Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

doi: 10.3791/60273 Published: September 16, 2019

Summary

De effecten van migraine remmers op glioom kanker Celmigratie in driedimensionale (3D) invasie testen met behulp van een histon deacetylase (HDAC) inhibitor worden gekenmerkt door een hoge resolutie confocale microscopie.

Abstract

Het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen in kankeronderzoek wordt steeds meer gebaseerd op medicijn schermen in 3D-formaat. Nieuwe remmers gericht op het migratie-en invasief potentieel van kankercellen, en bijgevolg de gemetastaseerde verspreiding van ziekten, worden ontdekt en beschouwd als complementaire behandelingen in zeer invasieve kankers zoals gliomas. Dus, het genereren van gegevens waardoor de gedetailleerde analyses van cellen in een 3D-omgeving na de toevoeging van een medicijn is vereist. De hier beschreven methodologie, het combineren van spheroid invasie testen met hoge resolutie beeldopname en data-analyse door confocale laser scanning microscopie (CLSM), ingeschakeld gedetailleerde karakterisering van de effecten van de potentiële anti-migratie remmer MI-192 op glioom cellen. Spheroids werden gegenereerd uit cellijnen voor invasie testen in laagaanhandig 96-goed platen en vervolgens voorbereid voor CLSM-analyse. De beschreven workflow had de voorkeur boven andere veelgebruikte spheroid-genererende technieken vanwege zowel gemak als reproduceerbaarheid. Dit, in combinatie met de verbeterde beeldresolutie bereikt door confocale microscopie in vergelijking met conventionele breedveld benaderingen, liet de identificatie en analyse toe van verschillende morfologische veranderingen in migratie cellen in een 3D-omgeving na behandeling met de migrastatic drug MI-192.

Introduction

Driedimensionale spheroid-technologieën voor preklinische geneesmiddelen ontdekking en de ontwikkeling van potentiële kankergeneesmiddelen worden in toenemende mate begunstigd op conventionele drugs schermen; Er is dus meer ontwikkeling van migraine — migratie en invasie voorkomen — drugs. De achterliggende gedachte achter deze ontwikkelingen in de behandeling van kanker is duidelijk: 3D-spheroid-assays vormen een realistischer benadering voor het screenen van potentiële anti-kanker drugs, omdat ze de 3D-tumor architectuur meer getrouw nabootsen dan de monolaag-culturen van cellen, even drug-tumor interacties (kinetiek) nauwkeuriger, en toestaan de karakterisering van drug activiteit in een tumor-gerelateerde setting. Bovendien is de opkomst van resistentie tegen chemotoxische geneesmiddelen in vele soorten kanker en hoge sterftecijfers onder kankerpatiënten als gevolg van metastasen versterkt door het vermogen van kankercellen te migreren naar verre tumor sites ondersteunt de opname van chemotherapeutische agenten gericht op het migratie potentieel van kankercellen als adjuvante behandeling in toekomstige klinische kanker onderzoeken1. Dit is met name het geval bij zeer invasieve kankers, zoals high-grade glioblastomas (GBM). GBM-beheer omvat chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Echter, zelfs met combinatiebehandeling, de meeste patiënten recidief binnen 1 jaar van de initiële diagnose met een mediane overleving van 11-15 maanden2,3. Er zijn de afgelopen jaren enorme vooruitgang geboekt op het gebied van 3D-technologie: rotatieve systemen, micro fabricaat structuren en 3D-steigers, en andere individuele testen worden voortdurend verbeterd om routinematige tests op grote schaal4mogelijk te maken, 5,6,7. De resultaten van deze testen moeten echter op een zinvolle manier worden geanalyseerd, omdat gegevens interpretatie vaak wordt belemmerd door pogingen om 3D-gegenereerde gegevens te analyseren met 2D-beeldanalyse systemen.

