Karakterisering av effekterna av Migrastatiska hämmare på 3D-tumör spheroid invasion av högupplöst Konfokal mikroskopi

Summary

Effekterna av migrastatiska hämmare på gliom cancer cell migration i tredimensionella (3D) invasion analyser med hjälp av en Histon histondeacetylas (HDAC) hämmare kännetecknas av högupplöst konfokal mikroskopi.

Abstract

Drug discovery och utveckling inom cancerforskningen bygger alltmer på drog skärmar i 3D-format. Nya hämmare som riktar sig mot cancercellernas migrations-och invasiva potential, och därmed den metastaserande spridningen av sjukdomen, upptäcks och betraktas som kompletterande behandlingar i mycket invasiva cancerformer som gliom. Således krävs att generera data som möjliggör detaljerade analyser av celler i en 3D-miljö efter tillsats av ett läkemedel. Den metod som beskrivs här, som kombinerar sfäroid invasion analyser med högupplösta bildfångst och dataanalys av konfokalmikroskopi laserscanning mikroskopi (clsm), aktiverat detaljerad karakterisering av effekterna av den potentiella anti-flyttande hämmare MI-192 på gliom celler. Spheroids genererades från cellinjer för invasions analyser i låg anhängare 96-well tallrikar och sedan förberett för CLSM analys. Det beskrivna arbetsflödet var att föredra framför andra vanliga spheroid-genererande tekniker på grund av både lätthet och reproducerbarhet. Detta, kombinerat med den förbättrade bildupplösning som uppnåtts genom konfokalmikroskopi jämfört med konventionella bred fälts strategier, möjliggjorde identifiering och analys av distinkta morfologiska förändringar i flytt celler i en 3D-miljö efter behandling med den migrastatiska drogen MI-192.

Introduction

Tredimensionell spheroidteknik för preklinisk läkemedels upptäckt och utveckling av potentiella cancerläkemedel gynnas alltmer över konventionella drog skärmar; Sålunda, det finns mer utveckling av migrastatic — migration och invasion förebygga — droger. Logiken bakom denna utveckling i cancerbehandling är tydliga: 3D sfäroid analyser utgör en mer realistisk metod för screening potentiella anti-cancerläkemedel som de härma 3D-tumör arkitektur mer troget än cell enskiktslager kulturer, recapitulate läkemedel-tumör interaktioner (kinetik) mer exakt, och tillåta karakterisering av drog aktivitet i en tumör-relaterad inställning. Dessutom, uppkomsten av resistens mot kemotoxiska läkemedel i många cancertyper och höga dödstalen bland cancerpatienter på grund av metastaser potentierad av förmågan hos cancerceller att migrera till avlägsna tumör platser stöder införandet av kemoterapeutiska medel inriktning på cancercellernas migrations potential som adjuvant behandling i framtida kliniska cancer prövningar¹. Detta är särskilt fallet i mycket invasiva cancerformer, såsom höggradig glioblastomas (GBM). GBM Management omfattar kirurgi, strålbehandling, och kemoterapi. Men även med kombinationsbehandling, de flesta patienter återfall inom 1 år av initial diagnos med en median överlevnad av 11-15 månader^2,3. Enorma framsteg inom 3D-teknik har gjorts under de senaste åren: Rotative system, microfabricerade strukturer och 3D ställningar, och andra enskilda analyser ständigt förbättras för att möjliggöra rutinmässig testning i stor skala^{4, 5,6,7}. Resultaten från dessa analyser måste dock analyseras på ett meningsfullt sätt, eftersom data tolkningen ofta hindras av försök att analysera 3D-genererade data med 2D-bildanalyssystem.

Trots att föredra i termer av bild förvärvs hastighet och minskad fototoxicitet, de flesta wide-fält system förblir begränsad av resolution⁸. Således, bortsett från data läsa-outs om läkemedels effekt, detaljerade effekter av drog åtgärder på 3D cellulära strukturer av migrerande celler oundvikligen förloras om avbildas med hjälp av ett Wide-fält system. Omvänt, konfokalmikroskopi laserscanning mikroskopi (clsm) fångar hög kvalitet, optiskt sektionerade bilder som kan rekonstrueras och återges i 3D efter förvärvet med hjälp av datorprogram. Således är CLSM lätt tillämplig på Imaging komplexa 3D cellulära strukturer, vilket möjliggör förhör av effekterna av anti-migrastatic hämmare på 3D-strukturer och djupgående analyser av mekanismer cell migration. Detta kommer utan tvekan att vägleda framtida migrastatic läkemedelsutveckling. Här beskrivs ett kombinerat arbetsflöde av sfäroid-generering, läkemedelsbehandling, infärgnings protokoll och karakterisering av konfokalmikroskopi med hög upplösning.

Protocol

1. generering av Cellspheroids

Dag 1

1. Förbered det standard odlingsmedium som krävs av den cell linje som undersöks.
2. Utför alla vävnadskulturer-associerade steg i en vävnad kultur huva med hjälp av steril hantering tekniker.
3. Trypsinize och räkna cancerceller. Använd 20 mL cellsuspension per tallrik. Håll cell upphängningarna i tydligt märkta sterila Universalrör.
4. Lägg till ett förutbestämt antal celler i varje brunn. Både det initiala antalet celler och Ultimate sfäroid storlek som krävs beror på spridningen hastighet av cell linjen utreds.
   Anmärkning: För etablerade gliom cellinjer såsom U251 och KNS42^9,10, 5 x 10³ celler/ml kommer att producera en mikroskopiskt synlig sfäroid (200 eller 800 μm) efter 4 dagar av inkubering.
5. Omsuspendera cellerna i universella rör genom att försiktigt inversion för att undvika cell clumping. Pipettera 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn på en 96-brunn-platta. Om alla brunnar inte behövs, är det tillrådligt att lägga till 200 μL 1x PBS till varje tom brunn för att undvika avdunstning.
6. Inkubera cellerna i en inkubator som vanligt vid 37 ° c.
   Anmärkning: Cellinjer såsom gliom cancer cellinjer kommer att bilda spheroids inom 24 h. Tillåt 3D cellulära arkitektur att bildas genom inkuberande den sfäroid för 72 h.

Dag 2

7. Kontrollera celler med ljus fält mikroskopi efter 24 h. beroende på cellinjer, celler kan ha bildat en sfäroid detekterbar i botten av brunnen.
   Anmärkning: Etablerade gliom cancer cellinjer lätt bilda spheroids inom 24 h. patient-derived gliom cancer cellinjer kan ta upp till 1-2 veckor.

2. analys av kollagen invasion

Dag 3

1. Placera kollagen, 5x odlingssubstrat, 1 M NaOH, och 1 20 mL rör på is.
2. Försiktigt och tillsätt långsamt 10,4 mL kallt kollagen i ett kylt odlings rör. Undvik bubblor. Denna mängd kollagen är nog för 1 96-brunn plattan. Uppskalning är möjligt, men det rekommenderas att 1 20 mL tub per platta bereds åt gången.
3. Tillsätt försiktigt 1,52 mL kallt sterilt 5x odlingssubstrat. Undvik bubblor.
4. Strax före användning, tillsätt försiktigt 72 μL kallt sterilt 1 M NaOH. Håll lösningen på isen.
5. Blanda försiktigt genom pipettering. Undvik bubblor. Effektiv blandning leder till en färgförändring (från rött till orange-rött (pH 7,4) i mediet. Lämna blandningen på is tills den används.
6. Avgörande steg: ta bort 190 μL av supernatanten från 96-brunnen plattan beredd på dag 1. Var mycket noga med att inte störa spheroids som bildas i botten av brunnen. Använd pipetten i en vinkel mot sidan, inte i mitten, av brunnen.
7. Tillsätt försiktigt 100 μL av kollagen blandningen i varje brunn. För att förhindra sfäroid störning, Pipettera blandningen ner på sidan av brunnen. Undvik bubblor. Behåll eventuell kvarvarande kollagen blandning i 20 mL-röret vid rumstemperatur för att bedöma polymerisation.
8. Inkubera plattan i inkubatorn i minst 10 minuter så att kollagenet kan polymerisera. Som en riktlinje, om överblivna kollagen har satt, blir halvfasta och svamp-liknande, spheroids är redo att behandlas med hämmare.
9. Tillsätt läkemedlen eller inhibitorer vid 2x koncentration till odlingsmediet. Tillsätt mediet försiktigt till varje brunn (100 μL per brunn). Återigen, Pipettera mediet ner på sidan av brunnen för att undvika sfäroid störning.
10. Observera och bild varje sfäroid av Bright-fältmikroskopi ibland T = 0 h, 24 h, 48 h, och 72 h för att bedöma drog aktivitet. Sedan tillbaka plattan till inkubatorn.
    Anmärkning: Beroende på den invasiva beteende cell linjen, migration bort från den ursprungliga sfäroid kärna kan observeras från 24 h och framåt.

3. beredning av kollagen inbäddade spheroids och flytt celler för konfokalmikroskopi

1. Placera plattan i en vävnad kultur huva och försiktigt bort supernatanten (200 μL). Återigen, noga med att inte störa sfäroid och undvika att röra kollagen, eftersom detta kan störa kollagen pluggen.
2. Byt ut supernatanten mot 100 μL 1x PBS. Upprepa detta tvättsteg 3x.
3. Ta bort den sista tvätten och Ersätt med 4% formaldehyd i 1x PBS (100 μL per brunn).
   Försiktighet: Formaldehyd är en potentiell carcinogen. Hantera med omsorg i enlighet med hälso-och säkerhetsriktlinjer.
4. Placera 96-brunnen plattan på en Lab bänk, täck med folie, och låt verka 24 h vid rumstemperatur.
5. Ta försiktigt bort formaldehyd och Ersätt med 1x PBS. Upprepa denna 1x PBS tvätta 3x.
6. Förbered 0,1% Triton X-100 i 1x PBS. Ta bort 1x PBS tvätta och Ersätt med 100 μL av Triton X-100 lösning. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Under tiden, Förbered den blockerande lösningen med 1x PBS och 0,05% skummjölkspulver och blanda grundligt.
7. Ta bort Triton X-100 och tvätta 3x med 1x PBS. Tillsätt 100 μL blockerande lösning till varje brunn och inkubera i 15 min.
8. Späd den erforderliga primära antikroppen i blockerande buffert vid den förutbestämda koncentrationen. Här, använda anti-mus IgG acetylerade tubulin antikropp (1:100).
9. Centrifugera den primära antikropps blockerande buffertblandningen i 5 minuter vid 15 682 x g. Ta försiktigt bort den blockerande lösningen och tillsätt supernatanten (25 − 50 μL) till varje brunn. Inkubera i mörkret vid rumstemperatur under 1 h.
10. Ta bort antikroppslösningen och tvätta 3x med 1x PBS (100 μL per brunn).
11. Späd ut sekundär antikropp i blockeringsbufferten vid den rekommenderade eller förutbestämda koncentrationen utöver eventuella ytterligare fluorescerande fläckar. Här använder 1:500 anti-Mouse fluorophore-488 konjugerad antikropp, phalloidin-594 (1:500) för aktin färgning, och DNA fläcken (DAPI).
12. Återigen Centrifugera den sekundära antikroppslösningen i 5 minuter vid 13 000 RPM.
13. Ta bort den blockerande lösningen från varje brunn och tillsätt 25 − 50 μL av den sekundära antikroppen/phalloidin/DAPI-blandningen. Inkubera i mörker för 1,5 h vid rumstemperatur.
14. Ta bort sekundär antikropp-Dye lösning och tvätta 3x med 1x PBS (100 μL per brunn).
15. Försiktigt lyfta enskilda kollagen pluggar genom sug med en plastpipett (200 μL) på mitten av en högkvalitativ Plain glas Slide.
16. Tillsätt en droppe av en passande monteringsmedel till kollagen pluggen, se till att pluggen är helt täckt. Undvik bubblor.
17. Applicera täckglas av den optimala tjocklek för mikroskopet mål som kommer att användas för avbildning och gör det möjligt att ställa över natten. Förvara bilderna i rumstemperatur i mörker.

4. fluorescens mikroskopi

1. Fånga fluorescerande bilder med ett lämpligt konfokalmikroskop.

Representative Results

Tredimensionell sfäroid teknologi främjar förståelsen av läkemedelsinteraktioner, eftersom det är mer representativt för den cancerspecifika miljön. Generering av spheroids kan uppnås på flera sätt; låg adherencen 96-brunn pläterar användes i detta protokoll. Efter att ha testat flera produkter från olika tillverkare, de plattor som används här valdes eftersom de genomgående presterade bäst när det gäller framgångsrik sfäroid produktion och enhetlighet. Ersättnings steget, där odlingsmediet ersätts med kollagen matrisen, är en kritisk punkt i protokollet. stor försiktighet måste iakttas för att avlägsna det mesta av mediet utan att störa sfäroid själv. Automatiserad avbildning för karakterisering av läkemedelsinducerade effekter av wide-fältmikroskopi kan övervägas för att avlägsna alla hanterarfördomar, men för närvarande är kommersiellt tillgängliga instrument fortfarande betydligt dyrare än de avbildningsmetoder beskrivs här.

Wide-fält epifluorescens mikroskopi möjliggör undersökning av effekten av drog aktivitet på cell migration och invasion. Men den resolution som uppnås från bredfältsmikroskopi är inte tillräckligt bra för att möjliggöra en detaljerad tolkning av resultaten när det gäller läkemedels effekt på cellmorfologin (figur 1). Här beskrivs beredningen av gliom spheroids och flytt av celler genom lätt reproducerbara färgprotokoll, följt av avbildning med hjälp av ett konfokala Mikroskop. Från wide-fältet mikroskopi bildanalys, det var uppenbart att olika morfologiska förändringar hade inträffat i gliom celler efter behandling med mi-192-hämmare, men tydligt definierade Detaljer saknades. Konfokalmikroskopi bekräftade de första resultaten, och dessa högre upplösning bilder tillät bedömningen av effekten av MI-192 ytterligare. Signifikanta skillnader mellan obehandlad (kontroll) spheroids, migrerande celler (figur 2), och behandlade spheroids och celler (figur 3) blev uppenbar. Medan den vuxna gliom cellinjer U251 verkade migrera i "spikar", strålar bort från den ursprungliga sfäroid kärna med enstaka celler lossnar, den pediatriska cellinjer KNS42 antagit ett blad-liknande migrationsmönster med några distinkta cell spikar. Tidigare, olika migrationsmönster bland olika cellinjer (här vuxna gliom cellinjer U251 och barn cell line KNS42) observerades, potentiellt återspeglar den celltyp de uppstod från och plats för tumör isolering. Avgörande, en ökning av acetylerade tubulin med ökande inhibitor koncentration (från 0,1 − 10 μM) avslöjades också, inte bara i de migrerande cellerna, men också i sfäroid-associerade celler. Detta var inte tydligt i den initiala wide-fält mikroskopi förvärvade bilder. Ytterligare avbildning skulle också möjliggöra kvantitativ analys av protein uttrycks nivåer som ett cellulärt svar på behandling med migrastatiska hämmare.

I denna studie, det visades att cellerna förändrats morfologiskt som svar på behandling; cell avrundning blev uppenbar med ökande inhibitor koncentrationer och celldöd vid den högsta inhibitoren koncentrationen (10 μM), med nukleär fragmentering tydligt i U251 celler och kollapsade mikrotubuli och nukleär fragmentering i KNS42. Dessa fynd är i linje med tidigare observationer att den anti-flyttande aktiviteten av mi-192 på gliom cellinjer är koncentrationsberoende^13,14. Det övergripande arbetsflödet för protokollet avbildas i figur 4.

Figur 1: spheroid cell invasion i kollagen avbildas av wide-fältmikroskopi. Representativa bilder av cellinjer U251 och KNS42 visas efter behandling med inhibitor MI-192 vid den anti-flyttande koncentrationen av 1 μM och med 24 h mellanrum. En kontroll sfäroid utan behandling visas också. Potentiella anti-eller Pro-migrationseffekter upptäcks som markerade (pilar). Detta är särskilt märkbar i KNS42 med till synes ingen migration i antingen kontroll eller behandlade spheroids. Alla bilder togs på 4x. Skalstapel = 1 000 μm. Skalstapel i förstorade bilder för SF188 = 200 μm, KNS42 = 1 000 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: effekten av den migrastatiska hämmaren mi-192 på gliom cellinjer U251 avslöjad av konfokalmikroskopi. Fasta och färgade gliom spheroids och flytt celler uppvisar distinkta flyttande fenotyper. Flytt celler som ligger nära de ursprungliga sfäroid kanterna visas. U251 cell spheroids kännetecknas av spikar strålar bort från den ursprungliga sfäroid med ökande cell avrundning i celler uppenbara med ökande inhibitor koncentration (pil indikerar cell Spike). Scale bar = 10 μm. Etiketter: röd = Actin, grön = acetylerade tubulin, blå = DAPI. För varje bild fångades ett enda representativt optiskt avsnitt med alla inställningar med både pre-och post-Image Capture bibehålls i jämförande syfte. Alla bilder bearbetades därefter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: effekten av den migrastatiska hämmaren mi-192 på gliom-celllinjen KNS42 avslöjad av konfokalmikroskopi. KNS42 migration kännetecknas av sheetlike utskjutande delar med Single cell spikes (pil indikerar cell Sheet). Vid den lägsta hämmare koncentrationen denna fenotyp verkar vara uttalad men går förlorad med ökande inhibitor koncentration (Scale bar = 10 μm); Etiketter: röd = Actin, grön = acetylerade tubulin, blå = DAPI. För varje bild fångades en enda representativ optisk sektion, med alla inställningar med både före och efter bildfångst bibehålls i jämförelsesyfte. Alla bilder bearbetades därefter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Sammanfattning av arbetsflödet. Införlivas i detta arbetsflöde är generering av spheroids, inbäddning i kollagen, läkemedelsbehandling, fixering, färgning, och avbildning av konfokala mikroskopi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Ett nytt sätt att skapa cancer cell spheroids för identifiering av migrastatic drog aktivitet med högupplöst konfokalmikroskopi beskrivs. Användningen av låga anhängare plattor över andra tekniker, såsom hängande droppar¹⁵, har underlättat ett sätt att generera reproducerbara och enhetliga spheroids för användning i kollagen migration och invasions analyser. De kritiska punkterna i detta protokoll är avlägsnandet av odlingssubstrat från 96-brunn plattan före cellen sfäroid inbäddning i en kollagen matris och noggrann hantering av kollagen pluggar som innehåller spheroids därefter. Ny teknik som digital mikrofluidik¹⁶ finns nu tillgängliga och, även om dyrare, skulle kunna utgöra ett alternativ till manuell borttagning av media och vätskor. Den huvudsakliga begränsningen av det beskrivna protokollet är att det är tidskrävande när enstaka sfäoider avbildas och sedan analyseras manuellt av ljus fältmikroskopi för att bedöma hämmare av läkemedels aktivitet. Dessutom, de reagens som krävs för alla steg i processen är dyra, och specialiserad utrustning, nämligen en högupplöst konfokal Mikroskop, krävs också. Optimala cell nummer som krävs för sådd och den tid det tar att få en cell sfäroid av erforderlig storlek också måste vara förutbestämd innan början av kollagen invasion analysen.

Utvecklingen av läkemedel riktade mot cancerceller, storskalig Drug screening, och karakterisering av drog aktivitet för läkemedels förändringar och förbättring förlitar sig alltmer på 3D cell analyser och teknik. Detta protokoll kan optimeras och anpassas för användning med andra experimentella analyser och många andra celltyper av betydelse i andra sjukdoms system. Hittills har tolkningen av data som genereras mikroskopiskt har hämmats av tillämpningen av bred fält mikroskopi, med bilder som förvärvats erbjuder begränsad upplösning och plågas av inneboende bild oskärpa till följd av ljus med ursprung utanför fokalplan. Den wide-fält mikroskopi bilder som visas här förvärvades manuellt med hjälp av en EVOS Imaging system, en process som var tidskrävande och kan potentiellt införa handler bias. Nya tekniker, inklusive automatiserade arbetsstationer och analysplattformar^17,18, finns nu tillgängliga men är fortfarande kostsamma och är därför ännu inte tillgängliga för många forskningslaboratorier. Dessutom kan ytterligare programvaruutveckling stöd i analysen av högupplösta 3D-renderade bilder för att exakt kvantifiera fenotypiska förändringar som de noterade här, och därmed effekten av hämmare på cell migration. Dessutom kommer tillämpningen av super-resolution fluorescerande avbildning tekniker som alltmer blir standard i många forskningslaboratorier ger ytterligare insikt i migrations beteende och morfologi av celler som odlas i 3D sfäroid strukturer och behandlas med hämmare läkemedel.

Det fastställdes att det är möjligt att fastställa och fläta spheroids, efter behandling med en migrastatic hämmare, när de är inbäddade i kollagen. Denna metod var lätt att utföra, med alla steg som slutförts i 96-bra tallrikar, följt av montering av kollagen pluggar som innehåller spheroids på täckglas för avbildning. Vid bedömningen av effekten av hämmare aktivitet på cancer cellmorfologi, var konfokalmikroskopi används för att belysa drog aktivitet. Initiala fynd på den anti-flyttande effekten av inhibitor MI-192 från lågupplöst bilder bekräftades av högupplöst konfokalmikroskopi. Denna särskilda hämmare riktar Histon histondeacetylas 3 (HDAC3). HDACs är enzymer som är involverade i den epigenetiska regleringen av genuttryck och har nyligen varit av ökande intresse som potentiella mål i utvecklingen av cancerläkemedel. Tidigare erfarenheter med MI-192 har visat att, vid låga koncentrationer, det reglerar acetylering av tubulin, leder till hyperacetylering och stabilisering av mikrotubuli. Stabiliserade mikrotubuli är mindre dynamiska, med en potentiell effekt på migrationsverksamhet av celler. Det konstaterades att den observerade effekten var närvarande i både representativa pediatriska och vuxna gliom cellinjer. En koncentrationsberoende ökning av tubulin acetylering status av både gliom cellinjer avslöjades, ett konstaterande som har konsekvenser för preselection av patienter när man överväger kompletterande behandling med migrastatic läkemedel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.