Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Мульти-Волокно Фотометрия для записи нейронной активности в свободно движущихся животных

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60278
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1CERVO Brain Research Center, Department of Psychiatry and Neurosciences, Université Laval, 2Center for Neural Circuits and Behavior, Department of Neuroscience and Section of Neurobiology, Division of Biology, University of California at San Diego, 3Neurophotometrics Ltd.

Summary

В этом протоколе подробно описано, как осуществлять и выполнять многоволоконные фотометрические записи, как исправить для независях от кальция артефактов, а также важные соображения для двухцветной фотометрической визуализации.

Abstract

Запись активности группы нейронов в свободно движущемся животном является сложной задачей. Кроме того, по мере того, как мозг расчленяется на все более мелкие и малые функциональные подгруппы, запись по проекциям и/или генетически определенным субпопуляциям нейронов становится первостепенной. Волоконная фотометрия является доступным и мощным подходом, который может преодолеть эти проблемы. Объединив оптические и генетические методологии, нейронная активность может быть измерена в глубоких структурах мозга путем выражения генетически закодированных индикаторов кальция, которые преобразуют нейронную активность в оптический сигнал, который можно легко измерить. Текущий протокол детализирует компоненты многоволоконной системы фотометрии, как получить доступ к глубоким структурам мозга для доставки и сбора света, метод учета артефактов движения, и как обрабатывать и анализировать флуоресцентные сигналы. Протокол детализирует экспериментальные соображения при выполнении одно- и двойной цветизображения, от одного или нескольких имплантированных оптических волокон.

Introduction

Способность соотносить нейронные реакции с определенными аспектами поведения животного имеет решающее значение для понимания роли конкретной группы нейронов играет в режиссуре или реагировании на действие или стимул. Учитывая сложность поведения животных, с множеством внутренних состояний и внешних стимулов, которые могут повлиять даже на простейшие действия, запись сигнала с односудебным разрешением оснащает исследователей необходимыми инструментами для преодоления этих Ограничения.

Волоконная фотометрия стала методом выбора для многих исследователей в области системной нейронауки из-за его относительной простоты по сравнению с другими методами записи in vivo, его высоким соотношением сигнала к шуму, а также способностью записываться в различных поведенческие парадигмы1,2,3,4,5,6,7,8. В отличие от традиционных электрофизиологических методов, фотометрия является оптическим подходом, наиболее часто используемым в сочетании с генетически закодированными индикаторами кальция (GECIs, серия GCaMP)9. ГИКи меняют свою способность к флуоресцизму в зависимости от того, связаны ли они с кальцием. Потому что внутренняя концентрация кальция в нейронах очень жестко регулируется и напряжения-gated кальциевых каналов открыты, когда нейрон пожаров потенциал действия, переходное увеличение внутренней концентрации кальция, что приводит к переходным увеличениям в способность GECI к флуоресценции, может быть хорошим прокси для нейронов стрельбы9.

С помощью волоконной фотометрии, возбуждая свет направлен вниз тонкой, многопользовательской оптической волокна в мозг, и сигнал выбросов собирается обратно через то же волокно. Поскольку эти оптические волокна легкие и сгибаемые, животное может двигаться в основном беспрепятственно, что делает этот метод совместимым с широким спектром поведенческих тестов и условий. Некоторые условия, такие как быстрые движения или изгиб волоконно-оптического патча шнур за радиус, в котором он может поддерживать общее внутреннее отражение, может ввести сигнал артефактов. Чтобы дизабигват сигнал от шума, мы можем использовать свойство GCaMP известный как "изосбестной точки". Кратко, с GCaMP, по мере того как длина волны света возбуждения перенесена к левой стороне, своя излучение в кальцием-связанном положении уменьшает и излучение в кальцием-unbound положении незначительно увеличивает. Точка, в которой относительная интенсивность этих двух выбросов равна, называется изосбестной точкой. Когда GCaMP возбужденных в этот момент, его выброс не влияет на изменения во внутренних концентрациях кальция, и дисперсия в сигнале чаще всего из-за затмения сигнала от overbending волоконно-оптического патча шнура или движения нервной ткани по отношению к имплантированному волокну.

Одноединая единица электрофизиологии по-прежнему является золотым стандартом для свободно движущихся записей in vivo из-за его одноклеточного и однопикового разрешения уровня. Тем не менее, это может быть трудно определить молекулярной идентичности клеток, регистрируются, и после специального анализа может быть довольно трудоемким. Хотя волоконная фотометрия не имеет одноклеточного разрешения, она позволяет исследователям задавать вопросы, которые невозможно решить с помощью традиционных методов. Сочетание вирусных стратегий с трансгенными животными, экспрессия ГГИС может быть направлена на генетически определенные типы нейронов для записи популяционно-или проекционно-определенной нейронной активности, которая может быть выполнена путем мониторинга сигнала кальция непосредственно на аксон терминалы10,11. Кроме того, имплантируя несколько волоконно-оптических канюли, можно одновременно контролировать нейронную активность из нескольких областей мозга и путей в одном животном12,13.

В этой рукописи мы описываем технику одно- и многоволоконной фотометрии, как исправить для независях от кальция артефактов, и подробно, как выполнять моно- и двухцветные записи. Мы также приведив примеры типов вопросов, которые он позволяет задать и их возрастающие уровни сложности (см. рисунок 1). Установка фотометрии волокна для многоволоконных записей, описанных в этом протоколе, может быть построена с помощью списка материалов, найденных на https://sites.google.com/view/multifp/hardware(рисунок 2).

Важно, чтобы система была оборудована как для 410 нм и 470 нм возбуждающие длины волн для кальция-независимых и кальциевых зависимых флуоресценции выбросов от GCaMP6 или его вариантов. Для пользовательских настроек или если нет доступного программного обеспечения для запуска системы, можно использовать бесплатную программу bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) с открытым исходным кодом. Кроме того, волоконная фотометрия может проходить через MATLAB (например, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 или другой язык программирования14. Программное и аппаратное обеспечение системы должно позволить манипулировать как 410 нм и 470 нм светодиодов и камеры, извлечение изображений (Рисунок 2), и расчет средней интенсивности флуоресцентных в регионах интереса (ROIs) обращается вокруг волокон на изображения. Выход должен быть таблицей значений средней интенсивности, записанных с 470 нм и 410 нм светодиодов от каждого волокна в патч шнур. При выполнении многоволоконных экспериментов, 400 мкм в комплекте волокон может ограничить движение мышей. В таких случаях мы рекомендуем использовать 200 мкм патч шнуры, которые обеспечивают большую гибкость. Это также может быть возможным использовать меньшие манекен кабели во время тренировки мышей.

Очень важно, чтобы иметь возможность извлечь очки времени для событий, представляющих интерес во время приобретения волоконной фотометрии. Если система не обеспечивает встроенную систему для интеграции TTL для конкретных событий, альтернативная стратегия заключается в присвоении отметки времени отдельным точкам времени, записанным в соответствие с конкретнымвременем и событиями в ходе эксперимента. Штамповка времени может быть выполнена с помощью компьютерных часов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с институциональными комитетами по уходу и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего и Канадским руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Университетом Лавал по защите животных Комитет.

1. Выравнивание оптического пути между камерой CMOS (дополнительный полупроводник оксида металла) и индивидуальным или разветвляющим сярприговым шнуром

  1. Потерять все винты на 5-осевой переводчик (11, Рисунок 2B).
  2. Винт в патч шнур (12, Рисунок 2B) к адаптеру «SMA (суб-миниатюра A) или FC (волоконно-оптический разъем)», который прикреплен к 5-осевой переводчика.
  3. Включите 470 нм возбуждательный свет (1, Рисунок 2B) при низкой мощности (100 зВт), и поместите кончик патчкорда, указывающий на автофлуоресцентный пластиковый слайд. Это не имеет никакого отношения к будущим записям, но предназначено исключительно для визуализации процесса выравнивания.
  4. Запись с камеры CMOS (13, Рисунок 2B) в режиме live. Увеличьте прибыль или отрегулируйте таблицу поиска (LUT) до тех пор, пока изображение не будет полностью черным. Смысл заключается в том, чтобы иметь возможность видеть изображение в координационном центре цели (10, рисунок 2B).
  5. Предварительный 5-осевой переводчик к цели, гарантируя, что 470 нм свет сосредоточен на волокно на SMA или FC конце патч шнур, пока изображение может быть решена на камеру.
  6. Отрегулируйте осей X и Y до тех пор, пока изображение не будет по центру и хорошо решено.
  7. Визуализируйте свет, излучаемый феррул-концом патч-провода. Он должен выглядеть как изотропный круг. Если используется ветвящий патч шнур, количество света, излучаемого на ферруле-концы каждого шнура патч должен быть одинаковым. Если круг не изотропный или излучаемый свет неравен, отрегулируйте 5-осевый переводчик в оси X-Y.

