합니다.
참고: 이 시점에서, 세포는 액체 질소에서 스냅 냉동 및 -70°C에서 저장될 수 있다. 이 기술에 익숙해지면 기본 설정의 다운스트림 프로토콜을 직접 계속할 수 있지만 항상 샘플을 채취하고 각 분획의 순도를 확인하는 것이 좋습니다. 총 RNA는 역전사 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 RNA 시퀀싱과 같은 방법에 의해 추출, 정량화 및 분석될 수 있다. 총 단백질 추출물은 또한 면역 침전 또는 서양 블로팅 분석을 수행할 수 있는 준비될 수있다(도 3).
Representative Results
생식 세포 유형의 충분한 농축은 일반적으로 80 %6이상으로 간주됩니다. MDR 프로토콜은 둥근 정자를 풍부하게 하기 위해 특히 잘 작동합니다. >90% 순수한 둥근 정자의 높은 수는 이 기술을 사용하여 일상적으로 얻을 수 있습니다. 파키텐 정자 세포의 최적 분획과 길쭉한 정자는 각각 ~ 75 % 및 ~ 80 %로 풍부합니다. 길쭉한 정자는 그라데이션의 상단에 머무르는 경향이 있고 첫번째 분획으로 집합됩니다. 도시된 예에서, 분획 1은 길쭉한 정자의 ~80%를 함유하였다(도2B). 이 기술로 얻은 대부분의 길쭉한 정자는 핵을 응축한 반면, 비 응축된 초기 길쭉한 정자는 부족합니다(그림 2A). 다음 분수에는 농축 된 둥근 정자가 포함되어 있습니다. 실시예에서, 둥근 정자의 농축은 분획 2, 3 및 4에서 90% 이상이었고, 80% 이상의 농축은 7분획(2−8)에서 전부보였다(도 2B). 그들의 큰 크기 때문에, 파키텐 정자 퇴적물 빨리 및 마지막 수집됩니다. 정제 예에서, 농축은 분획 14 및 15에서 약 75%였다(도2B).
DAPI 염색에 의해 시각화된 핵 형태는 일반적으로 세포 인식을 위해 충분하지만, 면역형광 분석은 분석을 지원하기 위해 수행될 수 있다. PNA는 둥글고 길쭉한 정자의 개발 곡예를 더럽히고, 곡예 외관은 더 분화 1-8 단계로 둥근 정자를 분류하기 위하여 이용될 수 있습니다10. PNA 염색 된 길쭉한 길쭉한 및 둥근 정자를 구별하는 것은 핵 모양의 차이에 의존합니다(그림 2C, 왼쪽 패널). 반대로 DDX4 항체는 각 둥근 정자의 세포질에서 단일 DDX4 양성 회엽, 크로마토이드 체(CB)를 시각화하기 때문에 둥근 정자 분획에 유용한 마커이다. 이러한 CB 특이적 염색은 정자세포에서 보다 광범위하게 분포된 세포질 염색과 구별하기쉽다(도 2C,중간 패널). 파시텐 정자세포는 제1 메오스틱 분열의 파시텐 단계에서 특이하게 나타나는 핵성 체체를 표지하는 항γH2AX 항체에 의해 인식될 수있다(도 2C,우측 패널). 이 정화에서, PNA 염색은 MDR 농축 둥근 정자 분획이 분화의 다양한 단계에서 둥근 정자의 혼합물을 포함 밝혀, 모두 자신의 서명 구조를 포함, DDX4 양성 CB(그림 2D, RS 분수). 항γH2AX는 분획 16에서 농축 파시텐 정자 세포(도2D,PSpc 분획)를 더욱 검증하였다.
