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Neuroscience

चूहा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स का अंत:केंद्र वितरण

Published: October 29, 2019 doi: 10.3791/60274
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1, 1, 1, 1
1Biogen, Inc., 2Ionis Pharmaceuticals
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम रीढ़ की हड्डी के काठ का इंट्राथेकल अंतरिक्ष में एक कैथेटर प्रत्यारोपण द्वारा चूहे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए दवाओं को वितरित करने के लिए एक विधि का वर्णन. हम antisense oligonucleotides के वितरण पर ध्यान केंद्रित है, हालांकि इस विधि के रूप में अच्छी तरह से अन्य चिकित्सीय रूपरेखा के वितरण के लिए उपयुक्त है.

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में रक्त से संभावित विषाक्त या रोगजनक एजेंटों के प्रवेश के खिलाफ एक महत्वपूर्ण रक्षा है। हालांकि, इसके अस्तित्व में भी नाटकीय रूप से सीएनएस के लिए व्यवस्थित रूप से प्रशासित चिकित्सीय एजेंटों की पहुंच कम करती है। इस पर काबू पाने के लिए एक तरीका है, उन एजेंटों को सीधे मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में इंजेक्ट करना है, इस प्रकार बीबीबी को दरकिनार करना। यह एक परासरणी पंप का उपयोग कर या तो निरंतर जलसेक के लिए एक कैथेटर के प्रत्यारोपण के माध्यम से किया जा सकता है, या एकल बोलस वितरण के लिए. इस लेख में, हम एक कैथेटर के माध्यम से सीएनएस-लक्ष्यीकरण antisense oligonucleotides (ASOs) की डिलीवरी के लिए एक शल्य प्रोटोकॉल का वर्णन वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी के cauda evina अंतरिक्ष में सीधे प्रत्यारोपित. प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हम चूहे सीएनएस के विभिन्न क्षेत्रों में लक्ष्य आरएनए नीचे दस्तक में इस कैथेटराइजेशन प्रणाली के माध्यम से एक एकल बोलस ASO इंट्राथेकल (आईटी) इंजेक्शन की प्रभावकारिता दिखाते हैं। प्रक्रिया सुरक्षित, प्रभावी है और महंगा उपकरण या शल्य चिकित्सा उपकरण की आवश्यकता नहीं है. यहाँ वर्णित तकनीक के रूप में अच्छी तरह से अन्य तरीकों में दवाओं देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के संवहनी प्रणाली homeostasis के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में विकसित किया गया है, अणुओं के यातायात को नियंत्रित करने, पोषक तत्वों की आपूर्ति और कचरे से छुटकारा मिल रहा है. यह प्रणाली बाहरी रोगजनकों के हमलों से रक्षा की पहली पंक्ति भी है, एंडोथेलियल कोशिकाओं की दीवारों के साथ तंग जंक्शनों के घने वितरण के लिए धन्यवाद। इन तंग जंक्शनों रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) का एक पहलू बना. जबकि बीबीबी पोषक तत्व ों और ऊर्जा की मांग (जैसे, आयनों, ग्लूकोज) को पूरा करने के लिए आवश्यक अणुओं के परिवहन की अनुमति देता है, यह चुनिंदा रोगजनकों के मार्ग के साथ-साथ जहरीले रसायनों1,2,3को भी सीमित करता है।

विडंबना यह है कि BBB का एक ही सुरक्षात्मक कार्य है कि रोगजनकों और विषाक्त रसायनों के पारित होने को सीमित करता है भी हमारे आसानी से जीव के लिए प्रणालीगत प्रशासन के बाद चिकित्सीय उपचार के साथ सीएनएस का उपयोग करने की क्षमता के लिए प्रमुख बाधा है2, 4,5. बीबीबी की इस भूमिका ने नई औषध वितरण प्रौद्योगिकियों के विकास औरदृष्टिकोण 6के विकास को प्रेरित किया है .

इस बाधा को दूर करने का एक तरीका यह है कि दवाओं को सीधे मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ ) में इंजेक्ट किया जाए जो मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डीदोनोंको लगातार 7 ,8,9,10तक ले जाता है . इस आलेख में, हम चूहे की रीढ़ की हड्डी के cauda इक्विना अंतरिक्ष में पूरी तरह से कैथेटर के आंतरिक अंत रखकर काठ का अंत अंतरिक्ष में एजेंटों को सफलतापूर्वक वितरित करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रक्रिया का विवरण पहले मजूर एट अल कहीं और11द्वारा प्रकाशित किया गया था.

प्रोटोकॉल बहुत प्रभावी है और लक्ष्य जीन दस्तक 8 के मात्रात्मक पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया (QPCR) विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन जब सीएनएस के लिए antisense ओलिगोन्यूक्लिओटाइड (ASO) वितरण की एक से अधिक 90% सफलता दर का उत्पादन करताहै। प्रक्रिया जानवरों के लिए कम से कम असुविधा का कारण बनता है, के रूप में चूहों के 100% सर्जरी जीवित रहने और शल्य चिकित्सा घाव और संकट का कोई संकेत के आसपास कम से कम सूजन दिखाने (जैसे, सक्रियता, निर्जलीकरण, चक्कर, संतुलन की हानि, भोजन का सेवन कम, और निर्जलीकरण) पोस्ट-ऑप अवलोकन के दौरान। विधि का एक और लाभ यहाँ वर्णित है कि यह महंगा उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और न ही किसी विशेष उपकरण.

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Protocol

सभी विवो प्रक्रियाओं में बायोजेन संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति (IACUC) अनुमोदित प्रोटोकॉल जो प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य गाइड द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों का पालन के तहत प्रदर्शन किया गया.

1. सामग्री और साधन की तैयारी

  1. विशेष गाइड cannulas तैयार करें.
    1. कट-ऑफ व्हील (या एक तेज आरी) के साथ एक रोटरी उपकरण का उपयोग करने के लिए एक 19 जी सुई के दो सिरों में कटौती, एक में जिसके परिणामस्वरूप एक $1.5 डिग्री 2 सेमी लंबी गाइड cannula (चित्र 1Aiii). दो सिरों चिकनी करने के लिए रोटरी उपकरण के पीसने पहिया का प्रयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, पूर्व निर्मित और बाँझ गाइड cannulas एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा जा सकता है (सामग्री की तालिका).
  2. कैथेटर/वायर असेंबली तैयार करें।
    1. इंट्राथेकल कैथेटर के रूप में सेवा करने के लिए पीई-10 ट्यूबिंग (पॉलीथीन ट्यूबिंग, व्यास 0.011 इंच) का 8 सेमी लंबा टुकड़ा काटें। एक इथेनॉल प्रतिरोधी मार्कर कलम के साथ एक छोर से एक निशान 2 सेमी बनाओ. पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन लेपित स्टेनलेस स्टील के तार से एक 11 सेमी लंबे स्टाइल तार को काटें। पीई-10कैथेटर के लुमेन में स्टाइलट तार डालें (चित्र1ऐ).
      नोट: एक कैथेटर/वायर असेंबली सेट (चित्र 1अव) प्रत्येक जानवर के लिए आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, कैथेटर और स्टाइल तारों एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा जा सकता है(सामग्री की तालिका).
  3. वितरण कैथेटर विधानसभा तैयार करें।
    1. पीई-50 कैथेटर (5 डिग्री 10 सेमी, पॉलीथीन ट्यूबिंग, व्यास 0.023 इंच) का एक टुकड़ा काटें(चित्र 1द्वि)। PE50 कैथेटर के एक छोर पर 23 जी ट्यूबिंग एडेप्टर डालें (चित्र 1बीव)। इस अंत को सर्जरी के दौरान 100 डिग्री सेल्सियस सिरिंज (सामग्री की तालिका) से जोड़ा जाएगा। हब कट ऑफ के साथ एक संशोधित 30 जी सुई डालें (चित्र 1Biii) पीई-10 ट्यूबिंग के लगभग 0.5 सेमी टुकड़े में (चित्र 1बिई) और पीई-10 ट्यूबिंग को कैथेटर के दूसरे छोर से जोड़ें।
    2. प्रसव कैथेटर विधानसभा के 30 जी सुई अंत (चित्र 1बीवी) सर्जरी के दौरान चूहे में प्रत्यारोपित पीई-10 कैथेटर के जिला अंत से जोड़ा जाएगा।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, वितरण कैथेटर विधानसभा (चित्र 1Bv) एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा जा सकता है ( सामग्रीकी तालिका).
  4. गाइड कैनुला-सुई एसेम्बली (चित्र 1एवी) को 23 जी सुई के अंत में एक गाइड कैनुला ( चित्र1Aiii) रखकर तैयार करें।
  5. गाइड कैनुला और तार /कैथेटर सहित सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों का बंध्याकरण 12 एच के लिए एक एथिलीन ऑक्साइड स्टरलाइज़र का उपयोग कर सेट।
    नोट: कैथेटर को छोड़कर सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों autoclaved किया जा सकता है; कैथेटर उच्च तापमान पर पिघल जाएगा।

