Summary
هنا ، ونحن وصف طريقه لتسليم المخدرات إلى الجهاز العصبي المركزي الفئران عن طريق زرع قسطرة في الفضاء داخل البراز القطني من العمود الفقري. ونحن نركز علي تسليم قله الكريات الأقليات انتيسنس ، علي الرغم من ان هذه الطريقة هي مناسبه لتسليم الطرائق العلاجية الأخرى ، وكذلك.
Abstract
حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو دفاع مهم ضد مدخل العوامل التي يحتمل ان تكون سامه أو المسببة للامراض من الدم إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS). ومع ذلك ، فان وجودها يقلل أيضا بشكل كبير من امكانيه الوصول إلى العوامل العلاجية الخاضعة للنظام الجهازي للجهاز العصبي الخاص. طريقه واحده للتغلب علي هذا ، هو حقن تلك العوامل مباشره في السائل النخاعي (الدماغي الشوكي) ، التالي تجاوز BBB. ويمكن القيام بذلك عن طريق غرس القسطرة اما للحقن المستمر باستخدام مضخة اوموتيك ، أو للتسليم بالبولي واحد. في هذه المقالة ، ونحن وصف بروتوكول العمليات الجراحية لتسليم الموجات العصبية التي تستهدف مضادات الأقليات (ASOs) عن طريق القسطرة زرعت مباشره في الفضاء المساواة متلازم من العمود الفقري الفئران الكبار. وكنتائج تمثيليه ، فاننا نظهر فعاليه حقنه واحده من البولي بالبراز (IT) من خلال نظام القسطرة هذا في إسقاط الجيش النيبالي الريبي المستهدف في مناطق مختلفه من الفئران CNS. الاجراء أمن وفعال ولا يتطلب معدات باهظه الثمن أو أدوات جراحيه. ويمكن تكييف التقنية الموصوفة هنا لتقديم الادويه في طرائق أخرى أيضا.
Introduction
وقد تطور نظام الاوعيه الدموية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) كمنظم الحرجة من التوازن ، والسيطرة علي حركه المرور من الجزيئات ، وتوفير المواد الغذائية والتخلص من النفايات. هذا النظام هو أيضا خط الدفاع الأول من هجمات مسببات الامراض الخارجية ، وذلك بفضل التوزيع الكثيف لتقاطعات ضيقه علي طول جدران الخلايا البطانية. هذه التقاطعات الضيقة تشكل جانبا واحدا من حاجز الدم في الدماغ (BBB). في حين يسمح BBB نقل الجزيئات المطلوبة لتلبيه الاحتياجات الغذائية والطاقة (علي سبيل المثال ، الأيونات والجلوكوز) ، فانه يحد أيضا بشكل انتقائي مرور مسببات الامراض وكذلك المواد الكيميائية السامة1،2،3.
ومن المفارقات ان نفس وظيفة الحماية من BBB التي تحد من مرور مسببات الامراض والمواد الكيميائية السامة هي أيضا العقبة الرئيسية امام قدرتنا علي الوصول بسهوله إلى الجهاز العصبي العام مع العلاجات العلاجية بعد الاداره الجهازية للكائن2، 4,5. وقد حفز هذا الدور لتطوير مجموعه كبيره من التكنولوجيات والنهج الجديدة لتوزيع المخدرات6.
طريقه واحده للتغلب علي هذه العقبة هو حقن المخدرات مباشره في السائل النخاعي (السائل الدماغي الشوكي) التي perfuses باستمرار كل من الدماغ والحبل الشوكي7,8,9,10. في هذه المقالة ، ونحن وصف طريقه لتسليم العملاء بنجاح في الفضاء داخل البراز القطنية عن طريق وضع الطرف الداخلي للقثطار تماما في الفضاء المساواة متلازم من العمود الفقري الفئران. وقد سبق ان نشر السيد مازور وآخرون وصفا لهذا الاجراء في الأماكن الأخرى11.
