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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

उच्च संकल्प Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी ट्यूमर स्फीरॉइड आक्रमण पर Migrastatic inhibitors के प्रभाव का चरित्र

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/60273
Automatic Translation
1, 2, 1
1School of Applied Sciences, University of Huddersfield, 2Laboratory of Radiotherapy and Experimental Radiation Oncology, Humbertus Wald Tumorzentrum, University Cancer Center Hamburg, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Summary

तीन आयामी (3 डी) आक्रमण पर ग्लियोमा कैंसर सेल प्रवास पर migrastatic inhibitors के प्रभाव एक हिस्टोन deacetylase (HDAC) अवरोध करनेवाला का उपयोग कर उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी की विशेषता है.

Abstract

दवा खोज और कैंसर अनुसंधान में विकास तेजी से एक 3 डी प्रारूप में दवा स्क्रीन पर आधारित किया जा रहा है. कैंसर कोशिकाओं के प्रवासी और आक्रामक क्षमता को लक्षित उपन्यास अवरोधकों, और फलस्वरूप रोग के मेटास्टैटिक प्रसार, की खोज की जा रही है और इस तरह के ग्लियोमास के रूप में अत्यधिक इनवेसिव कैंसर में पूरक उपचार के रूप में माना जाता है। इस प्रकार, एक दवा के अलावा के बाद एक 3 डी वातावरण में कोशिकाओं की विस्तृत विश्लेषण को सक्षम करने के लिए डेटा पैदा करने की आवश्यकता है. यहाँ वर्णित पद्धति, उच्च संकल्प छवि पर कब्जा और confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) द्वारा डेटा विश्लेषण के साथ spheroid आक्रमण assays के संयोजन, संभावित विरोधी प्रवासी निरोधक के प्रभाव का विस्तृत लक्षण सक्षम ग्लियोमा कोशिकाओं पर MI-192. स्फ़रॉइड्स कम अनुयायी 96-वेल प्लेट्स में आक्रमण परख के लिए सेल लाइनों से उत्पन्न किए गए थे और फिर सीएलएसएम विश्लेषण के लिए तैयार किए गए थे। वर्णित कार्यप्रवाह को आसानी और पुनरुत्पादनीयता दोनों के कारण अन्य सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले गोलभ-उत्पादक तकनीकों पर पसंद किया गया था. यह, पारंपरिक व्यापक क्षेत्र दृष्टिकोण की तुलना में confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त बढ़ाया छवि संकल्प के साथ संयुक्त, पहचान और एक 3 डी वातावरण में प्रवासी कोशिकाओं में अलग रूपात्मक परिवर्तन के विश्लेषण की अनुमति दी निम्नलिखित Migrastatic दवा एमआई-192 के साथ उपचार.

Introduction

पूर्व नैदानिक दवा की खोज और संभावित कैंसर दवाओं के विकास के लिए तीन आयामी गोलभॉइड प्रौद्योगिकियों तेजी से पारंपरिक दवा स्क्रीन पर इष्ट किया जा रहा है; इस प्रकार, वहाँ migrastatic के अधिक विकास है - प्रवास और आक्रमण को रोकने - दवाओं. कैंसर के इलाज में इन घटनाओं के पीछे तर्क स्पष्ट कर रहे हैं: 3 डी spheroid परख संभावित विरोधी कैंसर दवाओं स्क्रीनिंग के लिए एक और अधिक यथार्थवादी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व के रूप में वे 3 डी ट्यूमर वास्तुकला की नकल अधिक ईमानदारी से सेल monolayer संस्कृतियों से, दवा ट्यूमर बातचीत (kinetics) अधिक सही recapitulate, और एक ट्यूमर से संबंधित सेटिंग में दवा गतिविधि की विशेषता की अनुमति देते हैं. इसके अलावा, कई कैंसर प्रकार और कैंसर कोशिकाओं की क्षमता से कैंसर कोशिकाओं की क्षमता से शक्तिशाली के कारण कैंसर रोगियों के बीच उच्च मृत्यु दर में chemotoxic दवाओं के लिए प्रतिरोध की वृद्धि दूर ट्यूमर साइटों के लिए स्थानांतरित करने के लिए chemothetic एजेंटों के शामिल किए जाने का समर्थन करता है भविष्य के नैदानिक कैंसर परीक्षणों में सहायक उपचार के रूप में कैंसर कोशिकाओं की प्रवासी क्षमता को लक्षितकरना 1. यह विशेष रूप से अत्यधिक आक्रामक कैंसर में मामला है, जैसे उच्च ग्रेड ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम)। जीबीएम प्रबंधन सर्जरी, रेडियोथेरेपी, और कीमोथेरेपी भी शामिल है। हालांकि, यहां तक कि संयोजन उपचार के साथ, ज्यादातर रोगियों को 11-15 महीने2,3की एक औसत अस्तित्व के साथ प्रारंभिक निदान के 1 साल के भीतर पतन। 3 डी प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में भारी अग्रिम पिछले कुछ वर्षों में किया गया है: rotative सिस्टम, microfabricated संरचनाओं और 3 डी पाड़, और अन्य व्यक्तिगत परख लगातार एक बड़े पैमाने पर नियमित परीक्षण की अनुमति के लिए सुधार किया जा रहा है4, 5,6,7. हालांकि, इन परख से प्राप्त परिणामों का विश्लेषण एक सार्थक तरीके से किया जाना चाहिए क्योंकि डेटा व्याख्या अक्सर 2 डी छवि विश्लेषण प्रणालियों के साथ 3 डी जनित डेटा का विश्लेषण करने के प्रयासों से बाधित होती है।

