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Neuroscience

Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60278

Summary

Este protocolo detalha como aplicar e executar gravações da fotometria da multi-fibra, como corrigir para artefatos cálcio-independentes, e considerações importantes para a imagem latente da fotometria da duplo-cor.

Abstract

Registrar a atividade de um grupo de neurônios em um animal em movimento livre é uma empresa desafiadora. Além disso, como o cérebro é dissecado em subgrupos funcionais menores e menores, torna-se primordial para gravar a partir de projeções e/ou subpopulações geneticamente definidas de neurônios. A fotometria de fibras é uma abordagem acessível e poderosa que pode superar esses desafios. Combinando metodologias ópticas e genéticas, a atividade neural pode ser medida em estruturas cerebrais profundas, expressando indicadores de cálcio geneticamente codificados, que traduzem a atividade neural em um sinal óptico que pode ser facilmente medido. O protocolo atual detalha os componentes de um sistema da fotometria da multi-fibra, como alcançar estruturas profundas do cérebro para entregar e recolher a luz, um método para dar conta dos artefatos do movimento, e como processar e analisar sinais fluorescentes. O protocolo detalha considerações experimentais ao executar a imagem latente única e dupla da cor, de único ou de fibras óticas implantadas múltiplas.

Introduction

A capacidade de correlacionar respostas neurais com aspectos específicos do comportamento de um animal é fundamental para entender o papel que um determinado grupo de neurônios desempenha em dirigir ou responder a uma ação ou estímulo. Dada a complexidade do comportamento animal, com a miríade de Estados internos e estímulos externos que podem afetar até mesmo as ações mais simples, o registro de um sinal com resolução de julgamento único equipa pesquisadores com as ferramentas necessárias para superar esses Limitações.

A fotometria da fibra transformou-se a técnica da escolha para muitos investigadores no campo da neurociência dos sistemas por causa de sua simplicidade relativa comparada a outras técnicas in vivo da gravação, sua relação sinal-à-ruído elevada, e a habilidade de gravar em uma variedade de paradigmas comportamentais1,2,3,4,5,6,7,8. Diferentemente dos métodos eletrofisiológicos tradicionais, a fotometria é a abordagem óptica mais comumente utilizada em conjunto com indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs, a série GCaMP)9. GECIS mudar a sua capacidade de fluorescência com base em se eles estão ou não ligados ao cálcio. Porque a concentração interna de cálcio nos neurônios é muito firmemente regulada e tensão-gated canais de cálcio aberto quando um neurônio dispara um potencial de ação, aumentos transitórios na concentração interna de cálcio, que resultam em aumentos transitórios no capacidade de um GECI para fluorescência, pode ser um bom proxy para o disparo neuronal9.

Com a fotometria da fibra, a luz da excitação é dirigida abaixo de uma fibra ótica fina, multimodo no cérebro, e um sinal de emissão é coletado para trás acima através da mesma fibra. Porque estas fibras ópticas são leves e bendable, um animal pode mover-se pela maior parte Unhindered, fazendo esta técnica compatível com uma disposição larga de testes e de circunstâncias comportáveis. Algumas condições, tais como movimentos rápidos ou flexão do cabo de remendo de fibra óptica além do raio em que pode manter a reflexão interna total, podem introduzir artefatos de sinal. Para ambiguar sinal de ruído, podemos explorar uma propriedade do GCaMP conhecido como o "ponto isosbestic." Momentaneamente, com GCaMP, porque o comprimento de onda da luz da excitação é deslocado à esquerda, sua emissão no estado cálcio-ligado diminui e a emissão no estado cálcio-unbound aumenta marginalmente. O ponto em que a intensidade relativa destas duas emissões são iguais é denominado o ponto espécies. Quando GCaMP é excitado neste momento, sua emissão é afetada por mudanças em concentrações internas do cálcio, e a variação no sinal é o mais frequentemente devido à atenuação do sinal do overdobra do cabo de remendo Fiber-Optic ou do movimento do tecido neural em relação à fibra implantada.

A electrofisiologia da única unidade é ainda o padrão do ouro para livremente-mover-se em gravações in vivo devido a sua única-pilha e única-espiga resolução nivelada. No entanto, pode ser difícil identificar a identidade molecular das células que estão sendo gravadas, e a análise post-hoc pode ser bastante trabalhosa. Quando a fotometria da fibra não tiver a definição da único-pilha, permite investigadores de fazer perguntas impossíveis endereçar com técnicas tradicionais. Combinando estratégias virais com animais transgênicos, a expressão de GECIs pode ser direcionada para tipos neuronais geneticamente definidos para registrar a atividade neural definida pela população ou projeção, que pode ser realizada pelo monitoramento do sinal de cálcio diretamente no AXON terminais10,11. Além disso, através da implantação de múltiplas cânulas de fibra óptica, é possível monitorar simultaneamente a atividade neural de várias regiões cerebrais e caminhos no mesmo animal12,13.

Neste manuscrito, nós descrevemos uma técnica para a fotometria single e multi-Fiber, como corrigir para artefatos cálcio-independentes, e detalhar como executar gravações mono e Dual-Color. Nós também fornecemos exemplos dos tipos de perguntas que ele permite que alguém pergunte e seus níveis crescentes de complexidade (veja a Figura 1). A configuração de fotometria de fibra para gravações de várias fibras detalhadas neste protocolo pode ser construída usando uma lista de materiais encontrados em https://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figura 2).

É essencial que o sistema esteja equipado para comprimentos de onda da excitação de 410 nanômetro e de 470 nanômetro para a emissão cálcio-independente e cálcio-dependente da fluorescência de GCaMP6 ou de suas variações. Para configurações personalizadas ou se não houver nenhum software disponível para executar o sistema, o livre, programa de código aberto bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) pode ser usado. Alternativamente, a fotometria da fibra pode ser executada através de MATLAB (por exemplo, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 ou a outra língua de programação14. O software e hardware do sistema deve permitir a manipulação de ambos os 410 nm e 470 nm LEDs e a câmera, extração de imagens (Figura 2), e cálculo da intensidade média fluorescente nas regiões de interesse (Rois) desenhado em torno das fibras em as imagens. A saída deve ser uma tabela de valores médios de intensidade registradas com os LEDs 470 nm e 410 nm de cada fibra no cabo de remendo. Ao realizar experimentos Multifibras, 400 μm de fibras podem limitar o movimento de camundongos. Nesses casos, recomendamos o uso de cabos de remendo de 200 μm, que proporcionam mais flexibilidade. Também pode ser possível usar cabos fictícios menores durante o treinamento de camundongos.

É crucial poder extrair pontos do tempo para eventos do interesse durante a aquisição da fotometria da fibra. Se o sistema não fornecer prontamente um sistema interno para integrar TTLs para eventos específicos, uma estratégia alternativa é atribuir um carimbo de data/hora a pontos de tempo individuais gravados para alinhar com horários e eventos específicos durante o experimento. O carimbo de tempo pode ser feito usando o relógio do computador.

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Protocol

Todos os experimentos foram feitos de acordo com os comitês institucionais de cuidados e uso de animais da Universidade da Califórnia, San Diego, e o guia canadense para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pela Université Laval proteção animal Comité.

1. alinhamento do trajeto ótico entre a câmera do CMOS (semicondutor complementar do óxido de metal) e o cabo de remendo individual ou ramificando

  1. Afrouxe todos os parafusos no Tradutor de 5 eixos (11, Figura 2B).
  2. Aparafuse o cabo de remendo (12, Figura 2B) ao adaptador [sma (sub-miniatura a) ou FC (conector de fibra óptica)] que é afixada ao Tradutor de 5 eixos.
  3. Gire sobre a luz da excitação de 470 nanômetro (1, Figura 2b) na baixa potência (100 μW), e coloc a ponta do chicote que aponta a uma corrediça plástica autofluorescent. Isto não tem nenhum rolamento em gravações futuras mas é unicamente para visualizar o processo do alinhamento.
  4. Gravar a partir da câmera CMOS (13, Figura 2b) no modo ao vivo. Aumente o ganho ou ajuste a tabela de pesquisa (LUT) até que a imagem não seja totalmente preta. O ponto é ser capaz de ver uma imagem no ponto focal do objetivo (10, Figura 2b).
  5. Avance o tradutor de 5 eixos em direção ao objetivo, assegurando que a luz 470 nm esteja centrada na fibra na extremidade SMA ou FC do cabo de remendo, até que uma imagem possa ser resolvida na câmera.
  6. Ajuste os eixos X e Y até que a imagem seja centralizada e bem resolvida.
  7. Visualize a luz emitida da ponteira-extremidade do cabo de remendo. Deve aparecer como um círculo isotrópico. Se um cabo de remendo de ramificação é usado, a quantidade de luz emitida nas ponteira-extremidades de cada cabo de remendo deve ser similar. Se o círculo não for isotrópico ou se a luz emitida for desigual, ajuste o tradutor de 5 eixos no eixo X-Y.