세포 계산은 둥근 정자 및 파키틴 정자 세포 분수에 있는 세포의 수가 각종 다운스트림 분석을 위해 적정하다는 것을 밝혔습니다. 둥근 정자 분획 (5−8) 각각 약 2.5 x 106 세포를 포함. 따라서, 이들 분획을 풀링함으로써, 1,000만 개 이상의 세포를 얻을 수 있다. 파키텐 정자 세포 분획 (14 및 15)은 일반적으로 다소 적은 세포를 포함했다. 이러한 격리에서, 분획당 약 1.5-2.0 x 106셀을 계수하였다. 첫 번째 분획은 0.75 x 106 길쭉한 정자를 포함했다.
도 3A에도시된 바와 같이, 대부분의 분획으로부터 수득된 총 RNA 양은 0.5-2.5 μg에서 원거리이며, 이는 역전사 PCR, RNA 시퀀싱 또는 RNA를 겔상에서 시각화하는 것과 같은 다운스트림 RNA 분석에 충분하다. 각 분획에서 얻어진 단백질의 양은 전형적으로 20-140 μg(그림 3B)에서구역 수색합니다, 이는 몇몇 서쪽 얼룩을 위해 충분합니다. 전체 세포 용해액은 수집된 분획으로부터 제조되었고, 서쪽 얼룩 분석은 DDX4, PIWIL1 및 PIWIL2를 검출하는 항체를 사용하여 수행되었으며, 이는 모두 유비쿼터스로 뿐만 아니라 파키텐 정자 세포및 둥근 정자에서 고도로 발현된다. 발현 된 글리세랄데히드 3-인산 탈수소 효소 (GAPDH).
본 프로토콜에서, 단일 분획으로부터 유래된 단백질 의 10%는 표준 웨스턴 블롯 설정상에서 이들 모든 단백질을 명확하게 검출하기에 충분하였다(도3C). 1분획에서 단백질의 양은 또한 PIWIL1에 대한 항체를 사용하여 면역 침전을 위한 충분한 것으로 나타났으며, 뿐만 아니라 공동 면역침전된 PIWIL2의 검출을위해(도 3D). 더욱이, 이 프로토콜은 정량적 역전사 PCR 11과 같은 하류 응용을 위한 통제 및 유전자 변형 마우스에서 파키텐 정자 세포 및 둥근 정자의 농축된 분획을 얻기 위하여 성공적으로 이용되었습니다 및 높은 처리량 RNA 시퀀싱12.
그림 1: 불연속 BSA 그라데이션의 준비. (A)그라데이션 의 준비를위한 5 mL 혈청 학적 파이펫 팁. (B)침전 후 배아 세포 분획의 그라데이션 및 수집의 제조를 위한 1 mL 파이펫 팁. (C)그라데이션 준비에 필요한 장비. (D)불연속 BSA 밀도 그라데이션의 측면 도면은 5%(하단)에서 1%(상부) BSA 용액; 2% 및 4% BSA 솔루션은 더 나은 시각화를 위해 파란색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 수집된 세포 분획및 농축 분석의 대표적인 이미지. (A)DAPI 염색 된 고환 세포. 상부 행은 PFA 고정, 파라핀 내장 고환 절편 (왼쪽) 또는 현탁액 (오른쪽)의 손상되지 않은 반월상피에 고환 세포를 보여줍니다. 더 낮은 행은 농축 된 길쭉한 정자 (ES), 둥근 정자 (RS) 또는 파키텐 정자 세포 (PSpc)의 분율을 보여줍니다. 배율 막대 = 위쪽 행의 경우 20 μm, 하부 행의 인세트의 경우 10 μm입니다. (B)각 분획에서 상이한 생식 세포 유형의 상대적 정량화. 셀은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수동으로 계수되었고 RS, ES, PSpc, Sertoli 세포 및 기타 세포로 분류되었습니다. 그라데이션의 분수 수와 각각의 BSA 백분율은 x축에 표시됩니다. (C)고환 세포의 면역 형광 분석. 왼쪽 패널: 로다민 라벨PNA는 ES(노란색 화살표)와 RS(흰색 화살표)에서 곡어를 더럽힌다. 중간 패널: DDX4 항체는 RS에서 단일 회핵 과립을 염색하며, 이는 정자 세포(파란색 화살표)에서 보다 확산되는 세포질 신호와 구별하기 쉽습니다. ES(주황색 화살표)에서 DDX4 신호가 감지되지 않습니다. 