Summary
ההשפעות של מעכבי migrastatic על הגירה התאים של סרטן glioma בתלת מימדי (3D) הפלישה אומר באמצעות המעכב deacetylase (HDAC) מתאפיין במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
Abstract
גילוי ופיתוח של תרופות בחקר הסרטן הוא יותר ויותר מבוסס על מסכי הסמים בפורמט 3D. מעכבי הרומן מיקוד הפוטנציאל הנדידה פולשנית של תאים סרטניים, וכתוצאה מכך התפשטות גרורתית של המחלה, מתגלים ונחשבים טיפולים משלימים סרטן פולשני מאוד כגון gliomas. לכן, יצירת נתונים המאפשרים ניתוחים מפורטים של תאים בסביבה תלת-ממדית לאחר הוספת תרופה נדרשת. המתודולוגיה מתוארת כאן, שילוב של הפלישה ספרואיד מספר עם לכידת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח נתונים על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ (CLSM), מאפשר אפיון מפורט של ההשפעות של מעכבי נגד נדידה הפוטנציאלי MI-192 על תאים glioma. Spheroids נוצרו קווי התא עבור בחני פלישה אומר ב מחסיד נמוך 96-טוב צלחות ולאחר מכן מוכן ניתוח clsm. זרימת העבודה המתוארת הייתה מועדפת על-ידי שימוש נפוץ אחרים ביצירת שיטות הייצור הנפוצות בשל הקלות והתוכסות. זה, בשילוב עם רזולוציית תמונה משופרת מושגת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לעומת גישות רגילות שדה רחב, איפשר זיהוי וניתוח של שינויים מורפולוגיים ברורים בתאי נדידה בסביבה תלת-ממדית לאחר טיפול עם התרופה migrastatic MI-192.
Introduction
שלוש טכנולוגיות ספרואיד ממדיות לגילוי תרופות טרום-קליניות ופיתוח תרופות לסרטן פוטנציאליות הן יותר ויותר להיות המועדף על מסכי סמים קונבנציונליים; כך, יש יותר פיתוח של migrastatic-הגירה ומניעת פלישה-סמים. הרציונל מאחורי ההתפתחויות האלה בטיפול בסרטן הם ברורים: 3d ספרואיד בחני מייצגים גישה מציאותית יותר לסינון תרופות נגד סרטן פוטנציאלי כפי שהם מחקים אדריכלות הגידול 3d בנאמנות יותר מאשר התרבויות התא דופלקס, באופן מדויק יותר, ולאפשר אפיון של פעילות התרופות בהגדרה הקשורה לגידול. בנוסף, עליית ההתנגדות לתרופות כימוחלות בסוגים רבים של סרטן ושיעורי מוות גבוה בקרב חולי סרטן בשל הפוטנציאל גרורות על ידי היכולת של תאים סרטניים להגר לאתרי גידול מרחוק תומך הכללה של סוכני כימותרפיות מיקוד הפוטנציאל הנדידה של תאים סרטניים כמו הטיפול שדון בעתיד סרטן קליני ניסויים1. זה במיוחד המקרה של סרטן פולשני מאוד, כגון glioblastomas בדרגה גבוהה (GBM). ניהול GBM כולל ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה. עם זאת, גם עם טיפול משולב, רוב המטופלים מתדרדרות בתוך שנה 1 של אבחנה ראשונית עם הישרדות חציון של 11-15 חודשים2,3. התקדמות אדירה בתחום הטכנולוגיה 3D נעשו בשנים האחרונות: מערכות מיקרו, מבנים מפוברק ו 3D פיגומים, ומוסר הפרט השני הם השתפרו ללא הרף כדי לאפשר בדיקות שגרתיות בקנה מידה גדול4, 5,6,7. עם זאת, התוצאות שהתקבלו משיטות אלה חייבות להיות מנותח באופן משמעותי משום שפענוח הנתונים מפריע לעתים קרובות על-ידי ניסיונות לנתח נתונים שנוצרו על-ידי 3D עם מערכות ניתוח תמונה דו-ממדית.
למרות היותו עדיף במונחים של מהירות רכישת תמונה והפחתת רעילות התמונה, רוב מערכות השדה הרחב נשארות מוגבלות על ידי רזולוציה8. לפיכך, מלבד מידע לקריאה הקשורות ליעילות הסמים, השפעות מפורטות של פעולת התרופה על מבנים סלולריים תלת-ממדיים של תאים הגירה יאבדו באופן בלתי נמנע אם התמונה באמצעות מערכת שטח רחב. לעומת זאת, מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד (clsm) לוכדת באיכות גבוהה, תמונות מנות בצורה אופטית שניתן לשחזור ומעובד ב-3d לאחר הרכישה באמצעות תוכנת מחשב. כך, CLSM ישימה בקלות על הדמיה מורכבים 3D מבנים סלולריים, ובכך מאפשר חקירה של ההשפעות של מעכבי anti-migrastatic על מבנים תלת-ממד וניתוחים מעמיק של מנגנוני הגירה התא. זה ללא ספק ידריך בעתיד migrastatic התפתחות התרופה. כאן, מתוארת זרימת עבודה משולבת של דור כדורי, טיפול בתרופות, כתמים ואפיון על-ידי מיקרוסקופ קונטואיד ברזולוציה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדור של הספרואידים תא
היום הראשון
- הכן את מדיום התרבות הסטנדרטית כנדרש על-ידי קו התא תחת חקירה.
- בצע את כל תרבות הרקמה הקשורים שלבים במכסה של תרבות הרקמה באמצעות טכניקות טיפול סטרילי.
- טריזיסיזציה וספירת תאים סרטניים. השתמש ב-20 מ ל של השעיית תאים לכל צלחת. לשמור את השעיות התא בתווית בבירור צינורות אוניברסלי סטרילי.
- הוסף מספר מוגדר מראש של תאים לכל באר. הן המספר ההתחלתי של תאים וגודל ספרואיד האולטימטיבי נדרש תלוי בקצב ההתפשטות של קו התא שנחקר.
הערה: עבור הוקמה קווי התאים glioma כגון U251 ו KNS429,10, 5 x 103 תאים/mL יפיק מאכל עין ספרואיד (200 או 800 μm) לאחר 4 ימים של דגירה. - השהה את התאים בצינורות אוניברסליים על ידי היפוך עדין כדי להימנע מקלפינג תאים. פיפטה 200 μL של התא מושעה לכל טוב של צלחת 96-באר. אם כל הבארות אינם נדרשים, רצוי להוסיף 200 μL של 1x PBS לכל הבאר ריקה כדי למנוע אידוי.
- מודיית את התאים בחממה כרגיל ב 37 ° c.
הערה: קווי התאים כגון שורות התאים של סרטן glioma יהיה טופס spheroids בתוך 24 h. אפשר ארכיטקטורה תאית 3D כדי ליצור על ידי דגירה של ספרואיד עבור 72 h.
היום השני
- בדיקת תאים על-ידי מיקרוסקופ שדה בהיר לאחר 24 שעות. בהתאם לקו התא, ייתכן שתאים יצרו מזהה ספרואיד בתחתית הבאר.
הערה: הקים glioma סרטן התאים קווי בצורה בקלות spheroids בתוך 24 h. החולה-הנגזר glioma סרטן קווי התאים עשויים להימשך עד 1-2 שבועות.
2. שיטת הפלישה קולגן
היום השלישי
- המקום קולגן, 5x בינוני התרבות, 1 M NaOH, ו 1 20 mL על קרח.
- בזהירות ובאיטיות להוסיף 10.4 mL של קולגן קר לתוך צינור תרבות מקורר. להימנע בועות. כמות זו של קולגן מספיק עבור 1 96-בסדר צלחת. ניתן לעשות שינוי קנה מידה אפשרי, אך מומלץ לעשות שפופרת 1 20 mL לכל צלחת מוכנה בכל פעם.
- הוסיפו בעדינות 1.52 מ ל של בינונית תרבותית 5x הקרה וסטרילית. להימנע בועות.
- רק לפני השימוש, להוסיף בעדינות 72 μL של קר סטרילי 1 M NaOH. . שמור על הפתרון על הקרח
- מערבבים בעדינות על ידי ליטוף. להימנע בועות. ערבוב יעיל מוביל לשינוי צבע (מאדום לכתום-אדום (pH 7.4) במדיום. השאירו את התערובת על הקרח עד השימוש.
- צעד מכריע: הסר 190 μL של סופרנטאנט מצלחת 96-באר המוכן ביום 1. להיזהר מאוד לא להפריע את הספרואידים שנוצרו בחלק התחתון של הבאר. השתמשו בפיפטה בזווית לכיוון הצד, ולא במרכז, בבאר.
- הוסף בעדינות 100 μL של תערובת הקולגן לכל טוב. , כדי למנוע הפרעה ספרואידית. התערובת מעורבת בצד הבאר להימנע בועות. שמרו כל שילוב קולגן שנותר 20 מ ל בטמפרטורת החדר כדי להעריך את הפלמור.
- הצלחת דגירה בחממה לפחות 10 דקות כדי לאפשר קולגן כדי פולימייט. כמנחה, אם שאריות הקולגן יש להגדיר, להיות וצק ו ספוג כמו, הspheroids מוכנים להיות מטופלים עם מעכב.
- הוסיפו את התרופות או המעכבי בריכוז 2x למדיום התרבותי. הוסף את המדיום בעדינות לכל טוב (100 μL לכל טוב). שוב, פיפטה את המדיום במורד הצד של הבאר כדי למנוע הפרעה ספרואיד.
- להתבונן ולצלם כל ספרואיד על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר לפעמים T = 0 h, 24 h, 48 h, ו 72 h כדי להעריך את פעילות הסמים. . אז תחזיר את הצלחת לחממה
הערה: בהתאם התנהגות פולשנית של קו התא, הגירה הרחק מן הליבה ספרואיד המקורי ניתן לצפות 24 h ואילך.
3. הכנת מיכלי קולגן מוטבעים ותאי נדידה למיקרוסקופיה קונפוקלית
- הניחו את הצלחת במכסה של תרבות הרקמה והסירו בעדינות את הסופרנטנט (200 μL). שוב, לדאוג לא להפריע הספרואיד ולהימנע מלגעת קולגן, כמו זה עלול להפריע תקע הקולגן.
- החלף את הסופרנטאנט עם 100 μL של 1x PBS. חזור על זה שלב 3 x.
- הסר את השטיפה הסופית והחלף עם 4% פורמלדהיד ב-1x PBS (100 μL לכל טוב).
זהירות: פורמלדהיד הוא גורם מסרטן פוטנציאלי. טפל בזהירות בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות. - מניחים את הצלחת 96-באר על ספסל מעבדה, לכסות עם נייר כסף, ולצאת 24 שעות בטמפרטורת החדר.
- בזהירות להסיר את פורמלדהיד ולהחליף עם 1x PBS. חזור על זה 1 x PBS כביסה 3x.
- להכין 0.1% טריטון X-100 ב 1x PBS. להסיר את הכביסה 1x PBS ולהחליף עם 100 μL של הפתרון X-100 טריטון. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, להכין את הפתרון חסימת עם 1 x PBS ו 0.05% אבקת חלב גנב ומערבבים ביסודיות.
- להסיר את טריטון X-100 ולשטוף 3x עם 1x PBS. הוסף 100 μL של פתרון חסימת כל טוב ו מודעד 15 דקות.
- לדלל את הנוגדן העיקרי הנדרש במאגר חסימת בריכוז הקבועה מראש. כאן, השימוש נגד עכבר IgG acetylated טובולין נוגדן (1:100).
- צנטריפוגה את התערובת העיקרית לחסימת נוגדנים עבור 5 דקות ב 15,682 x g. הסר בזהירות את פתרון החסימה והוסף את הסופרנטנט (25-50 μL) לכל היותר. מודטה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 1 h.
- הסר את פתרון נוגדן ולשטוף 3x עם 1x PBS (100 μL לכל טוב).
- דלל את הנוגדן המשני במאגר חסימת הריכוז המומלץ או הקבוע מראש בנוסף לכל כתמי פלורסנט נוספים. כאן, השתמש 1:500 נגד העכבר fluorophore-488 נוגדן מצובן, phalloidin-594 (1:500) עבור כתמי אקטין, ואת כתם DNA (dapi).
- שוב, צנטריפוגה את הפתרון נוגדן משני עבור 5 דקות ב 13,000 סל ד.
- הסר את פתרון חסימת מכל באר והוסף 25-50 μL של הנוגדן המשני/phalloidin/DAPI mix. דגירה בחושך עבור 1.5 h בטמפרטורת החדר.
- להסיר את הפתרון נוגדן משני לצבוע ולשטוף 3x עם 1x PBS (100 μL לכל טוב).
- הרימו בזהירות את אטמי הקולגן הבודדים באמצעות שאיבה עם פיפטה פלסטי (200 μL) למרכז של שקופית זכוכית פשוטה באיכות גבוהה.
- הוסיפו טיפה אחת של השוטר המתאים לתקע הקולגן, והקפדה על התקע מכוסה לחלוטין. להימנע בועות.
- החלת הכיסויים של העובי האופטימלי למטרת המיקרוסקופ שישמשו לדימות ולאפשר את הגדרת הלילה. אחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר בחשכה.
4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- לכידת תמונות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית מתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טכנולוגיית ספרואיד תלת ממדית מקדמת את ההבנה של אינטראקציות הגידול בסמים, משום שהיא מייצגת יותר את הסביבה הספציפית לסרטן. הדור של הספרואידים יכול להיות מושגת במספר דרכים; הדבקות נמוכה 96-לוחיות הרישוי שימשו בפרוטוקול זה. לאחר בדיקת מספר מוצרים מיצרנים שונים, הצלחות המשמשות כאן נבחרו משום שהם בעקביות ביצעו את הטוב ביותר במונחים של ייצור ואחידות מוצלחים של ספרואיד. הצעד המחליף, שבו בינוני הגדילה מוחלף עם מטריצת קולגן, הוא נקודה קריטית של הפרוטוקול; טיפול גדול יש לנקוט כדי להסיר את רוב המדיום מבלי להפריע את הספרואיד עצמו. הדמיה אוטומטית לאפיון של אפקטים המושרה בסמים באמצעות מיקרוסקופ רחב-שטח עשויה להיחשב להסרת הטיה של כל מטפל, אך כיום המכשירים הזמינים באופן מסחרי נותרים יקרים בהרבה מגישות ההדמיה מתוארים כאן.
המיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בשדה רחב מאפשר בדיקת ההשפעה של פעילות הסמים על הגירה תא ופלישה. עם זאת, הרזולוציה שהתקבלה ממיקרוסקופ שטח רחב אינה טובה מספיק כדי לאפשר פרשנות מפורטת של תוצאות לגבי השפעת הסמים על מורפולוגיה של התא (איור 1). כאן, הכנת מעקב glioma ותאים מעביר בקלות באמצעות פרוטוקולים מכתים כתמים מתוארת, ואחריו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. מתוך ניתוח מיקרוסקופ שטח רחב, זה היה ברור כי שינויים מורפולוגיים שונים אירעו בתאי glioma לאחר הטיפול עם מעכב MI-192, אבל פרטים מוגדרים בבירור היו חסרים. מיקרוסקופ confocal וקד אישר את הממצאים הראשוניים, ואת אלה תמונות ברזולוציה גבוהה מותר להערכת ההשפעה של MI-192 עוד יותר. הבדלים משמעותיים בין הספרואידים שאינם מטופלים (בקרה), העברת תאים (איור 2), ומטופלים ותאים שטופלו (איור 3) הפכו לגלויים. בעוד שהקו המבוגר glioma תא U251 הופיע להעביר ' קוצים ', מקרין הרחק הליבה ספרואיד המקורי עם תאים בודדים ניתוק, קו התא ילדים KNS42 אימץ תבנית הגירה כמו גיליון עם כמה קוצים תאים נפרדים. בעבר, דפוסי הגירה שונים בין קווי תאים שונים (כאן קו מבוגרים glioma תא U251 ואת קו התא ילדים KNS42) נצפו, המשקף את סוג התא הם התעוררו מהאתר של בידוד הגידול. באופן מכריע, גידול של acetylated טובולין עם ריכוז מעכב הגוברת (מ 0.1-10 μM) נחשף גם, לא רק בתאי הגירה, אלא גם בתאים הקשורים ספרואיד. זה לא היה מובן מאליו. הדמיה נוספת תאפשר גם ניתוח כמותי של רמות ביטוי חלבון כתגובה תאית לטיפול עם מעכבי migrastatic.
במחקר זה, הוכח כי התאים השתנו מורפולוגית בתגובה לטיפול; עיגול התא התברר עם ריכוזי מעכב הגוברת ומוות התאים בריכוז המדכא הגבוה ביותר (10 μM), עם פיצול גרעיני ברור בתאי U251 והתמוטט microtubules ופיצול גרעיני ב KNS42. ממצאים אלה הם בשמירה על התצפיות הקודמות כי הפעילות נגד הנדידה של MI-192 על קווי התאים glioma הוא הריכוז תלוי13,14. זרימת העבודה הכוללת של הפרוטוקול מתוארת באיור 4.
איור 1: הפלישה תא ספרואיד לתוך מיקרוסקופית קולגן על ידי שדה רחב מיקרוסקופ. תמונות מייצגות של קווי התא U251 ו KNS42 מוצגים לאחר הטיפול עם מעכב MI-192 בריכוז נגד הנדידה של 1 μM ו במרווחי זמן 24 h. שליטה ספרואיד ללא טיפול מוצג גם. אפקטים פוטנציאליים נגד או פרו-נדידה מזוהים כמסומנים (חיצים). זה מורגש במיוחד ב KNS42 עם הגירה לא לכאורה בשליטה או מטופלים באמצעות spheroids. . כל התמונות צולמו ב-4x סרגל קנה מידה = 1,000 μm. סרגל קנה מידה בתמונות מוגדלות עבור SF188 = 200 μm, KNS42 = 1,000 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההשפעה של migrastatic מעכב MI-192 על קו התאים glioma U251 נחשף על ידי המיקרוסקופיה קונפוקלית. קבוע ומוכתם glioma, תאים נודדים להציג פנוטיפים הנדידה מובחנת. תאים נודדים קרוב לקצוות המקוריים של הספרואיד מוצגים. U251 cell spheroids מאופיינים קוצים מקרין הרחק ספרואיד המקורי עם עיגול התא הגדלת בתאים לכאורה עם ריכוז מעכב הגוברת (החץ מציין ספייק תא). סרגל בקנה מידה = 10 μm. תוויות: אדום = actin, ירוק = acetylated טובולין, כחול = DAPI. עבור כל תמונה, מקטע אופטי נציג יחיד נלכד עם כל ההגדרות עם לכידת טרום ולאחר תמונה שנשמרה למטרות השוואתית. כל התמונות עובדו לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ההשפעה של migrastatic מעכב MI-192 על קו התאים glioma KNS42 נחשף על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית. KNS42 הגירה מאופיינת בגליונות כמו בליטות עם תא בודד (חץ מציין את גיליון התא). ב הריכוז המדכא הנמוך ביותר זה פנוטיפ נראה מבוטא אבל הוא איבד עם ריכוז מעכב הגדלת (סרגל קנה מידה = 10 μm); תוויות: אדום = actin, ירוק = acetylated טובולין, כחול = DAPI. עבור כל תמונה מקטע אופטי נציג אחד נלכד, עם כל ההגדרות עם לכידת טרום ולאחר תמונה שנשמר למטרות השוואתי. כל התמונות עובדו לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סיכום זרימת העבודה. משולב בזרימת עבודה זו הוא דור של spheroids, הטבעה של קולגן, טיפול בסמים, תיקון, כתמים, והדמיה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדרך הרומן ליצור spheroids תאים סרטניים לזיהוי של פעילות סמים migrastatic באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה מתואר. השימוש בלוחות מסוכרנים נמוכים על פני טכניקות אחרות, כגון תליית טיפות15, הקלה על אמצעי ליצירת הספרואידים ומדים אחידים לשימוש הגירה קולגן הפלישה assays. הנקודות הקריטיות בפרוטוקול זה הם הסרת בינוני הצמיחה מלוחית 96-באר לפני הטבעה ספרואיד התא במטריצה קולגן ואת הטיפול הזהיר של אטמי הקולגן המכיל את spheroids לאחר מכן. טכנולוגיות חדשות כגון מיקרופלואידיקה הדיגיטלי16 זמינים כעת, למרות יקר יותר, יכול לספק חלופה להסרה ידנית של מדיה ונוזלים. המגבלה העיקרית של הפרוטוקול המתואר היא כי היא גוזלת זמן כאשר הספרואידים בודדים הם התמונה ולאחר מכן מנותח באופן ידני על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר על מנת להעריך את פעילות התרופה מעכב. בנוסף, הריאגנטים הנדרש עבור כל השלבים של התהליך הם יקרים, וציוד מיוחד, כלומר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה, נדרש גם. מספרי תאים אופטימליים הנדרשים לזריעה ואת הזמן שנלקח כדי לקבל תא ספרואיד של הגודל הנדרש גם חייב להיות מראש לפני תחילת הקבוע של הפלישה קולגן.
התפתחות של תרופות מיקוד תאים סרטניים, הקרנת סמים בקנה מידה גדול, ואת האפיון של פעילות התרופה עבור שינוי התרופה ושיפור יותר ויותר להסתמך על בחני תא תלת-ממד וטכנולוגיה. פרוטוקול זה יכול להיות אופטימיזציה ומותאם לשימוש עם בחני ניסויים אחרים וסוגים רבים של תאים אחרים של חשיבות במערכות מחלות אחרות. עד היום, הפרשנות של הנתונים המופקים מיקרוסקוטית הייתה מכוונת על ידי יישום של מיקרוסקופ רחב השדות, עם תמונות שנרכשו מציע רזולוציה מוגבלת והטרידו טשטוש תמונה הטבועה כתוצאה מאור שמקורם מחוץ ל . מטוס מוקד התמונות המיקרוסקופיה של השדה הרחב המוצגות כאן נרכשו באופן ידני באמצעות מערכת הדמיה EVOS, תהליך שהיה ארוך זמן ועלול להחדיר הטיית המטפל. טכנולוגיות חדשות, כולל תחנות עבודה אוטומטיות ופלטפורמות ניתוח17,18, זמינות כעת אך נשארות יקרות ולכן עדיין אינן זמינות למעבדות מחקר רבות. בנוסף, התפתחויות תוכנה נוספת יכול לסייע בניתוח של ברזולוציה גבוהה 3D תמונות שניתנו כדי לכמת במדויק שינויים פנוטימית כגון אלה שצוין כאן, ולכן את היעילות של מעכבי על הגירה התא. יתר על כן, היישום של ברזולוציה סופר שיטות הדמיה פלורסנט כי הם הופכים יותר ויותר סטנדרטיים במעבדות מחקר רבות תספק תובנה נוספת להתנהגות הנדידה מורפולוגיה של תאים גדל 3D ספרואיד מבנים וטיפול בסמים מעכבי.
הוא הוקם כי ניתן לתקן ולהכתים כתמים, בעקבות הטיפול עם מעכב migrastatic, כאשר מוטבע קולגן. שיטה זו היתה קלה לביצוע, עם כל השלבים שהושלמו 96-היטב צלחות, ואחריו להרכבה את אטמי הקולגן המכיל את spheroids על כיסוי עבור הדמיה. בהערכת ההשפעה של פעילות מעכבי על מורפולוגיה של תאים סרטניים, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד שימש להבהיר פעילות סמים. הממצאים הראשוניים על ההשפעה נגד הנדידה של מעכב MI-192 מתמונות ברזולוציה נמוכה אושרו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. מטרות מעכבי מסוים זה האבן המרה 3 (HDAC3). HDACs הם אנזימים המעורבים בוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים והיה לאחרונה הריבית גוברת כמו מטרות פוטנציאליות פיתוח התרופה לסרטן. חוויות קודמות עם MI-192 הראו כי, בריכוזים נמוכים, זה מווסת את הרחרחון של טובולין, המוביל היפרפרלציה וייצוב של microtubules. Microtubules התייצב הם פחות דינמיים, עם השפעה פוטנציאלית על פעילויות נדידה של תאים. זה היה והוא וודא כי ההשפעה נצפתה היתה נוכחת הן בתור ילדים מייצגים ומבוגרים תאים glioma. גידול תלוי ריכוז במצב טובולין פרלציה של שני קווי התאים glioma נחשף, ממצא כי יש השלכות על מבחר מראש של חולים כאשר בהתחשב טיפול משלים עם תרופות migrastatic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
היינו רוצים להודות לפרופסור כריס ג'ונס על שתרמה את קו הטלפון הKNS42. מיקרוסקופ zeiss LSM880 קונפוקלית וקד עם airyscan בשימוש בעבודה זו הוא חלק של חדשנות האדרספילד פרויקט דגירה (hiip) ממומן באמצעות העיר לידס באזור שותפות ארגוני (lep) עסקת צמיחה. קרדיט על תמונת המיקרוסקופ איור 3: מיקרוסקופ קרל Zeiss GmbH, microscopy@zeiss.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen I, rat tail, 100 mg | Corning | 354236 | for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen. |
| Coverslips | various | various | for microscopy imaging |
| DMEM powder | Sigma | D5648 | needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay; this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use. |
| Foetal calf serum | Sigma | F7524-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Glass slides | various | various | for microscopy imaging |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965062 | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Inhibitor | Tocris | various | various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results. |
| Mountant | various | various | for microscopic imaging |
| NaOH (1 M) | various | various | NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation. |
| Paraformaldehyde | various | various | for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay |
| Pastettes (graduated pipette, 3 mL) | various | various | for invasion assay, solution removal |
| PBS, sterile for tissue culture | Sigma | D1408-500ML | needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining |
| Pen/strep (antibiotics) | Sigma | P4333 | needed for cell culture of glioma cell lines |
| Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin | various | various | there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration |
| Trypsin | Sigma | T4049 | for trypsinisation |
| Ultra low attachment plates | Sigma/Nunc | CLS7007-24EA | for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids |
| Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) | various e.g. Costar | CLS4488-50; CLS4487-50 | for tissue culture and collagen preparation |
| Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) | various | various | for cell and spheroid handling |
| Widefield microscopy | various | various | for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific) |
| Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective | Zeiss | quote from manufacturer | Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop. |
References
- Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).
- Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
- Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
- Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
- Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
- Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
- Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).
- Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).
- Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
- Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
- Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
- Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
- Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).
- Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9 (5), e96426 (2014).