छवि अधिग्रहण की गति और कम फोटो विषाक् तता के मामले में बेहतर होने के बावजूद, सबसे व्यापक क्षेत्र प्रणालीसंकल्प 8द्वारा सीमित रहते हैं। इस प्रकार, दवा प्रभावकारिता से संबंधित डेटा पठन-आउट के अलावा, पलायन कोशिकाओं के 3 डी सेलुलर संरचनाओं पर दवा कार्रवाई के विस्तृत प्रभाव अनिवार्य रूप से खो रहे हैं अगर एक व्यापक क्षेत्र प्रणाली का उपयोग कर छवि. इसके विपरीत, confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) उच्च गुणवत्ता, ऑप्टिकली अनुभाग छवियों कि पुनर्निर्माण किया जा सकता है और 3 डी के बाद अधिग्रहण में प्रदान कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कब्जा. इस प्रकार, सीएलएसएम आसानी से इमेजिंग जटिल 3 डी सेलुलर संरचनाओं के लिए लागू है, जिससे 3 डी संरचनाओं पर विरोधी migrastatic inhibitors के प्रभाव और सेल प्रवास तंत्र के गहन विश्लेषण के पूछताछ को सक्षम करने. यह निस्संदेह भविष्य migrastatic दवा विकास मार्गदर्शन करेंगे. यहाँ, गोलभद्योग पीढ़ी, दवा उपचार, धुंधला प्रोटोकॉल, और उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषता का एक संयुक्त कार्यप्रवाह वर्णित है.

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Protocol

1. सेल स्फीरॉइड्स का उत्पादन

1 दिन

  1. जांच के तहत सेल लाइन द्वारा आवश्यक के रूप में मानक संस्कृति माध्यम तैयार करें।
  2. बाँझ हैंडलिंग तकनीक का उपयोग कर एक ऊतक संस्कृति हुड में सभी ऊतक संस्कृति संबद्ध कदम बाहर ले.
  3. ट्रिप्सिनाइज़ करें और कैंसर कोशिकाओं की गणना करें। प्रति प्लेट सेल निलंबन के 20 एमएल का उपयोग करें। सेल निलंबन स्पष्ट रूप से लेबल बाँझ सार्वभौमिक ट्यूबों में रखें.
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए कोशिकाओं की एक पूर्व निर्धारित संख्या जोड़ें. कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या और परम गोलभॉइड आकार दोनों की जांच की जा रही सेल लाइन की प्रसार दर पर निर्भर करता है।
    नोट: U251 और KNS429,10,5 x 103 कोशिकाओं/mL के रूप में स्थापित ग्लियोमा सेल लाइनों के लिए एक सूक्ष्म रूप से दिखाई गोलभ (200 या 800 $m) ऊष्मायन के 4 दिनों के बाद उत्पादन होगा।
  5. सेल clumping से बचने के लिए कोमल उलटा द्वारा सार्वभौमिक ट्यूबों में कोशिकाओं को फिर से निलंबित. एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 200 डिग्री सेल्सियस पिपेट. यदि सभी कुओं की आवश्यकता नहीं है, यह वाष्पीकरण से बचने के लिए प्रत्येक खाली अच्छी तरह से 1x पीबीएस के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के लिए सलाह दी जाती है.
  6. किसी इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य रूप में इनक्यूबेट करें।
    नोट: ग्लियोमा कैंसर सेल लाइनों जैसे सेल लाइनें 24 ज के भीतर गोलभड़ियों का निर्माण करेंगी। 3 डी सेलुलर वास्तुकला को 72 घंटे के लिए गोलभड़ को इनक्यूबेट करके बनाने की अनुमति दें।