2. Установка ROIs вокруг волокон для измерения средней интенсивности флуоресцентных

  1. Включите все возбуждающие огни, чтобы лучше визуализировать волокна. Отрегулируйте прирост камеры таким образом, чтобы пиксели не насыщались и четкое изображение волокон присутствуют.
  2. Запись в прямом эфире или возьмите предварительное изображение.
  3. Нарисуйте ROIs вокруг волокон и держать их для измерения значений средней интенсивности во время записи(Рисунок 2A).
  4. Для нескольких волоконных записей, тест на независимость в сигналах.
    1. Запись в реальном маштабе времени от всех волокон.
    2. Укажите одно волокно к источнику света и коснитесь пальцем. Очень большие колебания должны происходить исключительно в этом канале (приемлемая утечка 1:1000).
    3. Если сигналы не являются независимыми, перерисовывайте более консервативные ROIs и повторите тест на независимость.
  5. Для маркировки и отслеживания которых рентабельность инвестиций соответствует тому, какое волокно, цветная лента или лак для ногтей могут быть применены к концу волокон. Сфотографируйте перед началом любого эксперимента в качестве вторичного напоминания.

3. Настройка арены звукозаписи

  1. Повесьте шнур патча над ареной, используя трибуны, зажимы или держатели.
  2. Убедитесь, что животное может свободно перемещаться по всей арене, раскованно по длине волокна.
  3. Используется ли оператная коробка или открытое поле, убедитесь, что патч шнур сможет достичь животного с минимальным изгибом. Если это требует нос тыкать, убедитесь, что есть достаточно места накладных расходов для предотвращения изгиба волокна. Избегайте чрезмерного изгиба или скручивания патч шнура.

4. Записи In vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура имплантации волокон волокон волокон для экспериментов на фотометрии волокон идентична процедуре оптогенетики, описанной в Sparta et al15. Мы рекомендуем использовать зубной цемент (см. Таблица материалов),который обеспечивает надежное закрепление головной колпак к кости черепа. Зубной цемент будет особенно полезен в тех случаях, когда не могут быть использованы якорные винты.

  1. Визуально осматривайте дистальный конец волокон патч-провода на глаз и с помощью микроскопа minifiber. Если поверхность волокон поцарапан, repolish волокон с помощью волокна полировки / плеск пленки с тонкой крупы (1 мкм и 0,3 мкм).
  2. Очистите дистальные концы патч шнура с 70% этанола и хлопка наконечник аппликатор.
  3. Очистите волоконно-оптические канюли с помощью 70% этанола и аппликатора кончика хлопка.
  4. Соедините феррульский конец патч-провода с имплантированным волокном с помощью керамического сплит-рукава, покрытого черной термоусадкой. Во время соединения убедитесь, что рукав тугой, в противном случае используйте новый рукав.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Там будет большое количество потери сигнала, если есть какое-либо пространство между патч шнур ferrule и имплантат, и записи не будут работать.
  5. Разрешить животному восстановиться в течение нескольких минут до начала поведенческого тестирования.
  6. Начните запись оптического сигнала и запустите эксперимент.
  7. Во время записи, внимательно следите за живой след, чтобы обеспечить качество записей. Сигнал, как ожидается, быстро уменьшится как функция времени в первые 2 минуты записи. Этот эффект вызван теплоо-опосредованным led распадом, при котором увеличение тепла увеличивает сопротивление оптического элемента.
  8. Если происходит скачок сигнала, превышающий кинетизацию GCaMP, это часто свидетельствует о том, что рукав недостаточно плотно и пространство между патч-проводом и имплантатом меняется. В этом случае, остановить эксперимент и восстановить животное с помощью нового рукава.

5. Анализ данных фотометрии клетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: Это метод для анализа данных, который хорошо работает для большинства записей. Однако можно внедрить альтернативные подходы. Пример кода для анализа данных можно найти здесь: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.

  1. Извлекайте средние значения интенсивности флуоресценции, зарегистрированные от 470 нм(Int470) и 410 нм(Int410) светодиодов, соответствующих каждому отдельному волокну.
  2. Гладкая каждый сигнал с помощью алгоритма движущегося среднего(рисунок 3A).
  3. Выполните базовую коррекцию каждого сигнала(рисунок 3A и 3B)с использованием адаптивного итеративного алгоритма наименьших квадратов (airPLS) (https://github.com/zmzhang/airPLS) для удаления наклона и низкой частоты колебания сигналов.
  4. Стандартизировать каждый сигнал, используя среднее значение и стандартное отклонение(рисунок 3C):
    Equation 1
  5. Использование неотрицательной надежной линейной регрессии, подходят стандартизированные сигналы zInt410 к zInt470(Рисунок 3D)к функции регрессии:
    Equation 2
    1. Используйте параметры линейной регрессии(a, b)для поиска новых значений zInt410, установленных на zInt470(fitInt410, Рисунок 3D,E).
      Equation 3
  6. Рассчитайте нормализованный dF/F (z dF/F)(рисунок 3F):
    Equation 4

6. Одновременные двухцветные записи

  1. Добавьте к системе фотометрии светодиод 560 нм, чтобы возбудить красный флуоресцентный датчик кальция и соответствующие дихроические зеркала и фильтры (см. Kim et al., 2016 для подробного описания)12.
  2. Добавьте сплиттер изображения между целью и камерой CMOS, чтобы отделить зеленые и красные длины волн эмиссии (см. рисунок 5). Сплиттер изображения образует два зеркальных изображения на датчике камеры, соответствующие красным и зеленым сигналам (например, патч-провод с 3 ветвями создаст изображение с 6 волокнами).
  3. Нарисуйте ROIs вокруг всех волокон в обоих цветах, как описано выше. Убедитесь в том, чтобы четко определить каждую рентабельность инвестиций с соответствующим и каналом (зеленый и красный)(рисунок 4A).
  4. Триггер одновременное возбуждение с 470 нм и 560 нм светодиодов и чередовать их с 410 нм светодиод(рисунок 5A).

7. Анализ данных двойного цвета

  1. Следуйте шагам в разделе 5, чтобы найти fitInt410 для сигнала Int470 и рассчитать z dF/F.
  2. Поскольку изосбестная точка для гЕКИ с красными сдвигами, как правило, неизвестна, сигнал, записанный со светодиодом 410 нм в зеленом канале, может быть использован для коррекции движения по обоим каналам. Следуйте шагам в разделе 5, чтобы найти fitInt410 для сигнала Int560 и рассчитать z dF/F.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Нейронные корреляты поведенческих реакций могут варьироваться в зависимости от различных факторов. В этом примере мы использовали фотометрию волокна in vivo для измерения активности аксонных терминалов из боковой гипоталамической области (LHA), которые заканчиваются в боковой хабенуле (LHb). Мыши дикого типа были введены с адено-ассоциированных вирусов (AAV), кодирующих GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) в LHA и оптическое волокно было имплантировано с наконечником непосредственно над LHb(Рисунок 4A). Выражение GCaMP6s находится в клеточных телах ЛХА и их аксонных терминалах, проецирующихся на LHb, где может быть записан сигнал кальция. Активация пути LHA-LHb способствует пассивному избеганию в тесте предпочтений в реальном времени, предполагая, что этот путь передает аверсивные сигналы16. Мыши были затем подключены к системе фотометрии волокна, помещены в открытой арене в течение 6 минут, и подвергаются 1 сек aversive airpuffs каждые 60 сек. Измеренная флуоресценция значительно увеличилась одновременно с введением воздухопачих(рисунок 4B-C). У мышей, выражающих зеленый флуоресцентный белок (GFP), никаких изменений в сигнале не было обнаружено во время введения воздухопачих пацан(рисунок 4C). После поведенческого тестирования, место инъекции в LHA и размещение волокна выше LHb были подтверждены гистологически (Рисунок 4A).

Figure 1
Рисунок 1: Стратегии и подходы к выражению GECI с анатомической и клеточной специфичностью. (A) Вирусный вектор адено-ассоциированного вируса (AAV), кодирующего GCaMP6 (AAV-GCaMP6) вводится в область мозга, представляющих интерес. Оптическое волокно может быть хронически имплантировано с наконечником, размещенным над клеточными телами (1) или над аксонными терминалами (2). Для селективного выражения в генетически определенной нейронной популяции, cre-dependent AAV (например, AAV-DIO-GCaMP6) может быть введен в трансгенных мышей, выражающих крем рекомбинациназу в конкретной нейронной популяции. (B) Для двухцветной визуализации кальция, в этом примере AAV-GCaMP6s вводится в области мозга, представляющих интерес, и cre-зависимых AAV кодирования красно-сдвинутых GECI (например, jrGECO1a; AAV-DIO-jrGECO1a) вводится в генетически определяемой нейронной популяции в области мозга цели. Оптическое волокно имплантируется для одновременного изображения сигнала кальция аксонных терминалов (зеленая флуоресценция) и клеточных тел (красная флуоресценция). (C) Для перекрестной вирусной стратегии, вирусный вектор с ретроградными транспортными свойствами (например, retroAAV17) кодирование крем-рекомбиназа (retroAAV-cre) вводится в целевой области мозга вместе с AAV-DIO-GCaMP6s вводят в проецирующейся области мозга в той же мыши. Оптовочные волокна канюли имплантируются над клетками для надежной кальциево-зависимой записи сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Схема фотометрии волокна. (A) Возбуждение света от двух светодиодов (410 нм и 470 нм) проходит через ряд фильтров и дихроических зеркал и производит возбуждение месте на рабочем расстоянии 20x цели. Свет проходит через один шнур патча или в комплекте волокон (для нескольких записей сайта), которые подключены к имплантированных канюли. Испускаемые флуоресценции собираются теми же волокнами, фильтруются и проецируется на датчик камеры CMOS. На захваченных изображениях средняя интенсивность флуоресценции регистрируется при рентабельности каждого волокна. Для одновременного получения сигналов от 410 нм и 470 нм светодиодов реализуется мультиплексирование тайм-деления (нижняя правая диаграмма). (B) Изображение нашей пользовательской системы фотометрии и ее компонентов: (1) Волокно на 465 нм светодиод, (2) Волокно до 405 нм светодиод, (3) Коллиматоры, (4) 470 нм фильтр ампасс, (5) 410 нм диапазон фильтр, (6) 535 нм bandpass, (7) Труба объектив, (8 Cube) с длинным итнам bandpass фильтр, (6) 535 нм bandpass фильтр, (7) Куб) 425 дихроическое зеркало, (9) Куб с длиннопроходным 495 дихроическим зеркалом, (10) 20x объектив, (11) 5-осевой переводчик, (12) Моно- или пучок-волокно патч шнур, (13) CMOS камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ данных фотометрии волокон. (A) Гладкая средняя флуоресцентная интенсивность (Int), зарегистрированная от 470 нм (верхняя синяя линия) и 410 нм (нижняя фиолетовая линия) длин волн возбуждения. Черные линии являются базовыми линиями, найденными с помощью алгоритма airPLS. (B) Относительная интенсивность изменяется в сигналах после коррекции базовой линии. (C) Стандартизированные 470 нм и 410 нм сигналов (zInt470, сверху; zInt410, дно). (D) Неотрицательный надежный линейный припадок 470 нм и 410 нм сигналов. (E) Выравнивание трассировки Int410 к Int470 основано на пригонке. (F) Исправленные и нормализованные кальциевые изменения в флуоресценции (z dF/F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Результаты представитель. (A) Диаграмма экспериментальной процедуры. AAV-GCaMP6s вводится в LHA мышей и 4 недели спустя, оптическое волокно канюли имплантируется над LHb для аксона терминала записи сигнала. Вмножество являются репрезентативными конфокальными изображениями экспрессии GCaMP6в в клеточных телах нейронов LHA (слева) и их аксонных терминалов, проецирующихся на LHb (справа). (B) Представитель кальция сигнала след к airpuffs (пунктирные вертикальные бары) измеряется от LHb-проектирующих LHA аксон терминалов измеряется от GCaMP6s-выражения мыши. (C) Peri-событие участок среднего ответа кальция на события airpuff. Толстая зеленая линия представляет собой среднюю, а зеленые затененные области представляют собой стандартную погрешность среднего (SEM, левая панель), а сигнал измеряется до и после воздушного пуфа (3 мыши, 15 событий). (D,E) Те же измерения, как (B, C) для GFP-выражения мышей (2 мышей, 10 событий). Шкала баров 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Схема двухцветной фотометрии волокна. (A) Дополнительные 560 нм светодиод, соответствующие фильтры и дихроические зеркала, и сплиттер изображения до датчика камеры были добавлены к первоначальной установки. (B) Компоненты системы фотометрии: (1) Волокно до 560 нм светодиод, (2) Волокно до 465 нм светодиод, (3) Волокно до 405 нм светодиод, (4) Коллиматоры, (5) 560 нм фильтра bandpass, (6) 470 нм bandpass фильтр, (7) 410 нм bandpass фильтр, (8) Кубик5. , (9) Куб с longpass 425 дихроическое зеркало, (10) Куб с 493/574 дихроическое зеркало, (11) 20x цель, (12) 5-осевой переводчик, (13) Моно- или в комплекте волокна патч шнур, (14) Изображение сплиттер, (15) CMOS камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Фотометрия клетчатки является доступным подходом, который позволяет исследователям записывать динамику навалом кальция из определенных нейронных популяций у свободно движущихся животных. Этот метод может быть объединен с широким спектром поведенческих тестов, в том числе "движение тяжелых" задач, таких как принудительные тесты плавать2, страх кондиционирования18, социальные взаимодействия1,4, и другие7, 8,19,20. Это позволяет исследователям наблюдать, какое поведение или стимулы приводят к активности в определенной нейронной популяции или наоборот.

Несмотря на свою простоту prima facie, есть важные соображения при внедрении волоконной фотометрии, и система, описанная в этом протоколе, предлагает ряд преимуществ, обходит общие подводные камни. Во-первых, он использует тот факт, что варианты GCaMP имеют кальций-независимую изосбестную точку возбуждения около 410 нм21 и мультиплексирование тайм-деления для коррекции кальциево-зависимых изменений в сигналах почти одновременно12. Когда нейроны, выражающие GCaMP, возбуждаются с длиной волны 410 нм, интенсивность выбросов от GCaMP не зависит от его связывания с кальцием и ведет себя по существу как низкоэффективный GFP. Мультиплексирование тайм-деления использует как 410 нм кальция-независимых и 470 нм кальциевых зависимых волн возбуждения длины в той же записи. Сигнал, записанный с длиной волн возбуждения 410 нм, используется в качестве контроля для движения кальция независимого и артефактного изменения интенсивности флуоресценции. Можно представить себе альтернативные стратегии, которые не включают одновременное использование изосбестного возбуждения GCAMP. Например, можно подготовить двух животных когорты, один из них выражает GFP, а другой выражает GCaMP2. Тем не менее, это не идеальный контроль, как это происходит у животных, и это более трудно определить, если данный ответ в данном животном был артефакт. Во-вторых, описанная установка фотометрии волокна позволяет исследователям измерить деятельность в нескольких путях одновременно, раскрывая дверь к вопросам относительно распространения сигнала повсеместно в мозг. В-третьих, двухцветная запись позволяет дополнительную гибкость для вскрытия различных путей в той же области мозга, сочетающей зеленые и красно-сдвинутые ГИКИ(рисунок 1).

С волоконной фотометрии записей, очень низкий уровень выбросов флуоресценции должна быть записана через фоновый шум. Поэтому крайне важно обеспечить максимальную сбор флуоресценции, испускаемых гЕКИ. Во-первых, при разработке вирусной стратегии необходимо учитывать, что запись с терминалов может быть сложной задачей, потому что аксонные терминалы в области записи могут быть редкими. Чтобы решить эту проблему, альтернативная перекрестная вирусная стратегия может быть предусмотрена позволяет выражение GCaMP в целевой области, представляющих интерес и оптического волокна канюли имплантированных над клеточными телами, где более надежной флуоресценции может быть измеряется22,23,24. Другим фактором, который может негативно повлиять на соотношение сигнала к шуму является качество волоконно-оптического волокна и патч шнура. Для имплантации предпочтительнее ферруле из нержавеющей стали, так как циркония очень аутофлуоресцентна и увеличит фоновый сигнал. Очень важно использовать высококачественные кунаковые консервы из оптического волокна с хорошо отполированными стержнями и высокими скоростями передачи передачи (85% передачи). Любые дефекты в волокнах приведут к снижению соотношения сигнала к шуму. Оптико-волоконный патч шнур должен быть высокого качества, а также. Поставщики производят волокна, специально предназначенные для волоконной фотометрии, в которых автофлюоресценция максимально минимизирована. Индивидуальные патч шнуры часто не достигают необходимой эффективности. Важно также оптимизировать выравнивание оптического пути, чтобы получить изображение со всеми волокнами, хорошо решенными в координационном центре цели. Кроме того, численная диафрагма (NA) волокна должна соответствовать, что из патч шнура, а также цель, используемая с системой. Любое несоответствие NA приведет либо к возбуждению, либо к потере света на выбросах. Все предыдущие шаги обеспечат четкие сигналы, зависящие от кальция. Тем не менее, коррекция сигнала по-прежнему требуется. Большинство записей имеют экспоненциальное снижение флуоресценции из-за автофлюоресценции в волокнах, тепло-опосредованного светодиодного распада, и photobleaching. Это снижение зависит от различных волокон и каналов, и важно удалить его в каждом канале отдельно с помощью алгоритма airPLS, описанного в разделе протокола. Во-вторых, необходимо принимать во внимание коррекцию движения. Даже если сигналы GCaMP кажутся высокими там, где любые изменения артефакта кажутся бессмысленными, важно исправить их с помощью независимого сигнала кальция. График с выровнены 410 нм и 470 нм сигналов является ссылкой, показывающей, какие изменения в интенсивности вызваны GCaMP, а не артефакты.

Добавление 560 нм возбуждающий светодиод, надлежащие dichroic линзы, и beamsplitter позволяет одновременной записи зеленого и красного флуоресценции. Это открывает возможность контролировать нейронную активность двух генетически различных нейронных популяций или контролировать пресинаптическую активность с аксонных терминалов (например, выражение GCaMP6) и постсинаптическую нейронную активность (например, выражение jrGECO1a). При реализации двухцветных записей необходимо учитывать важные соображения. Значительные фотоконверсии и фотоактивации было сообщено для многих красных сдвига GECIs, где освещение с 405 нм, 488 нм, и 560 нм может увеличить кальций-независимой флуоресценции25. Использование jrGECO1a и RCaMP1b может свести к минимуму эту проблему26. Еще одна проблема во время двойного цвета изображения зеленый сигнал, который просачивается в красный канал. Многие стратегии могут быть предусмотрены, чтобы избежать этой проблемы. Например, можно переплести три волнения, чтобы возбудить изосбестную точку зеленого датчика кальция (410 нм), сигнал, зависящий от кальция от зеленого датчика кальция (470 нм) и красный датчик кальция (560 нм) в последовательности. В этом случае можно полагаться на изосбестную точку зеленого датчика для коррекции движения. Наконец, при выполнении двойного цветного изображения, лучше всего приобрести более сильный сигнал от красного датчика кальция (например, от клеточных сом), потому что они имеют более слабые выбросы флуоресценции по сравнению с зелеными датчиками.

Новые генетически закодированные флуоресцентные датчики были разработаны для быстрого и специфического обнаружения in vivo нейромедиаторарелиз 22,23,24. Эти датчики излучают зеленую флуоресценцию при связке с их соответствующими эндогенными лигандами и могут быть объединены с красными гЕКИ, такими как jrGECO1a, для одновременного обнаружения выпуска нейромедиатора одновременно с изменениями в нейронной активности от однократные оптические волокна5,27.

Оптоволоконная фотометрия обеспечивает изысканную гибкость для мониторинга нейронной активности свободно движущихся животных через гибкие и легкие оптические волокна патч шнуры. Тем не менее, он не подходит для ситуаций, требующих перемещения между отсеками, таких как свет-темные испытания камеры. Это станет возможным благодаря дальнейшим разработкам в беспроводной системе фотометрии28. Наконец, в то время как он обеспечивает большие преимущества при мониторинге нейронной динамики из нескольких областей мозга, или от различных нейронных популяций, сигнал, полученный в волоконной фотометрии представляет собой совокупность многих нейронов, которые не могут стрелять с той же височной динамикой и не будет решена. Тем не менее, он обеспечивает дополнительный подход к in vivo микроэндоскопической визуализации кальция решения соматического сигнала кальция от десятков до сотен отдельных нейронов29. Наконец, при записи из нескольких волокон в одном животном, это может быть трудно дифференцировать ли сигнал исходит от терминалов или от клеточной сомы. Тщательное проектирование экспериментов может преодолеть большинство из этих ограничений. Тем не менее, разработка новых GECIs исключительно локализованы на клеточных сомы обеспечит большее разрешение во время экспериментов многоволоконной визуализации кальция.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sage Aronson является генеральным директором и основателем Neurophotometrics Ltd., которая продает многоволоконные фотометрические системы.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC: RGPIN-2017-06131) к К.П. К.П. является ФСК Чрчер-Бурсье. Мы также благодарим Plateforme d'Outils Mol'culaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) за производство вирусных векторов, используемых в данном исследовании.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long Thorlabs SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long Thorlabs SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long Thorlabs SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs M59L01
12.7 mm Optical Post Thorlabs TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder Thorlabs PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube Thorlabs KPS101
20x objective Thorlabs RMS20X #10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs CM1-DCH/M #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED Doric Lenses CLED_405 #2 in Figure 2
410 nm bandpass filter Thorlabs FB410-10 #5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED Doric Lenses CLED_465 #1 in Figure 2
470 nm bandpass filter Thorlabs FB470-10 #4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter Semrock FF01-560/14-25 #5 in Figure 5
560 nm LED Doric Lenses CLED_560 #1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount Thorlabs K5X1 #11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet Thorlabs AC254-035-A-ML #7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator Thorlabs AD11F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator Thorlabs AD127-F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard Thorlabs MB1824
Clamping Fork Thorlabs CF125
Cube connector Thorlabs CM1-CC
Dual 493/574 dichroic Semrock FF493/574-Di01-25x36 #10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6 Semrock FF01-535/22-25 #6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels Thorlabs XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining Thorlabs SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder Thorlabs SM1QP #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light Thorlabs F671SMA-405 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light Thorlabs F240SMA-532 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter Semrock FF01-520/35-25 In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera Thorlabs DCC3260M #13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter Neurophotometrics SPLIT #14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff Thorlabs DMLP425R #8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff Semrock FF495-Di03 #9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement C&B
M8 - M8 cable Doric Lenses Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter Semrock FF01-600/37-25 In light beam splitter
T7 LabJack LabJack
T-cube LED Driver Thorlabs LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 Thorlabs CAB-DCU-T3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
  2. Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
  3. Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
  4. Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
  5. de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
  6. Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
  7. Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
  8. González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
  9. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  10. Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
  11. Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
  12. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
  13. Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
  14. Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
  15. Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
  16. Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
  17. Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  18. Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
  19. Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
  20. Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
  21. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
  22. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  23. Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
  24. Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
  25. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
  26. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  27. Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
  28. Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
  29. Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).

Tags

Поведение Выпуск 152 генетически закодированный индикатор кальция GCaMP фотометрия волокна поведение нервные пути свободно движущиеся животные
Мульти-Волокно Фотометрия для записи нейронной активности в свободно движущихся животных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martianova, E., Aronson, S., Proulx, … More

Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. J. Vis. Exp. (152), e60278, doi:10.3791/60278 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter