Summary
Burada, omurganın lomber intratekal uzayına bir kateter yerleştirerek sıçan merkezi sinir sistemine ilaç teslim etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem diğer terapötik yöntemlerin de teslimi için uygun olsa da, antisense oligonükleotidlerin teslimatına odaklanıyoruz.
Abstract
Kan beyin bariyeri (BBB) merkezi sinir sistemi (CNS) içine kan potansiyel toksik veya patojenik ajanların girişine karşı önemli bir savunmadır. Ancak, varlığı da önemli ölçüde CNS için sistematik olarak yönetilen terapötik ajanların erişilebilirliğini düşürür. Bunun üstesinden gelmek için bir yöntem, beyin omurilik sıvısı (BOS) içine doğrudan bu ajanları enjekte etmektir, böylece BBB atlayarak. Bu bir ozmotik pompa kullanarak sürekli infüzyon için bir kateter implantasyonu yoluyla yapılabilir, ya da tek bolus teslimat için. Bu makalede, cns hedefleyen antisense oligonükleotidlerin (ASOs) yetişkin sıçan omurgasının kauda equina alanına doğrudan yerleştirilen bir kateter aracılığıyla teslimi için bir cerrahi protokol açıklanır. Temsili sonuçlar olarak, sıçan CNS'nin farklı bölgelerinde hedef RNA'yı devirmede bu kateterizasyon sistemi ile tek bir bolus ASO intratekal (BT) enjeksiyonunun etkinliğini gösteriyoruz. Prosedür güvenli, etkili ve pahalı ekipman veya cerrahi aletler gerektirmez. Burada açıklanan teknik, diğer yöntemlerde de ilaç teslim etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Merkezi sinir sisteminin vasküler sistemi (CNS) homeostaz kritik bir düzenleyici olarak gelişti, moleküllerin trafiğini kontrol, besin temini ve atık kurtulmak. Bu sistem aynı zamanda endotel hücrelerinin duvarları boyunca sıkı kavşakların yoğun dağılımı sayesinde, dış patojenlerin saldırılarına karşı ilk savunma hattıdır. Bu sıkı kavşaklar kan beyin bariyerinin bir yönünü oluşturan (BBB). BBB besin ve enerji taleplerini karşılamak için gerekli moleküllerin taşınmasına izin verirken (örneğin, iyonlar, glikoz), aynı zamanda seçici olarak patojenlerin yanı sıra toksik kimyasalların geçişini de sınırlandırır1,2,3.
İronik olarak, bbb'nin patojenlerin ve toksik kimyasalların geçişini sınırlayan aynı koruyucu işlevi de, organizmaya sistemik uygulamadan sonra cns'ye terapötik tedaviler ile kolayca erişebilme yeteneğimizin önündeki en büyük engeldir2, 4,5. BBB'nin bu rolü, yeni uyuşturucu dağıtım teknolojilerinin bir bolluk ve yaklaşımlar bir bolluk gelişimini yol açmıştır6.
Bu engeli aşmak için bir yolu sürekli beyin ve omurilikhemde perfuses beyin omurilik sıvısı (BOS) içine doğrudan ilaç enjekteetmektir 7 ,8,9,10. Bu makalede, kateterin iç ucunu tamamen sıçan omurgasının kauda equina alanına yerleştirerek ajanları lomber intratekal alana başarılı bir şekilde teslim etme yöntemini açıklıyoruz. Bu prosedürün bir açıklaması daha önce Mazur ve ark. başka bir yerde11tarafından yayınlanmıştır .
Protokol çok etkilidir ve hedef gen knockdown8kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi ile değerlendirildiğinde CNS'ye antisense oligonükleotid (ASO) teslimatının %90'dan daha büyük bir başarı oranı üretir. İşlem hayvanlar için en az rahatsızlığa neden olur, çünkü sıçanların %100'ü ameliyattan sağ kurtulur ve cerrahi yaranın etrafında en az şişlik ve herhangi bir sıkıntı belirtisi göstermez (örn. hiperaktivite, dehidratasyon, daire çizme, denge kaybı, gıda alımında azalma ve dehidratasyon) post-op gözlem sırasında. Burada açıklanan yöntemin bir diğer avantajı pahalı ekipman, ne de herhangi bir özel araçlar gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm in vivo prosedürleri Biogen Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi (IACUC) onaylı protokoller altında laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzu tarafından belirlenen yönergeleri takip yapıldı.
1. Malzeme ve alet hazırlama
- Özel rehber kanüllerini hazırlayın.
- 19 G iğnenin iki ucunu kesmek için kesme tekerleği (veya keskin testere) olan bir döner alet kullanın ve bu da ~1,5−2 cm uzunluğundaki kılavuz kanülle sonuçlanır (Şekil 1Aiii). İki ucunu düzeltmek için döner aletin taşlama çarkını kullanın.
NOT: Alternatif olarak, önceden yapılmış ve steril kılavuz kanüller ticari bir satıcıdan satın alınabilir (Malzeme Tablosu).
- 19 G iğnenin iki ucunu kesmek için kesme tekerleği (veya keskin testere) olan bir döner alet kullanın ve bu da ~1,5−2 cm uzunluğundaki kılavuz kanülle sonuçlanır (Şekil 1Aiii). İki ucunu düzeltmek için döner aletin taşlama çarkını kullanın.
- Kateter/tel tertibatını hazırlayın.
- İntekkal kateter olarak hizmet vermek için 8 cm uzunluğunda bir PE-10 boru (polietilen boru, çap 0,011 inç) kesin. Etanol dirençli marker kalem ile bir ucundan 2 cm bir işaret yapın. Politetrafloroetilen kaplamalı paslanmaz çelik telden 11 cm uzunluğunda bir stylet telkesin. PE-10kateterinlüne stylet teli (Şekil 1Aii)yerleştirin (Şekil 1Ai).
NOT: Her hayvan için bir kateter/tel montaj seti(Şekil 1Av)gereklidir. Alternatif olarak, kateterler ve stylet tellerticari bir satıcıdan satın alınabilir(Tablo Malzemeler).
- İntekkal kateter olarak hizmet vermek için 8 cm uzunluğunda bir PE-10 boru (polietilen boru, çap 0,011 inç) kesin. Etanol dirençli marker kalem ile bir ucundan 2 cm bir işaret yapın. Politetrafloroetilen kaplamalı paslanmaz çelik telden 11 cm uzunluğunda bir stylet telkesin. PE-10kateterinlüne stylet teli (Şekil 1Aii)yerleştirin (Şekil 1Ai).
- Teslimat kateter montajını hazırlayın.
- Pe-50 kateter (5−10 cm, polietilen boru, çapı 0,023 inç)(Şekil 1Bi)bir parça kesin. PE50 kateterin bir ucuna 23 G boru adaptörü(Şekil 1Biv)takın. Bu uç, ameliyat sırasında 100 μL'lik bir şırıngaya(Malzeme Tablosu)bağlanır. Göbek kesilmiş modifiye edilmiş 30 G iğneyi(Şekil 1Biii)yaklaşık 0,5 cm'lik PE-10 boru parçasına(Şekil 1Bii)yerleştirin ve PE-10 boruyu kateterin diğer ucuna bağlayın.
- Doğum kateter tertibatının 30 G iğne ucu(Şekil 1Bv)ameliyat sırasında sıçanda implante edilen PE-10 kateterin distal ucuna bağlanır.
NOT: Alternatif olarak, teslimat kateter montajı(Şekil 1Bv)ticari bir satıcıdan(Malzeme Tablosu)satın alınabilir.
- Kılavuz kanül-iğne tertibatını(Şekil 1Avi)23 G iğnenin ucuna bir kılavuz kanül(Şekil 1Aiii)yerleştirerek hazırlayın.
- Kılavuz kanül ve tel/kateter setleri dahil olmak üzere tüm cerrahi aletleri 12 saat boyunca etilen oksit sterilizatörü kullanarak sterilize edin.
NOT: Kateter dışındaki tüm cerrahi aletler otoklavlanabilir; kateter yüksek sıcaklıkta eriyecektir.
2. Cerrahi hazırlık
NOT: Bu işlem rutin olarak erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanlarında vücut ağırlıkları 200 g ile 400 g arasında yapılır. İki sıçan, yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12 saat açık / karanlık döngüsü altında kafes başına ev sahipliği vardır.
- Ağırlık bir sıçan ve anestezi ikna etmek için bir isofluran odasına yerleştirin (1−5% isofluran O2, etkisi titrated).
NOT: Sıçan daha sonra sürekli işlem boyunca bir burun konisi ile derin anestezi korumak için isoflurane ile anestezi edilir. Alternatif anestezi yöntemi (örneğin, ketamin 100 mg/kg ve ksilazin 10 mg/kg) IACUC tarafından onaylanmış olarak kullanılabilir. - Sıçan bir parmak sıkışma yanıt başarısız olduğunda, kaudal torasik omurga için kuyruk sırtını tıraş ve bir ısıtma yastığı üstüne koydu steril bir levha üzerine tıraş lı sıçan yerleştirin.
- Lomber bölgede omurgayı esnetmek için farenin karnının altına 50 ml'lik konik santrifüj tüpü yerleştirin(Şekil 2A) ve gözlere oftalmik merhem uygulayın.
- Enjekte sürekli salınım buprenorfin (1.0 mg/kg; Malzeme Tablosu) sıçanda deri altı. Alternatif povison ve alkol önlük ile maruz kalan cildi temizleyin ve bu üç kez tekrarlayın.
NOT: Alternatif bir ağrı kesici IACUC protokolü tarafından onaylanmış olarak kullanılabilir. - Cerrahi bölge üzerinde fenestrated olan steril şeffaf bir perde ile hayvan drape.
3. Cerrahi
- 50 mL konik tüp tarafından desteklenen fare ile, pelvis üzerindeki kaslar arasındaki iki doğal çukuru tanımlayın (Şekil 2A'dakioklar). Bir elinizbu çukurları tutarken, diğer elinizi kaudal yöne hafifçe basmak ve hissetmek için diğer elinizi kullanın ve omurlar arasındaki ilk büyük girintiyi bulmak ve bu S1 ve L6 omurları arasındaki intervertebral boşlukdur (Şekil 2B ).
- Bir sonraki girintiyi, L5 ve L6 omurları ile enjeksiyon bölgesi arasındaki intervertebral boşluğu (Şekil 2A'daki*) tanımlamak için hafifçe rostrally hareket ettirin. Enjeksiyon bölgesinin kesinin merkezinde olması için rostral'dan kaudal'a kadar orta hat boyunca deride en fazla 2 cm uzunluğunda bir kesi yapmak için neşter kullanın (Şekil 2A'dakinoktalı çizgi).
- Kas tabakasını görselleştirmek için bağ dokusunu parçalamak için diseksiyon makası kullanın. Sonra l6 lomber vertebra dorsal spinal süreci hemen lateral kas kapsülü 1 cm kesi olun.
NOT: Bu noktada L6 lomber vertebra kemikleri görüntülenebilir. - Kılavuz kanül-iğne tertibatını 6. İğne boyunca kılavuz kanülitini yerine itin ve 23 G iğneyi çıkarın ve sadece kılavuz kanülleri yerinde bırakarak.
NOT: İğneyi takmadan önce L6 lomber vertebranın dorsal prosesini bulmak için künt forceps kullanmak faydalıdır. Genellikle, BOS sıvısı iğne göbeğine girerken görülebilir (bu sıvı bir kan parçasıyla karıncalanabilir, ancak bu zararın meydana geldiğini veya iğnenin doğru yerleştirilmediğini göstermez). Yazarlar bu işlem sırasında kan veya şiddetli kanama büyük miktarda görmedim. Herhangi bir durumda, uygun tedavi belirlemek için bir veteriner başvurulmalıdır ve hayvanlar ötenazi olmalıdır. - Kateter teli tertibatını kılavuz kanüle takın. Kateter-tel tertibatını yaklaşık 45° açıyla omurilik kanalına doğru açılayın ve ucunu yaklaşık 0,3 cm'lik bir açıyla omurilik kanalına doğru zorlayın.
- Kılavuz kanülleri çıkarın, kateteri stylet teli ile yerinde bırakarak. Stylettelini kateterin intratekal ucundan yaklaşık 2,5 cm çıkarın ve 2 cm işareti kanalın girişinde (kas ın hemen altında görünür) Şekil 1Bvi'degösterildiği gibi olana kadar kateteri omurilik kanalına ilerletin.
NOT: Eklenen kateter subaraknoid alana rostrally genişletmelidir. Başarılı yerleştirme bu alanda kateter serbest hareket için izin vermelidir. - Stylet telini tamamen geri çekin ve BOS implante kateteri girerken görülebilir.
- Doğum kateter tertibatını 30 G iğne ucu ile implante edilen kateterin distal ucuna bağlayın(Şekil 1Bv,vi).
- 100 μL şırınga (şırınga yıkama) içine 60 μL steril salin yükleyin. Test bileşiğinin 30 μL'lik bir bolus'u (örn. ASO çözeltisi) ikinci bir şırıngaya (enjeksiyon şırıngası) yükleyin.
- Yıkama şırıngasını (tuzlu su yla yüklenmiş) dağıtım kateter tertibatının boru adaptörü ucuna bağlayın(Şekil 1Bv). İntertekal alana 20 μL steril salin enjekte edin (enjeksiyon öncesi yıkama).
- Enjeksiyon şırıngını (test bileşiği ile yüklenmiş) doğum kateter tertibatının boru adaptörü ucuna bağlayın(Şekil 1Bv). 30 s'nin üzerinde intratekal uzaya 30 μL test bileşiği enjekte edin.
NOT: ASO'nun rutin enjeksiyon hacmi omurilikte ve kortekste iyi bir nakavt elde etmek için 30 μL'dir. Farklı enjeksiyon hacimleri test edilmemiş olsa da enjeksiyon hacimleri bileşik dağılım12etkileyebilir bildirilmiştir. Diğer bileşik veya hacim kullanılırsa, güvenlik ve etkinliğin ampirik olarak belirlenmesi gerekir. - Adımı 3.10'u tekrarlayın ve kateteri 40 μL daha steril salin (enjeksiyon sonrası kızarma) ile yıkayın. Daha sonra doğum kateter tertibatını implante edilen kateterden ayırın.
NOT: Enjeksiyon öncesi ve sonrası floş bileşiklerin lokal sekestrasyonunu azaltmak ve rostral yapılara dağılımlarını artırmak için düşünülmektedir12. - Aseptik kesilmiş ve ısı mühür implante kateter: Onlar çok sıcak olana kadar bir boncuk sterilize sterilize bir çift steril diseksiyonu yerleştirin, sonra forceps sıcak ucu ile tüp aşağı kıskaç.
NOT: Bu eylem kateteri eritir. Böylece, tüp delik çöker ve her iki taraf birbirine sopa, bir aseptik moda tüp mühürleme ve daha sonra deri altı uzaya yerleştirilir. - Kalan ısı yalıtımlı kateteri bağ dokusuna sabitlemek için emilebilir monofilament sütürler kullanın. Daha sonra, cildi güvenli ısı yalıtımlı kateter üzerinde kapatmak için emilemez monofilament sütürler kullanın.
NOT: Yara klipleri IACUC protokolü tarafından onaylandığı şekilde de kullanılabilir. Bu teknik, ellerimizde sadece bir kerelik enjeksiyonlar için kullanılmış olsa da tekrarlanan enjeksiyonlarla uyumludur. Tekrarlanan enjeksiyonların fizibilitesi IACUC onayı ile ampirik olarak değerlendirilmelidir. - Deriden herhangi bir kan yıkamak için gazlı bez ve tuzlu kullanın ve mobil kadar ısıtılmış bir kuvöz anestezi kurtarmak için hayvan izin, hangi noktada kendi ev kafesi (kafes başına iki sıçan) döndürülür.
NOT: Aynı gün birden fazla sıçanüzerinde ameliyat lar gerçekleştirirken, su kullanarak temiz aletler kan çıkarmak ve hayvanlar arasında ısıtmalı kuru boncuk sterilizatörü (en az 20 s, soğumasüresi ile) kullanarak yeniden sterilize. Her 5 hayvanda yeni bir alet seti kullanılır. - Ameliyattan sonra hayvanları günlük olarak en az 3 gün boyunca takip edin ve IACUC protokolüne göre ameliyattan sonra her hafta hayvanları izlemeye devam edin.
NOT: Herhangi bir komplikasyon (idrar tutma, kesi enfeksiyonları, nöbet veya felç gibi nörolojik bozukluk) meydana gelirse, uygun tedaviyi belirlemek ve hayvanların ötenazi yapılması gerekiyorsa bir veterinere başvurulmalıdır. Sürekli salınım lı buprenorfin kullanılmazise, Ameliyat sonrası IACUC protokolüne göre her gün ağrı kesici verilmelidir.
4. BT enjeksiyonu sonrası dokuya özgü nakavtın değerlendirilmesi
- Asos BT bolus enjeksiyonundan iki hafta sonra, beynin farklı bölgelerini (yani serebral korteks, striatum ve serebellum) ve omuriliğin farklı bölümlerini (yani servikal, torasik ve lomber) toplayın. Ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak toplam doku RNA ayıklayın ve daha önce açıklandığı gibi cDNA sentez reaksiyonu gerçekleştirmek13.
NOT: Standart reaktifler qPCR için aşağıdaki tahlillerle kullanılmıştır: sıçan Malat1 ve sıçan GAPDH. Bağıl transkript düzeyleri 2-ΔΔCT yöntemi(CT = eşik döngüsü) kullanılarak hesaplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan yöntemi kullanarak, iki grup yetişkin dişi sıçana (250−300 g; n = 10/grup) iki grup fosfat tamponlu salin PBS veya uzun kodlamaz (linc) RNA Malat1'i hedefleyen 300 μg aso enjekte ettik; Laboratuarımızda rutin bir araç bileşeni olarak Malat1 ASO kullanın, Malat1 her yerde ifade edilir çünkü ve tüm dokularda yüksek düzeyde14, beyin ve omurilik de dahil olmak üzere. Malat1 ASO, RNA'yı alçaltan ve yıkılmaya (KD) yol açan RNa1 aracılı mekanizma15 ile çalışır. Burada açıklanan deneyde, aso'nun tesliminden iki hafta sonra beynin farklı bölgelerini (yani serebral korteks, striatum ve striatum ve beyincik) ve omuriliğin lomber segmentini topladık. Toplanan bölgenin her birinden RNA ayıklandı ve Malat1 RNA ifade düzeylerini değerlendirmek için qPCR ile analiz edildi.
Test edilen ajan bir ASO olduğunda, şudurumlardan tavsiye edilir: 1) ASO etkinliğini karşılaştırmak için her zaman CNS'nin birden fazla bölgesini toplar; 2) cerrahi yöntemin teknik karmaşıklığı göz önüne alındığında, biz iyi kurulmuş farmakokinetik ve farmakodinamik özelliklere sahip bir bileşik (yani, Laboratuarımızda Malat1 ASO) test ajanı paralel olarak test edilir olumlu bir kontrol grubu, dahil öneririz; beklenmeyen veya açıklanamayan sonuçlar elde edilmesi halinde (örn. RNA düzenlemesinin olmaması veya yetersiz olması) ameliyatların etkinliği hakkında bilgi verecektir.
Burada açıklanan deneyde, Şekil 3'tegösterildiği gibi toplanan tüm bölgelerde çok iyi KD elde ettik. Ancak, omurilik ile bölgesel değişkenlik bir dereceye kadar KD (serebral korteks = 87% KD, striatum = 77% KD, beyincik = 74% KD, omurilik = 94% KD) en yüksek yüzdesi gösteren gözlemledik. Ameliyat sonrası 2 haftadan önce in vivo nakavt etkinliğine erişemedik. Birkaç ASO ile deneyimlerimizde, ameliyat sonrası 6−8 haftaya kadar hedef genlerin önemli ölçüde yıkıldığını tespit ettik (veriler gösterilmedi). Belirli bir ASO'nun kesin zamana bağlı nakavt verimliliği ilgi çekiciyse, bir zaman-kurs çalışması yapılmalıdır.
Şekil 1: İntertekal enjeksiyonlarda kullanılan özelleştirilmiş malzeme ve kateter setleri. (A) Kateter/tel tertibatı (v) PE-10 kateterinlüne stylet tel (ii) takılarak yapılır(i). Kanül/iğne montajı (vi) kılavuz kanül (iii) lümeniçine 23 G iğne takılarak yapılır. (B) Teslimat kateter montajı (v) boru adaptörünün PE-50 kateterin in bir ucuna bağlanması ve kesilen 30 G iğnenin adaptör olarak PE-10 kateter (ii) parçası kullanılarak diğer uca bağlanması ile yapılır. Ameliyat sırasında, implante edilen kateterin diğer ucu hayvanın intratekal boşluğuna yerleştirildikten sonra, doğum kateter tertibatının (v) 30 G iğne ucu implante edilen kateterin (vi) tepesine bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enjeksiyon bölgesi ve kesi hattının belirlenmesi. (A) Farenin karın 50 mL konik tüp ile desteklenen, pelvis üzerinde kaslar arasında iki çukurkolayca görülür (oklar). (B) Bir elinizçukurları tutarak, diğer elinizi omurgaya hafifçe basmak ve hissetmek ve L5 ve L6 omurları arasındaki kıtalararası boşluğu, yani enjeksiyon bölgesini (* a panelinde) bulmak için kullanın. A panelindeki noktalı çizgi, merkezinde enjeksiyon yeri olan kesi çizgisini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Asos tek bir bolus BT enjeksiyonu in vivo sıçan Malat1 azaltır. Biz Ya PBS veya 300 μg Malat1 ASO tek bir bolus enjekte; ameliyattan iki hafta sonra CNS'nin farklı bölgelerini topladık ve Malat1 RNA'nın ekspresyon düzeylerini ölçtük. Analiz edilen tüm bölgelerde malat1 RNA'nın iyi KD'sini elde ettik ve bölgeler arasında bazı değişkenlikler (serebral korteks = %87 KD, striatum = %77 KD, beyincik = %74 KD, omurilik = %94 KD; hata çubukları = ± SEM). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede sıçan CNS doğrudan terapötik ajanlar sunmak için güçlü bir yöntem gösterir. Teorik olarak, benzer bir teknik farelerde de yapılabilir, ancak küçük boyutu nedeniyle, yöntem daha zor olabilir. Bu nedenle, grubumuz, farklı bir uygulama yolu ile aynı hedeflere ulaşan CNS ilaç teslimatı için farelerde intracerebroventricular (ICV) enjeksiyonları gerçekleştirmelidir. Bu yöntem başka bir çalışmada16tanımlanmıştır.
Burada açıklanan yöntemin avantajı pahalı ekipman, ne de herhangi bir özel araçlar gerektirmez olmasıdır. Şekil 1A'da gösterilen kateter/tel tertibatını önceden hazırlamanızı öneririz. Çalışmada fareler olduğu kadar en az kateter/tel montajları hazırlanmalıdır, ancak ameliyat sırasında bazı hasar lar olması veya değiştirilmesi gerekmesi durumunda ekstra kateter/tel montajları hazırlanmasını önermeliyiz.
Teknik hakim bir kez, açıklanan tüm prosedür fare başına yaklaşık 25 dakika gerektirir, böylece bir gün içinde birçok sıçan tedavisine izin. Bir kişi ilk sıçan üzerinde ameliyat yapar, ve ikinci bir kişi sonraki sıçan üzerinde cerrahi hazırlık yapar, iki sıçan hayvan başına süresini azaltmak için aynı anda işlenebilir. Yeterli bir operatör için, iğnenin subaraknoid alan yerine epidural alana ulaşması için hala küçük bir şans vardır. BOS geri akışının gözlemi doğru iğne pozisyonunun iyi bir göstergesidir ancak mükemmel değildir. Test bileşiğin doğru teslimini onaylamak için sonuç oturumunda açıklanan RNA knockdown analizi gibi bir hedef katılım testinin yapılmasını öneririz.
Burada açıklanan gibi teknikler oluşturmak, CNS hedefleme terapilerini ilerletebilecek sağlam bir klinik öncesi araştırma boru hattının geliştirilmesi için çok önemlidir. Nitekim, terapötik bir müdahale olarak ASOs BT teslim şu andaCNS17,18,19,20birçok bozuklukların tedavisi için araştırılan bir yöntemdir. Nusinersen, spinal müsküler atrofi (SMA) hastalar için bir ASO tabanlı tedavi, son zamanlarda pediatrik hastalara da bu yöntemin uygulanabilirliğini gösteren, dünya çapında çeşitli pazarlarda onaylandı21,22, 23. yıl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hepsi Biogen, Inc. veya Ionis Pharmaceuticals'ın çalışanlarıdır. Yazarlar Ionis İlaç makalede açıklanan antisense oligonükleotidalırsınız.
Acknowledgments
Ionis Pharmaceuticals'a makalede açıklanan AsO'ları temin ettiği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture | 3M | 1020 | |
| 70% ethanol | Decon Laboratories, Inc | 8416-160Z | |
| Alcohol swab sticks | Dynarex | NO 1204 | |
| BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip | BD | 1ml TB Luer-Lok tip | BD 302830 |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in | BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P) |
| BD Intramedic PE Tubing | BD | Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in | BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B) |
| BD Intramedic PE Tubing Adapters | BD | 23 gauge intramedic luer stub adaper | BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E |
| BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G | BD | BD 305128 | |
| Buprenorphine Sustained Release-lab | ZooPharm | Prescription required | |
| Ethylene oxide sterilizer | Andersen Sterilizer INC. | AN 74i, gas sterilizer | AN 74i |
| Guide cannula | BD | 19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle | BD 305186 |
| Hamilton syringe 100ul | Hamilton company | Hamilton syringe 100ul | |
| Hot bead Sterilizer | Fine Science Tools | STERILIZER MODELNO FST 250 | |
| Ophthalmic ointment | Dechra veterranery product | 17033-211-38 | |
| Pocket Pro Pet Trimmer | Braintree Scientific | CLP-9931 B | |
| Povidone scrub | PDI | S48050 | |
| Saline | Baxter | Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml | FE1306G |
| Scalpel | Feather | disposable scalpel | No. 10 |
| Small animal heating pad | K&H Manufacturing | Model # 1060 | |
| Stylet Wire | McMaster-Carr | 1749T14 | LH-36233780 |
| Surgery Towel drape | Dynarex | 4410 | |
| Surgical scissors and forceps | FST and Fisher Scientific | ||
| Sutures | Ethicon | 4-0 or 5-0 | |
| Tool to make the Guide cannular | Grainger | Rotary tool (Dremel) | 14H446 (Mfr: EZ456) |
| EZ lock cut off Wheel | 1PKX5 (Mfr: 3000-1/24) | ||
| Grinding Wheel, Aluminum Oxide | 38EY44 (Mfr: EZ541GR) | ||
| EZ lock Mandrel | 1PKX8 (Mfr: EZ402-01) | ||
| Diamond wheel floor Tile | 3DRN4 (Mfr: EZ545) | ||
| Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure | |||
| Dosing catheter system | SAI Infusion Systems | RIDC-01 | |
| Guide cannula | SAI Infusion Systems | RIDC-GCA | |
| Internal Catheters | SAI Infusion Systems | RIDC-INC | |
| Stylet Wire | SAI Infusion Systems | RIDC-STY |
References
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
- Greene, C., Campbell, M. Tight junction modulation of the blood brain barrier: CNS delivery of small molecules. Tissue Barriers. 4 (1), e1138017 (2016).
- Daneman, R., Engelhardt, B. Brain barriers in health and disease. Neurobiology of Disease. 107, 1-3 (2017).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
- Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Research Reviews. 64 (2), 328-363 (2010).
- Larsen, J. M., Martin, D. R., Byrne, M. E. Recent advances in delivery through the blood-brain barrier. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (9), 1148-1160 (2014).
- Brinker, T., Stopa, E., Morrison, J., Klinge, P. A new look at cerebrospinal fluid circulation. Fluids Barriers CNS. 11, 10 (2014).
- Standifer, K. M., Chien, C. C., Wahlestedt, C., Brown, G. P., Pasternak, G. W. Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor. Neuron. 12 (4), 805-810 (1994).
- Wahlestedt, C., et al. Antisense oligodeoxynucleotides to NMDA-R1 receptor channel protect cortical neurons from excitotoxicity and reduce focal ischaemic infarctions. Nature. 363 (6426), 260-263 (1993).
- Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., Heilig, M. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science. 259 (5094), 528-531 (1993).
- Mazur, C., et al. Development of a simple, rapid, and robust intrathecal catheterization method in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 280, 36-46 (2017).
- Wolf, D. A., et al. Dynamic dual-isotope molecular imaging elucidates principles for optimizing intrathecal drug delivery. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (2), e85311 (2016).
- Becker, L. A., et al. Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice. Nature. 544 (7650), 367-371 (2017).
- Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions. RNA Biology. 14 (12), 1705-1714 (2017).
- Crooke, S. T., Witztum, J. L., Bennett, C. F., Baker, B. F. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metabolism. 27 (4), 714-739 (2018).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3558-3567 (2018).
- Schoch, K. M., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Translation from Mouse Models to Human Neurodegenerative Diseases. Neuron. 94 (6), 1056-1070 (2017).
- Lane, R. M., et al. Translating Antisense Technology into a Treatment for Huntington's Disease. Methods in Molecular Biology. 1780, 497-523 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Antisense oligonucleotides in neurological disorders. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
- Haché, M., et al. Intrathecal Injections in Children With Spinal Muscular Atrophy: Nusinersen Clinical Trial Experience. Journal of Child Neurology. 31 (7), 899-906 (2016).
- Goodkey, K., Aslesh, T., Maruyama, R., Yokota, T. Nusinersen in the Treatment of Spinal Muscular Atrophy. Methods in Molecular Biology. 1828, 69-76 (2018).
- Wurster, C. D., Ludolph, A. C. Nusinersen for spinal muscular atrophy. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).
