Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения

doi: 10.3791/60273 Published: September 16, 2019

Summary

Влияние миграстатических ингибиторов на миграцию клеток рака глиомы в трехмерных (3D) инватифицированных анализах с использованием ингибитора гистона деацетилазы (HDAC) характеризуется конфокальной микроскопией высокого разрешения.

Abstract

Обнаружение и разработка лекарственных средств в исследованиях рака все чаще основывается на экранах лекарств в 3D-формате. Новые ингибиторы, нацеленные на мигрирующие и инвазивные потенциал раковых клеток, и, следовательно, метастатическое распространение болезни, в настоящее время обнаружены и рассматриваются в качестве дополнительного лечения в высокоинвазивных раковых заболеваний, таких как глиомы. Таким образом, требуется создание данных, позволяющих провести детальный анализ клеток в 3D-среде после добавления препарата. Описанная здесь методология, сочетающая анализ ысфероидов с высоким разрешением захвата изображений и анализа данных с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), позволила детально охарактеризовать последствия потенциального антимиграционного ингибитора МИ-192 на клетках глиомы. Сфероиды были созданы из клеточных линий для анализа вторжения в низких адептов 96-колодцев, а затем подготовлены для анализа CLSM. Описанный рабочий процесс был предпочтительнее по сравнению с другими широко используемыми методами генерации сферидов из-за легкости и воспроизводимости. Это, в сочетании с улучшенным разрешением изображения, достигнутым с помощью конфокальной микроскопии по сравнению с обычными широкоугольными подходами, позволило выявить и проанализировать различные морфологические изменения в мигрирующих клетках в 3D-среде после лечение миграстатическим препаратом Ми-192.

Introduction

Трехмерные сфероидные технологии для доклинического открытия лекарственных средств и разработки потенциальных лекарств от рака все чаще отдают предпочтение по сравнению с обычными экранами лекарств; таким образом, наблюдается более развитие мигратического - миграции и предотвращения вторжения - наркотиков. Обоснование этих событий в лечении рака ясно: 3D сфероидных анализов представляют собой более реалистичный подход для скрининга потенциальных противораковых препаратов, поскольку они имитируют 3D архитектуры опухоли более точно, чем монослой культур клеток, более точно подытоживая лекарственное взаимодействие (кинетику) и позволяющий охарактеризовать активность препарата в условиях, связанных с опухолью. Кроме того, рост устойчивости к химиотоксическим препаратам во многих типах рака и высокие показатели смертности среди онкологических больных из-за метастазов, потенцяющихся благодаря способности раковых клеток мигрировать в отдаленные места опухоли, поддерживает включение химиотерапевтических агентов ориентации миграционный потенциал раковых клеток в качестве адъювантного лечения в будущих клинических испытаний рака1. Это особенно верно при высокоинвазивных раковых заболеваниях, таких как высококачественные глиобластомы (ГБМ). GBM управление включает в себя хирургию, лучевую терапию и химиотерапию. Однако, даже при комбинированном лечении, большинство пациентов рецидива в течение 1 года с начала диагностики со средней выживаемости 11-15 месяцев2,3. Огромные достижения в области 3D-технологий были сделаны за последние несколько лет: вращающиеся системы, микрофабрикаты структур и 3D эшафот, и другие индивидуальные анализы постоянно совершенствуются, чтобы позволить рутинное тестирование в больших масштабах4, 5,6,7. Однако результаты, полученные в результате этих анализов, должны быть проанализированы значимым образом, поскольку интерпретация данных часто затрудняется попытками анализа 3D-данных с помощью 2D-систем анализа изображений.

Несмотря на предпочтительность с точки зрения скорости приобретения изображения и снижения фототоксичности, большинство широкоугольных систем остаются ограниченными резолюцией8. Таким образом, помимо данных считывание из-за эффективности препарата, подробное воздействие действия препарата на 3D клеточные структуры мигрирующих клеток неизбежно теряется, если наснимки с помощью широкоугольной системы. И наоборот, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) захватывает высококачественные оптически секционные изображения, которые могут быть реконструированы и представлены в 3D пост-приобретении с помощью компьютерного программного обеспечения. Таким образом, CLSM легко применим к сложным 3D-клеточным структурам, что позволяет проводить анализ воздействия антимиграстатических ингибиторов на 3D-структуры и проводить углубленный анализ механизмов миграции клеток. Это, несомненно, будет определять будущую разработку миграстатических препаратов. Здесь описан комбинированный рабочий процесс генерации сфероидов, медикаментозного лечения, протокола окрашивания и характеристики с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Поколение сотовых сфероидов

День 1

  1. Подготовьте стандартную среду культуры, как того требует исследуемая линия ячейки.
  2. Провести все ткани культуры связанных шагов в ткани культуры капот с использованием стерильных методов обработки.
  3. Трипсинизуйте и подсчитайте раковые клетки. Используйте 20 мл клеточной подвески на тарелку. Держите клеточные суспензии в четко обозначенных стерильных универсальных трубках.
  4. Добавьте в каждый колодец предопределенное количество ячеек. Как первоначальное количество клеток, так и максимальный размер сфероида, зависят от скорости пролиферации исследуемой клеточной линии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установленных линий клеток глиомы, таких как U251 и KNS429,10, 5 х 103 клетки / мл будет производить микроскопически видимых сфероидов (200 или 800 мкм) после 4 дней инкубации.
  5. Resuspend клетки в универсальных трубах нежной инверсии, чтобы избежать слипания клеток. Пипетка 200 л клеточной подвески в каждую скважину из 96-колодца пластины. Если все скважины не требуются, желательно добавить 200 л 1x PBS к каждой пустой скважине, чтобы избежать испарения.
  6. Инкубировать клетки в инкубаторе в обычном режиме при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные линии, такие как линии клеток рака глиомы, образуют сфероиды в пределах 24 ч. Разрешить 3D клеточной архитектуры, чтобы сформировать путем инкубации сфероида для 72 ч.

День 2

  1. Проверка клеток с помощью ярко-поляной микроскопии после 24 ч. В зависимости от клеточной линии клетки могут образоваться в сфероиде, обнаруживаемом в нижней части скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установленные линии клеток рака глиомы легко образуют сфероиды в течение 24 ч. Пациент производные линии рака глиомы может занять до 1-2 недель.

2. Коллаген вторжения Асса

День 3

  1. Поместите коллаген, 5x культуры среды, 1 М НаОГ, и один 20 мл трубки на льду.
  2. Тщательно и медленно добавить 10,4 мл холодного коллагена в охлажденной трубки культуры. Избегайте пузырьков. Это количество коллагена достаточно для одной пластины 96-наилучшим образом. Подъемвозможен, но рекомендуется, чтобы одна трубка 20 мл на тарелку готовилась одновременно.
  3. Аккуратно добавьте 1,52 мл холодной стерильной 5x культуры среды. Избегайте пузырьков.
  4. Непосредственно перед использованием, аккуратно добавьте 72 л холодного стерильного 1 M NaOH. Храните раствор на льду.
  5. Смешайте осторожно путем пипетки. Избегайте пузырьков. Эффективное смешивание приводит к изменению цвета (от красного до оранжево-красного (pH 7.4) в среде. Оставьте смесь на льду до использования.
  6. Решающий шаг: Удалите 190 л супернатанта с 96-хорошо подготовленной пластины на 1-й день. Будьте очень осторожны, чтобы не беспокоить сфероидов, которые образуются в нижней части колодца. Используйте пипетку под углом к стороне, а не к центру, колодца.
  7. Аккуратно добавьте 100 кл/л коллагеновой смеси к каждому колодцу. Для предотвращения любых сфероидных нарушений, pipette смесь вниз стороне скважины. Избегайте пузырьков. Держите все оставшиеся коллагеновы смеси в 20 мл трубки при комнатной температуре для оценки полимеризации.
  8. Инкубировать пластину в инкубаторе, по крайней мере 10 минут, чтобы коллаген полимеризации. В качестве ориентира, если оставшийся коллаген установил, став полутвердым и губчатым, сфероиды готовы к лечению с помощью ингибитора.
  9. Добавьте препараты или ингибиторы с концентрацией 2x в культурную среду. Добавьте среду мягко к каждому колодцу (100 л на колодец). Опять же, pipette среды вниз стороне хорошо, чтобы избежать сфероидов нарушения.
  10. Наблюдайте и образуйте каждый сфероид с помощью ярко-поляной микроскопии, иногда T q 0 h, 24 h, 48 h и 72 h для оценки активности препарата. Затем верните тарелку в инкубатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от инвазивного поведения клеточной линии, миграция от исходного сфероидного ядра может наблюдаться с 24 ч.

3. Подготовка коллагеновых встроенных сфероидов и мигрирующих клеток для конфокальной микроскопии

  1. Поместите тарелку в капюшон культуры ткани и аккуратно удалите супернатант (200 л). Опять же, позаботьтесь, чтобы не беспокоить сфероид и не прикасаться к коллагену, так как это может помешать коллагеновой вилке.
  2. Замените супернатант 100 зл 1x PBS. Повторите этот шаг мытья 3x.
  3. Снимите окончательную стирку и замените 4% формальдегида в 1x PBS (100 л на скважину).
    ПРЕДЕКТО: Формальдегид является потенциальным канцерогеном. Обработка с осторожностью в соответствии с рекомендациями по охране здоровья и безопасности.
  4. Поместите 96-хорошую тарелку на лабораторную скамейку, накройте фольгой и оставьте на 24 ч при комнатной температуре.
  5. Аккуратно удалите формальдегид и замените 1x PBS. Повторите это 1x PBS мыть 3x.
  6. Подготовка 0,1% Тритон X-100 в 1x PBS. Удалите 1x PBS мыть и заменить 100 зл и l раствора Triton X-100. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. В то же время, подготовить блокирующий раствор с 1x PBS и 0,05% обезжиренное сухое молоко и тщательно перемешать.
  7. Удалить Triton X-100 и мыть 3x с 1x PBS. Добавьте 100 зл блокирующего раствора к каждой скважине и инкубируйте в течение 15 минут.
  8. Разбавить необходимые первичные антитела в блокировании буфера при заранее определенной концентрации. Здесь используйте анти-мышь IgG ацетилированных тубулина антитела (1:100).
  9. Центрифуге первичной антитела блокирования буфера смесь в течение 5 мин на 15,682 х г. Тщательно удалите блокирующий раствор и добавьте супернатант (25–50 л) к каждому колодцу. Инкубировать в темноте при комнатной температуре 1 ч.
  10. Удалите раствор антитела и промойте 3x с 1x PBS (100 л на хорошо).
  11. Разбавить вторичное антитело в блокирующем буфере при рекомендуемой или предопределенной концентрации в дополнение к любым дополнительным флуоресцентным пятнам. Здесь используйте 1:500 анти-мышонок фторофор-488 конъюгированных антител, фаллоидин-594 (1:500) для актимного окрашивания и пятна ДНК (DAPI).
  12. Опять же, центрифуга вторичного раствора антитела в течение 5 минут при 13000 об/мин.
  13. Удалите блокирующий раствор из каждой скважины и добавьте 25-50 л вторичного антитела/фаллоидина/DAPI смеси. Инкубировать в темноте 1,5 ч при комнатной температуре.
  14. Удалить вторичный антитела-краситель раствор и мыть 3x с 1x PBS (100 л на хорошо).
  15. Тщательно поднимите отдельные коллагеновые пробки путем всасывания с помощью пластиковой пипетки (200 л) на центр высококачественной простой стеклянной горки.
  16. Добавьте одну каплю подходящего крепления к разъему коллагена, гарантируя, что вилка полностью покрыта. Избегайте пузырьков.
  17. Применить coverslip оптимальной толщины для микроскопа цели, которые будут использоваться для визуализации и позволяют установить на ночь. Храните горки при комнатной температуре в темноте.

4. Флуоресценция Микроскопия

  1. Захват флуоресцентных изображений с помощью подходящего конфокального микроскопа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Трехмерная сфероидная технология продвигает понимание лекарственно-опухолевых взаимодействий, поскольку она более репрезентативной для специфической для рака среды. Поколение сфероидов может быть достигнуто несколькими способами; в этом протоколе использовались пластины с низким содержанием 96 колодцев. После тестирования нескольких продуктов от разных производителей, пластины, используемые здесь были выбраны потому, что они последовательно выполняется лучше всего с точки зрения успешного производства сфероидов и единообразия. Ступень замены, где среда роста заменяется коллагеновой матрицей, является критической точкой протокола; большая осторожность должна быть принята, чтобы удалить большую часть среды, не нарушая сфероид себя. Автоматизированная визуализация для характеристики эффектов, вызванных наркотиками с помощью широкоугольной микроскопии, может рассматриваться как устранение любых предубеждений обработчика, но в настоящее время коммерчески доступные инструменты остаются значительно более дорогостоящими, чем подходы к визуализации изложены здесь.

Широкополевой эпифлюоресценционной микроскопии позволяет изучить влияние наркоактивности на миграцию клеток и вторжение. Тем не менее, разрешение, достигнутое из широкоугольной микроскопии, недостаточно хорошо, чтобы позволить детально интерпретировать результаты в отношении воздействия препарата на морфологию клеток(рисунок 1). Здесь описывается подготовка сфероидов глиомы и мигрирующих клеток через легко воспроизводимые протоколы окрашивания, а затем изображение с помощью конфокального микроскопа. Из широкоугольного микроскопического анализа изображений было очевидно, что после лечения ингибитором МИ-192 в клетках глиомы произошли различные морфологические изменения, однако четко определенные детали отсутствовали. Конфокальная микроскопия подтвердила первоначальные выводы, и эти изображения с более высоким разрешением позволили еще больше оценить эффект МИ-192. Значительные различия между необработанными (контрольными) сфероидами, мигрирующими клетками(рисунок 2)и обработанными сфероидами и клетками(рисунок 3)стали очевидными. В то время как взрослая линия клеток глиомы U251, как представляется, мигрирует в "шипах", излучающих от оригинального сфероидного ядра с отсоединившимися одноклеточными клетками, педиатрическая клеточная линия KNS42 приняла образец миграции с несколькими различными клеточными шипами. Ранее наблюдались различные модели миграции между различными клеточными линиями (здесь наблюдалась линия клеток взрослой глиомы U251 и линия детской клеточной линии KNS42), потенциально отражающие тип клетки, из которой они возникли, и место изоляции опухоли. Важно отметить, что было также обнаружено увеличение ацетилированного тубулина с увеличением концентрации ингибитора (от 0,1–10 мкм) не только в мигрирующих клетках, но и в сфероидно-ассоциированных клетках. Это не было очевидно в первоначальной широкоугольной микроскопии приобретенных изображений. Дальнейшая визуализация также позволит количественно анализировать уровни экспрессии белка в качестве клеточной реакции на лечение миграстатическими ингибиторами.

В этом исследовании было продемонстрировано, что клетки изменили морфологически в ответ на лечение; округление клеток стало очевидным с увеличением концентрации ингибитора и клеточной смерти при самой высокой концентрации ингибитора (10 мкм), с ядерной фрагментацией, очевидной в клетках U251 и рухнувших микротрубах и ядерной фрагментации в KNS42. Эти выводы в соответствии с предыдущими наблюдениями, что анти-миграционная активность МИ-192 на линиях клеток глиомы зависит от концентрации13,14. Общий рабочий процесс протокола изображен на рисунке 4.

Figure 1
Рисунок 1: Вторжение сфероидных клеток в коллаген, изображенный широкоугольной микроскопией. Репрезентативные изображения клеточных линий U251 и KNS42 показаны после лечения ингибитором МИ-192 при антимиграционной концентрации в 1 км/ ч и с интервалом 24 ч. Контроль сфероид без лечения также показано. Потенциальные анти- или про-миграционные эффекты обнаруживаются в виде выделенных (стрел). Это особенно заметно в KNS42 с, казалось бы, нет миграции ни в контроле или лечение сфероидов. Все изображения были сделаны в 4x. Шкала бар 1000 мкм. Шкала бар в увеличенных изображений для SF188 200 мкм, KNS42 и 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Эффект миграстатического ингибитора МИ-192 на линию клеток глиомы U251 выявлен оконфокальной микроскопией. Фиксированные и окрашенные сфероиды глиомы и мигрирующие клетки демонстрируют различные мигрирующие фенотипы. Показаны мигрирующие клетки, близкие к исходным краям сфероидов. Сфероиды u251 характеризуются шипами, излучающими от оригинального сфероида с увеличением округления клеток в клетках, очевидной с увеличением концентрации ингибитора (стрелка указывает на всплеск клеток). Шкала бар No 10 мкм. Этикетки: красный актин, зеленый, ацетилированный тубулин, синий и DAPI. Для каждого изображения, один представитель оптический раздел был захвачен со всеми настройками как с до, так и после изображения захвата поддерживается для сравнительных целей. Все изображения были впоследствии обработаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Эффект миграстатического ингибитора МИ-192 на линии клеток глиомы KNS42 выявлен оконфокальной микроскопией. Миграция KNS42 характеризуется листовыми выступами с одноклеточными шипами (стрелка указывает на клеточный лист). При самой низкой концентрации ингибитора этот фенотип, как представляется, выражен, но теряется с увеличением концентрации ингибитора (шкала бар 10 мкм); этикетки: красный и актин, зеленый, ацетилированный тубулин, синий и DAPI. Для каждого изображения был захвачен один представитель оптический раздел, при этом все настройки как с до, так и после изображения захвата поддерживается для сравнительных целей. Все изображения были впоследствии обработаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Резюме рабочего процесса. В этот рабочий процесс включено поколение сфероидов, встраиваемых в коллаген, медикаментозное лечение, фиксация, окрашивание и визуализация с помощью конфокальной микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описан новый способ создания сфероидов раковых клеток для выявления мигратической активности препарата с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением. Использование низких адепт пластин над другими методами, такими как висит капель15, способствовало средства генерации воспроизводимых и однородных сфероидов для использования в миграции коллагена и вторжения анализов. Критическими моментами в этом протоколе являются удаление среды роста из 96-хорошо пластины до клеточной сфероидвирования в коллагеновой матрицы и тщательного обращения с коллагеном пробки, содержащие сфероиды после этого. Новые технологии, такие, как цифровые микрофлюиды16, теперь доступны и, хотя и дороже, могут стать альтернативой ручному удалению носителей и жидкостей. Основное ограничение описанного протокола заключается в том, что он занимает много времени, когда одиночные сфероиды снимаются, а затем вручную анализируются с помощью яркой полевой микроскопии для оценки активности ингибитора препарата. Кроме того, реагенты, необходимые для всех этапов процесса, являются дорогостоящими, и требуется специализированное оборудование, а именно конфокальный микроскоп высокого разрешения. Оптимальные номера клеток, необходимые для посева и время, затрачаемые для получения клеточного сфероида требуемого размера также должны быть предопределены до начала наблюдения за вторжением коллагена.

Разработка препаратов, нацеленных на раковые клетки, крупномасштабный скрининг на наркотики и характеристика лекарственной активности для модификации и совершенствования лекарственных средств, все чаще опираются на 3D-анализы и технологии. Этот протокол может быть оптимизирован и адаптирован для использования с другими экспериментальными анализами и многочисленными другими типами клеток, имеющих важное значение в других системах заболеваний. На сегодняшний день интерпретация данных, генерируемых микроскопически, затрудняется применением широкоугольной микроскопии, при этом изображения, приобретенные, предлагают ограниченное разрешение и страдают от размытия изображения, образующегося в результате света, возникающего за пределами фокусной плоскости. Широкоугольные микроскопии изображения, показанные здесь, были приобретены вручную с помощью системы визуализации EVOS, процесс, который занимает много времени и потенциально может ввести обработчик смещения. Новые технологии, включая автоматизированные рабочие станции и аналитические платформы17,18,теперь доступны, но остаются дорогостоящими и поэтому по-прежнему недоступны для многих исследовательских лабораторий. Кроме того, дальнейшие разработки программного обеспечения могут помочь в анализе 3D-изображений с высоким разрешением для точной количественной оценки фенотипических изменений, подобных тем, которые отмечены здесь, и, следовательно, эффективности ингибиторов на миграцию клеток. Кроме того, применение методов флуоресцентной визуализации, которые становятся все более стандартными во многих исследовательских лабораториях, даст дальнейшее представление о миграционном поведении и морфологии клеток, выращенных в 3D сфероидных структур и лечение ингибиторными препаратами.

Установлено, что можно фиксировать и испачкать сфероиды после лечения миграстатическим ингибитором, при внедревке в коллаген. Этот метод был прост в выполнении, со всеми шагами, выполненными в 96-колодцах пластин, а затем монтаж коллагеновых вилок, содержащих сфероиды на крышки для визуализации. При оценке влияния ингибиторной активности на морфологию раковых клеток для выяснения активности препарата использовалась конфокальная микроскопия. Первоначальные выводы об антимиграционном эффекте ингибитора МИ-192 с изображениями с низким разрешением были подтверждены конфокальной микроскопией высокого разрешения. Данный ингибитор нацелен на гистон деацетилазу 3 (HDAC3). HDACs являются ферменты, участвующие в эпигенетической регуляции экспрессии генов и в последнее время все большеинтереса в качестве потенциальных целей в разработке рака наркотиков. Предыдущий опыт работы с МИ-192 показал, что при низких концентрациях он регулирует ацетилирование тубулина, что приводит к афрацетилированию и стабилизации микротрубок. Стабилизированные микротрубочки менее динамичны, что может повлиять на миграционную деятельность клеток. Было установлено, что наблюдаемый эффект присутствовал как в репрезентативных педиатрических, так и во взрослом глиоме клеточных линий. Обнаружено концентрационно-зависимое увеличение состояния ацетилирования тубулина обеих линий клеток глиомы, что имеет последствия для предварительного отбора пациентов при рассмотрении дополнительного лечения миграстативными препаратами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить профессора Криса Джонса за содействие линии клеток KNS42. Конфокальный микроскоп «Зейсс» с AiryScan, используемым в этой работе, является частью проекта по инновациям и инкубации Хаддерсфилда (HIIP), финансируемого за счет партнерства по развитию предпринимательства в Лидсе (LEP). Кредит для микроскопа изображение Рисунок 3: Карл Зейсс Микроскопия GmbH, microscopy@zeiss.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.   
Coverslips various various for microscopy imaging
DMEM powder Sigma D5648 needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum Sigma F7524-500ML needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides various various for microscopy imaging
High glucose DMEM Gibco 41965062 needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor Tocris various various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant various various for microscopic imaging
NaOH (1 M) various  various NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde  various various for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL) various various for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture Sigma D1408-500ML   needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics) Sigma P4333 needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin various various there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate Sigma S5761 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate Sigma P5280 needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin Sigma T4049 for trypsinisation
Ultra low attachment plates Sigma/Nunc CLS7007-24EA for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL) various e.g. Costar CLS4488-50; CLS4487-50 for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL) various various for cell and spheroid handling
Widefield microscopy various  various for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective Zeiss quote from manufacturer Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gandalovičová, A., et al. Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges. Trends in Cancer. 3, (6), 391-406 (2017).
  2. Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clinical and Translational Oncology. 18, 1062 (2016).
  3. Foreman, P. M., et al. Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma. Neurotherapeutics. 14, 333 (2017).
  4. Rodrigues, T., et al. Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling. Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).
  5. Sirenko, O., et al. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13, (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).
  6. Wu, Q., et al. Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening. Biomedical Microdevices. 20, 82 (2018).
  7. Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform. Scientific Reports. 8, 253 (2018).
  8. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26, (2), 54-65 (2015).
  9. Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. Human Tumor Cells in Vitro. Springer US. Boston. 175-206 (1975).
  10. Takeshita, I., et al. Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42. Neurologica Medico Chirurgica. 27, (7), 581-587 (1987).
  11. Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration. Journal of Cell Science. 132, (2019).
  12. Bacon, T., et al. Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation. Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).
  13. Jackman, L., et al. Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach. Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).
  14. Bhandal, K., et al. Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192. Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).
  15. Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. Journal of Neuro-oncology. 67, (3), 295-303 (2004).
  16. Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays. Lab on a Chip. 16, (8), 1505-1513 (2016).
  17. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  18. Härmä, V., et al. Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis. PLOS ONE. 9, (5), e96426 (2014).
Характеристика влияния миграстатических ингибиторов на 3D-вторжение опухолевых сфероидов с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).More

Harmer, J., Struve, N., Brüning-Richardson, A. Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e60273, doi:10.3791/60273 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter