Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man implementerer og udfører multifiber fotometriske optagelser, hvordan man korrigerer for calcium-uafhængige artefakter, og vigtige overvejelser for dual-Color fotometri Imaging.
Abstract
Registrering af aktiviteten af en gruppe af neuroner i et frit bevægende dyr er en udfordrende virksomhed. Desuden, da hjernen er dissekeret i mindre og mindre funktionelle undergrupper, det bliver altafgørende at registrere fra fremskrivninger og/eller genetisk definerede subpopulationer af neuroner. Fiber fotometri er en tilgængelig og kraftfuld tilgang, der kan overvinde disse udfordringer. Ved at kombinere optiske og genetiske metoder kan neurale aktiviteter måles i dybe hjernestrukturer ved at udtrykke genetisk kodede calcium indikatorer, som omsætter neurale aktiviteter til et optisk signal, der let kan måles. Den nuværende protokol beskriver komponenterne i en multi-fiber fotometri system, hvordan man adgang dybe hjernestrukturer til at levere og indsamle lys, en metode til at konto for motion artefakter, og hvordan man behandler og analyserer fluorescerende signaler. Protokollen beskriver eksperimentelle overvejelser, når du udfører enkelt og dobbelt farve billeddannelse, fra enten enkelt eller flere implanterede optiske fibre.
Introduction
Evnen til at korrelere neurale reaktioner med specifikke aspekter af et dyrs adfærd er afgørende for at forstå den rolle, en bestemt gruppe af neuroner spiller i at lede eller reagere på en handling eller stimulus. I betragtning af kompleksiteten af dyrs adfærd, med myriader af interne stater og eksterne stimuli, der kan påvirke selv den enkleste af handlinger, optagelse af et signal med enkelt-Trial resolution udstyre forskerne med de nødvendige værktøjer til at overvinde disse Begrænsninger.
Fiber fotometri er blevet den foretrukne teknik for mange forskere inden for systemer Neurovidenskab på grund af sin relative enkelhed i forhold til andre in vivo optagelses teknikker, dens høje signal-støj-forhold, og evnen til at optage i en række forskellige adfærdsmæssige paradigmer1,2,3,4,5,6,7,8. I modsætning til traditionelle elektrofysiologiske metoder er fotometri den optiske tilgang, der oftest anvendes sammen med genetisk kodede calcium indikatorer (GECIs, GCaMP-serien)9. GECIs ændre deres evne til at fluorescerer baseret på, om de er bundet til calcium. Fordi den interne koncentration af calcium i neuroner er meget stramt reguleret og spændings-gated calcium kanaler åbne, når en neuron brande et aktionspotentiale, forbigående stigninger i den indre calciumkoncentration, hvilket resulterer i forbigå lige stigninger i evne til en GECI til fluorescens, kan være en god proxy for neuronal fyring9.
Med fiber fotometri, excitation lys er rettet ned en tynd, multi mode optisk fiber i hjernen, og et emissions signal er indsamlet tilbage op gennem den samme fiber. Fordi disse optiske fibre er lette og bøjelige, kan et dyr bevæge sig stort set uhindret, hvilket gør denne teknik kompatibel med en bred vifte af adfærdsmæssige tests og betingelser. Nogle betingelser, såsom hurtige bevægelser eller bøjning af fiber-optisk patch ledning ud over den radius, hvor det kan opretholde total interne refleksion, kan introducere signal artefakter. For at skelne signal fra støj, kan vi udnytte en ejendom af GCaMP kendt som "isosbestic point." Kort, med GCaMP, som bølgelængden af excitation lys er flyttet til venstre, dens emission i den calcium-bundne tilstand falder og emissionen i den calcium-ubundne tilstand marginalt stiger. Det punkt, hvor den relative intensitet af disse to emissioner er lige, kaldes det isosbestiske punkt. Når GCaMP er spændt på dette tidspunkt, dets emission er upåvirket af ændringer i de interne calcium koncentrationer, og variansen i signalet er oftest på grund af dæmpning af signalet fra over bøjningen af fiber-optisk patch ledning eller bevægelse af neurale væv i forhold til den implanterede fiber.
Enkelt enhed Elektrofysiologi er stadig den gyldne standard for frit-at flytte in vivo optagelser på grund af sin enkelt-celle og single-Spike niveau opløsning. Det kan imidlertid være vanskeligt at identificere den molekylære identitet af de celler, der registreres, og post-hoc-analysen kan være ganske omstændelig. Mens fiber fotometri ikke har en enkelt celle opløsning, det gør det muligt for forskerne at stille spørgsmål umuligt at behandle med traditionelle teknikker. Ved at kombinere virale strategier med transgene dyr kan ekspression af GECIs rettes mod genetisk definerede neuronal typer til registrering af populations-eller projektions definerede neurale aktiviteter, som kan udføres ved at overvåge calcium signalet direkte ved Axon klemme10,11. Ved at implante flere fiberoptiske kanyle, er det desuden muligt samtidig at overvåge neurale aktiviteter fra flere hjerneområder og veje i samme dyr12,13.
I dette manuskript beskriver vi en teknik til enkelt-og multifiber fotometri, hvordan man korrigerer for calcium-uafhængige artefakter, og detaljer hvordan man udfører mono-og Dual-Color optagelser. Vi giver også eksempler på de typer af spørgsmål, det giver mulighed for at spørge og deres stigende kompleksitet (Se figur 1). Fiber fotometri opsætningen for multifiber optagelser, der er beskrevet i denne protokol, kan bygges ved hjælp af en liste over materialer fundet på https://sites.google.com/view/multifp/hardware (figur 2).
Det er vigtigt, at systemet er udstyret til både 410 nm og 470 nm excitation bølgelængder for calcium-uafhængig og calcium-afhængige fluorescens emission fra GCaMP6 eller dens varianter. For specialbyggede opsætninger, eller hvis der ikke er nogen tilgængelig software til at køre systemet, kan det gratis open source-program Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) bruges. Alternativt kan fiber fotometri køres gennem MATLAB (f. eks. https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 eller andet programmeringssprog14. Systemets software og hardware bør muliggøre manipulation af både 410 nm-og 470 nm-lysdioderne og kameraet, ekstraktion af billeder (figur 2) og beregning af den gennemsnitlige fluorescerende intensitet i de områder af interesse (Rois), der tegnes omkring fibrene på billederne. Udgangen skal være en tabel med gennemsnitlige intensitetsværdier optaget med 470 nm og 410 nm lysdioder fra hver fiber i patch ledningen. Når du udfører multi-fiber eksperimenter, kan 400 μm bundtede fibre begrænse flytning af mus. I sådanne tilfælde anbefaler vi at bruge 200 μm patch ledninger, som giver mere fleksibilitet. Det kan også være muligt at bruge mindre dummy kabler under træning af mus.
Det er afgørende at være i stand til at udtrække tidspunkter for begivenheder af interesse under fiber fotometri erhvervelse. Hvis systemet ikke umiddelbart giver et indbygget system til at integrere Ttl'er for bestemte hændelser, er en alternativ strategi at tildele et tidsstempel til individuelle tidspunkter, der er registreret for at tilpasse sig bestemte tider og hændelser under eksperimentet. Tidsstempling kan gøres ved hjælp af computerens ur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de institutionelle dyrepasning og brug komitéer på University of California, San Diego, og den canadiske guide til pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af Université Laval Animal Protection Udvalget.
1. justering af den optiske vej mellem CMOS (komplementært metaloxid halvleder) kamera og den individuelle eller forgrenet patch ledning
- Løsn alle skruer på 5-akse oversætteren (11, figur 2B).
- Skru i patch ledningen (12, figur 2B) til adapteren [sma (sub-miniature A) eller FC (fiberoptik stik)], der er fastgjort til 5-akse oversætteren.
- Tænd for 470 nm excitation Light (1, figur 2b) ved lav effekt (100 μw), og Placer spidsen af patchcord, som peger på et autofilter med plastik udtræk. Dette har ingen indflydelse på fremtidige optagelser, men er udelukkende til visualisering af justeringsprocessen.
- Optag fra CMOS-kameraet (13, figur 2b) i live-tilstand. Forøg Gain, eller Juster opslagstabellen (LUT), indtil billedet ikke er helt sort. Pointen er at kunne se et billede i brændpunktet af målet (10, figur 2b).
- Advance den 5-akse oversætter mod målet, at sikre, at 470 nm lys er centreret om fiber på SMA eller FC enden af patch ledningen, indtil et billede kan løses på kameraet.
- Juster X-og Y-akserne, indtil billedet er centreret og godt løst.
- Visualiser det lys, som udsendes fra ferrule-enden af patch ledningen. Det skal fremstå som en isotropisk cirkel. Hvis der anvendes en forgrenings snor, skal mængden af lys, der udsendes ved ferrule-enderne af hver lappe ledning, være den samme. Hvis cirklen ikke er isotropisk, eller det udsendte lys er ulige, kan du justere 5-aksens oversætter i X-Y-aksen.
2. opsætning af ROIs omkring fibre til måling af middel fluorescerende intensitet
- Tænd for alle de excitation lys til bedre at visualisere fibrene. Juster kameraets Gain sådan, at ingen pixels er mættet og et klart billede af fibrene er til stede.
- Live record eller tage et foreløbigt billede.
- Tegn ROIs omkring fibrene og opbevar dem til måling af middelintensitets værdierne under optagelser (figur 2A).
- For flere fiber optagelser, test for uafhængighed i signaler.
- Live record fra alle fibre.
- Peg på en fiber mod en lyskilde, og tryk med en finger. Meget store udsving bør kun forekomme i denne kanal (acceptabel lækage 1:1000).
- Hvis signalerne ikke er uafhængige, genudstedelse mere konservative Rois og gentage uafhængigheds testen.
- At mærke og holde styr på, hvilke ROI svarer til hvilke fiber, farvet tape eller neglelak kan anvendes til enden af fibrene. Tag et billede før starten af et eksperiment som en sekundær påmindelse.
3. opsætning af optagelses Arena
- Hæng plaster ledningen over arenaen ved hjælp af stativer, klemmer eller holdere.
- Sørg for, at dyret frit kan bevæge sig i hele arenaen, uhæmmet af længden af fiber.
- Uanset om der anvendes en operant boks eller et åbent felt, skal du sikre, at patch ledningen vil kunne nå dyret med minimal bøjning. Hvis dette kræver en næse Poke, sikre, at der er nok plads overhead til at forhindre bøjning af fiber. Undgå overdreven bøjning eller vridning af plaster ledningen.
4. in vivo-optagelser
Bemærk: proceduren for optisk fiber kanyle implantation for fiber fotometri eksperimenter er identisk med proceduren for optogenetik som beskrevet i Sparta et al15. Vi anbefaler at bruge dental cement (Se tabel over materialer), som giver robust forankring af headcap til kraniet knogle. Dental cement vil være særlig nyttig i tilfælde, hvor forankring skruer ikke kan anvendes.
- Inspicér visuelt den distale ende af fibrene i plasteret med øje og med mini fiber mikroskop. Hvis overfladen af fibrene er ridset, repolish fibrene ved hjælp af fiber polering/lapping film med fine Grit (1 μm og 0,3 μm).
- Rengør de distale ender af patch ledningen med 70% ethanol og en bomulds spids applikator.
- Rengør den fiberoptiske kanyle ved hjælp af 70% ethanol og en bomulds spids applikator.
- Tilslut ferrule enden af patch ledningen til den implanterede fiber ved hjælp af en keramisk split-ærme dækket med en sort krympe slange. Under forbindelsen skal du sørge for, at ærmet er stramt, ellers skal du bruge et nyt ærme.
Bemærk: der vil være en stor mængde af signal tab, hvis der er nogen plads mellem patch ledningen ferrule og implantatet, og optagelserne vil ikke arbejde. - Lad dyret komme sig i et par minutter før starten af adfærdsmæssige tests.
- Start optagelsen af det optiske signal, og Kør eksperimentet.
- Mens du optager, skal du holde øje med Live-Trace for at sikre kvalitets optagelser. Signalet forventes at falde hurtigt som en funktion af tiden i de første 2 minutter af optagelsen. Denne effekt er forårsaget af varme-medieret LED forfald, hvorved stigningen i varmen øger modstanden af det optiske element.
- Hvis et hop i signalet, der overstiger den on/off kinetik af GCaMP opstår, er dette ofte en indikation af, at ærmet ikke er stramt nok, og rummet mellem patch ledningen og implantatet er under forandring. I dette tilfælde, stop eksperimentet og Tilslut dyret igen ved hjælp af en ny ærme.
5. analyse af fiber fotometri data
Bemærk: Dette er en metode til dataanalyse, der fungerer godt for de fleste optagelser. Der kan dog gennemføres alternative tilgange. Eksempelkode for dataanalyse kan findes her: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.
- Udpak middelværdier for fluorescens intensitet registreret fra 470 nm (int470) og 410 nm (int410) lysdioder, svarende til hver enkelt fiber.
- Glat hvert signal ved hjælp af en bevægende middelalgoritme (figur 3a).
- Udfør den oprindelige korrektion af hvert signal (figur 3A og 3b) ved hjælp af den adaptive iterativt Revægtede Penaliserede mindste kvadraters (airpls) algoritme (https://github.com/zmzhang/airPLS) for at fjerne hældningen og den lave frekvens udsving i signalerne.
- Standardiserer hvert signal ved hjælp af middelværdien og standardafvigelsen (figur 3C):
- Brug af ikke-negativ robust lineær regression, Tilpas standardiserede zint410 til zint470 signaler (figur 3D) til regressions funktionen:
- Brug parametrene for den lineære regression (a, b) for at finde nye værdier af Zint410 monteret på zint470 (fitint410, figur 3D, E):
- Brug parametrene for den lineære regression (a, b) for at finde nye værdier af Zint410 monteret på zint470 (fitint410, figur 3D, E):
- Beregn den normaliserede DF/f (z DF/f) (figur 3F):
6. samtidige Dual-Color optagelser
- Tilføj til fotometri-systemet en 560 nm førte til at begejstre den røde fluorescerende calcium sensor og passende koldtlysreflektorlamper-spejle og filtre (Se Kim et al., 2016 for detaljeret beskrivelse)12.
- Tilføj en billed opdeler mellem målsætningen og CMOS-kameraet for at adskille de grønne og røde emissions bølgelængder (Se figur 5). Billed splitter vil danne to spejlede billeder på kamerasensoren, svarende til de røde og grønne signaler (f. eks. en patch ledning med 3 grene vil skabe et billede med 6 fibre).
- Tegn ROIs omkring alle fibre i begge farver som beskrevet ovenfor. Sørg for klart at identificere hver ROI med den tilsvarende fiber og kanal (grøn og rød) (figur 4A).
- Udløse simultan excitation med 470 nm og 560 nm lysdioder og suppleant dem med 410 nm LED (figur 5A).
7. analyse af Dual Color-data
- Følg trinene i afsnit 5 for at finde fitint410 til int470-signalet og Beregn z DF/F.
- Fordi det isosbestiske punkt for rødt-forskudt GECIs er generelt ukendt, kan signalet optaget med 410 nm LED i den grønne kanal bruges til bevægelses korrektion på tværs af begge kanaler. Følg trinene i afsnit 5 for at finde fitint410 til int560-signalet og Beregn z DF/F.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurale korrelater af adfærdsmæssige svar kan variere afhængigt af en række faktorer. I dette eksempel brugte vi in vivo fiber fotometri til at måle aktiviteten af Axon-terminaler fra det laterale hypothalamus-område (LHA), der ophører i den laterale habenula (LHb). Wild type mus blev injiceret med en adeno-associeret virus (AAV) kodning GCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) i LHA og en optisk fiber blev implanteret med spidsen umiddelbart over LHb (figur 4A). GCaMP6s-ekspression findes i LHA'S celle kroppe og deres Axon-terminaler projicerer til LHb, hvor der kan optages calcium signal. Aktivering af LHA-LHb-vejen fremmer passiv undgåelse i realtids præference testen, der antyder, at denne vej transmitterer aversive-signaler16. Mus blev derefter forbundet til fiber fotometri system, placeret i en åben arena for 6 min, og udsat for 1 sek aversive luftpust hver 60 sek. Den målte fluorescens steg signifikant samtidig med administrationen af luft puffer (figur 4B-C). I mus, som udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), blev der ikke registreret nogen ændring i signalet under administration af luftpust (figur 4C). Efter adfærdsmæssige tests blev injektionsstedet i LHA og fiber placering over LHb bekræftet histologisk (figur 4A).
Figur 1: strategier og tilgange til GECI udtryk med anatomiske og celle-type specificitet. A) enviral vektor adeno-associeret virus (AAV) encoding GCaMP6 (AAV-GCaMP6) injiceres i en hjerneregion af interesse. Den optiske fiber kan være kronisk implanteret med spidsen placeret over cellen organer (1) eller over Axon terminaler (2). For selektiv ekspression i en genetisk defineret neuronal population kan en CRE-afhængig AAV (f. eks. AAV-DIO-GCaMP6) injiceres i Transgene mus, der udtrykker CRE-rekombinasen i en specifik neuronal population. (B) for dual-Color calcium Imaging, i dette eksempel en AAV-GCaMP6s injiceres i en hjerneregion af interesse, og en CRE-afhængige AAV kodning en rød-forskudt geci (f. eks, jrGECO1a; AAV-DIO-jrGECO1a) injiceres i en genetisk defineret neuronal population i en målhjerne region. Den optiske fiber implanteres til simultan calcium signalbilleddannelse af Axon-terminalerne (grøn fluorescens) og celle legemer (rød fluorescens). (C) for en tværsnits viral strategi injiceres en viral vektor med tilbagetransport egenskaber (som retroaav17), der indkoder CRE rekombinase (retroaav-CRE) i Target Brain region sammen med en AAV-Dio-GCaMP6s injiceres i den projicere hjerneregion i samme mus. Optiske fiber-kanyle er implanteret over celle ligene for robust calcium-afhængig signal optagelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fiber fotometri skematisk. (A) excitation Light fra to lysdioder (410 nm og 470 nm) passerer gennem en række filtre og koldtlysreflektorlamper spejle og producerer en excitation spot i arbejdsafstanden af 20x mål. Lyset passerer enten en enkelt patch ledning eller bundtede fibre (for flere site optagelser), der er forbundet til de implanterede kanyle. Den udsendte fluorescens opsamles af de samme fibre, filtreres og projiceres på en CMOS-kamera sensor. På de optagne billeder, den gennemsnitlige fluorescens intensitet registreres på ROIs af hver fiber. Til samtidig at erhverve signaler fra både 410 nm og 470 nm lysdioder, en time-division multiplexing er implementeret (nederste højre diagram). (B) billede af vores specialfremstillede fotometriske system og dets komponenter: (1) fiber til 465 Nm led, (2) fiber til 405 nm led, (3) kollimatorer, (4) 470 nm båndpas filter, (5) 410 nm båndpas filter, (6) 535 nm båndpas filter, (7) tube linse, (8) terning med longpass 425 koldtlysreflektorlamper spejl, (9) terning med longpass 495 koldtlysreflektorlamper spejl, (10) 20x mål, (11) 5-akse oversætter, (12) mono-eller bundtet-fiber patch ledning, (13) CMOS kamera. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af fiber fotometriske data. (A) udjævnet middel fluorescerende intensiteter (int) indspillet fra 470 nm (top blå linje) og 410 nm (nederste lilla linje) excitation bølgelængder. Sorte streger er basislinjer, der findes ved hjælp af airPLS-algoritmen. B) relative intensitets ændringer i signaler efter baseline korrektion. C) standardiserede 470 nm-og 410 nm-signaler (zInt470, top; zInt410, bund). D) ikke-negativt robust lineært fit på 470 nm-og 410 nm-signaler. (E) tilpasning af Trace Int410 til Int470 baseret på pasformen. F) korrigeret og normaliseret calciumafhængig ændring i fluorescens (z DF/F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater. A) diagram over forsøgs proceduren. En AAV-GCaMP6s injiceres i LHA af mus og 4 uger senere, en optik fiber kanyle implanteres over LHb for Axon Terminal signal optagelse. Inset er repræsentative konfokale billeder af GCaMP6s udtryk i celle kroppe af LHA neuroner (venstre) og deres Axon-terminaler projicerer til LHb (højre). B) repræsentativt calcium signal spor til luftpust (stiplede lodrette bjælker) målt fra LHB-projicering af LHA Axon-terminaler målt fra en mus med GCaMP6s udtryk. (C) peri-Event plot af den gennemsnitlige calcium respons på airpuff hændelser. Den tykke grønne linje repræsenterer gennemsnittet, og de grøn-skraverede områder repræsenterer standardfejl i middelværdien (SEM, venstre panel), og signalet måles før og efter en airpuff (3 mus, 15 begivenheder). (D, E) Samme mål som (B, C) for gfp-ekspor-mus (2 mus, 10 hændelser). Skala stænger er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: skematisk af Dual-Color fiber fotometri. A) yderligere 560 nm-led, passende filtre og koldtlysreflektorlamper-spejle samt en billed opdeler, før kamerasensoren blev føjet til den oprindelige opsætning. B) fotometriske systemkomponenter: (1) fiber til 560 nm led, (2) fiber til 465 Nm led, (3) fiber til 405 nm led, (4) kollimatorer, (5) 560 nm båndpas filter, (6) 470 nm båndpas filter, (7) 410 nm båndpas filter, (8) terning med longpass 495 koldtlysreflektorlamper spejl , (9) terning med longpass 425 koldtlysreflektorlamper spejl, (10) terning med 493/574 koldtlysreflektorlamper spejl, (11) 20x mål, (12) 5-akse oversætter, (13) mono-eller bundtet-fiber patch ledning, (14) billed splitter, (15) CMOS kamera. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fiber fotometri er en tilgængelig tilgang, der giver forskerne mulighed for at registrere bulk-calcium dynamik fra definerede neuronal populationer i frit bevægende dyr. Denne metode kan kombineres med en bred vifte af adfærdsmæssige tests, herunder "bevægelse tunge" opgaver såsom tvungen svømme tests2, frygt-condition18, sociale interaktioner1,4, og andre7, 8,19,20. Dette gør det muligt for forskerne at observere, hvad adfærd eller stimuli drive aktivitet i en bestemt neurale befolkning eller omvendt.
På trods af sin prima facie enkelhed, der er vigtige overvejelser, når de gennemfører fiber fotometri, og systemet i denne protokol giver flere fordele omgåelse fælles faldgruber. For det første udnytter det det faktum, at GCaMP varianter har en calcium-uafhængig isosbestisk excitation punkt omkring 410 nm21 og time-division multiplexing at korrigere calcium-afhængige ændringer i signaler næsten samtidig12. Når neuroner udtrykker GCaMP er begejstrede med 410 nm bølgelængde, er emissions intensiteten fra GCaMP uafhængig af dens binding til calcium og opfører sig i det væsentlige som en laveffektiv GFP. Time-division multiplexing bruger både 410 nm calcium-uafhængig og 470 nm calcium-afhængige excitation bølgelængder i samme optagelse. Signalet optaget med 410 nm excitation bølgelængde bruges som en kontrol for calcium-uafhængig bevægelse og artefakt ændringer i fluorescens intensitet. Alternative strategier, der ikke omfatter samtidige anvendelser af isosbestic excitation af GCaMP kan forestillede sig. For eksempel er det muligt at forberede to dyr kohorter, en udtrykker GFP og den anden udtrykker GCaMP2. Dette er imidlertid ikke en perfekt kontrol, da det er på tværs af dyr, og det er vanskeligere at identificere, hvis et givet svar i et givet dyr var en artefakt. For det andet, den beskrevne fiber fotometri setup giver forskerne mulighed for at måle aktivitet i flere veje samtidig, åbne døren til spørgsmål vedrørende signal formering i hele hjernen. For det tredje giver Dual-Color optagelse yderligere fleksibilitet til at dissekere forskellige veje i samme hjerneregion, der kombinerer grøn og rød-forskudt GECIs (figur 1).
Med fiber fotometriske optagelser skal der registreres en meget lav emission af fluorescens gennem baggrundsstøj. Det er derfor afgørende at sikre den maksimale indsamling af den fluorescens, der udsendes fra GECIs. For det første skal man, når man udvikler en viral strategi, overveje, at optagelse fra terminaler kan være udfordrende, fordi Axon-terminaler i optagelses feltet kan være sparsom. For at løse dette problem kan en alternativ tværsnits viral strategi forudses at tillade ekspression af GCaMP i et mål-projicere område af interesse og optisk fiber kanyle implanteret over cellen organer, hvor mere robust fluorescens kan være målt22,23,24. En anden faktor, der kan have en negativ indvirkning på signal-støj-forholdet er kvaliteten af den optiske fiber kanyle og patch ledning. For implantationer, rustfrit stål ferrule er at foretrække, fordi zirkoner er meget Auto-luorescent og vil øge baggrunds signalet. Det er vigtigt at bruge den højeste kvalitet optiske fiber kanyle med velpolerede Terminal stik og høje transmissionshastigheder (> 85% transmission). Eventuelle defekter i fibrene vil føre til et fald i signal-til-støj-forholdet. Den optiske fiber patch ledning bør være af høj kvalitet samt. Udbydere producerer fibre, der er specielt designet til fiber fotometri, hvor autofluorescens minimeres så meget som muligt. Skræddersyede patch ledninger ofte ikke nå nødvendige effektivitet. Det er også vigtigt at optimere tilpasningen af den optiske vej for at få et billede med alle fibre godt løst på omdrejningspunktet for målet. Desuden skal den numeriske blænde (NA) af fibrene matche den af patch ledningen samt det mål, der anvendes med systemet. Enhver NA uoverensstemmelse vil resultere i enten excitation eller emission lys tab. Alle tidligere trin vil give klare calcium-afhængige signaler. Der kræves dog stadig en signal korrektion. De fleste optagelser har en eksponentiel nedgang i fluorescens på grund af autofluorescens i fibrene, varme medierede LED forfald og foto blegning. Dette fald varierer med forskellige fibre og kanaler, og det er vigtigt at fjerne det i hver kanal separat ved hjælp af den airPLS algoritme, der er beskrevet i afsnittet protokol. For det andet skal der tages hensyn til bevægelses korrektion. Selv hvis GCaMP signaler synes høj, hvor enhver artefakt ændringer synes meningsløs, er det vigtigt at korrigere det med calcium uafhængige signal. Grafen med justeret 410 nm og 470 nm signaler er en reference, der viser, hvilke ændringer i intensitet er forårsaget af GCaMP og ikke artefakter.
Tilføjelse af en 560 nm excitation led, korrekt koldtlysreflektorlamper linser, og en beamsplitter muliggør samtidig optagelse af grøn og rød fluorescens. Dette åbner mulighed for at overvåge neurale aktivitet fra to genetisk adskilte neuronal populationer eller til at overvåge præsynaptisk aktivitet fra Axon terminaler (f. eks, udtrykke GCaMP6), og postsynaptiske neuronal aktivitet (f. eks, udtrykker jrGECO1a). Når du implementerer Dual-Color optagelser, vigtige overvejelser skal holdes for øje. Signifikant foto konvertering og fotoaktivering er blevet rapporteret for mange rød-skiftede GECIs, hvor belysning med 405 nm, 488 nm, og 560 nm kan øge calcium-uafhængig fluorescens25. Brug af jrGECO1a og RCaMP1b kan minimere dette problem26. En anden bekymring under Dual Color Imaging er grønt signal, der lækker ind i den røde kanal. Mange strategier kan forestillede sig at undgå dette problem. For eksempel er det muligt at sammenflette de tre excitation bølgelængder at ophidsende isosbestic punkt af den grønne calcium sensor (410 nm), det calcium-afhængige signal fra den grønne calcium sensor (470 nm), og den røde calcium sensor (560 nm) i rækkefølge. I så fald er det muligt at stole på det isosbestiske punkt i den grønne sensor til bevægelses korrektion. Endelig, når du udfører Dual Color Imaging, er det bedst at erhverve stærkere signal fra den røde calcium sensor (f. eks fra celle Somas), fordi disse har svagere fluorescens emissioner i forhold til grønne sensorer.
Nye genetisk kodede fluorescerende sensorer er udviklet til hurtig og specifik in vivo påvisning af neurotransmitter frigivelse22,23,24. Disse sensorer udsender grøn fluorescens, når de bindes med deres respektive endogene ligand og kan kombineres med rød-skiftede GECIs, såsom jrGECO1a, til samtidig påvisning af neurotransmitter frigivelse samtidig med ændringer i neuronal aktivitet fra enkelt flere optiske fibre5,27.
Fiber fotometri giver udsøgt fleksibilitet til at overvåge neurale aktivitet i frit bevægende dyr gennem fleksible og lette optiske fiber patch ledninger. Men det er ikke velegnet til situationer, der kræver bevægelse mellem rum, såsom lys-mørk kammer test. Dette vil være muligt med yderligere udviklinger i det trådløse fotometri-system28. Endelig, mens det giver store fordele, når de overvåger neurale dynamik fra flere hjerneområder, eller fra forskellige neurale populationer, er signalet opnået i fiber fotometri et aggregat af mange neuroner, der ikke kan skyde med den samme tidsmæssige dynamik og vil ikke blive løst. Men, det giver en supplerende tilgang til in vivo mikroendoskopisk calcium Imaging løse somatisk calcium signal fra TENS til hundredvis af individuelle neuroner29. Endelig, når du optager fra flere fibre i et enkelt dyr, kan det være svært at skelne, om signalet kommer fra terminalerne eller fra celle Somas. Omhyggeligt designe eksperimenter kan overvinde de fleste af disse begrænsninger. Men udviklingen af nye GECIs udelukkende lokaliseret på celle Somas vil give mere opløsning under multi-fiber calcium Imaging eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sage Aronson er administrerende direktør og grundlægger af Neurophotometrics Ltd., som sælger multifiber fotometriske systemer.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et stipendium fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: RGPIN-2017-06131) til C.P. C. P. er en FRSQ Chercheur-Boursier. Vi takker også Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) for produktionen af de virale vektorer, der anvendes i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25x36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 - M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