오른쪽 패널: γH2AX 항체는 파시텐 정자 세포(γH2AX-음성 세포는 백색 별표에 의해 표시된)에서만 존재하는 특징적인 핵 성체체를 인식한다. 스케일 바 = 10 μm.(D)MDR 농축 된 세포 분획은 PNA (RS 분획), 안티 DDX4 (RS 분획) 및 안티 γH2AX (PSpc 분획)로 표지되어 각 분획에서 세포 농축을 더욱 검증하였다. 배율 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MDR 셀 농축 후 다운스트림 분석. (A)RNA는 대표적인 MDR 세포 농축 후 각 분획으로부터 추출하고 정량화하였다. 그라데이션의 분수 수와 각각의 BSA 백분율은 x축에 표시됩니다. (b)단백질을 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액에서 세포 펠릿을 포량화한 후 정량화하여 각 분획으로부터 단백질을 추출하였다. (C)전체 세포 단백질 추출물을 DDX4, PIWIL1, PIWIL2 및 GAPDH에 대한 항체를 사용하여 서쪽 블로팅에 의해 제조 및 분석하였다. 10%의 포액을 각각 의한 분획으로부터 적재하였다. (D)면역침전은 항-PIWIL1 및 항-PIWIL2 항체를 이용한 서방 블로팅이어서 항PIWIL1을 이용한 지시된 분획으로부터 수행되었다. 입력 샘플은 상이한 분획으로부터 의 단백질 용해물의 혼합물을 포함하고, 토끼 IgG를 이용한 제어 면역침전(IP)은 또한 혼합 용해물로부터 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 각 단계를 완료하는 데 필요한 MDR 프로토콜 및 시간의 회로도 표현. 시작 물질은 성인 마우스로부터의 두 개의 고환으로 구성된다. 세포의 평균 수와 하나의 분획으로부터 수득된 RNA 및 단백질의 양이 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 | 시약 | 준비 | 보관소 |
| 크렙스 버퍼(10x) | 3.26 g KH2PO4 | H2O, 필터 0.22 μm 및 오토클레이브로 2L로 가져옵니다. | 몇 개월 동안 4 °C에서 보관 할 수 있습니다. |
| 나클 139.5 g | |||
| 5.89 g MgSO4•7H2O | |||
| 덱스트로스 50 g | |||
| 3.78 g CaCl2•2H2O | |||
| 7.12 g KCl | |||
| 크렙스 버퍼 (1x) | 4.24 g NaHCO3 | NaHCO3 ~100 mL의H2O를 용해시키고, 10x 크렙스 버퍼의 200 mL을 추가하고,H2O로 2L로 가져온다. | 신선하게 준비하려면 |
| 200 mL 10x 크렙스 버퍼 |
표 1: 크렙스 버퍼의 준비.
| BSA 농도 (v 와) | 10% BSA 솔루션 | 1x 크렙스 버퍼 |
| 0.50% | 0.5 mL | 9.5 mL |
| 1% | 1 mL | 9mL |
| 2% | 2 mL | 8mL |
| 3% | 3 mL | 7 mL |
| 4% | 4 mL | 6 mL |
| 5% | 5 mL | 5 mL |
표 2: BSA 솔루션의 준비.
| 소화 용액 | 작업 집중력 | 시약 | 준비 |
| 콜라게나아제 | 1 mg/mL | 콜라게나아제 IV | 콜라게나아제 IV 2 mg을 50 mL 원추형 튜브에 넣고 소화 직전에 따뜻한 1x 크렙스 완충액 2 mL을 추가합니다(단계 2.3). |
| 트립신 (것)과 같은 | 0.6 mg/mL | 트립신 (것)과 같은 | 무게 15 50 mL 원추형 튜브에 트립신의 mg, 따뜻한 1 x KREBS 버퍼의 25 mL와 DNase I의 40 μL을 추가 (단계 2.6). |
| >3.2 쿠/mL | DNase I |
표 3: 소화 효소의 준비.