والبروتوكول فعال جدا وينتج معدل نجاح أكبر من 90 في المائة من التسليم المضاد لقله الكريات الوحيدة المفعول (ASO) إلى النظام العصبي الوطني عند تقييمه بواسطة تحليل تفاعل البلمره الكمي (qPCR) للجينات المستهدفة بالضربة القاضية8. الاجراء يسبب الحد الأدنى من الانزعاج للحيوانات ، كما 100 ٪ من الفئران البقاء علي قيد الحياة الجراحة وتظهر الحد الأدنى من التورم حول الجرح الجراحي وعدم وجود علامات الاستغاثة (علي سبيل المثال ، فرط النشاط ، والجفاف ، وتحلق ، وفقدان التوازن ، وانخفاض كميه الطعام ، و الجفاف) خلال فتره ما بعد العملية المراقبة. ميزه أخرى من الطريقة الموصوفة هنا هو انه لا يتطلب معدات باهظه الثمن ، ولا اي أدوات خاصه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات المجرية في اطار البروتوكولات المعتمدة للجنة المعنية بالاستخدام الحيواني والرعاية المؤسسية Biogen (IACUC) التي تتبع المبادئ التوجيهية التي وضعها دليل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة لرعاية واستخدام الماشية المختبرية.
1. اعداد المواد والاداهات
- اعداد الدليل الخاص الاكله.
- استخدام أداه دواره مع عجله قطع (أو منشار حاد) لقطع نهايات اثنين من ابره 19 G ، مما ادي إلى ~ 1.5 − 2 سم دليل طويل قني (الشكل 1aiii). استخدم عجله الطحن للاداه الدوارة لتنعيم الطرفين.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن شراء cannulas دليل المسبقة والعقيمة من بائع تجاري (جدول المواد).
- استخدام أداه دواره مع عجله قطع (أو منشار حاد) لقطع نهايات اثنين من ابره 19 G ، مما ادي إلى ~ 1.5 − 2 سم دليل طويل قني (الشكل 1aiii). استخدم عجله الطحن للاداه الدوارة لتنعيم الطرفين.
- اعداد القسطرة/الأسلاك الجمعية.
- قطع قطعه طويلة 8 سم من الأنابيب PE-10 (أنابيب البولي إيثيلين ، قطر 0.011 بوصه) لتكون بمثابه القسطرة داخل البراز. جعل علامة 2 سم من نهاية واحده مع القلم علامة مقاومه الايثانول. قطع سلك مرود طوله 11 سم من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدا تترافلوروايثيلين المغلفة. ادخل السلك مرود (الشكل 1Aii) في تجويف القسطرة PE-10 (الشكل 1Ai).
ملاحظه: واحد القسطرة/سلك مجموعه الجمعية (الشكل 1Av) هو مطلوب لكل الحيوانية. بدلا من ذلك ، يمكن شراء القسطرة والأسلاك مرود من بائع تجاري (جدول المواد).
- قطع قطعه طويلة 8 سم من الأنابيب PE-10 (أنابيب البولي إيثيلين ، قطر 0.011 بوصه) لتكون بمثابه القسطرة داخل البراز. جعل علامة 2 سم من نهاية واحده مع القلم علامة مقاومه الايثانول. قطع سلك مرود طوله 11 سم من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدا تترافلوروايثيلين المغلفة. ادخل السلك مرود (الشكل 1Aii) في تجويف القسطرة PE-10 (الشكل 1Ai).
- اعداد تجميع القسطرة التسليم.
- قطع قطعه من القسطرة PE-50 (5 − 10 سم ، أنابيب البولي إيثيلين ، قطر 0.023 بوصه) (الشكل 1Bi). إلى نهاية واحده من القسطرة PE50 ادراج محول أنابيب 23 G (الشكل 1biv). سيتم توصيل هذه النهاية إلى حقنه 100 μL (جدول المواد) اثناء الجراحة. ادراج ابره معدله 30 G مع محور قطع (الشكل 1biii) إلى حوالي 0.5 سم قطعه من الأنابيب pe-10 (الشكل 1biii) وربط أنابيب pe-10 إلى الطرف الآخر من القسطرة.
- سيتم توصيل نهاية الابره 30 G من الجمعية القسطرة التسليم (الشكل 1Bv) إلى النهاية البعيدة من القسطرة PE-10 مزروع في الفئران اثناء الجراحة.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن شراء التجميع القسطرة التسليم (الشكل 1Bv) من بائع تجاري (جدول المواد).
- اعداد دليل قني-ابره الجمعية (الشكل 1Avi) عن طريق وضع دليل قني (الشكل 1aiii) علي نهاية الابره 23 غرام.
- تعقيم جميع الاداات الجراحية بما في ذلك قني دليل والأسلاك/القسطرة مجموعات باستخدام معقم أكسيد الإيثيلين لمده 12 ساعة.
ملاحظه: يمكن تعقيم جميع الاداات الجراحية باستثناء القسطرة. سوف تذوب القسطرة في درجه حرارة عاليه.
2. اعداد الجراحة
ملاحظه: يتم تنفيذ هذا الاجراء بشكل روتيني علي الذكور والإناث Sprague Dawley الفئران مع أوزان الجسم بين 200 g و 400 g. يتم إيواء اثنين من الفئران لكل قفص تحت دوره الضوء/الظلام 12 ح مع الوصول المجاني إلى الطعام والماء.
- وزن الفئران ووضعها في غرفه ايزوفلواني للحث علي التخدير (1 − 5 ٪ ايزوفلواني في O2، معاير للتاثير).
ملاحظه: ثم تخدير الفئران بشكل مستمر مع ايزوفلونان للحفاظ علي التخدير العميق عبر مخروط الأنف طوال العملية. ويمكن استخدام طريقه التخدير البديلة (علي سبيل المثال ، أداره الكيتامين 100 ملغم/كغ و اكسيليازين 10 مغ/كغ) كما وافق عليها IACUC. - عندما يفشل الجرذ في الاستجابة لقرصه اصبع القدم ، يحلق ظهره من الذيل إلى العمود الفقري الصدري الذيليه ووضع الفئران حلق علي ورقه معقمه وضعت علي راس لوحه التدفئة.
- وضع أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 ml تحت بطن الجرذ لثني العمود الفقري في المنطقة القطنية (الشكل 2ا) وتطبيق مرهم العيون علي العينين.
- حقن الإفراج المستمر البوبرينورفين (1.0 مغ/كغ; جدول المواد) جلد في الجرذ. نظف البشرة المكشوفة بالتناوب مع التقشير الكحولي وفرك الكحول وكرر هذا ثلاث مرات.
ملاحظه: يمكن استخدام تخفيف الم بديله كما وافق عليها بروتوكول IACUC. - ثني الحيوانية مع ستاره شفافة معقمه التي تم تصنيفها علي موقع الجراحة.
3-الجراحة
- مع الفئران المدعومة من أنبوب مخروطي 50 mL ، تحديد الحفر الطبيعية اثنين بين العضلات فوق الحوض (الأسهم في الشكل 2ا). مع يد واحده عقد تلك الحفر ، واستخدام اليد الأخرى للضغط برفق ويشعر العمود الفقري من الذيليه إلى اتجاه منقاري والعثور علي المسافة البادئة الرئيسية الاولي بين الفقرات وهذا هو الفضاء بين الفقرية S1 و L6 الفقرات (الشكل 2ب ).
- تحرك بشكل طفيف للتعرف علي المسافة البادئة التالية ، والمساحة بين الفقرتين L5 و L6 وموقع الحقن (* في الشكل 2ا). استخدام مشرط لجعل شق لا يزيد عن 2 سم طويلة في الجلد علي طول الخط الأوسط من منقاري إلى الذيليه حتى ان موقع الحقن هو في مركز الشق (خط منقط في الشكل 2ا).
- استخدام مقص تشريح لتشريح بعيدا النسيج الضام من أجل تصور طبقه العضلات. ثم اجراء شق 1 سم في كبسوله العضلات الجانبية فورا إلى عمليه العمود الفقري الظهرية من الفقرة القطنية L6.
ملاحظه: يمكن تصور عظام الفقرة القطنية L6 في هذه المرحلة. - وضع دليل الجمعية ابره cannula بالقرب من الجانب الامامي من الفقرة القطنية السادسة ودفعها إلى الفضاء الفقري علي طول الجانب الامامي من الفقرة السادسة بحيث تخترق نهاية الابره القناة الشوكية. دفع قني دليل في مكان علي طول الابره وأزاله الابره 23 G ترك فقط قني دليل في مكان.
ملاحظه: من المفيد استخدام ملقط حاد لتحديد العملية الظهرية لفقره L6 القطنية قبل إدخال الابره. عموما ، يمكن رؤية السائل الدماغي الشوكي دخول محور ابره (قد يكون هذا السائل مشوبة مع اشاره من الدم ، ولكن هذا لا يشير إلى ان الضرر قد تم أو ان الابره لا توضع بشكل صحيح). ولم ير المؤلفون كميه كبيره من الدم أو نزيفا شديدا خلال هذا الاجراء. إذا حدث اي منهما ، يجب الاتصال بطبيب بيطري لتحديد العلاج المناسب وإذا كان ينبغي ان تكون الرحيم الحيوانية. - ادخل الجمعية القسطرة الأسلاك في cannula دليل. زاوية أسفل القسطرة سلك الجمعية في حوالي 45 درجه زاوية إلى القناة الشوكية وفرض نهاية تقريبا 0.3 سم في القناة الشوكية.
- أزاله الدليل cannula ، وترك القسطرة مع السلك مرود في مكان. أزاله السلك مرود حوالي 2.5 سم من الطرف داخل البراز من القسطرة وتقدم القسطرة في القناة الشوكية حتى علامة 2 سم هو عند مدخل القناة (مرئية فقط تحت العضلات) كما هو مبين في الشكل 1جزر فيرجنالعذراء.
ملاحظه: يجب توسيع القسطرة المدرجة rostrally في الفضاء تحت العنكبوتية. وينبغي ان يسمح التنسيب الناجح بالحركة الحرة للقثطار في تلك المساحة. - سحب تماما السلك مرود ، ويمكن رؤية السائل الدماغي الشوكي دخول القسطرة مزروع.
- قم بتوصيل تجميع قسطرة التسليم بالطرف البعيد للقثطار المزروع عبر نهاية الابره التي تبلغ 30 جرام (الشكل 1Bv ، vi).
- تحميل 60 μL من المحلول الملحي المعقم في حقنه 100 μL (بيغ حقنه). تحميل البلعه من 30 μl من مركب الاختبار (علي سبيل المثال ، حل اسو) في حقنه ثانيه (حقنه حقن).
- توصيل حقنه بيغ (محمله المالحة) إلى نهاية محول الأنابيب من التجمع القسطرة التسليم (الشكل 1Bv). حقن 20 μL من المحلول الملحي المعقم في الفضاء داخل البراز (تنظيف ما قبل الحقن).
- قم بتوصيل حقنه الحقن (محمله بمركب الاختبار) إلى نهاية محول الأنابيب لتجميع قسطرة التسليم (الشكل 1Bv). حقن 30 μL من مركب الاختبار في الفضاء داخل البراز أكثر من 30 ثانيه.
ملاحظه: حجم الحقن الروتينية من ASO هو 30 μL لتحقيق ضربه قاضيه جيده في الحبل الشوكي وفي القشرة. وقد أفيد بان احجام الحقن قد تؤثر علي التوزيع المركب12، علي الرغم من عدم اختبار احجام الحقن المختلفة. في حاله استخدام مركب أو وحده تخزين أخرى ، يجب تحديد السلامة والفعالية بشكل تجريبي. - كرر الخطوة 3.10 ومسح القسطرة مع آخر 40 μL من المحلول الملحي المعقم (بعد الحقن بيغ). ثم افصل التجميع قسطرة التسليم من القسطرة المزروعة.
ملاحظه: ويعتقد ان ما قبل وبعد حقن دافق للحد من تنحيه المحلية للمركبات وتحسين توزيعها علي الهياكل منقاري12. - يقطع القسطرة المزروعة والحرارة بشكل قطعي: ضعي زوجا من ملقط التشريح المعقم في معقم الخرزة حتى تكون ساخنه جدا ، ثم قم بالتضييق علي الأنبوب مع الطرف الساخن من الملقط.
ملاحظه: هذا الاجراء يذوب القسطرة. وهكذا ، يتم طي الحفرة في الأنبوب وجميع الأطراف التمسك بعضها البعض ، وختم الأنابيب بطريقه عقيمه ومن ثم يتم وضعها في الفضاء تحت الجلد. - استخدم الخيوط القابلة للامتصاص لتامين القسطرة المتبقية المختومة بالحرارة إلى النسيج الضام. ثم استخدم الغرز غير القابلة للامتصاص لإغلاق الجلد علي القسطرة الامنه المختومة بالحرارة.