Ondanks de voorkeur in termen van beeld acquisitie snelheid en verminderde foto-toxiciteit, blijven de meeste breedveldsystemen beperkt door resolutie8. Zo, afgezien van de gegevens lezen-outs met betrekking tot de werkzaamheid van het geneesmiddel, gedetailleerde effecten van drug actie op 3D cellulaire structuren van migrerende cellen zijn onvermijdelijk verloren als afbeelding gemaakt met behulp van een breed-veld systeem. Omgekeerd, confocale laser scanning microscopie (CLSM) vangt hoge kwaliteit, optisch verdeelde beelden die kunnen worden gereconstrueerd en gerenderd in 3D na overname met behulp van computer software. CLSM is dus gemakkelijk toepasbaar op Imaging complexe 3D cellulaire structuren, waardoor ondervraging van de effecten van anti-migrastatic remmers op 3D structuren en diepgaande analyses van de cel migratie mechanismen. Dit zal ongetwijfeld leiden tot toekomstige migrastatic drug ontwikkeling. Hier wordt een gecombineerde workflow van spheroid-generatie, medicamenteuze behandeling, kleurings protocol en karakterisering door confocale microscopie met hoge resolutie beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generatie van Celsferioïden

Dag 1

  1. Bereid het standaard kweekmedium voor zoals vereist door de onderzochte cellijn.
  2. Voer alle met weefselkweek samenhangende stappen uit in een weefselkweek afzuigkap met behulp van steriele behandelingstechnieken.
  3. Trypsinize en Tel kankercellen. Gebruik 20 mL celsuspensie per plaat. Houd de celsuspensies in duidelijk gelabelde steriele universele buizen.
  4. Voeg een vooraf bepaald aantal cellen toe aan elk goed. Zowel het aanvankelijke aantal cellen als de uiteindelijke grootte van de spheroid is afhankelijk van het proliferatie percentage van de cellijn dat wordt onderzocht.
    Opmerking: Voor gevestigde glioom cellijnen zoals U251 en KNS429,10, 5 x 103 cellen/ml zal na 4 dagen incubatie een microscopisch zichtbare spheroid (200 of 800 μm) produceren.
  5. Rebreng de cellen in universele buizen door zachte inversie om celklontering te voorkomen. Pipetteer 200 μL van de celsuspensie in elke put van een 96-well plaat. Als alle putjes niet nodig zijn, is het raadzaam om 200 μL 1x PBS aan elke lege put toe te voegen om verdamping te voorkomen.
  6. Incuberen de cellen in een incubator als normaal bij 37 °C.
    Opmerking: Cellijnen zoals glioom Cancer cellijnen vormen sferoïden binnen 24 uur. laat de 3D-cellulaire architectuur vorm geven door de spheroid voor 72 h te inbroed.

Dag 2

  1. Controleer cellen op helder-veld microscopie na 24 h. afhankelijk van de cellijn, cellen kunnen hebben gevormd een spheroid detecteerbaar in de bodem van de put.
    Opmerking: Opgezette glioom kanker cellijnen vormen gemakkelijk sferoïden binnen 24 uur. patiënten afgeleide glioom Cancer cellijnen kunnen tot 1-2 weken duren.

2. collageen invasie test

Dag 3

  1. Plaats collageen, 5x kweekmedium, 1 M NaOH en 1 20 mL Tube op ijs.
  2. Voeg voorzichtig en langzaam 10,4 mL koud collageen toe aan een gekoelde kweek buis. Vermijd bubbels. Deze hoeveelheid collageen is genoeg voor 1 96-goed plaat. Opschalen is mogelijk, maar het wordt aanbevolen dat 1 20 mL buis per plaat wordt bereid op een tijdstip.
  3. Voeg zachtjes 1,52 mL koud steriel 5x kweekmedium toe. Vermijd bubbels.
  4. Net voor gebruik, voeg voorzichtig 72 μL koude steriele 1 M NaOH toe. Houd de oplossing op ijs.
  5. Meng zachtjes door pipetteren. Vermijd bubbels. Efficiënte menging leidt tot een kleurverandering (van rood naar oranje-rood (pH 7,4) in het medium. Laat het mengsel op ijs staan tot het gebruik.
  6. Cruciale stap: Verwijder 190 μL supernatant van de 96-put die op dag 1 is bereid. Wees heel voorzichtig om de sferoïden die in de bodem van de put zijn gevormd niet te verstoren. Gebruik de pipet onder een hoek naar de zijkant, niet het midden, van de put.
  7. Voeg voorzichtig 100 μL van de collageen mix toe aan elk goed. Pipetteer de Meng zijde van de put om een spheroid-verstoring te voorkomen. Vermijd bubbels. Bewaar elke overgebleven collageen mengsel in de tube van 20 mL bij kamertemperatuur om polymerisatie te beoordelen.
  8. Incubeer de plaat in de incubator gedurende ten minste 10 min om het collageen te laten polymeriseren. Als een richtlijn, als de overgebleven collageen heeft ingesteld, steeds halfvaste en spons-achtige, de sferoïden zijn klaar om te worden behandeld met remmer.
  9. Voeg de geneesmiddelen of remmers bij 2x de concentratie toe aan het kweekmedium. Voeg het medium zachtjes toe aan elk goed (100 μL per put). Pipetteer het medium aan de zijkant van de put om spheroid-verstoring te voorkomen.
  10. Observeren en beeld elke spheroid door helderveld microscopie soms T = 0 h, 24 h, 48 h, en 72 h om drug activiteit te beoordelen. Breng vervolgens de plaat terug naar de incubator.
    Opmerking: Afhankelijk van het invasieve gedrag van de cellijn kan de migratie weg van de oorspronkelijke spheroid-kern vanaf 24 uur worden waargenomen.

3. bereiding van met collageen ingesloten spheroïden en migratie cellen voor confocale microscopie

  1. Plaats de plaat in een weefselkweek kapje en verwijder voorzichtig het supernatant (200 μL). Nogmaals, zorg dat u de spheroid niet verstoort en Vermijd het aanraken van het collageen, omdat dit de collageen plug kan verstoren.
  2. Vervang de supernatant met 100 μL 1x PBS. Herhaal deze Wash stap 3x.
  3. Verwijder de laatste wassing en vervang met 4% formaldehyde in 1x PBS (100 μL per put).
    Let op: Formaldehyde is een potentieel kankerverwekkend. Behandel met zorg in overeenstemming met de gezondheids-en veiligheidsrichtlijnen.
  4. Plaats de 96-put plaat op een labbank, dek af met folie en laat 24 uur op kamertemperatuur liggen.
  5. Verwijder voorzichtig de formaldehyde en vervang deze door 1x PBS. Herhaal deze 1x PBS Wash 3x.
  6. Maak 0,1% Triton X-100 klaar in 1x PBS. Verwijder de 1x PBS Wash en vervang met 100 μL van de Triton X-100 oplossing. Inincuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de blokkerende oplossing met 1x PBS en 0,05% mageremelkpoeder en meng grondig.
  7. Verwijder Triton X-100 en was 3x met 1x PBS. Voeg 100 μL blokkerende oplossing toe aan elk goed en incuberen gedurende 15 minuten.
  8. Verdun het vereiste primaire antilichaam in de blokkerende buffer bij de vooraf bepaalde concentratie. Hier, gebruik anti-muis IgG geacetseerd tubuline antilichamen (1:100).
  9. Centrifugeer de primaire antistofblokkerende buffer mix gedurende 5 minuten bij 15.682 x g. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing en voeg de supernatant (25 − 50 μL) toe aan elk goed. Inincuberen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  10. Verwijder de antilichaam oplossing en was 3x met 1x PBS (100 μL per put).
  11. Verdun het secundaire antilichaam in de blokkerende buffer bij de aanbevolen of vooraf bepaalde concentratie, naast eventuele extra fluorescerende vlekken. Hier, gebruik 1:500 anti-muis fluorophore-488 geconjugeerd antilichaam, phalloidin-594 (1:500) voor actine kleuring, en de DNA vlek (DAPI).
  12. Centrifugeer nogmaals de secundaire antilichaam oplossing gedurende 5 minuten bij 13.000 tpm.
  13. Verwijder de blokkerende oplossing van elke put en voeg 25 − 50 μL van het secundaire antilichaam/phalloidine/DAPI-mengsel toe. Inincuberen in het donker voor 1,5 uur bij kamertemperatuur.
  14. Verwijder secundaire antistof oplossing en was 3x met 1x PBS (100 μL per put).
  15. Til individuele collageen pluggen voorzichtig op met een plastic pipet (200 μL) op het midden van een hoge kwaliteit glijbaan van glas.
  16. Voeg een druppel van een geschikte inbedmiddel toe aan de collageen plug, zodat de stekker volledig bedekt is. Vermijd bubbels.
  17. Breng de afdekfolie van de optimale dikte aan voor de Microscoop doelstelling die zal worden gebruikt voorbeeld vorming en laat 's nachts instellen. Bewaar de glaasjes bij kamertemperatuur in het donker.

4. fluorescentiemicroscopie

  1. Vang fluorescerende beelden met behulp van een geschikte confocale Microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Driedimensionale spheroid-technologie vordert het begrip van interacties tussen geneesmiddelen en tumoren, omdat het meer representatief is voor de kankerspecifieke omgeving. De generatie van sferoïden kan op verschillende manieren worden bereikt; lage hechting 96-put platen werden gebruikt in dit protocol. Na het testen van verschillende producten van verschillende fabrikanten, werden de hier gebruikte platen gekozen omdat ze consequent het beste presteerden in termen van succesvolle spheroid-productie en uniformiteit. De vervangings stap, waarbij het groeimedium wordt vervangen door de collageenmatrix, is een cruciaal punt van het Protocol; Er moet veel zorg worden besteed aan het verwijderen van het grootste deel van het medium zonder de spheroid zelf te verstoren. Geautomatiseerde beeldvorming voor de karakterisering van door de drug geïnduceerde effecten door middel van breedveld microscopie kan worden overwogen om elke afhandelings afwijking te verwijderen, maar momenteel zijn commercieel beschikbare instrumenten aanzienlijk duurder dan de beeldvormings benaderingen hier beschreven.

Breed-veld epifluorescentie microscopie maakt onderzoek van het effect van drug activiteit op Celmigratie en invasie. De resolutie die wordt bereikt met een brede microscopie is echter niet goed genoeg om een gedetailleerde interpretatie te geven van de resultaten met betrekking tot het effect op de celmorfologie (Figuur 1). Hier wordt de bereiding van glioom-sferioïden en migrerende cellen door gemakkelijk reproduceerbare kleurings protocollen beschreven, gevolgd door beeldvorming met behulp van een confocale Microscoop. Uit de analyse van het brede microscopische beeld bleek dat er in de glioom cellen verschillende morfologische veranderingen hadden plaatsgevonden na behandeling met de MI-192-remmer, maar er ontbrak duidelijk gedefinieerde Details. Confocale microscopie bevestigde de eerste bevindingen, en deze hogere resolutie beelden lieten de beoordeling van het effect van MI-192 nog verder. Significante verschillen tussen onbehandelde (controle) spheroïden, migrerende cellen (Figuur 2) en behandelde sferioïden en cellen (Figuur 3) werden duidelijk. Terwijl de volwassen glioom cellijn U251 in ' spikes ' leek te migreren, uit de buurt van de oorspronkelijke spheroid-kern met loskomende cellen, nam de pediatrische cellijn KNS42 een blad achtig migratie patroon aan met enkele afzonderlijke celpieken. Eerder, verschillende migratiepatronen tussen verschillende cellijnen (hier de volwassen glioom cellijn U251 en de pediatrische cellijn KNS42) werden waargenomen, potentieel weerspiegelen het celtype ze ontstonden uit en de plaats van tumor isolatie. Cruciaal, een toename van geacetuleerd tubuline met toenemende remmer concentratie (van 0,1 − 10 μM) werd ook blootgelegd, niet alleen in de migrerende cellen, maar ook in de spheroid-geassocieerde cellen. Dit was niet duidelijk in de initiële in het groot veld verkregen microscopie beelden. Verdere beeldvorming zou ook de kwantitatieve analyse van eiwit uitdrukkings niveaus mogelijk maken als een cellulaire respons op de behandeling met migrastatische remmers.

In deze studie werd aangetoond dat de cellen morfologisch veranderden in reactie op de behandeling; celafronding werd zichtbaar met toenemende remmer concentraties en celdood bij de hoogste remmer concentratie (10 μM), met nucleaire fragmentatie duidelijk in U251 cellen en ingeklapte microtubuli en nucleaire fragmentatie in KNS42. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met eerdere opmerkingen dat de anti-migratieactiviteit van Mi-192 op glioom cellijnen concentratie-afhankelijke13,14is. De algemene workflow van het protocol is afgebeeld in Figuur 4.

Figure 1
Figuur 1: Spheroid-celinvasie in collageen, geimagd door een brede microscopie. Representatieve beelden van de cellijnen U251 en KNS42 worden getoond na behandeling met de remmer MI-192 bij de anti-migratie concentratie van 1 μM en met intervallen van 24 uur. Er wordt ook een controle-spheroid met geen behandeling getoond. Potentiële anti-of Pro-migratie-effecten worden gedetecteerd als gemarkeerde (pijlen). Dit is vooral merkbaar in KNS42 met schijnbaar geen migratie in de controle of behandelde spheroids. Alle beelden werden genomen op 4x. Schaalbalk = 1.000 μm. schaalbalk in vergrote beelden voor SF188 = 200 μm, KNS42 = 1.000 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: het effect van de migrastatische remmer mi-192 op glioom cellijn U251 onthuld door confocale microscopie. Vaste en bevlekte glioom-spheroïden en migratie cellen vertonen verschillende migrerende fenotypes. Migratie cellen in de buurt van de originele spheroid-randen worden weergegeven. U251 celsferoïden worden gekenmerkt door pieken die wegstralen van de oorspronkelijke spheroid met toenemende celafronding in cellen die zichtbaar zijn met toenemende concentratie van remmers (pijl geeft celpiek aan). Schaalbalk = 10 μm. Labels: rood = actin, groen = geacetyleerd tubuline, blauw = DAPI. Voor elke afbeelding werd een enkele representatieve optische sectie vastgelegd met alle instellingen waarbij zowel pre-als post-Image Capture voor vergelijkende doeleinden werd bijgehouden. Alle afbeeldingen zijn vervolgens verwerkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: het effect van de migrastatische remmer mi-192 op de glioom CELLIJN KNS42 onthuld door confocale microscopie. KNS42 migratie wordt gekenmerkt door sheetlike uitsteeksels met één celpieken (pijl geeft celblad aan). Bij de laagste concentratie van de remmer lijkt dit fenotype uitgesproken te zijn, maar gaat het verloren met toenemende concentratie van remmers (schaalbalk = 10 μm); Labels: rood = actin, groen = geacetyleerd tubuline, blauw = DAPI. Voor elke afbeelding werd een enkele representatieve optische sectie vastgelegd, met alle instellingen met zowel pre-als post-Image-Capture gehandhaafd voor vergelijkende doeleinden. Alle afbeeldingen zijn vervolgens verwerkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: samenvatting van de workflow. Opgenomen in deze workflow is de generatie van spheroids, inbedding in collageen, medicamenteuze behandeling, fixatie, kleuring en beeldvorming door confocale microscopie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een nieuwe manier om kankercel sferoïden te maken voor de identificatie van de activiteit van migraine met behulp van hoge-resolutie confocale microscopie wordt beschreven. Het gebruik van lage hecht platen over andere technieken, zoals hangende druppels15, heeft een middel vergemakkelijkt om reproduceerbare en uniforme sferioïden te genereren voor gebruik in de collageen migratie en invasie testen. De kritische punten in dit protocol zijn de verwijdering van het groeimedium van de 96-put voor de celspheroid-inbedding in een collageenmatrix en de zorgvuldige behandeling van de collageen pluggen die de sferoïden bevatten. Nieuwe technologieën zoals Digital microfluïdica16 zijn nu beschikbaar en kunnen, hoewel duurder, een alternatief bieden voor het handmatig verwijderen van media en vloeistoffen. De belangrijkste beperking van het beschreven protocol is dat het tijdrovend is wanneer enkelvoudige sferoïden worden afbeelding gemaakt en vervolgens handmatig worden geanalyseerd door heldere veld microscopie om de drug activiteit van remmers te beoordelen. Bovendien zijn de reagentia die nodig zijn voor alle stappen van het procesduur en zijn gespecialiseerde apparatuur, namelijk een hoge resolutie confocale Microscoop, ook vereist. Optimale celaantallen die vereist zijn voor het zaaien en de tijd die nodig is om een celspheroid van de vereiste grootte te verkrijgen, moeten ook vooraf worden bepaald vóór aanvang van de collageen invasie test.

De ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op kankercellen, grootschalige drug screening, en de karakterisering van drugs activiteit voor drug modificatie en verbetering steeds meer vertrouwen op 3D-cel assays en technologie. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd en aangepast voor gebruik met andere experimentele testen en tal van andere celtypen van belang in andere ziektebestrijdings systemen. Tot op heden is de interpretatie van de microscopisch gegenereerde gegevens belemmerd door de toepassing van een brede microscopie, waarbij beelden die een beperkte resolutie bieden en geplaagd worden door inherente beeld vervaging als gevolg van licht dat afkomstig is van buiten de brandvlak. De hier getoonde afbeeldingen met een breed veld microscopie werden handmatig verkregen met behulp van een EVOS-beeldvormings systeem, een proces dat tijdrovend was en mogelijk de vertekening van de handler kon introduceren. Nieuwe technologieën, waaronder geautomatiseerde werkstations en analyse platforms17,18, zijn nu beschikbaar, maar blijven kostbaar en zijn daarom nog steeds niet beschikbaar voor veel onderzoeklaboratoria. Daarnaast kunnen verdere software ontwikkelingen helpen bij de analyse van 3D-gerenderde afbeeldingen met hoge resolutie om fenotypische veranderingen, zoals die hier genoteerd, nauwkeurig te kwantificeren, en dus de werkzaamheid van remmers op Celmigratie. Bovendien zal de toepassing van super-resolution fluorescerende beeldvormingstechnieken die steeds meer standaard worden in veel onderzoekslab oratoria, meer inzicht geven in het migratie gedrag en de morfologie van cellen die worden gekweekt in 3D-spheroid structuren en behandeld met remmer drugs.

Er werd vastgesteld dat het mogelijk is om spheroids vast te stellen en te vlechten na behandeling met een migrastatische remmer, wanneer het in collageen is ingebed. Deze methode was gemakkelijk uit te voeren, met alle stappen voltooid in 96-well Plates, gevolgd door het monteren van de collageen pluggen met de sferoïden op dekstroken voorbeeld vorming. Bij de beoordeling van het effect van remmer activiteit op de morfologie van kankercellen werd confocale microscopie gebruikt om de geneesmiddel activiteit te verheldigen. De eerste bevindingen over het anti-migratie effect van de remmer MI-192 uit afbeeldingen met een lage resolutie werden bevestigd door confocale microscopie met hoge resolutie. Deze specifieke remmer richt zich op histon deacetylase 3 (HDAC3). HDACs zijn enzymen die betrokken zijn bij de Epigenetische regulatie van genexpressie en zijn recentelijk steeds belangrijker geworden als potentiële doelwitten in de ontwikkeling van kankergeneesmiddelen. Eerdere ervaringen met MI-192 hebben aangetoond dat het bij lage concentraties de acetylering van tubulin reguleert, wat leidt tot hyperacetylering en stabilisatie van microtubuli. Gestabiliseerde microtubuli zijn minder dynamisch, met een mogelijk effect op de migratieactiviteiten van cellen. Er werd vastgesteld dat het waargenomen effect aanwezig was in zowel representatieve pediatrische als volwassen glioom cellijnen. Een concentratie-afhankelijke toename van de tubuline acetylering status van beide glioom cellijnen werd ontdekt, een bevinding die implicaties heeft voor de preselectie van patiënten bij het overwegen van een complementaire behandeling met migrastatic drugs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

We willen professor Chris Jones bedanken voor het bijdragen aan de KNS42 Cell line. De Zeiss LSM880 confocale Microscoop met AiryScan die in dit werk wordt gebruikt, maakt deel uit van het Huddersfield Innovation and incubation project (HIIP) dat wordt gefinancierd door de Leeds City Region Enterprise Partnership (LEP) Growth deal. Krediet voor Microscoop-beeld afbeelding 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, Microscopy@zeiss.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.   
Coverslips various various for microscopy imaging
DMEM powder Sigma D5648 needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum Sigma F7524-500ML needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides various various for microscopy imaging
High glucose DMEM Gibco 41965062 needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor Tocris various various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant various various for microscopic imaging
NaOH (1 M) various  various NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde  various various for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL) various various for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture Sigma D1408-500ML   needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics) Sigma P4333 needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin various various there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate Sigma S5761 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate Sigma P5280 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin Sigma T4049 for trypsinisation
Ultra low attachment plates Sigma/Nunc CLS7007-24EA for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) various e.g. Costar CLS4488-50; CLS4487-50 for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) various various for cell and spheroid handling
Widefield microscopy various  various for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective Zeiss quote from manufacturer Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3, (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13, (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26, (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27, (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67, (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16, (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9, (5), e96426 (2014).
Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).More

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter