Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Summary

Virkningerne af migrastatiske hæmmere på gliom cancer celle migration i tredimensionelle (3D) invasion assays ved hjælp af en Histon deacetylase (HDAC) hæmmer er karakteriseret ved høj opløsning Konfokal mikroskopi.

Abstract

Drug opdagelse og udvikling i kræftforskning er i stigende grad baseret på narkotika skærme i et 3D-format. Nye hæmmere, der er rettet mod kræftcellernes migrerende og invasive potentiale, og dermed den metastatiske sygdomsspredning, opdages og betragtes som supplerende behandlinger i stærkt invasive kræftformer såsom gliomer. Således er det nødvendigt at generere data, der muliggør detaljerede analyser af celler i et 3D-miljø efter tilsætning af et lægemiddel. Den beskrevne metode, der kombinerer sfæroide invasion assays med høj opløsning billedoptagelse og dataanalyse af confokal Laserscanning mikroskopi (clsm), aktiveret detaljeret karakterisering af virkningerne af den potentielle anti-migrerende hæmmer MI-192 på gliom-celler. Sfæroider blev genereret fra cellelinjer til invasion assays i lav overholder 96-brønd plader og derefter forberedt til CLSM analyse. Den beskrevne arbejdsgang blev foretrukket frem for andre almindeligt anvendte sfæoidskabende teknikker på grund af både lethed og reproducerbarhed. Dette, kombineret med den forbedrede billedopløsning opnået ved Konfokal mikroskopi sammenlignet med konventionelle bred-felt tilgange, tillod identifikation og analyse af særskilte morfologiske ændringer i migrerende celler i et 3D-miljø efter behandling med det migræstatiske lægemiddel MI-192.

Introduction

Tredimensionelle sfæriske teknologier til prækliniske lægemidler opdagelse og udvikling af potentielle kræftlægemidler er i stigende grad favoriseret over konventionelle stof skærme; således er der mere udvikling af migrastatic-migration og invasion forebyggelse-narkotika. Begrundelsen for denne udvikling i kræftbehandling er klar: 3D sfæroide assays repræsenterer en mere realistisk tilgang til screening potentielle anti-cancer stoffer, som de efterligner 3D tumor arkitektur mere trofast end celle enkeltlags kulturer, rekapitulere Drug-tumor interaktioner (kinetik) mere præcist, og tillade karakterisering af narkotika aktivitet i en tumor-relaterede indstilling. Hertil kommer, at stigningen i resistens over for kemo toksiske lægemidler i mange kræfttyper og høje dødelighed blandt kræftpatienter på grund af metastase potenseret af kræftcellernes evne til at migrere til fjerne tumor sites understøtter optagelsen af kemoterapeutika målretning af kræftcellernes migrations potentiale som adjuverende behandling i fremtidige kliniske kræft forsøg¹. Dette er især tilfældet i forbindelse med stærkt invasive kræftformer, såsom glioblastomi af høj kvalitet (GBM). GBM Management omfatter kirurgi, strålebehandling, og kemoterapi. Men selv med kombinationsbehandling, de fleste patienter tilbagefald inden for 1 år efter Initial diagnose med en Median overlevelse på 11-15 måneder^2,3. Store fremskridt inden for 3D-teknologi er blevet gjort i løbet af de sidste par år: roterende systemer, mikrofabrikerede strukturer og 3D stilladser, og andre individuelle assays løbende forbedres for at muliggøre rutinetest på en stor skala^{4, 5,6,7}. Resultaterne fra disse analyser skal dog analyseres på en meningsfuld måde, fordi data fortolkningen ofte hindres af forsøg på at analysere 3D-genererede data med 2D-billedanalyse systemer.