2 दिन

  1. 24 ज के बाद चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा कोशिकाओं की जांच करें, कोशिका रेखा के आधार पर, कोशिकाओं ने कुएं के नीचे एक गोलभॉइड डिटेक्टेबल का गठन किया हो सकता है।
    नोट: स्थापित ग्लियोमा कैंसर सेल लाइनों आसानी से 24 ज के भीतर गोलिसे के रूप में फार्म रोगी व्युत्पन्न ग्लिओमा कैंसर सेल लाइनों 1-2 सप्ताह तक लग सकते हैं।

2. कोलेजन आक्रमण परख

तीसरा दिन

  1. जगह कोलेजन, 5x संस्कृति मध्यम, 1 एम NaOH, और बर्फ पर एक 20 एमएल ट्यूब.
  2. ध्यान से और धीरे धीरे एक ठंडा संस्कृति ट्यूब में ठंड कोलेजन के 10.4 एमएल जोड़ें. बुलबुले से बचें। कोलेजन की यह मात्रा एक 96-वेल प्लेट के लिए पर्याप्त है। अपस्केलिंग संभव है, लेकिन यह अनुशंसा की जाती है कि एक समय में प्रति प्लेट एक 20 एमएल ट्यूब तैयार की जाती है।
  3. धीरे से ठंड बाँझ 5x संस्कृति माध्यम के 1.52 एमएल जोड़ें. बुलबुले से बचें।
  4. बस उपयोग से पहले, धीरे ठंड बाँझ 1 एम NaOH के 72 $L जोड़ें. बर्फ पर समाधान रखें.
  5. पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। बुलबुले से बचें। कुशल मिश्रण माध्यम में (लाल से नारंगी-लाल (पीएच 7.4) के लिए एक रंग परिवर्तन की ओर जाता है। उपयोग करने तक इस मिश्रण को बर्फ पर छोड़ दें।
  6. महत्वपूर्ण कदम: दिन 1 पर तैयार 96 अच्छी तरह से थाली से supernatant के 190 $L निकालें. बहुत सावधान रहना है कि अच्छी तरह से नीचे में गठन किया है कि गोलिभों को परेशान करने के लिए नहीं। पक्ष की ओर एक कोण पर पिपेट का प्रयोग करें, केंद्र नहीं, अच्छी तरह से.
  7. धीरे से प्रत्येक अच्छी तरह से कोलेजन मिश्रण के 100 डिग्री एल जोड़ें. किसी भी गोलभॉइड अशांति को रोकने के लिए, कुएं के किनारे मिश्रण को पिपेट करें। बुलबुले से बचें। बहुलकीकरण का आकलन करने के लिए कमरे के तापमान पर 20 एमएल ट्यूब में किसी भी शेष कोलेजन मिश्रण रखें।
  8. कोलेजन बहुलक करने के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट प्लेट। एक दिशानिर्देश के रूप में, अगर बचे हुए कोलेजन सेट किया गया है, अर्द्ध ठोस और स्पंज की तरह बनने, गोलोइड अवरोधक के साथ इलाज के लिए तैयार हैं.
  9. संस्कृति माध्यम के लिए 2x एकाग्रता पर दवाओं या inhibitors जोड़ें. प्रत्येक अच्छी तरह से धीरे से मध्यम जोड़ें (100 $L प्रति अच्छी तरह से). फिर, गोलोइड अशांति से बचने के लिए मध्यम को कुएं के किनारे नीचे पिपेट करें।
  10. औषध गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्येक स्पताल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक स्पताल माइक्रोस्कोपी का निरीक्षण और छवि बनाईजिए। फिर प्लेट को इनक्यूबेटर पर वापस रखें।
    नोट: सेल लाइन के आक्रामक व्यवहार के आधार पर, मूल गोलाभ कोर से दूर प्रवास 24 ज बाद से देखा जा सकता है।

3. कोलेजन एम्बेडेड स्फीरॉइड्स और Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए प्रवासी कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक ऊतक संस्कृति हुड में थाली प्लेस और धीरे supernatant (200 $L) को हटा दें. फिर, ध्यान रखने के लिए spheroid परेशान नहीं है और कोलेजन को छूने से बचने के लिए, के रूप में इस कोलेजन प्लग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
  2. 1x पीबीएस के 100 डिग्री एल के साथ supernatant बदलें. इस धोने चरण 3x दोहराएँ.
  3. अंतिम धोने निकालें और 1x पीबीएस (100 $L प्रति अच्छी तरह से) में 4% formaldehyde के साथ बदलें.
    चेतावनी: Formaldehyde एक संभावित कासिफ्य है. स्वास्थ्य और सुरक्षा दिशानिर्देशों के अनुसार देखभाल के साथ संभालें।
  4. एक प्रयोगशाला बेंच पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस, पन्नी के साथ कवर, और कमरे के तापमान पर 24 एच के लिए छोड़ दें.
  5. सावधानी से formaldehyde निकालें और 1x पीबीएस के साथ बदलें. इस 1x पीबीएस धोने 3x दोहराएँ.
  6. 1x पीबीएस में 0.1% Triton एक्स-100 तैयार करें। 1x पीबीएस धोने निकालें और Triton X-100 समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ बदलें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। इस बीच, 1x पीबीएस और 0.05% स्किम्ड मिल्क पाउडर के साथ अवरुद्ध समाधान तैयार करें और अच्छी तरह से मिश्रण करें।
  7. Triton एक्स-100 निकालें और 1x पीबीएस के साथ 3x धो लें. प्रत्येक अच्छी तरह से और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए समाधान अवरुद्ध के 100 $L जोड़ें।
  8. पूर्व निर्धारित एकाग्रता पर बफर अवरुद्ध करने में आवश्यक प्राथमिक एंटीबॉडी को विलेय करें। यहाँ, विरोधी माउस IgG एसिटाइलेटिल्ड ट्यूबुलिन एंटीबॉडी (1:100) का उपयोग करें।
  9. सेंट्रीफ्यूज प्राथमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध बफर मिश्रण के लिए 5 मिनट पर 15,682 x g. ध्यान से अवरुद्ध समाधान को दूर करने और प्रत्येक अच्छी तरह से supernatant (25 डिग्री 50 $L) जोड़ें. 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट।
  10. एंटीबॉडी समाधान निकालें और 1x पीबीएस (100 डिग्री सेल्सियस प्रति अच्छी तरह से) के साथ 3x धोने.
  11. किसी भी अतिरिक्त फ्लोरोसेंट दाग के अलावा की सिफारिश की या पूर्व निर्धारित एकाग्रता पर अवरुद्ध बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला. यहाँ, 1:500 एंटी-माउस फ्लोरोफोर-488 संयुग्मी एंटीबॉडी, phaloidin-594 (1:500) actin धुंधला के लिए उपयोग करें, और डीएनए दाग (DAPI).
  12. फिर, 13,000 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान centrifuge.
  13. प्रत्येक अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी के 25 डिग्री 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें / कमरे के तापमान पर 1.5 एच के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट।
  14. माध्यमिक एंटीबॉडी डाई समाधान निकालें और 1x पीबीएस (100 डिग्री सेल्सियस प्रति अच्छी तरह से) के साथ 3x धोने.
  15. ध्यान से एक उच्च गुणवत्ता वाले सादे कांच स्लाइड के केंद्र पर एक प्लास्टिक पिपेट (200 जेडएल) के साथ चूषण द्वारा व्यक्तिगत कोलेजन प्लग उठा।
  16. कोलेजन प्लग करने के लिए एक उपयुक्त mountant की एक बूंद जोड़ें, प्लग पूरी तरह से कवर किया जाता है यह सुनिश्चित करने. बुलबुले से बचें।
  17. इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और रात भर सेट करने के लिए अनुमति देंगे कि माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए इष्टतम मोटाई के कवरस्लिप लागू करें। स्लाइड को अंधेरे में कमरे के तापमान पर रखें।

4. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

  1. एक उपयुक्त confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा.

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Representative Results

तीन आयामी गोलभॉइड प्रौद्योगिकी दवा ट्यूमर बातचीत की समझ को आगे बढ़ा रही है क्योंकि यह कैंसर विशेष वातावरण के अधिक प्रतिनिधि है. गोलभों की पीढ़ी को कई तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है; इस प्रोटोकॉल में कम पालन 96-वेल प्लेटों का उपयोग किया गया था। विभिन्न निर्माताओं से कई उत्पादों के परीक्षण के बाद, यहाँ इस्तेमाल प्लेटों क्योंकि वे लगातार सफल गोलभयाबाद उत्पादन और एकरूपता के मामले में सबसे अच्छा प्रदर्शन चुना गया. प्रतिस्थापन कदम है, जहां विकास माध्यम कोलेजन मैट्रिक्स के साथ बदल दिया है, प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण बिंदु है; बहुत ध्यान स्फीरॉइड ही परेशान किए बिना माध्यम के अधिकांश को दूर करने के लिए लिया जाना चाहिए। व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा दवा प्रेरित प्रभाव की विशेषता के लिए स्वचालित इमेजिंग किसी भी हैंडलर पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए विचार किया जा सकता है, लेकिन वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों इमेजिंग दृष्टिकोण की तुलना में काफी अधिक महंगा रहते हैं यहाँ रेखांकित.

वाइड-फील्ड एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सेल माइग्रेशन और आक्रमण पर दवा गतिविधि के प्रभाव की जांच की अनुमति देता है। तथापि, विस्तृत क्षेत्र माइक्रोस्कोपी से प्राप्त संकल्प कोशिका आकारिकी पर औषध प्रभाव के संबंध में परिणामों की विस्तृत व्याख्या की अनुमति देने के लिए पर्याप्त नहीं है (चित्र 1)। यहाँ, ग्लियोमा गोलाभ और आसानी से reproduible धुंधला प्रोटोकॉल के माध्यम से कोशिकाओं पलायन की तैयारी का वर्णन किया है, एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इमेजिंग द्वारा पीछा किया. व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण से, यह स्पष्ट है कि विभिन्न रूपात्मक परिवर्तन एमआई-192 अवरोधक के साथ उपचार के बाद ग्लियोमा कोशिकाओं में हुई थी, लेकिन स्पष्ट रूप से परिभाषित विवरण की कमी थी। Confocal माइक्रोस्कोपी प्रारंभिक निष्कर्षों की पुष्टि की, और इन उच्च संकल्प छवियों एमआई-192 के प्रभाव के आकलन की अनुमति दी और भी आगे. अनुपचारित (नियंत्रण) गोलोइडों के बीच महत्वपूर्ण अंतर, प्रवास कोशिकाओं (चित्र 2) और उपचारित स्फिरॉइड तथा कोशिकाओं (चित्र 3) स्पष्ट हो गए। जबकि वयस्क ग्लिओमा सेल लाइन U251 'स्पाइक्स' में माइग्रेट करने के लिए दिखाई दिया, एकल कोशिकाओं के साथ मूल स्फिरॉइड कोर से दूर radiating, बाल चिकित्सा सेल लाइन KNS42 कुछ अलग सेल spikes के साथ एक शीट की तरह प्रवास पैटर्न अपनाया. पहले, विभिन्न सेल लाइनों के बीच विभिन्न प्रवास पैटर्न (यहाँ वयस्क ग्लिओमा सेल लाइन U251 और बाल चिकित्सा सेल लाइन KNS42) मनाया गया, संभावित सेल प्रकार वे से पैदा हुई और ट्यूमर अलगाव की साइट को दर्शाती है. महत्वपूर्ण बात यह है कि बढ़ती अवरोधक एकाग्रता के साथ एसिटाइलेत ट्यूबुलिन की वृद्धि (0.1 डिग्री सेल्सियस से) को भी खुला नहीं किया गया था, न केवल पलायन कोशिकाओं में, बल्कि गोलोइड-संबद्ध कोशिकाओं में भी। प्रारंभिक वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी अर्जित छवियों में यह स्पष्ट नहीं था। इसके अलावा इमेजिंग भी migrastatic inhibitors के साथ उपचार के लिए एक सेलुलर प्रतिक्रिया के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति होगी.

इस अध्ययन में, यह प्रदर्शित किया गया था कि कोशिकाओं के उपचार के जवाब में आकृति विज्ञान बदल; कोशिका गोलाई उच्चतम अवरोधक सांद्रता (10 डिग्री सेल्सियस) पर बढ़ती अवरोधक सांद्रता और सेल मौत के साथ स्पष्ट हो गया, परमाणु विखंडन U251 कोशिकाओं में स्पष्ट और KNS42 में microtubules और परमाणु विखंडन के साथ स्पष्ट. ये निष्कर्ष पिछली टिप्पणियों के ध्यान में रखते हुए किए गए हैं कि ग्लियोमा सेल लाइनों पर एमआई-192 की प्रवासी विरोधी गतिविधि एकाग्रता पर निर्भर13,14है । प्रोटोकॉल का समग्र कार्यप्रवाह चित्र 4 में दर्शायागया है।

Figure 1
चित्रा 1: व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि कोलेजन में स्फिरॉइड सेल आक्रमण। सेल लाइनों U251 और KNS42 के प्रतिनिधि छवियों 1 $M के विरोधी प्रवासी एकाग्रता पर अवरोध करनेवाला एमआई-192 के साथ उपचार के बाद और 24 एच अंतराल पर दिखाए जाते हैं। कोई उपचार के साथ एक नियंत्रण गोलभभ भी दिखाया गया है। संभावित विरोधी या समर्थक प्रवासी प्रभाव प्रकाश डाला (तीर) के रूप में पाए जाते हैं। यह विशेष रूप से KNS42 में ध्यान देने योग्य है या तो नियंत्रण या इलाज गोलियों में कोई प्रवास के साथ. सभी छवियों 4x पर ले जाया गया. SF188 के लिए बढ़े हुए चित्रों में स्केल बार $ 1,000 m. स्केल बार , KNS42 ] 1,000 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ग्लियोमा सेल लाइन U251 पर migrastatic अवरोध करनेवाला MI-192 का प्रभाव confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला. स्थिर और दाग ग्लियोमा स्फीरॉइड और प्रवासी कोशिकाएं अलग-अलग प्रवासी फीनोटाइप प्रदर्शित करती हैं। मूल स्रूपभक किनारों के निकट प्रवासी कोशिकाएं दिखाई जाती हैं। U251 सेल गोलाभ बढ़ते अवरोधक एकाग्रता के साथ स्पष्ट कोशिकाओं में सेल गोलाई बढ़ाने के साथ मूल गोलाभ से दूर radiating spikes द्वारा विशेषता है (तीर सेल कील इंगित करता है). स्केल बार - 10 डिग्री मी. लेबल: लाल - actin, हरे ] एसिटाइलेट्स ट्यूबुलिन, नीले ] DAPI. प्रत्येक छवि के लिए, एक एकल प्रतिनिधि ऑप्टिकल अनुभाग दोनों पूर्व और बाद छवि कब्जा तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए बनाए रखा के साथ सभी सेटिंग्स के साथ कब्जा कर लिया गया था. सभी छवियों को बाद में संसाधित किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ग्लियोमा सेल लाइन KNS42 पर migrastatic अवरोध करनेवाला MI-192 का प्रभाव confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला. KNS42 प्रवास एकल सेल spikes के साथ शीट की तरह उभार की विशेषता है (तीर सेल शीट इंगित करता है). सबसे कम अवरोधक एकाग्रता पर इस phenotype स्पष्ट किया जा करने के लिए प्रकट होता है, लेकिन बढ़ती अवरोध करनेवाला एकाग्रता के साथ खो दिया है (स्केल बार $ 10 डिग्री मी); लेबल: लाल ] actin, हरे ] एसिटाइलेट्स ट्यूबुलिन, नीले ] DAPI. प्रत्येक छवि के लिए एक एकल प्रतिनिधि ऑप्टिकल अनुभाग पर कब्जा कर लिया गया था, दोनों पूर्व और बाद छवि कब्जा के साथ सभी सेटिंग्स के साथ तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए बनाए रखा. सभी छवियों को बाद में संसाधित किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: वर्कफ़्लो का सारांश. इस कार्यप्रवाह में शामिल गोलिकेश की पीढ़ी है, कोलेजन में embedding, दवा उपचार, फिक्सिंग, धुंधला, और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर migrastatic दवा गतिविधि की पहचान के लिए कैंसर सेल स्फीरोइड बनाने के लिए एक उपन्यास तरीका वर्णित है. अन्य तकनीकों पर कम अनुलग्न प्लेटों के उपयोग, जैसे फांसी बूँदें15, कोलेजन प्रवास और आक्रमण परख में उपयोग के लिए reproduible और वर्दी spheroids पैदा करने का एक साधन की सुविधा है. इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण अंक सेल स्फीरॉइड एक कोलेजन मैट्रिक्स में embedding और उसके बाद गोलोइड युक्त कोलेजन प्लग के सावधान हैंडलिंग से पहले 96 अच्छी तरह से थाली से विकास के माध्यम को हटाने रहे हैं. डिजिटल microfluidics16 के रूप में नई प्रौद्योगिकियों अब उपलब्ध हैं और, हालांकि अधिक महंगा, मीडिया और तरल पदार्थ के मैनुअल हटाने के लिए एक विकल्प प्रदान कर सकता है. वर्णित प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा यह है कि यह समय लेने वाली है जब एकल स्फीरॉइड्स की छवि बनाई जाती है और फिर अवरोधक दवा गतिविधि का आकलन करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया जाता है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया के सभी चरणों के लिए आवश्यक अभिकर्मकों महंगे हैं, और विशेष उपकरण, अर्थात् एक उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोप, भी आवश्यक है. इष्टतम सेल संख्या बोने के लिए आवश्यक है और आवश्यक आकार की एक सेल गोहरॉइड प्राप्त करने के लिए लिया समय भी कोलेजन आक्रमण परख के शुरू होने से पहले पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए।

कैंसर कोशिकाओं को लक्षित दवाओं के विकास, बड़े पैमाने पर दवा स्क्रीनिंग, और दवा संशोधन और सुधार के लिए दवा गतिविधि की विशेषता तेजी से 3 डी सेल assays और प्रौद्योगिकी पर भरोसा करते हैं. इस प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य प्रयोगात्मक assays और अन्य रोग प्रणालियों में महत्व के कई अन्य प्रकार के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित. तारीख करने के लिए, सूक्ष्म रूप से उत्पन्न डेटा की व्याख्या व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के आवेदन द्वारा बाधित किया गया है, छवियों के साथ सीमित संकल्प की पेशकश का अधिग्रहण किया और निहित छवि कलंक के बाहर उत्पन्न प्रकाश से उत्पन्न होने से ग्रस्त फोकल विमान. यहाँ दिखाए गए व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवियों को मैन्युअल रूप से एक EVOS इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, एक प्रक्रिया जो समय लेने वाली थी और संभवतः हैंडलर पूर्वाग्रह को पेश कर सकती थी। स्वचालित कार्यकेंद्रों और विश्लेषण प्लेटफार्मों सहित नई प्रौद्योगिकियों17,18, अब उपलब्ध हैं, लेकिन महंगा रहते हैं और इसलिए अभी भी कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं. इसके अलावा, आगे सॉफ्टवेयर विकास उच्च संकल्प 3 डी के विश्लेषण में सहायता कर सकता है छवियों को सही ढंग से इस तरह के उन यहाँ उल्लेख के रूप में phenotypic परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रदान की है, और इसलिए सेल प्रवास पर inhibitors की प्रभावकारिता. इसके अलावा, सुपर संकल्प फ्लोरोसेंट इमेजिंग तकनीक है कि तेजी से कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं में मानक होते जा रहे हैं के आवेदन प्रवासी व्यवहार और 3 डी गोलभॉइड में विकसित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा संरचनाओं और अवरोधक दवाओं के साथ इलाज किया.

यह स्थापित किया गया था कि यह ठीक करने के लिए संभव है और दाग गोलिता, एक migrastatic अवरोध करनेवाला के साथ उपचार के बाद, जब कोलेजन में एम्बेडेड. इस विधि को प्रदर्शन करने के लिए आसान था, सभी 96 अच्छी तरह से प्लेटों में पूरा चरणों के साथ, इमेजिंग के लिए coverslips पर गोलोइड युक्त कोलेजन प्लग बढ़ते द्वारा पीछा किया. कैंसर कोशिका आकारिकी पर अवरोधक गतिविधि के प्रभाव का आकलन करने में, confocal माइक्रोस्कोपी दवा गतिविधि स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कम संकल्प छवियों से अवरोधक एमआई-192 के प्रवासी विरोधी प्रभाव पर प्रारंभिक निष्कर्ष उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई. यह विशेष अवरोधक histone deacetylase 3 (HDAC3) लक्ष्य. HDACs जीन अभिव्यक्ति के epigenetic विनियमन में शामिल एंजाइमों रहे हैं और हाल ही में कैंसर दवा के विकास में संभावित लक्ष्य के रूप में ब्याज बढ़ाने की गई है. एमआई-192 के साथ पिछले अनुभवों से पता चला है कि, कम सांद्रता पर, यह tubulin की एसिटाइलेशन को नियंत्रित करता है, hyperacetylation और microtubules के स्थिरीकरण के लिए अग्रणी. स्थिर microtubules कम गतिशील हैं, कोशिकाओं के प्रवासी गतिविधियों पर एक संभावित प्रभाव के साथ. यह पता लगाया गया था कि प्रभाव देखा दोनों प्रतिनिधि बाल चिकित्सा और वयस्क ग्लिओमा सेल लाइनों में मौजूद था. दोनों ग्लिओमा सेल लाइनों के ट्यूबुलिन एसिटाइलेशन स्थिति में एकाग्रता पर निर्भर वृद्धि का पर्दाफाश किया गया था, एक खोज है कि रोगियों के preselection के लिए निहितार्थ है जब migrastatic दवाओं के साथ पूरक उपचार पर विचार.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम KNS42 सेल लाइन योगदान के लिए प्रोफेसर क्रिस जोन्स शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम में इस्तेमाल AiryScan के साथ ज़ीस LSM880 confocal माइक्रोस्कोप लीड्स सिटी क्षेत्र उद्यम भागीदारी (एलईपी) विकास डील के माध्यम से वित्त पोषित Huddersfield अभिनव और इनक्यूबेशन परियोजना (HIIP) का हिस्सा है। माइक्रोस्कोप छवि चित्र 3के लिए क्रेडिट: कार्ल ज़ीस माइक्रोस्कोपी GmbH, microscopy@zeiss.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.   
Coverslips various various for microscopy imaging
DMEM powder Sigma D5648 needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum Sigma F7524-500ML needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides various various for microscopy imaging
High glucose DMEM Gibco 41965062 needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor Tocris various various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant various various for microscopic imaging
NaOH (1 M) various  various NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde  various various for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL) various various for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture Sigma D1408-500ML   needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics) Sigma P4333 needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin various various there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate Sigma S5761 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate Sigma P5280 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin Sigma T4049 for trypsinisation
Ultra low attachment plates Sigma/Nunc CLS7007-24EA for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) various e.g. Costar CLS4488-50; CLS4487-50 for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) various various for cell and spheroid handling
Widefield microscopy various  various for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective Zeiss quote from manufacturer Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.

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कैंसर अनुसंधान अंक 151 कैंसर सेल प्रवास ग्लिओमा स्फ़रॉइड 3 डी आक्रमण परख अवरोधक confocal माइक्रोस्कोपी
उच्च संकल्प Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी ट्यूमर स्फीरॉइड आक्रमण पर Migrastatic inhibitors के प्रभाव का चरित्र
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Harmer, J., Struve, N.,… More

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).

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