2. सर्जरी की तैयारी

नोट: इस प्रक्रिया को नियमित रूप से 200 ग्राम और 400 ग्राम के बीच शरीर के वजन के साथ पुरुष और महिला Sprague Dawley चूहों पर किया जाता है. दो चूहों को 12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र के तहत पिंजरे में रखा जाता है जिसमें भोजन और पानी तक निशुल्क पहुंच होती है।

  1. एक चूहा वजन और संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए एक आइसोलुरेन कक्ष में जगह (1 $5% isoflurane ओ2में , प्रभाव के लिए titrated).
    नोट: चूहा तो लगातार प्रक्रिया के दौरान एक नाक शंकु के माध्यम से गहरी संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए isoflurane के साथ एनेस्थेटाइज किया जाता है। एक वैकल्पिक संज्ञाहरण विधि (जैसे, केटामाइन का प्रशासन 100 मिलीग्राम/किग्रा और xylazine 10 मिलीग्राम/किलोग्राम) का उपयोग आईएसयूसी द्वारा अनुमोदित किया जा सकता है।
  2. जब चूहा एक टो चुटकी का जवाब करने में विफल रहता है, पुच्छव वक्ष रीढ़ की हड्डी के लिए पूंछ से अपनी पीठ दाढ़ी और एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखी एक बाँझ चादर पर मुंडा चूहे जगह है.
  3. कटि क्षेत्र में रीढ़ को फ्लेक्स करने के लिए चूहे के पेट के नीचे 50 मिलीलीटर शंकु अपकेंद्रण ट्यूब की स्थिति (चित्र 2ए) और आंखों पर नेत्र मलम लागू करें।
  4. इंजेक्शन निरंतर रिलीज buprenorphine (1.0 mg/ सामग्री की तालिका) चूहे में subcutaneously. बारी povidone और शराब scrubs के साथ उजागर त्वचा को साफ और यह तीन बार दोहराएँ.
    नोट: एक वैकल्पिक दर्द से राहत IACUC प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. एक बाँझ पारदर्शी कपड़ा है कि शल्य चिकित्सा स्थल पर fenestrated किया गया है के साथ जानवर को ड्रेप.