Discussion
여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비를 사용하여 둥근 정자, 파키텐 정자 세포 및 길쭉한 정자의 농축 인구를 격리하는 간단하고 저렴한 프로토콜입니다(그림 4에표시된 프로토콜 개요). 전문 지식이나 고가의 기계류가 필요하지 않지만 조직 소화, 그라데이션 구성 및 구배에 세포 현탁액을 로딩하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
생식 세포는 2개의 연속적인 효소 소화에 의해 반분면 관에서 풀어 놓입니다. 콜라게나아제 IV를 함유한 첫 번째 소화는 간질 세포를 제거하여 반분부 관을 분리합니다. 장기간 된 소화 시간 수 있습니다 tubules 손상 하 고 정자의 손실로 이어질 수 있습니다., 로 (이 단계 동안 tubules에서 해제 하는 경우) 그들은 다음 단계에서 폐기 될 것 이다. 트립신을 가진 두 번째 소화 단계는 반분 회 에서 생식 세포를 풀어 놓습니다. 때때로 세포 포해가 있을 수 있고 전형적으로 몇몇 덩어리 는 풀어 놓인 게놈 DNA 때문에 양식합니다. 소화의 제안된 기간 또는 온도를 초과하는 것은, 이것은 나쁜 생존력, 증가한 세포 용해 및 응집으로 이끌어 낼 수 있기 때문에, 조언되지 않습니다. 온화한 응집이 발생하는 경우, 덩어리를 무시할 수 있습니다. 그러나, 상당한 응집 및 세포의 손실의 경우, 트립신 소화 시간 또는 농도 감소 한다. 또한 트립신의 효소 활성 배치 와 저장의 장기간 된 시간 동안 다를 수 있습니다 주목 해야 한다. 트립신 소화 시 DNase I의 양은 또한 과잉 덩어리를 제거하기 위해 증가 될 수있다, 그러나 이것은 보조 솔루션으로 간주되어야한다. 응집된 세포가 더 빨리 침전되어 분획을 오염시키고 그라데이션을 방해하기 때문에 전처리가 끝날 때 균일 한 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 중요합니다.
그라데이션을 작성하려면 몇 가지 연습이 필요할 수 있습니다. 파이펫 컨트롤러가 있는 5mL 파이펫 팁을 사용하는 데 불편함이 있는 경우, 매끄러운 피스톤이 있는 일반 1mL 기계식 파이펫을 사용한 다음 피펫 팁을 직경 ~3mm의 조리개로 잘라내는 것이좋습니다(그림 1B). BSA 솔루션의 더 넓은 조리개와 부드러운 로딩은 그라데이션혼합의 위험을 감소시게 됩니다. 제대로 준비되면 서로 다른 굴절 지수로 인해 인접한 BSA 솔루션 사이의 경계를 볼 수 있습니다. 그라데이션은 사용하기 전에 직접 생성해야 합니다. 또한 작은 흔들림이나 진동이 그라데이션을 방해할 수 있으므로 그라데이션이 방해받지 않는 환경에서 설정해야 합니다.
그라데이션에 셀 서스펜션의 로딩은 매우 신중하게 수행해야합니다. 로딩 후 셀 서스펜션은 그라데이션 위에 유지되어야하며, 세포는 천천히 첫 번째 층을 통해 퇴적되기 시작합니다. 세포의 큰 그룹이 그라데이션을 통해 빠르게 움직이는 것을 볼 수 있는 경우에, 세포는 아마 주의깊게 중단되지 않았거나 과잉 응집이 있습니다. 세포가 로딩 시 불연속 BSA 그라데이션의 상단에 머무르지 않고 즉시 1% 및 2% BSA 층(단계 3.6) 사이에서 가라앉는 경우, 셀 서스펜션은 너무 조밀할 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 두 고환 (80-120 mg /testis)을 시작 재료로 사용하여 최적화되었습니다. 비록, 시작 재료의 감소 된 양을 사용하여 성공적인 격리가 수행되었습니다. 프로토콜을 업스케일링하고 고환의 높은 숫자에서 더 농축 된 생식 세포를 얻으려면 그라데이션이있는 50 mL 튜브를 더 도입해야합니다.