ملاحظه: يمكن أيضا استخدام قصاصات الجرح كما هو معتمد من قبل بروتوكول IACUC. هذه التقنية متوافقة مع الحقن المتكررة علي الرغم من انها قد استخدمت فقط لحقن مره واحده في ايدينا. وينبغي تقييم جدوى الحقن المتكررة تجريبيا مع موافقه IACUC. - استخدام الشاش والمالحة لغسل اي دم من الجلد والسماح للحيوان للتعافي من التخدير في حاضنه ساخنه حتى المحمول ، وعند هذه النقطة يتم إرجاعه إلى قفصه الرئيسي (اثنين من الفئران لكل قفص).
ملاحظه: عند اجراء العمليات الجراحية علي الفئران متعددة في نفس اليوم ، وأداات نظيفه باستخدام الماء لأزاله الدم وأعاده تعقيم باستخدام معقم حبه جافه ساخنه (لمده 20 ثانيه علي الأقل ، مع الوقت لتبرد) بين الحيوانية. يتم استخدام مجموعه جديده من الاداات كل 5 الحيوانية. - راقب الماشية يوميا لمده 3 أيام علي الأقل بعد الجراحة واستمر في مراقبه الماشية أسبوعيا بعد التعافي من الجراحة وفقا لبروتوكول IACUC.
ملاحظه: إذا حدثت اي مضاعفات (احتباس البول ، التهابات الشق ، الاضطرابات العصبية مثل النوبات أو الشلل) ، يجب الاتصال بطبيب بيطري لتحديد العلاج المناسب وإذا كان ينبغي ان رحيم الماشية. إذا لم يتم استخدام الإفراج المستمر البوبرينورفين ، وينبغي إعطاء تخفيف الم يوميا بعد الجراحة وفقا لبروتوكول iacuc.
4. تقييم الانسجه المحددة بالضربة القاضية بعد حقن تكنولوجيا الوصول
- بعد أسبوعين من حقن البولي فانه من أسوس ، وجمع مناطق مختلفه من الدماغ (اي القشرة الدماغية ، المخطط والمخيخ) ، فضلا عن أجزاء مختلفه من الحبل الشوكي (اي ، عنق الرحم والصدر والقطني). استخراج الكلي الانسجه RNA باستخدام التجارية الجيش النيبالي الريبي استخراج عده وأداء cDNA رد فعل التوليف كما هو موضح سابقا13.
ملاحظه: تم استخدام الكواشف القياسية ل qPCR مع الاختبارات التالية: الفئران Malat1 والفئران جابده. وقد تم حساب المستويات النسبية للنص باستخدام الأسلوب 2-ΔδCt (ct = دوره العتبة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، قمنا بحقن مجموعتين من الجرذان الانثويه البالغة (250 − 300 غ ؛ ن = 10/مجموعه) اما بالنسبة لكل من الفوسفات المخزن بالمحلول الملحي أو 300 ميكروغرام من اسو التي تستهدف التشفير الطويل غير الترميز (لينك) RNA Malat1 ؛ في مختبرنا نستخدم بشكل روتيني Malat1 ASO كمركب أداه ، لأنه يتم التعبير عن Malat1 بشكل مطلق وعلي مستويات عاليه في جميع الانسجه14، بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي. Malat1 ASO يعمل عن طريق اليه بوساطة RNaseH115 الذي يحط من الحمض الريبي ، مما يؤدي إلى ضربه قاضيه (KD). في التجربة الموصوفة هنا ، جمعنا مناطق مختلفه من الدماغ (مثل القشرة الدماغية ، المخطط والمخيخ) وكذلك الجزء القطني من الحبل الشوكي ، بعد أسبوعين من تسليم ASO. ثم تم استخراج الحمض الريبي النيبالي من كل من المنطقة التي تم جمعها وتحليلها عن طريق qPCR ، لتقييم مستويات التعبير من Malat1 RNA.
عندما يكون الوكيل المختبر هو ASO ، نوصي بما يلي: 1) دائما جمع مناطق متعددة من النظام العصبي العام ، من أجل مقارنه فعاليه اسو ؛ 2) بالنظر إلى التعقيد التقني للأسلوب الجراحي ، نوصي بتضمين مجموعه مراقبه ايجابيه ، حيث يتم اختبار مركب مع الخصائص الدوائية والدوائية الراسخة (اي ، Malat1 ASO في مختبرنا) بالتوازي مع وكيل الاختبار ؛ وهذا سيوفر معلومات عن فعاليه العمليات الجراحية ، وينبغي الحصول علي نتائج غير متوقعه أو غير قابله للتفسير (علي سبيل المثال ، عدم وجود أو عدم كفاية التنظيم الحمض الريبي النيبالي).
في التجربة الموصوفة هنا ، حصلنا علي دينار كويتي جيد جدا في جميع المناطق التي تم جمعها ، كما هو مبين في الشكل 3. ومع ذلك ، فقد لاحظنا درجه من التقلب الإقليمي مع الحبل الشوكي الذي يظهر اعلي نسبه مئوية من القشرة المخية (لحاء المخ = 87% دينار كويتي ، المخطط = 77% دينار كويتي ، المخيخ = 74% دينار كويتي ، الحبل الشوكي = 94% دينار كويتي). لم نتمكن من الوصول اليها في الجسم الفعال ضربه قاضيه في وقت سابق من 2 أسابيع بعد الجراحة. في تجاربنا مع العديد من ASOs ، اكتشفنا ضربه قاضيه كبيره من الجينات المستهدفة تصل إلى 6 − 8 أسابيع بعد الجراحة (البيانات لم تظهر). وينبغي اجراء دراسة بالدورة الزمنيه إذا كانت كفاءه الضربة القاضية التي تعتمد علي الوقت بالبالضبط والتي تكون ذات فائده.
الشكل 1: المواد المخصصة ومجموعات القسطرة المستخدمة في الحقن داخل البراز. (ا) يتم اجراء القسطرة/الأسلاك الجمعية (v) عن طريق ادراج السلك مرود (2) في تجويف القسطرة PE-10 (ط). يتم اجراء الجمعية الابره (vi) عن طريق إدخال ابره 23 G في تجويف الدليل قني (iii). (ب) يتم اجراء التجميع القسطرة التسليم (v) عن طريق ربط محول الأنابيب إلى نهاية واحده من القسطرة pe-50 وربط قطع 30 G ابره في الطرف الآخر باستخدام قطعه من القسطرة pe-10 (2) كمحول. خلال العملية الجراحية ، يتم توصيل نهاية الابره التي تبلغ 30 غ من التركيب الخاص بقسطرة التوصيل (v) إلى اعلي القسطرة المزروعة (vi) ، بعد إدخال الطرف الآخر من القسطرة المزروعة في الحيز الموجود داخل البراز للحيوان. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد موقع الحقن وخط الشق. (A) مع البطن من الفئران بدعم من أنبوب مخروطي 50 mL ، وينظر بسهوله الحفرتين بين العضلات فوق الحوض (السهام). (ب) بيد واحده تحمل الحفر ، استخدم اليد الأخرى للضغط برفق والشعور بالعمود الفقري والعثور علي المسافة بين الفقرتين L5 و L6 ، اي موقع الحقن (* في اللوحة A). يظهر الخط المنقط في اللوحة A خط الشق مع موقع الحقن في مركزه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: A البلعه واحد حقن IT من ASOs يقلل الفئران Malat1 في الجسم الفيفو. قمنا بحقن البلعه واحد من اما تلفزيوني أو 300 ميكروغرام من Malat1 ASO; بعد أسبوعين من الجراحة جمعنا مناطق مختلفه من الجهاز العصبي الخاص وكميه مستويات التعبير من Malat1 RNA. حصلنا علي الدينار الكويتي جيده من Malat1 RNA في جميع المناطق تحليلها ، مع بعض التباين بين المناطق (القشرة الدماغية = 87 ٪ دينار كويتي ، سترياتوم = 77 ٪ دينار كويتي ، المخيخ = 74 ٪ دينار كويتي ، الحبل الشوكي = 94 ٪ دينار كويتي ، القضبان خطا = ± SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتبين هذه المادة طريقه قويه لتسليم العوامل العلاجية مباشره إلى الفئران العصبية. من الناحية النظرية ، يمكن أيضا ان يتم تنفيذ تقنيه مماثله في الفئران ، علي الرغم من انه نظرا لصغر حجمها ، فان الطريقة يمكن ان تكون أكثر تحديا. ولذلك ، تقوم مجموعتنا باجراء حقن البطين البطيني (ICV) في الفئران لتسليم المخدرات CNS ، والتي تصل إلى نفس الأهداف من خلال مسار مختلف من الاداره. وقد وصفت هذه الطريقة في دراسة أخرى16.
ميزه الطريقة الموصوفة هنا هي انه لا يتطلب معدات باهظه الثمن ، ولا اي أدوات خاصه. نوصي باعداد تجميع القسطرة/الأسلاك المبين في الشكل 1في وقت مبكر. يجب علي المرء اعداد ما لا يقل عن العديد من الجمعيات القسطرة/الأسلاك كما ان هناك الفئران في الدراسة ، علي الرغم من اننا نقترح اعداد بعض اضافيه القسطرة/الأسلاك الجمعيات في حاله تلف بعض أو تحتاج إلى استبدال اثناء الجراحة.
بمجرد إتقان هذه التقنية ، يتطلب الاجراء الموصوف بالبالكامل حوالي 25 دقيقه لكل جرذ ، مما يسمح بعلاج العديد من الفئران في غضون يوم واحد. إذا كان شخص واحد يؤدي الجراحة علي الفئران الاولي ، وشخص ثان لا التحضير الجراحي علي الفئران المقبل ، ويمكن معالجه اثنين من الفئران في نفس الوقت للحد من كل وقت الحيوانية. للمشغل يتقن ، لا يزال هناك فرصه صغيره لابره للوصول إلى الفضاء فوق الجافية بدلا من الفضاء تحت العنكبوتية. ملاحظه التدفق الخلفي السائل الدماغي الشوكي هو مؤشر جيد للوضع ابره الصحيح ولكنها ليست مثاليه. نوصي بان يتم اجراء فحص المشاركة المستهدفة مثل تحليل الضربة القاضية RNA الموصوفة في جلسة النتائج لتاكيد التسليم الصحيح لمجمع الاختبار.
ويعد إنشاء تقنيات مثل التقنية الموصوفة هنا ، أمرا حاسما لتطوير خط أنابيب أبحاث قبل السريرية القوية التي يمكن ان تقدم العلاجات التي تستهدف الموجات العصبية. في الواقع ، فانه تسليم ASOs كتدخل علاجي هو الأسلوب الذي يجري حاليا استكشاف لعلاج العديد من الاضطرابات في الCNS17،18،19،20. Nusinersen ، وهو علاج اسو القائم علي ضمور العضلات الشوكي (SMA) المرضي ، تمت الموافقة مؤخرا في العديد من الأسواق في جميع انحاء العالم ، مما يدل علي تطبيق هذه الطريقة أيضا لمرضي الأطفال21،22، 23-الآن
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين جميعا من العاملين في Biogen ، وشركه أو Ionis الصيدلة. يتلقى المؤلفات المضادة [اولنوكليوتيدس] [انتيسنس] يوصف في المادة من [ايويس] مستحضرات صيدلانيه.
Acknowledgments
ونود ان نشكر Ionis الصيدلة لتوريد ASOs الموصوفة في المقالة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | |
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | |
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | |
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | |
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | |
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | |
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | |
| Povidone scrub | PDI | S48050 | |
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | |
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | |
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | ||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | |
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | ||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | ||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | |||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | |
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | |
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | |
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Greene, C., Campbell, M. Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules. Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).
- Daneman, R., Engelhardt, B. Brain barriers in health and disease. Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).
- Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. Recent advances in delivery through the blood-brain barrier. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).
- Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. A new look at cerebrospinal fluid circulation. Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).
- Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor. Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).
- Wahlestedt, C., et al. Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions. Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).
- Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science. 259 (5094), 528-531 (1993).
- Mazur, C., et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).
- Wolf, D. A., et al. Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).
- Becker, L. A., et al. Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice. Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).
- Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions. RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).
- Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).
- Schoch, K. M., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases. Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).
- Lane, R. M., et al. Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease. Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Antisense oligonucleotides in neurological disorders. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
- Haché, M., et al. Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience. Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).
- Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy. Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Nusinersen for spinal muscular atrophy. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