2. configuração de ROIs em torno das fibras para a medida da intensidade fluorescente média

  1. Ligue todas as luzes de excitação para visualizar melhor as fibras. Ajuste o ganho da câmera de forma que nenhum pixel esteja saturado e uma imagem clara das fibras esteja presente.
  2. Registro ao vivo ou ter uma imagem preliminar.
  3. Desenhar ROIs em torno das fibras e mantê-los para a medição dos valores médios de intensidade durante as gravações (Figura 2a).
  4. Para gravações múltiplas da fibra, teste para a independência nos sinais.
    1. Registro ao vivo de todas as fibras.
    2. Aponte uma fibra para uma fonte de luz e bata com um dedo. Flutuações muito grandes devem ocorrer unicamente nesse canal (vazamento aceitável 1:1000).
    3. Se os sinais não forem independentes, redesenhe ROIs mais conservadores e repita o teste de independência.
  5. Para etiquetar e manter-se a par de que ROI corresponde a que a fibra, a fita colorida ou o lustrador de prego podem ser aplicados à extremidade das fibras. Tire uma foto antes do início de qualquer experimento como um lembrete secundário.

3. configuração da arena de gravação

  1. Pendure o cabo de remendo acima da arena usando carrinhos, grampos, ou suportes.
  2. Certifique-se de que o animal pode mover-se livremente ao longo de toda a arena, desinibida pelo comprimento da fibra.
  3. Se uma caixa operante ou campo aberto é usado, assegure-se de que o cabo de remendo possa alcangar o animal com dobra mínima. Se isto exige um puxão do nariz, assegure-se de que haja bastante sobrecarga do quarto para impedir a dobra da fibra. Evite qualquer dobra ou torção excessiva do cabo de remendo.

4. gravações in vivo

Nota: o procedimento de implante de cânula de fibra óptica para experimentos de fotometria de fibra é idêntico ao procedimento para optogenética, conforme descrito em Sparta et al.15. Recomendamos o uso de cimento dentário (ver tabela de materiais), que fornece ancoragem robusta do cinza para o osso do crânio. O cimento dentário será particularmente útil nos casos em que os parafusos de ancoragem não possam ser utilizados.

  1. Inspecione visualmente a extremidade longe do ponto de origem das fibras do cabo de remendo pelo olho e com um microscópio do minifiber. Se a superfície das fibras for arranhada, relustrar as fibras usando a película de lustro/lapping da fibra com grão fino (1 μm e 0,3 μm).
  2. Limpe as extremidades distais do cabo de remendo com 70% de etanol e um aplicador de ponta de algodão.
  3. Limpe as cânulas de fibra óptica usando 70% de etanol e um aplicador de ponta de algodão.
  4. Conecte a extremidade da ponteira do cabo de remendo à fibra implantada usando uma separação-luva cerâmica coberta com um tubo preto do psiquiatra. Durante a ligação, certifique-se de que a manga está apertada, caso contrário utilize uma manga nova.
    Nota: haverá uma grande quantidade de perda de sinal se houver algum espaço entre a ponteira do cabo de remendo e o implante, e as gravações não funcionarão.
  5. Permitir que o animal se recupere por alguns minutos antes do início do teste comportamental.
  6. Comece a gravar o sinal óptico e execute o experimento.
  7. Durante a gravação, mantenha um olho atento no rastreio ao vivo para garantir gravações de qualidade. Espera-se que o sinal diminua rapidamente em função do tempo nos primeiros 2 min de gravação. Este efeito é causado pela deterioração Heat-mediada do diodo emissor de luz, por meio de que o aumento no calor aumenta a resistência do elemento ótico.
  8. Se um salto no sinal que excede a cinética de ligar/desligar do GCaMP ocorre, isto é frequentemente uma indicação que a luva não é apertada bastante e o espaço entre o cabo de remendo e o implante está mudando. Neste caso, pare o experimento e reconecte o animal usando uma luva nova.

5. análise de dados da fotometria da fibra

Nota: Este é um método para análise de dados que funciona bem para a maioria das gravações. No entanto, abordagens alternativas podem ser implementadas. Código de exemplo para análise de dados pode ser encontrado aqui: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.

  1. Extraia os valores médios de intensidade de fluorescência registados a partir de 470 nm (int470) e 410 nm (int410) LEDs, correspondendo a cada fibra individual.
  2. Suavizar cada sinal usando um algoritmo de média móvel (Figura 3a).
  3. Execute a correção de linha de base de cada sinal (Figura 3a e 3B) usando o algoritmo adaptável iterativamente reponderado penalizado de mínimos quadrados (airpls) (https://github.com/zmzhang/airPLS) para remover a inclinação e a baixa frequência flutuações nos sinais.
  4. Padronize cada sinal usando o valor médio e o desvio padrão (Figura 3C):
    Equation 1
  5. Usando regressão linear robusta não negativa, ajuste os sinais padronizados zint410 a zint470 (Figura 3D) para a função de regressão:
    Equation 2
    1. Use os parâmetros da regressão linear (a, b) para encontrar novos valores de zint410 cabido a zint470 (fitint410, Figura 3D, E):
      Equation 3
  6. Calcule o DF/f normalizado (z DF/f) (Figura 3f):
    Equation 4

6. simultânea Dual-cor gravações

  1. Adicione ao sistema da fotometria um diodo emissor de luz de 560 nanômetro para excitar o sensor fluorescente vermelho do cálcio e os espelhos e os filtros dichroic apropriados (veja Kim et al., 2016 para a descrição detalhada)12.
  2. Adicione um divisor de imagem entre o objetivo e a câmera CMOS para separar os comprimentos de onda de emissão verde e vermelho (veja a Figura 5). O divisor de imagem irá formar duas imagens espelhadas no sensor da câmera, correspondendo aos sinais vermelhos e verdes (por exemplo, um cabo de remendo com 3 ramos criará uma imagem com 6 fibras).
  3. Desenhe ROIs em torno de todas as fibras em ambas as cores como detalhado acima. Certifique-se de identificar claramente cada ROI com a fibra correspondente e canal (verde e vermelho) (Figura 4A).
  4. Acionar A excitação simultânea com 470 nm e 560 nm LEDs e alterná-los com 410 nm LED (Figura 5A).

7. análise de dados de cor dupla

  1. Siga as etapas na seção 5 para encontrar Fitint410 para o sinal 470 inte calcule z DF/F.
  2. Porque o ponto espécies para GECIS vermelho-deslocado é geralmente desconhecido, o sinal gravado com o diodo emissor de luz de 410 nanômetro no canal verde pode ser usado para a correção do movimento através de ambos os canais. Siga as etapas na seção 5 para encontrar Fitint410 para o sinal 560 inte calcule z DF/F.

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Representative Results

Correlações neurais de respostas comportamentais podem variar dependendo de uma variedade de fatores. Neste exemplo, utilizou-se a fotometria de fibra in vivo para medir a atividade dos terminais AXON da área hipotálamo lateral (LHA) que terminam no habenula lateral (LHb). Camundongos tipo Wild foram injetados com um vírus adeno-associado (AAV) codificando GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) na LHA e uma fibra óptica foi implantada com a ponta imediatamente acima do LHb (Figura 4a). GCaMP6s expressão é encontrada nos corpos celulares da LHA e seus terminais AXON projetando para o LHb, onde o sinal de cálcio pode ser gravado. A ativação da via LHA-LHb promove a evasão passiva no teste de preferência em tempo real, sugerindo que esta via transmite sinais aversivos16. Os camundongos foram então conectados ao sistema de fotometria de fibra, colocados em uma arena aberta por 6 min, e expostos a 1 seg airpuffs aversivo cada 60 seg. A fluorescência medida aumentou significativamente concomitantemente com a administração de airpuffs (Figura 4B-C). Em camundongos expressando proteína verde fluorescente (GFP), nenhuma alteração no sinal foi detectada durante a administração de airpuffs (Figura 4C). Após o teste comportamental, o local da injeção no LHA e a colocação da fibra acima do LHb foram confirmados histològica (Figura 4A).

Figure 1
Figura 1: estratégias e abordagens para expressão de GECI com especificidade anatômica e tipo celular. (A) uma codificação viral do vírus adeno-associado do vetor (AAV) GCaMP6 (AAV-GCaMP6) é injetada em uma região do cérebro do interesse. A fibra óptica pode ser implantada cronicamente com a ponta colocada sobre os corpos celulares (1) ou sobre os terminais AXON (2). Para a expressão seletiva em uma população neuronal genetically-definida, um AAV CRE-dependente (por exemplo, AAV-dio-GCaMP6) pode ser injetado em ratos transgênicas que expressam o recombinase do CRE em uma população neuronal específica. (B) para a imagem latente do cálcio da duplo-cor, neste exemplo um AAV-GCaMP6s é injetado em uma região do cérebro do interesse, e um CRE-dependente AAV que codifica um Geci vermelho-deslocado (por exemplo, jrGECO1a; AAV-DIO-jrGECO1a) é injetado em uma população neuronal geneticamente definida em uma região do cérebro alvo. A fibra óptica é implantada para a imagem latente simultânea do sinal do cálcio dos terminais do AXON (fluorescência verde) e dos corpos da pilha (fluorescência vermelha). (C) para uma estratégia viral intersecional, um vetor viral com propriedades retrógradas do transporte (como retroaav17) que codifica o recombinase do CRE (retroaav-CRE) é injetado na região do cérebro do alvo junto com um AAV-dio-GCaMP6s injetado em a região do cérebro saliente no mesmo rato. As cânulas ópticas da fibra são implantadas sobre os corpos da pilha para a gravação cálcio-dependente robusta do sinal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema de fotometria de fibras. (A) aluz de excitação de dois LEDs (410 nm e 470 nm) passa através de uma série de filtros e espelhos dichroic e produz um ponto de excitação na distância de trabalho do objetivo 20x. A luz passa através de um único cabo de remendo ou de fibras empacotadas (para gravações múltiplas do local) que são conectadas às cânulas implantadas. A fluorescência emitida é coletada pelas mesmas fibras, filtradas e projetadas em um sensor de câmera CMOS. Nas imagens capturadas, a intensidade média de fluorescência é registrada nas ROIs de cada fibra. Para adquirir simultaneamente sinais de ambos os 410 nm e 470 nm LEDs, uma multiplexação de divisão de tempo é implementada (diagrama inferior direito). (B) imagem de nosso sistema personalizado-feito da fotometria e de seus componentes: (1) fibra para o 465 nm LED, (2) fibra para o 405 nm LED, (3) colimadores, (4) 470 nm bandpass filtro, (5) 410 nm bandpass filtro, (6) 535 Nm bandpass filtro, (7) tubo de lente, (8) cubo com longpass 425 espelho dichroic, (9) cubo com longpass 495 espelho dichroic, (10) objetivo 20x, (11) tradutor de 5 eixos, (12) mono-ou cabo de remendo da fibra empacotada, (13) câmera do CMOS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: análise de dados de fotometria de fibras. (A) intensidades fluorescentes médias suavizadas (int) gravadas a partir de 470 nm (linha azul superior) e de comprimentos de onda de excitação de 410 nm (linha roxa inferior). As linhas pretas são linhas base encontradas usando o algoritmo de airpls. (B) alterações da intensidade relativa dos sinais após a correção basal. (C) estandardizados 470 nm e 410 nm sinais (zInt470, Top; zInt410, inferior). (D) não-negativo robusto ajuste linear de 470 nm e 410 nm sinais. (E) alinhamento do traço Int410 a Int470 com base no ajuste. (F) alteração dependente de cálcio corrigida e normalizada na fluorescência (z DF/F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: resultados representativos. (A) diagrama do procedimento experimental. Um AAV-GCaMP6s é injetado no LHA dos ratos e 4 semanas mais tarde, uma cânula ótica da fibra é implantada sobre o LHb para a gravação terminal do sinal do AXON. Os Inset são imagens confocais representativas da expressão GCaMP6s nos corpos celulares dos neurônios LHA (à esquerda) e seus terminais axônio projetando-se para o LHb (à direita). (B) traço representativo do sinal do cálcio aos airpuffs (barras verticais tracejadas) medidos dos terminais do AXON de lhb-projetando lha medidos de um rato GCaMP6s-expressando. (C) peri-parcela do evento da resposta média do cálcio aos eventos do stimuli. A linha verde grossa representa a média e as regiões verde-protegidas representam o erro padrão da média (sem, painel esquerdo), e o sinal medido antes e depois de um Stimuli (3 ratos, 15 eventos). (D, E) Mesmas medições que (B, C) para camundongos expressando GFP (2 camundongos, 10 eventos). As barras de escala são 200 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: esquema de fotometria de fibra de dupla cor. (A) um diodo emissor de luz adicional de 560 nanômetro, uns filtros apropriados e uns espelhos dichroic, e um divisor da imagem antes do sensor da câmera foram adicionados à instalação original. B) componentes do sistema fotometria: (1) fibra para o 560 nm LED, (2) fibra para o 465 nm LED, (3) fibra para o 405 nm LED, (4) colimadores, (5) 560 nm bandpass filtro, (6) 470 nm bandpass filtro, (7) 410 nm bandpass filtro, (8) cubo com longpass 495 dichroic espelho , (9) cubo com longpass 425 espelho dichroic, (10) cubo com 493/574 espelho dichroic, (11) 20x objetivo, (12) tradutor de 5 eixos, (13) mono-ou cabo de remendo da fibra empacotada, (14) divisor da imagem, (15) câmera do CMOS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A fotometria da fibra é uma aproximação acessível que permita que os investigadores gravem a dinâmica do volume-cálcio das populações neuronal definidas em animais livre-moventes. Este método pode ser combinado com uma ampla gama de testes comportamentais, incluindo tarefas de "movimento pesado", como testes de natação forçada2, Fear-condicionamento18, interações sociais1,4e outros7, 8,19,20. Isso permite que os pesquisadores observem quais comportamentos ou estímulos impulsionam a atividade em uma determinada população neural ou vice-versa.

Apesar de sua simplicidade prima facie , há umas considerações importantes ao executar a fotometria da fibra, e o sistema detalhado neste protocolo oferece diversas vantagens que contorna armadilhas comuns. Primeiramente, aproveita-se do fato que as variações de gcamp têm um ponto espécies cálcio-independente da excitação em torno de 410 nanômetro21 e multiplexação da tempo-divisão para corrigir mudanças cálcio-dependentes nos sinais quase simultaneamente12. Quando os neurônios expressando GCaMP estão excitados com 410 nm de comprimento de onda, a intensidade de emissão de GCaMP é independente de sua ligação ao cálcio e se comporta essencialmente como um GFP de baixa eficiência. A multiplexação de divisão de tempo usa 410 nm de cálcio-independente e 470 nm de comprimentos de onda de excitação dependente de cálcio na mesma gravação. O sinal gravado com o comprimento de onda da excitação de 410 nanômetro é usado como um controle para mudanças cálcio-independentes do movimento e do artefato na intensidade da fluorescência. As estratégias alternativas que não incluem usos simultâneos da excitação espécies de gcamp podem ser envisioned. Por exemplo, é possível preparar dois coortes de animais, um expressando GFP e o outro expressando GCaMP2. No entanto, este não é um controle perfeito, como é através dos animais e é mais difícil identificar se uma dada resposta em um determinado animal era um artefato. Em segundo lugar, a configuração de fotometria de fibra descrita permite aos pesquisadores medir a atividade em vários caminhos simultaneamente, abrindo a porta para perguntas sobre a propagação do sinal em todo o cérebro. Em terceiro lugar, a gravação de duas cores permite flexibilidade adicional para dissecar diferentes vias na mesma região do cérebro combinando GECIs verde e vermelho-deslocado (Figura 1).

Com gravações da fotometria da fibra, a fluorescência muito baixa da emissão precisa de ser gravada com o ruído de fundo. Portanto, é crucial garantir a coleta máxima da fluorescência emitida pelo GECIs. Primeiro, ao desenvolver uma estratégia viral deve-se considerar que a gravação a partir de terminais pode ser desafiador, porque os terminais AXON no campo de gravação pode ser escasso. Para resolver este problema, uma estratégia viral intersecional alternativa pode ser imaginado permitindo a expressão de GCaMP em uma região alvo-projetando do interesse e das cânulas óticas da fibra implantadas acima dos corpos da pilha, onde a fluorescência mais robusta pode ser medido22,23,24. Outro fator que pode impactar negativamente a relação sinal-ruído é a qualidade da cânula de fibra óptica e do cabo de remendo. Para Implantations, o virola do aço inoxidável é preferível, porque o zirconia é altamente autofluorescent e aumentará o sinal do fundo. É essencial usar as cânulas de fibra óptica de alta qualidade com conectores terminais bem polidos e altas taxas de transmissão (> 85% de transmissão). Quaisquer defeitos nas fibras levará a uma diminuição na relação sinal-ruído. O cabo de remendo da fibra ótica deve ser da alta qualidade também. Os fornecedores produzem fibras projetadas especificamente para a fotometria da fibra, em que o autofluorescence é minimizado tanto quanto possível. Os cabos de remendo feito-à-medida frequentemente não alcangam a eficiência exigida. Também é importante otimizar o alinhamento do caminho óptico para obter uma imagem com todas as fibras bem resolvidas no ponto focal do objetivo. Além disso, a abertura numérica (NA) da fibra deve corresponder àquela do cabo de remendo assim como o objetivo usado com o sistema. Qualquer incompatibilidade de NA resultará em excitação ou perda de luz de emissão. Todas as etapas anteriores fornecerão sinais claros dependentes de cálcio. No entanto, uma correção de sinal ainda é necessária. A maioria das gravações tem uma diminuição exponencial da fluorescência devido à autofluorescência nas fibras, deterioração do LED mediada pelo calor e fotobranqueamento. Esta diminuição varia com diferentes fibras e canais, e é importante removê-lo em cada canal separadamente usando o algoritmo airPLS descrito na seção de protocolo. Em segundo lugar, a correção de movimento deve ser levada em conta. Mesmo se os sinais de GCaMP parecerem altos onde qualquer alteração de artefato pareça insignificante, é importante corrigi-la com sinal independente de cálcio. O gráfico com sinais alinhados de 410 nm e 470 nm é uma referência que mostra quais mudanças de intensidade são causadas pelo GCaMP e não por artefatos.

Adicionando um diodo emissor de luz da excitação de 560 nanômetro, lentes dichroic apropriadas, e um refletores permite a gravação simultânea da fluorescência verde e vermelha. Isso abre a possibilidade de monitorar a atividade neural de duas populações neuronais geneticamente distintas ou monitorar a atividade pré-sináptica dos terminais axíticos (por exemplo, expressar GCaMP6) e a atividade neuronal pós-Synaptic (por exemplo, expressar jrGECO1a). Ao implementar gravações de cores duplas, considerações importantes precisam ser mantidas em mente. Fotoconversão e fotoativação significativos foram relatados para muitos GECIS vermelho-deslocados, onde a iluminação com 405 nanômetro, 488 nanômetro, e 560 nanômetro pode aumentar a fluorescência cálcio-independente25. Uso de jrGECO1a e RCaMP1b pode minimizar esse problema26. Uma outra preocupação durante a imagem latente dupla da cor é sinal verde que escapa no canal vermelho. Muitas estratégias podem ser imaginou para evitar este problema. Por exemplo, é possível intertecer os três comprimentos de onda da excitação para excitar o ponto espécies do sensor verde do cálcio (410 nanômetro), o sinal cálcio-dependente do sensor verde do cálcio (470 nanômetro), e o sensor vermelho do cálcio (560 nanômetro) na seqüência. Nesse caso, é possível confiar no ponto espécies do sensor verde para a correção do movimento. Finalmente, ao executar a imagem latente de cor dupla, é o melhor adquirir um sinal mais forte do sensor vermelho do cálcio (por exemplo, da pilha somas) porque estes têm umas emissões mais fracas da fluorescência comparados aos sensores verdes.

Novos sensores fluorescentes geneticamente codificados foram desenvolvidos para detecção rápida e específica in vivo da liberação do neurotransmissor22,23,24. Estes sensores emitem a fluorescência verde quando encadernado com seu ligante endógeno respectivo e podem ser combinados com o GECIS vermelho-deslocado, tal como jrGECO1a, para a deteção simultânea da liberação do neurotransmissor simultaneamente com as mudanças na atividade neuronal de únicas fibras ópticas múltiplas5,27.

A fotometria da fibra fornece a flexibilidade requintado monitorar a atividade neural em animais livremente-moventes através dos cabos de remendo flexíveis e leves da fibra óptica. No entanto, não é adequado para situações que exigem movimento entre compartimentos, tais como testes de câmara de luz escura. Isto será possível com desenvolvimentos mais adicionais no sistema sem fio da fotometria28. Finalmente, embora forneça grandes vantagens ao monitorar a dinâmica neural de várias regiões cerebrais, ou de populações neurais distintas, o sinal obtido na fotometria de fibras é um agregado de muitos neurônios que não podem disparar com a mesma dinâmica temporal e não será resolvida. Entretanto, fornece uma aproximação complementar à imagem latente microendoscópica in vivo do cálcio que resolve o sinal somático do cálcio de dezenas a centenas de neurônios individuais29. Finalmente, ao gravar a partir de múltiplas fibras em um único animal, pode ser difícil diferenciar se o sinal está vindo dos terminais ou da célula somas. Projetar experimentos com cuidado pode superar a maioria dessas limitações. Entretanto, o desenvolvimento de GECIs novo localizou exclusivamente na pilha somas fornecerá mais definição durante experimentos da imagem latente do cálcio da multi-fibra.

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Disclosures

Sage Aronson é o CEO e fundador da Neurophotometrics Ltd., que vende sistemas de fotometria de múltiplas fibras.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (NSERC: RGPIN-2017-06131) para C.P. C. P. é um FRSQ chercheur-Boursier. Agradecemos também ao Plateforme d' Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) pela produção dos vetores virais utilizados neste estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long Thorlabs SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long Thorlabs SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long Thorlabs SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs M59L01
12.7 mm Optical Post Thorlabs TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder Thorlabs PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube Thorlabs KPS101
20x objective Thorlabs RMS20X #10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs CM1-DCH/M #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED Doric Lenses CLED_405 #2 in Figure 2
410 nm bandpass filter Thorlabs FB410-10 #5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED Doric Lenses CLED_465 #1 in Figure 2
470 nm bandpass filter Thorlabs FB470-10 #4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter Semrock FF01-560/14-25 #5 in Figure 5
560 nm LED Doric Lenses CLED_560 #1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount Thorlabs K5X1 #11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet Thorlabs AC254-035-A-ML #7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator Thorlabs AD11F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator Thorlabs AD127-F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard Thorlabs MB1824
Clamping Fork Thorlabs CF125
Cube connector Thorlabs CM1-CC
Dual 493/574 dichroic Semrock FF493/574-Di01-25x36 #10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6 Semrock FF01-535/22-25 #6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels Thorlabs XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining Thorlabs SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder Thorlabs SM1QP #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light Thorlabs F671SMA-405 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light Thorlabs F240SMA-532 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter Semrock FF01-520/35-25 In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera Thorlabs DCC3260M #13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter Neurophotometrics SPLIT #14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff Thorlabs DMLP425R #8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff Semrock FF495-Di03 #9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement C&B
M8 - M8 cable Doric Lenses Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter Semrock FF01-600/37-25 In light beam splitter
T7 LabJack LabJack
T-cube LED Driver Thorlabs LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 Thorlabs CAB-DCU-T3

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References

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Comportamento indicador de cálcio geneticamente codificado GCaMP fotometria de fibras comportamento vias neurais animais em movimento livre
Fotometria de múltiplas fibras para gravar atividade neural em animais em movimento livre
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Martianova, E., Aronson, S., Proulx, More

Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. J. Vis. Exp. (152), e60278, doi:10.3791/60278 (2019).

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