3. सर्जरी

  1. 50 एमएल शंकु नली द्वारा समर्थित चूहे के साथ, श्रोणि के ऊपर की मांसपेशियों के बीच दो प्राकृतिक गड्ढों की पहचान करें (चित्र 2एमें तीर )। एक हाथ से उन गड्ढों को पकड़े हुए, दूसरे हाथ का उपयोग धीरे से प्रेस और रोस्ट्रल दिशा के लिए पुच्छ से रीढ़ महसूस करने के लिए और कशेरुक के बीच पहली प्रमुख इंडेंटेशन खोजने के लिए और यह S1 और L6 कशेरुक के बीच अंतरकशेरुक अंतरिक्ष है (चित्र 2बी ).
  2. अगले इंडेंटेशन की पहचान करने के लिए थोड़ा रोस्ट्रोली ले जाएँ, L5 और L6 कशेरुकी और इंजेक्शन साइट के बीच अंतरकशेरुकी अंतरिक्ष (* चित्र 2एमें )। रोस्ट्रल से पुच्छ तक मिडलाइन के साथ त्वचा में 2 सेमी से अधिक लंबा चीरा बनाने के लिए स्कैल्पल का उपयोग करें ताकि इंजेक्शन साइट चीरा के केंद्र में हो (चित्र 2एमें डॉटेड लाइन )।
  3. मांसपेशी परत कल्पना करने के लिए संयोजी ऊतक को अलग करने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। फिर L6 कटि कशेरुक के पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी की प्रक्रिया के लिए तुरंत पार्श्व मांसपेशी कैप्सूल में एक 1 सेमी चीरा बनाते हैं।
    नोट: L6 कठकी कशेरुक की हड्डियों इस बिंदु पर कल्पना की जा सकती है.
  4. 6 वीं काठ की कशेरुक ी के पूर्ववर्ती पहलू के पास गाइड कैनुला-नेडलए असेंबली को स्थिति दें और इसे 6 कशेरुक के पूर्ववर्ती पहलू के साथ अंतरकशेरुकी अंतरिक्ष में धकेल दें ताकि सुई का अंत रीढ़ की हड्डी में प्रवेश कर सके। सुई के साथ जगह में गाइड cannula धक्का और जगह में केवल गाइड cannula छोड़ने 23 जी सुई को हटा दें।
    नोट: यह सुई डालने से पहले L6 काठ का कशेरुक के पृष्ठीय प्रक्रिया का पता लगाने के लिए कुंद forceps का उपयोग करने के लिए उपयोगी है. आम तौर पर, सीएसएफ तरल पदार्थ सुई हब में प्रवेश देखा जा सकता है (इस तरल पदार्थ रक्त का एक संकेत के साथ tinged किया जा सकता है, लेकिन यह संकेत नहीं है कि नुकसान किया गया है या सुई सही ढंग से नहीं रखा गया है). लेखकों रक्त या गंभीर खून बह रहा है इस प्रक्रिया के दौरान बड़ी मात्रा में नहीं देखा है. यदि या तो होता है, एक पशु चिकित्सक उचित उपचार निर्धारित करने के लिए संपर्क किया जाना चाहिए और अगर जानवरों euthanized किया जाना चाहिए.
  5. गाइड कैनुला में कैथेटर-वायर असेंबली डालें। रीढ़ की हड्डी नहर के लिए लगभग एक 45 डिग्री कोण पर कैथेटर-वायर विधानसभा नीचे कोण और रीढ़ की हड्डी नहर में लगभग 0.3 सेमी के अंत को मजबूर.
  6. गाइड cannula निकालें, जगह में स्टाइल तार के साथ कैथेटर छोड़ने. कैथेटर के इंट्राथेकल टिप से लगभग 2.5 सेमी स्टाइल तार निकालें और कैथेटर को रीढ़ की हड्डी में तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि 2 सेमी का निशान नहर के प्रवेश द्वार पर न हो (केवल मांसपेशियों के नीचे दिखाई दे) जैसा कि चित्र 1बीवीमें दिखाया गया है।
    नोट: डाला कैथेटर sarrachnoid अंतरिक्ष में rostrally का विस्तार करना चाहिए. सफल प्लेसमेंट उस अंतरिक्ष में कैथेटर के मुक्त आंदोलन के लिए अनुमति देनी चाहिए.
  7. पूरी तरह से स्टाइल तार वापस लेने, और सीएसएफ प्रत्यारोपित कैथेटर में प्रवेश देखा जा सकता है.
  8. 30 जी सुई अंत के माध्यम से प्रत्यारोपित कैथेटर के distal अंत करने के लिए वितरण कैथेटर विधानसभा कनेक्ट (चित्र 1Bv,vi) .
  9. एक 100 डिग्री सिरिंज (प्रवाह सिरिंज) में बाँझ नमकीन के 60 डिग्री एल लोड करें। एक दूसरे सिरिंज (इंजेक्शन सिरिंज) में परीक्षण यौगिक (उदा., ASO समाधान) के 30 $L के एक बोलस लोड करें।
  10. फ्लशिंग सिरिंज (लवण के साथ भरी हुई) को डिलीवरी कैथेटर असेंबली के ट्यूबिंग एडेप्टर अंत से कनेक्ट करें (चित्र 1Bv)। इंट्राथेकल स्पेस (पूर्व-इंजेक्शन फ्लशिंग) में बाँझ लवण के 20 डिग्री एल इंजेक्शन।
  11. इंजेक्शन सिरिंज कनेक्ट करें (परीक्षण यौगिक के साथ भरी हुई) प्रसव कैथेटर विधानसभा के ट्यूबिंग एडेप्टर अंत करने के लिए (चित्र 1बीवी)। परीक्षण यौगिक के 30 डिग्री सेल्सियस को 30 s से अधिक इंट्राथेकल स्पेस में इंजेक्ट करें।
    नोट: ASO की नियमित इंजेक्शन मात्रा है 30 $L रीढ़ की हड्डी में और प्रांतस्था में अच्छा दस्तक प्राप्त करने के लिए. यह सूचित किया गया है कि इंजेक्शन की मात्रा यौगिक वितरण को प्रभावित कर सकताहै 12,हालांकि विभिन्न इंजेक्शन मात्रा का परीक्षण नहीं किया गया है. यदि अन्य यौगिक या मात्रा का उपयोग किया जाता है, सुरक्षा और प्रभावशीलता अनुभवजन्य निर्धारित करने की आवश्यकता है.
  12. चरण 3.10 दोहराएँ और बाँझ नमकीन (पोस्ट इंजेक्शन फ्लशिंग) के एक और 40 डिग्री एल के साथ कैथेटर फ्लश। फिर प्रत्यारोपित कैथेटर से वितरण कैथेटर असेंबली को अलग करें।
    नोट: पूर्व और बाद इंजेक्शन फ्लश यौगिकों के स्थानीय अलगाव को कम करने और rostral संरचनाओं12करने के लिए उनके वितरण में सुधार करने के लिए सोचा है।
  13. Aseptically कटौती और गर्मी सील प्रत्यारोपित कैथेटर: एक मनका sterilizer में बाँझ विच्छेदन संदंश की एक जोड़ी प्लेस जब तक वे बहुत गर्म कर रहे हैं, तो संदंश के गर्म अंत के साथ ट्यूबिंग पर नीचे दबाना.
    नोट: यह कार्रवाई कैथेटर पिघला देता है. इस प्रकार, ट्यूब में छेद ढह गया है और सभी पक्षों को एक दूसरे से चिपके रहते हैं, एक aseptic फैशन में ट्यूबिंग सील और फिर यह subcutaneous अंतरिक्ष में रखा गया है.
  14. संयोजी ऊतक के लिए शेष गर्मी सील कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए अवशोषित monofilament टांके का उपयोग करें। फिर सुरक्षित गर्मी सील कैथेटर पर त्वचा को बंद करने के लिए गैर-अवशोषीय मोनोफिलामेंट टांके का उपयोग करें।
    नोट: घाव क्लिप भी IACUC प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. तकनीक दोहराया इंजेक्शन के साथ संगत है, हालांकि यह केवल हमारे हाथों में एक बार इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है. दोहराया इंजेक्शन की व्यवहार्यता अनुभवजन्य आईएसयूसी के अनुमोदन के साथ मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
  15. त्वचा से किसी भी रक्त को धोने के लिए धुंध और नमकीन का उपयोग करें और जानवर को मोबाइल तक गर्म इनक्यूबेटर में संज्ञाहरण से ठीक होने की अनुमति दें, जिस पर यह अपने घर पिंजरे (पिंजर प्रति दो चूहों) को वापस कर दिया जाता है।
    नोट: एक ही दिन में कई चूहों पर सर्जरी प्रदर्शन करते समय, साफ उपकरण पानी का उपयोग करने के लिए रक्त को हटाने और फिर से एक गर्म सूखी मनका स्टरलाइज़र का उपयोग कर स्टरलाइज़ (कम से कम 20 s के लिए, समय के साथ शांत करने के लिए) जानवरों के बीच. उपकरणों का एक नया सेट हर 5 जानवरों का उपयोग किया जाता है।
  16. सर्जरी के बाद कम से कम 3 दिनों के लिए दैनिक जानवरों की निगरानी और IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार सर्जरी से उबरने के बाद साप्ताहिक जानवरों की निगरानी करने के लिए जारी है।
    नोट: यदि कोई जटिलता (मूत्र प्रतिधारण, चीरा संक्रमण, जब्ती या पक्षाघात जैसे न्यूरोलॉजिकल विकार) होते हैं, तो उचित उपचार निर्धारित करने के लिए एक पशुचिकित्सक से संपर्क किया जाना चाहिए और यदि जानवरों को इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। यदि निरंतर रिलीज buprenorphine प्रयोग नहीं किया जाता है, दर्द से राहत IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार सर्जरी के बाद दैनिक दिया जाना चाहिए.

4. आईटी इंजेक्शन के बाद ऊतक विशिष्ट दस्तक का मूल्यांकन

  1. एएसओ के आईटी बोलस इंजेक्शन के दो सप्ताह बाद, मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों (यानी, सेरेब्रल कॉर्टेक्स, स्ट्रायटम और सेरिबैलम) के साथ-साथ रीढ़ की हड्डी के विभिन्न खंडों (यानी, गर्भाशय ग्रीवा, वक्षक, और काठ) इकट्ठा करते हैं। एक वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर कुल ऊतक आरएनए निकालें और पहले13वर्णित के रूप में cDNA संश्लेषण प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं।
    नोट: मानक अभिकर्मकों निम्नलिखित परख के साथ QPCR के लिए इस्तेमाल किया गया: चूहा Malat1 और चूहा GAPDH. संबंधित प्रतिलिपि स्तर की गणना 2-$CT विधि(CT ] थ्रेशोल्ड चक्र) का उपयोग करके की गई थी.

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Representative Results

यहाँ वर्णित विधि का उपयोग करते हुए, हमने वयस्क मादा चूहों के दो समूहों (250$300 ग्राम; n $ 10/समूह) को या तो फॉस्फेट-बफर नमकीन पीबीएस का एक एकल बोलस या ASO के 300 ग्राम लंबे गैर-कोडिंग (लिन्क) आरएनए Malat1 को लक्षित करने के साथ इंजेक्शन लगाया; हमारी प्रयोगशाला में हम नियमित रूप से एक उपकरण यौगिक के रूप में Malat1 ASO का उपयोग करें, क्योंकि Malat1 सर्वव्यापी और सभी ऊतकों में उच्च स्तर पर व्यक्त की है14, मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी सहित. Malat1 ASO एक RNaseH1 मध्यस्थता तंत्र15 कि आरएनए नीचा, दस्तक (केडी) के लिए अग्रणी के माध्यम से काम करता है. यहाँ वर्णित प्रयोग में, हम मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों एकत्र (यानी, सेरेब्रल कॉर्टेक्स, striatum और सेरिबैलम) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रीढ़ की हड्डी का काठ का खंड, ASO के वितरण के बाद दो सप्ताह. एकत्र क्षेत्र में से प्रत्येक से आरएनए तो निकाला गया था और QPCR के माध्यम से विश्लेषण, Malat1 आरएनए की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए.

जब परीक्षण एजेंट एक ASO है, हम अनुशंसा करते हैं: 1) हमेशा CNS के कई क्षेत्रों को इकट्ठा, ASO प्रभावकारिता की तुलना करने के लिए; 2) शल्य चिकित्सा विधि की तकनीकी जटिलता को देखते हुए, हम एक सकारात्मक नियंत्रण समूह को शामिल करने की सलाह देते हैं, जहां अच्छी तरह से स्थापित फार्माकोकाइनेटिक और फार्माकोडायनामिक गुणों के साथ एक यौगिक (यानी, हमारी प्रयोगशाला में Malat1 ASO) परीक्षण एजेंट के समानांतर में परीक्षण किया जाता है; यह सर्जरी की प्रभावशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करेगा, अप्रत्याशित या अस्पष्ट परिणाम प्राप्त किया जाना चाहिए (उदा., की कमी या अपर्याप्त आरएनए विनियमन).

यहाँ वर्णित प्रयोग में हमने एकत्र किए गए सभी क्षेत्रों में बहुत अच्छी केडी प्राप्त की, जैसा कि चित्र 3में दर्शाया गया है। हालांकि, हम रीढ़ की हड्डी के साथ क्षेत्रीय परिवर्तनशीलता के कुछ डिग्री का पालन किया था केडी के उच्चतम प्रतिशत दिखा (सेरेब्रल कॉर्टेक्स - 87% केडी, striatum - 77% केडी, सेरिबैलम - 74% केडी, रीढ़ की हड्डी की हड्डी ] 94% केडी). हम 2 सप्ताह के बाद सर्जरी से पहले vivo knockdown दक्षता में प्रवेश नहीं किया है. कई ASOs के साथ हमारे अनुभवों में, हम अप करने के लिए लक्ष्य जीन के महत्वपूर्ण दस्तक का पता चला 6-8 सप्ताह के बाद सर्जरी (डेटा नहीं दिखाया). यदि किसी दिए गए ASO की सटीक समय-निर्भर नॉकडाउन दक्षता ब्याज की है तो एक समय-पाठ्यक्रम अध्ययन किया जाना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: अनुकूलित सामग्री और कैथेटर सेट इंट्राथेकल इंजेक्शन में इस्तेमाल किया। (अ)कैथेटर/वायर एसेम्बली (अ) पीई-10 कैथेटर (प) के लुमेन में स्टाइलतार (पप) डालने से किया जाता है। कैनुला/सुई असेंबली (vi) गाइड कैनुला (पप) के लुमेन में 23 जी सुई डालने से बनाई जाती है। (बी) डिलीवरी कैथेटर असेंबली (v) पीई-50 कैथेटर के एक छोर से ट्यूबिंग एडाप्टर को जोड़ने और पीई-10 कैथेटर (ii) के एक टुकड़े का उपयोग करते हुए दूसरे छोर में कट 30 जी सुई को जोड़ने के द्वारा किया जाता है। सर्जरी के दौरान, डिलीवरी कैथेटर विधानसभा के 30 जी सुई अंत (v) प्रत्यारोपित कैथेटर (vi) के शीर्ष करने के लिए जुड़ा हुआ है, प्रत्यारोपित कैथेटर के दूसरे छोर के बाद जानवर के इंट्राथेकल अंतरिक्ष में डाला जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: इंजेक्शन साइट और चीरा लाइन की पहचान. (ए) 50 एमएल शंकु नली द्वारा समर्थित चूहे के पेट के साथ, श्रोणि के ऊपर की मांसपेशियों के बीच दो गड्ढों को आसानी से देखा जा सकता है (तीर) । (बी) एक हाथ से गड्ढों को पकड़े हुए दूसरे हाथ का उपयोग रीढ़ की हड्डी को धीरे से दबाकर महसूस करें और एल 5 और एल 6 कशेरुकके के बीच अंतरकशेरुकी स्थान को ढूंढें, अर्थात इंजेक्शन साइट (* पैनल ए में)। पैनल ए में डॉटेड लाइन अपने केंद्र में इंजेक्शन साइट के साथ चीरा लाइन से पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ASOs के एक एकल बोलस आईटी इंजेक्शन vivo में चूहे Malat1 कम कर देता है. हम या तो पीबीएस या Malat1 ASO के 300 डिग्री ग्राम के एक एकल बोलस इंजेक्शन; सर्जरी के दो सप्ताह बाद हम सीएनएस के विभिन्न क्षेत्रों एकत्र और Malat1 आरएनए की अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा निर्धारित. हम विश्लेषण सभी क्षेत्रों में Malat1 आरएनए की अच्छी केडी प्राप्त की, क्षेत्रों के बीच कुछ परिवर्तनशीलता के साथ (सेरेब्रल कॉर्टेक्स - 87% केडी, striatum - 77% केडी, सेरिबैलम - 74% केडी, रीढ़ की हड्डी ] 94% केडी; त्रुटि सलाखों ] SEM). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान लेख चूहे सीएनएस में सीधे चिकित्सीय एजेंटों देने के लिए एक शक्तिशाली विधि से पता चलता है. सिद्धांत रूप में, एक ऐसी ही तकनीक भी चूहों में प्रदर्शन किया जा सकता है, हालांकि छोटे आकार के कारण, विधि और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है. इसलिए, हमारे समूह सीएनएस दवा वितरण के लिए चूहों में intresrebroventricular (ICV) इंजेक्शन, जो प्रशासन के एक अलग मार्ग के माध्यम से एक ही लक्ष्य तक पहुँचने प्रदर्शन करता है. इस विधि का वर्णन एक अन्य अध्ययन16में किया गया है .

यहाँ वर्णित विधि का लाभ यह है कि यह महंगा उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और न ही किसी विशेष उपकरण. हम अनुशंसा करते हैं कि चित्र 1A में दिखाए गए कैथेटर/वायर असेंबली को समय से पहले तैयार करना। एक कम से कम के रूप में कई कैथेटर / तार विधानसभाओं तैयार करना चाहिए के रूप में वहाँ अध्ययन में चूहे हैं, हालांकि हम कुछ अतिरिक्त कैथेटर / तार विधानसभाओं की तैयारी के मामले में कुछ क्षतिग्रस्त कर रहे हैं या सर्जरी के दौरान प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता का सुझाव देते हैं.

एक बार तकनीक में महारत हासिल है, पूरी प्रक्रिया का वर्णन चूहे प्रति के बारे में 25 मिनट की आवश्यकता है, इस प्रकार एक दिन के भीतर कई चूहों के उपचार की अनुमति. यदि एक व्यक्ति पहले चूहे पर सर्जरी करता है, और एक दूसरे व्यक्ति अगले चूहे पर शल्य चिकित्सा तैयारी करता है, दो चूहों एक ही समय में संसाधित किया जा सकता है प्रति पशु समय को कम करने के लिए. एक कुशल ऑपरेटर के लिए, वहाँ अभी भी सुई के लिए एक छोटा सा मौका subarachnoid अंतरिक्ष के बजाय एपिड्यूरल अंतरिक्ष तक पहुँचने के लिए है. सीएसएफ backflow के अवलोकन सही सुई की स्थिति का एक अच्छा संकेत है, लेकिन यह सही नहीं है. हम अनुशंसा करते हैं कि परिणाम सत्र में वर्णित आरएनए नॉकडाउन विश्लेषण की तरह एक लक्ष्य सगाई परख परीक्षण यौगिक की सही वितरण की पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए।

इस तरह के एक यहाँ वर्णित के रूप में तकनीक की स्थापना, एक मजबूत पूर्व नैदानिक अनुसंधान पाइप लाइन है कि सीएनएस-लक्ष्यीकरण चिकित्सा अग्रिम कर सकते हैं के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. वास्तव में , एएसओ का आईटी वितरण एक चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में है जो वर्तमान में सीएनएस17,18,19,20के कई विकारों के उपचार के लिए पता लगाया जा रहा है . Nusinersen, रीढ़ की हड्डी पेशी शोष (SMA) रोगियों के लिए एक ASO आधारित उपचार, हाल ही में दुनिया भर के कई बाजारों में मंजूरी दे दी थी, बाल चिकित्सा रोगियों के लिए भी इस विधि की प्रयोज्यता का प्रदर्शन21,22, 23.

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Disclosures

लेखक Biogen, इंक या Ionis फार्मास्यूटिकल्स के सभी कर्मचारी हैं. लेखकों Ionis फार्मास्यूटिकल्स से लेख में वर्णित antisense ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स प्राप्त करते हैं.

Acknowledgments

हम लेख में वर्णित ASOs की आपूर्ति के लिए Ionis फार्मास्यूटिकल्स धन्यवाद देना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture 3M 1020
70% ethanol Decon Laboratories, Inc 8416-160Z
Alcohol swab sticks Dynarex NO 1204
BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip BD 1ml TB Luer-Lok tip BD 302830
BD Intramedic PE Tubing BD Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Tubing BD Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic PE Tubing Adapters BD 23 gauge intramedic luer stub adaper BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G BD BD 305128
Buprenorphine Sustained Release-lab ZooPharm Prescription required
Ethylene oxide sterilizer Andersen Sterilizer INC. AN 74i, gas sterilizer AN 74i
Guide cannula BD 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle BD 305186
Hamilton syringe 100ul Hamilton company Hamilton syringe 100ul
Hot bead Sterilizer Fine Science Tools STERILIZER MODELNO FST 250
Ophthalmic ointment Dechra veterranery product 17033-211-38
Pocket Pro Pet Trimmer Braintree Scientific CLP-9931 B
Povidone scrub PDI S48050
Saline Baxter Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml FE1306G
Scalpel Feather disposable scalpel No. 10
Small animal heating pad K&H Manufacturing Model # 1060
Stylet Wire McMaster-Carr 1749T14 LH-36233780
Surgery Towel drape Dynarex 4410
Surgical scissors and forceps FST and Fisher Scientific
Sutures Ethicon 4-0 or 5-0
Tool to make the Guide cannular Grainger Rotary tool (Dremel) 14H446 (Mfr: EZ456)
EZ lock cut off Wheel 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
Grinding Wheel, Aluminum Oxide 38EY44 (Mfr: EZ541GR)
EZ lock Mandrel 1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
Diamond wheel floor Tile 3DRN4 (Mfr: EZ545)
Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure
Dosing catheter system SAI Infusion Systems RIDC-01
Guide cannula SAI Infusion Systems RIDC-GCA
Internal Catheters SAI Infusion Systems RIDC-INC
Stylet Wire SAI Infusion Systems RIDC-STY

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 152 antisense ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स रक्त मस्तिष्क बाधा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र इंट्राथेकल वितरण चूहा आरएनए रीढ़ की हड्डी
चूहा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स का अंत:केंद्र वितरण
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Chen, Y., Mazur, C., Luo, Y., Sun,… More

Chen, Y., Mazur, C., Luo, Y., Sun, L., Zhang, M., McCampbell, A., Tomassy, G. S. Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System. J. Vis. Exp. (152), e60274, doi:10.3791/60274 (2019).

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