프로토콜은 처음에 개발 및 성인 마우스 고환에서 haploid 둥근 정자를 풍부하게하기 위해 최적화되었으며, 둥근 정자 분획의 순도는 90 % 이상이 될 것으로 예상된다. 매우 순수한 둥근 정자 분획 이외에, 파키틴 정자 세포의 농축과 길쭉한 정자의 농축에 대한 만족스러운 결과를 얻었다. 적혈구가 길쭉한 정자 분획을 오염시킬 수 있으며, 그들의 존재가 다운스트림 분석을 방해 할 것으로 예상되는 경우 이를 제거하기위한 추가 단계를 취해야한다는 점에 유의해야합니다. 우리는 MDR 프로토콜을 사용하여 성인 마우스에서 premeiotic 또는 초기 meiotic 세포 (파시텐 단계 이전)와 같은 그밖 세포 모형을 풍부하게 할 수 없었습니다.
또한, STA-PUT 침전은 성공적으로 출생 후 주어진 시점에서 수집 된 청소년 고환을 사용하여 정자 또는 preleptotene, 렙토텐, 및 zygotene 정자 세포의 풍부한 분획을 얻기 위해 사용되었습니다13. 이 접근은 정자 발생의 첫번째 파동 도중 이 세포 모형의 외관을 이용합니다. 동일한 접근 방식이 MDR 보강에 적용될 수 있지만 실제로는 아직 테스트되지 않았습니다. 분화의 특정 단계에서 premeiotic 및 meiotic 세포의 정제를 위한 좋은 선택권인 또 다른 방법은 존재 특정 마커에 근거를 둔 특정 세포 모형의 격리를 허용하는 중요한 이점이 있는 FACS입니다14 ,15,16,17.
전반적으로, MDR 속도 침전은 배아 세포 농축을 위한 유용한 방법역할을 한다. 이 방법은 농축 된 세포의 순도 또는 양면에서 다른 잘 확립 된 방법보다 우수하지 않지만 명확한 장점은 단순성과 낮은 설정 비용입니다. 이것은, 필요한 시작 물자의 낮은 양과 더불어, 이 프로토콜은 정자 발생 필드에 있는 연구원 및 그밖 필드에 있는 그(것)들에 있는 사람들을 위한 중대한 선택권을 렌더링합니다 전문화한 하드웨어 또는 동물의 큰 단에 투자하고 싶지 않을 지도 모릅니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 프로토콜의 개발 동안 자신의 기여에 대한 모든 Kotaja 실험실 회원에게 감사하고, 자신의 연구 프로젝트에서 프로토콜의 적극적인 사용및 테스트. 특히 우리는 프로토콜을 최적화하는 데 도움을 주어 Jan Lindström의 기여에 감사드립니다. 이 연구는 핀란드 아카데미, 시그리드 주셀리우스 재단, 그리고 분자 의학의 투르쿠 박사 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
| AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
| Dextrose | Preference of researcher | ||
| DNase I | Worthington | LS006355 | |
| GAPDH | HyTest | 5G4 | |
| HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
| HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
| KCl | Preference of researcher | ||
| KH2PO4 | Preference of researcher | ||
| MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
| NaCl | Preference of researcher | ||
| NaHCO3 | Preference of researcher | ||
| NH4Cl | Preference of researcher | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
| PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
| PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
| Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
| Rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
| Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
| TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
| Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
| γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| 0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1.5 mL or 2 mL tubes | Preference of researcher | ||
| 40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
| 5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
| Cell culture incubator | Preference of researcher | ||
| Centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
| Microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| Microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
| Refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Water bath | Preference of researcher | ||
| Widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |
References
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