På trods af at være at foretrække med hensyn til billed erhvervelse hastighed og reduceret foto-toksicitet, de fleste Wide-felt systemer forbliver begrænset af resolution⁸. Således, bortset fra data læse-outs vedrørende Drug effekt, detaljerede virkninger af narkotika handling på 3D cellulære strukturer af migrerende celler er uundgåeligt tabt, hvis afbildet ved hjælp af et bredt felt system. Omvendt, confokal Laserscanning mikroskopi (CLSM) fanger høj kvalitet, optisk sektionerede billeder, der kan rekonstrueres og gengives i 3D efter erhvervelse ved hjælp af edb-software. Således, CLSM er let anvendelig på billeddannelse komplekse 3D cellulære strukturer, hvilket muliggør afhøring af virkningerne af anti-migrastatiske hæmmere på 3D-strukturer og dybtgående analyser af celle migration mekanismer. Dette vil utvivlsomt guide fremtidige migrastatisk narkotika udvikling. Her beskrives en kombineret arbejdsgang for sfætoid generering, narkotikabehandling, farvnings protokol og karakterisering af højopløsnings Konfokal mikroskopi.

Protocol

1. generering af celle Sfæroider

Dag 1

1. Forbered standard dyrkningsmediet som krævet af den cellelinje, der undersøges.
2. Udfør alle vævskultur-relaterede trin i en vævskultur hætte ved hjælp af sterile håndteringsteknikker.
3. Trypsinize og tælle kræftceller. Brug 20 mL cellesuspension pr. plade. Opbevar celle suspensionerne i tydeligt mærkede sterile Universal rør.
4. Tilføj et forudbestemt antal celler til hver brønd. Både det oprindelige antal celler og den ultimative sfæoidstørrelse afhænger af sprednings hastigheden for den cellelinje, der undersøges.
   Bemærk: For etablerede gliom cellelinjer såsom U251 og KNS42^9,10, 5 x 10³ celler/ml vil producere et mikroskopisk synligt sfæoid (200 eller 800 μm) efter 4 dages inkubation.
5. Resuspendere cellerne i Universal rør ved blid inversion for at undgå celle sammenklumpning. Der afpipetteres 200 μL af cellesuspensionen i hver brønd på en 96-brønd plade. Hvis alle brønde ikke er påkrævet, er det tilrådeligt at tilføje 200 μL 1x PBS til hver tomme brønd for at undgå fordampning.
6. Cellerne inkubates i en inkubator som normalt ved 37 °C.
   Bemærk: Cellelinjer såsom gliom Cancer cellelinjer vil danne sfæroider inden for 24 h. Tillad 3D cellulære arkitektur til form ved at inkubere sfæroide for 72 h.

Dag 2

7. Check celler ved lyse-felt mikroskopi efter 24 h. afhængigt af celle linjen, celler kan have dannet en sfæide detekterbare i bunden af brønden.
   Bemærk: Etablerede gliom Cancer cellelinjer let danner sfæroider inden for 24 h. patient-afledte gliom Cancer cellelinjer kan tage op til 1-2 uger.

2. kollagen invasion analyse

Dag 3

1. Placer kollagen, 5x kulturmedium, 1 M NaOH, og 1 20 mL rør på is.
2. Tilsæt forsigtigt og langsomt 10,4 mL kold kollagen til et kølet kulturrør. Undgå bobler. Denne mængde kollagen er nok til 1 96-brønd plade. Opskalering er muligt, men det anbefales, at 1 20 mL rør pr. plade fremstilles ad gangen.
3. Tilsæt forsigtigt 1,52 mL kold steril 5x kulturmedium. Undgå bobler.
4. Lige før brug tilsættes forsigtigt 72 μL kold steril 1 M NaOH. Hold opløsningen på isen.
5. Bland forsigtigt ved pipettering. Undgå bobler. Effektiv blanding fører til en farveændring (fra rød til orange-rød (pH 7,4) i mediet. Lad blandingen ligge på isen indtil brug.
6. Afgørende skridt: Fjern 190 μL supernatanten fra 96-brønd pladen tilberedt på dag 1. Vær meget omhyggelig med ikke at forstyrre de sfæroider, der dannes i bunden af brønden. Brug pipetten i en vinkel mod siden, ikke i midten, af brønden.
7. Tilsæt forsigtigt 100 μL af kollagen blandingen til hver brønd. For at undgå sfæide forstyrrelser skal du pipettere blandingen ned ad siden af brønden. Undgå bobler. Opbevar eventuelt resterende kollagenmix i 20 mL-røret ved stuetemperatur for at vurdere Polymeriseringen.
8. Inkubér pladen i ruge atoren i mindst 10 minutter for at gøre det muligt for kollagen at polymerisere. Som en retningslinje, hvis rester af kollagen har sat, bliver stof og svamp-lignende, sfæroider er klar til at blive behandlet med inhibitor.
9. Tilsæt stofferne eller inhibitorer ved 2x koncentration til dyrkningsmediet. Tilsæt mediet forsigtigt til hver brønd (100 μL pr. brønd). Igen, pipette mediet ned på siden af brønden for at undgå sfæide forstyrrelser.
10. Observere og billede hver sfæroide af lyse-felt mikroskopi til tider T = 0 h, 24 h, 48 h, og 72 h at vurdere narkotika aktivitet. Vend derefter pladen tilbage til inkubator.
    Bemærk: Afhængigt af celle linjens invasive opførsel kan der observeres migration væk fra den oprindelige sfæoidkerne fra 24 timer og fremefter.

3. fremstilling af kollagen indlejrede Sfæroider og migrerende celler til Konfokal mikroskopi

1. Anbring pladen i en vævskultur hætte, og fjern forsigtigt supernatanten (200 μL). Igen, passe på ikke at forstyrre sfæroide og undgå at røre kollagen, da dette kan forstyrre kollagen stikket.
2. Supernatanten udskiftes med 100 μL 1x PBS. Gentag dette vaske trin 3x.
3. Fjern den sidste vask og Udskift med 4% formaldehyd i 1x PBS (100 μL pr. brønd).
   Forsigtig: Formaldehyd er et potentielt carcinogen. Håndteres med omhu i overensstemmelse med retningslinjerne for sundhed og sikkerhed.
4. Placer 96-brønd pladen på en laboratorie bænk, dæk med folie, og lad den stå i 24 timer ved stuetemperatur.
5. Fjern forsigtigt formaldehyd og Udskift med 1x PBS. Gentag denne 1x PBS vask 3x.
6. Forbered 0,1% Triton X-100 i 1x PBS. Fjern 1x PBS vask og Udskift med 100 μL af Triton X-100 opløsningen. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur. I mellemtiden, forberede blokering løsning med 1x PBS og 0,05% skummetmælkspulver og blandes grundigt.
7. Fjern Triton X-100 og vask 3x med 1x PBS. Tilsæt 100 μL blokerende opløsning til hver brønd og Inkuber i 15 min.
8. Det påkrævede primære antistof fortyndes i blokerende buffer ved den forudberegnede koncentration. Her, brug anti-mus IgG acetyleret Tubulin antistof (1:100).
9. Den primære antistof blokerende buffer blanding centrifugeres i 5 min ved 15.682 x g. Fjern forsigtigt blokerings opløsningen, og tilsæt supernatanten (25 − 50 μL) til hver brønd. Inkuber i mørket ved stuetemperatur i 1 time.
10. Fjern antistof opløsningen og vask 3x med 1x PBS (100 μL pr. brønd).
11. Det sekundære antistof fortyndes i blokerings bufferen ved den anbefalede eller forudbestemte koncentration ud over yderligere fluorescerende pletter. Her skal du bruge 1:500 anti-mus fluorophore-488 konjugerede antistoffer, phalloidin-594 (1:500) til actin farvning, og DNA bejdsen (DAPI).
12. Igen centrifugeres den sekundære antistof opløsning i 5 minutter ved 13.000 rpm.
13. Fjern blokerings opløsningen fra hver brønd, og tilsæt 25 − 50 μL af det sekundære antistof/phalloidin/DAPI-mix. Inkuber i mørket i 1,5 h ved stuetemperatur.
14. Fjern sekundær antistof-farveopløsning og vask 3x med 1x PBS (100 μL pr. brønd).
15. Løft forsigtigt individuelle kollagenpropper ved at suge med en plastik pipette (200 μL) ind i midten af en højkvalitets almindelig glas rutsjebane.
16. Tilføj en dråbe af en egnet mountant til kollagen stikket, hvilket sikrer, at stikket er helt dækket. Undgå bobler.
17. Påfør dækglas af den optimale tykkelse for mikroskopet mål, der vil blive brugt til billeddannelse og tillade at sætte natten. Opbevar slides ved stuetemperatur i mørket.

4. Fluorescens mikroskopi

1. Optag fluorescerende billeder med et egnet Konfokal mikroskop.

Representative Results

Tredimensionel sfærisk teknologi fremmer forståelsen af lægemiddel tumor interaktioner, fordi det er mere repræsentativt for det kræftspecifikke miljø. Dannelse af sfæroider kan opnås på flere måder; lav vedhæftning 96-brønd plader blev brugt i denne protokol. Efter at have testet flere produkter fra forskellige producenter, blev pladerne, der blev brugt her, valgt, fordi de konsekvent klarede sig bedst i form af en vellykket sfæroide-produktion og ensartethed. Udskiftnings trinnet, hvor vækstmediet erstattes med kollagen-matrixen, er et vigtigt punkt i protokollen. der skal udvises stor omhu for at fjerne det meste af mediet uden at forstyrre sfæroide selv. Automatiseret billeddannelse til karakterisering af lægemiddelinducerede virkninger ved Wide-felt mikroskopi kan anses for at fjerne enhver handler bias, men i øjeblikket kommercielt tilgængelige instrumenter forbliver betydeligt dyrere end Imaging tilgange skitseret her.

Wide-felt epifluorescens mikroskopi giver mulighed for undersøgelse af effekten af narkotika aktivitet på celle migration og invasion. Men opløsningen opnået fra Wide-felt mikroskopi er ikke godt nok til at tillade en detaljeret fortolkning af resultaterne med hensyn til narkotika påvirkning på celle morfologi (figur 1). Her beskrives fremstillingen af gliom sfæroider og migrerende celler gennem let reproducerbare farvningsprotokoller, efterfulgt af billeddannelse ved hjælp af et Konfokal mikroskop. Fra den Wide-felt mikroskopi billedanalyse, det var indlysende, at forskellige morfologiske ændringer havde fundet sted i gliom celler efter behandling med mi-192 inhibitor, men klart definerede detaljer manglede. Konfokal mikroskopi bekræftede de første fund, og disse billeder med højere opløsning tillod vurderingen af virkningen af MI-192 endnu mere. Signifikante forskelle mellem ubehandlet (kontrol) sfæroider, migrerende celler (figur 2) og behandlede sfæroider og celler (figur 3) blev tydelige. Mens den voksne gliom cellelinje U251 syntes at migrere i ' spikes ', udstråler væk fra den oprindelige sfæokerne med enkeltceller afmontering, den pædiatriske cellelinje KNS42 vedtaget et ark-lignende migration mønster med få særskilte celle pigge. Tidligere, forskellige migrationsmønstre blandt forskellige cellelinjer (her den voksne gliom cellelinje U251 og den pædiatriske cellelinje KNS42) blev observeret, potentielt afspejler den celletype, de opstod fra og stedet for tumor isolation. Afgørende, en stigning af acetyleret Tubulin med stigende inhibitor koncentration (fra 0,1 − 10 μM) blev også afdækket, ikke kun i de migrerende celler, men også i spheroid-associerede celler. Dette var ikke tydeligt i den oprindelige Wide-felt mikroskopi erhvervede billeder. Yderligere billeddannelse vil også give mulighed for kvantitativ analyse af protein ekspressionsniveauer som et cellulært respons på behandling med migræstatiske hæmmere.

I denne undersøgelse, det blev påvist, at cellerne ændret morfologisk som reaktion på behandling; celle afrunding blev tydelig med stigende inhibitor koncentrationer og celledød ved den højeste inhibitor koncentration (10 μM), med nuklear fragmentering tydelig i U251 celler og kollapsede mikrotubuler og nuklear fragmentering i KNS42. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere observationer, at den anti-migrerende aktivitet af mi-192 på gliom cellelinjer er koncentrationsafhængig^13,14. Protokollens overordnede arbejdsgang er afbildet i figur 4.

Figur 1: spheroid Cell invasion i kollagen afbildet af Wide-felt mikroskopi. Repræsentative billeder af celle linjerne U251 og KNS42 vises efter behandling med inhibitorer MI-192 ved den anti-migrerende koncentration på 1 μM og med 24 timers intervaller. En kontrol sfæide uden behandling er også vist. Potentielle anti-eller promigrerende effekter registreres som fremhævet (pile). Dette er især mærkbar i KNS42 med tilsyneladende ingen migration i enten kontrol eller behandlede sfæroider. Alle billeder blev taget på 4X. Skala bar = 1.000 μm. Scale bar i forstørrede billeder til SF188 = 200 μm, KNS42 = 1.000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: effekten af den migrastatiske hæmmer mi-192 på gliom cellelinje U251 afsløret ved Konfokal mikroskopi. Faste og farvede gliom sfæroider og migrerende celler viser forskellige vandrende fænotyper. Migrerende celler tæt på de oprindelige sfæide kanter vises. U251 celle sfæroider er karakteriseret ved pigge udstråler væk fra den oprindelige sfæroide med stigende celle afrunding i celler tilsyneladende med stigende inhibitor koncentration (Arrow indikerer celle Spike). Skala bjælke = 10 μm. Labels: rød = actin, grøn = acetyleret Tubulin, blå = DAPI. For hvert billede, en enkelt repræsentativ optisk sektion blev fanget med alle indstillinger med både præ-og post-billede Capture vedligeholdes til komparative formål. Alle billeder blev efterfølgende behandlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: effekten af den migrastatiske hæmmer mi-192 på gliom-celle linjen KNS42 afsløret ved Konfokal mikroskopi. KNS42 migration er karakteriseret ved sheetlike fremspring med enkelt celle pigge (pil indikerer celle ark). Ved den laveste inhibitor koncentration synes denne fænotype at være udtalt, men er tabt med stigende inhibitor koncentration (skala bar = 10 μm); etiketter: rød = actin, grøn = acetyleret Tubulin, blå = DAPI. For hvert billede en enkelt repræsentativ optisk sektion blev fanget, med alle indstillinger med både præ-og post-billede Capture vedligeholdes til komparative formål. Alle billeder blev efterfølgende behandlet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: oversigt over arbejdsgange. Indarbejdet i denne arbejdsgang er den generation af sfæroider, indlejring i kollagen, Drug behandling, fastsættelse, farvning, og billeddannelse ved Konfokal mikroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

En ny måde at oprette kræft celle sfæroider til identifikation af migræt stof aktivitet ved hjælp af høj opløsning Konfokal mikroskopi er beskrevet. Brugen af lave vedhængende plader over andre teknikker, såsom hængende Drops¹⁵, har lettet et middel til at generere reproducerbare og ensartede sfæroider til brug i kollagen migration og invasion assays. De kritiske punkter i denne protokol er fjernelsen af vækstmediet fra 96-brønd pladen forud for celle sfæroide-indlejringen i en kollagen-matrix og omhyggelig håndtering af kollagen-stikkene, der indeholder sfæroider derefter. Nye teknologier såsom Digital microfluidics¹⁶ er nu tilgængelige og, selv om dyrere, kunne give et alternativ til manuel fjernelse af medier og væsker. Den vigtigste begrænsning af den beskrevne protokol er, at det er tidskrævende, når enkelt sfæroider er afbildet og derefter analyseres manuelt ved lyse felt mikroskopi for at vurdere inhibitor narkotika aktivitet. Desuden er de reagenser, der kræves til alle trin i processen er dyre, og specialiseret udstyr, nemlig en høj opløsning Konfokal mikroskop, er også påkrævet. Optimale cellenumre kræves for såning og den tid, det tager at opnå en celle sfæroide af den krævede størrelse også skal være forudbestemt forud for påbegyndelse af kollagen invasion assay.

Udviklingen af narkotika rettet mod kræftceller, storstilet Drug screening, og karakterisering af narkotika aktivitet for narkotika modifikation og forbedring i stigende grad er afhængige af 3D-celle analyser og teknologi. Denne protokol kan optimeres og tilpasses til brug med andre eksperimentelle assays og talrige andre celletyper af betydning i andre sygdoms systemer. Til dato, fortolkningen af data genereret mikroskopisk er blevet hæmmet af anvendelsen af Wide-felt mikroskopi, med billeder erhvervet tilbyder begrænset opløsning og plaget med iboende billedsløring som følge af lys med oprindelse uden for brændplanet. Den Wide-felt mikroskopi billeder vist her blev erhvervet manuelt ved hjælp af en EVOS Imaging system, en proces, der var tidskrævende og potentielt kunne introducere handler bias. Nye teknologier, herunder automatiserede arbejdsstationer og analyseplatforme^17,18, er nu tilgængelige, men forbliver dyre og er derfor stadig ikke tilgængelige for mange forskningslaboratorier. Desuden kan yderligere softwareudvikling støtte i analysen af højopløselige 3D-afsmeltet billeder til præcist at kvantificere fænotypiske ændringer som dem, der er noteret her, og derfor effekten af inhibitorer på celle migration. Desuden vil anvendelsen af super-resolution fluorescerende billedbehandlings teknikker, der i stigende grad bliver standard i mange forskningslaboratorier, give yderligere indsigt i migrationen adfærd og morfologi af celler dyrket i 3D sfæide og behandlet med inhibitor præparater.

Det blev fastslået, at det er muligt at fastsætte og plette sfæroider efter behandling med en migræstatisk hæmmer, når det er indlejret i kollagen. Denne metode var let at udføre, med alle trin afsluttet i 96-brønd plader, efterfulgt af montering af kollagen propper indeholdende sfæroider på dæksedler til billeddannelse. Ved vurderingen af effekten af inhibitor aktivitet på cancer celle morfologi blev Konfokal mikroskopi anvendt til at belyse lægemiddel aktiviteten. De første resultater af anti-migrations effekten af inhibitor MI-192 fra billeder med lav opløsning blev bekræftet af højopløsnings Konfokal mikroskopi. Denne særlige hæmmer er rettet mod Histon deacetylase 3 (HDAC3). HDACs er enzymer involveret i den epigenetiske regulering af genekspression og har for nylig været af stigende interesse som potentielle mål i kræft narkotika udvikling. Tidligere erfaringer med MI-192 har vist, at, ved lave koncentrationer, det regulerer acetylering af Tubulin, fører til hyperacetylering og stabilisering af microtubuler. Stabiliserede mikrotubuler er mindre dynamiske, med en potentiel indvirkning på migrerende aktiviteter af celler. Det blev konstateret, at den observerede effekt var til stede i både repræsentative pædiatriske og voksne gliom cellelinjer. En koncentrationsafhængig stigning i Tubulin-acetylerings status for begge gliomcellelinjer blev afdækket, en konstatering, der har konsekvenser for præselektion af patienter, når de overvejer supplerende behandling med migræstatiske lægemidler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.