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Neuroscience

Photométrie multifibres pour enregistrer l'activité neuronale chez les animaux en mouvement libre

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60278

Summary

Ce protocole détaille comment mettre en œuvre et exécuter des enregistrements de photométrie multifibres, comment corriger les artefacts indépendants du calcium et des considérations importantes pour l'imagerie photométrie bicolore.

Abstract

Enregistrer l'activité d'un groupe de neurones chez un animal en mouvement libre est une entreprise difficile. En outre, comme le cerveau est disséqué en sous-groupes fonctionnels de plus en plus petits, il devient primordial d'enregistrer à partir de projections et/ ou de sous-populations génétiquement définies de neurones. La photométrie en fibre est une approche accessible et puissante qui peut surmonter ces défis. En combinant des méthodologies optiques et génétiques, l'activité neuronale peut être mesurée dans des structures cérébrales profondes en exprimant des indicateurs de calcium génétiquement codés, qui traduisent l'activité neuronale en un signal optique qui peut être facilement mesuré. Le protocole actuel détaille les composants d'un système de photométrie multifibres, comment accéder aux structures profondes du cerveau pour délivrer et recueillir la lumière, une méthode pour rendre compte des artefacts de mouvement, et comment traiter et analyser les signaux fluorescents. Le protocole détaille les considérations expérimentales lors de l'exécution de l'imagerie mono et double couleur, à partir de fibres optiques implantées simples ou multiples.

Introduction

La capacité de corréler les réponses neuronales avec des aspects spécifiques du comportement d'un animal est essentielle pour comprendre le rôle qu'un groupe particulier de neurones joue dans la direction ou la réponse à une action ou un stimulus. Compte tenu de la complexité du comportement animal, avec la myriade d'états internes et de stimuli externes qui peuvent affecter même les actions les plus simples, l'enregistrement d'un signal avec une résolution d'essai unique équipe les chercheurs avec les outils nécessaires pour surmonter ces Limitations.

La photométrie de fibre est devenue la technique de choix pour beaucoup de chercheurs dans le domaine des neurosciences de systèmes en raison de sa simplicité relative comparée à d'autres techniques d'enregistrement in vivo, de son rapport signal-bruit élevé, et de la capacité d'enregistrer dans une série de paradigmes comportementaux1,2,3,4,5,6,7,8. Contrairement aux méthodes électrophysiologiques traditionnelles, la photométrie est l'approche optique la plus couramment utilisée en conjonction avec des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIs, la série GCaMP)9. Les GECI modifient leur capacité à fluorer en fonction du fait qu'ils sont ou non liés au calcium. Parce que la concentration interne de calcium dans les neurones est très étroitement réglementée et les canaux de calcium à rayons de tension s'ouvrent lorsqu'un neurone déclenche un potentiel d'action, les augmentations transitoires de la concentration interne de calcium, qui se traduisent par des augmentations transitoires de la capacité d'un GECI à la fluorescence, peut être un bon proxy pour le tir neuronal9.

Avec la photométrie de fibre, la lumière d'excitation est dirigée vers le bas une fibre optique mince et multimode dans le cerveau, et un signal d'émission est rassemblé vers le haut par la même fibre. Parce que ces fibres optiques sont légères et pliables, un animal peut se déplacer en grande partie sans entrave, ce qui rend cette technique compatible avec un large éventail de tests et de conditions comportementales. Certaines conditions, telles que les mouvements rapides ou la flexion du cordon de patch de fibre optique au-delà du rayon auquel il peut maintenir la réflexion interne totale, peuvent introduire des artefacts de signal. Pour désambiguer le signal du bruit, nous pouvons exploiter une propriété de GCaMP connue sous le nom de « point isosbestique ». En bref, avec GCaMP, comme la longueur d'onde de la lumière d'excitation est décalée vers la gauche, son émission dans l'état de calcium-lié diminue et l'émission dans l'état de calcium-unbound augmente légèrement. Le point auquel l'intensité relative de ces deux émissions est égale est appelé le point isosbestic. Lorsque GCaMP est excité à ce stade, son émission n'est pas affectée par les changements dans les concentrations internes de calcium, et la variance dans le signal est le plus souvent due à l'atténuation du signal de la surflexion du cordon de patch de fibre optique ou le mouvement du tissu neural par rapport à la fibre implantée.

L'électrophysiologie d'une seule unité demeure l'étalon-or pour les enregistrements in vivo en mouvement libre en raison de sa résolution de niveau à cellule unique et à un seul pic. Cependant, il peut être difficile d'identifier l'identité moléculaire des cellules enregistrées, et l'analyse post-hoc peut être assez laborieuse. Bien que la photométrie en fibre n'ait pas de résolution unicellulaire, elle permet aux chercheurs de poser des questions impossibles à aborder avec les techniques traditionnelles. Combinant des stratégies virales avec des animaux transgéniques, l'expression des IGE peut être dirigée vers des types neuronaux génétiquement définis pour enregistrer l'activité neuronale définie par la population ou la projection, qui peut être effectuée en surveillant le signal calcique directement à l'axone terminaux10,11. En outre, en implantant de multiples canules à fibres optiques, il est possible de surveiller simultanément l'activité neuronale de plusieurs régions et voies du cerveau chez le même animal12,13.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une technique pour la photométrie simple et multi-fibre, comment corriger pour les artefacts calcium-indépendants, et détailler comment exécuter des enregistrements mono- et dual-color. Nous fournissons également des exemples des types de questions qu'il permet de poser et de leur niveau croissant de complexité (voir la figure 1). La configuration de la photométrie en fibre pour les enregistrements multifibres détaillés dans ce protocole peut être construite à l'aide d'une liste de matériaux trouvés à https://sites.google.com/view/multifp/hardware (Figure 2).

Il est essentiel que le système soit équipé pour les longueurs d'onde d'excitation de 410 nm et 470 nm pour les émissions de fluorescence dépendantes du calcium et du calcium de GCaMP6 ou de ses variantes. Pour les configurations personnalisées ou s'il n'y a pas de logiciel disponible pour exécuter le système, le programme libre et open source Bonsai (http://www.open-ephys.org/bonsai/) peut être utilisé. Alternativement, la photométrie en fibre peut être exécuté par MATLAB (par exemple, https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 ou tout autre langage de programmation14. Le logiciel et le matériel du système devraient permettre la manipulation des LED de 410 nm et 470 nm et de la caméra, l'extraction d'images (figure 2), et le calcul de l'intensité fluorescente moyenne dans les régions d'intérêt (ROI) dessinées autour des fibres sur les images. La sortie devrait être un tableau des valeurs d'intensité moyennes enregistrées avec les LED de 470 nm et 410 nm de chaque fibre dans le cordon de correction. Lors de l'exécution d'expériences multifibres, les fibres groupées de 400 m peuvent limiter le mouvement des souris. Dans de tels cas, nous vous recommandons d'utiliser des cordons patch de 200 m, qui offrent plus de flexibilité. Il peut également être possible d'utiliser de plus petits câbles factices pendant la formation des souris.

Il est crucial d'être en mesure d'extraire des points de temps pour les événements d'intérêt lors de l'acquisition de la photométrie fibre. Si le système ne fournit pas facilement un système intégré pour intégrer les TTL pour des événements spécifiques, une autre stratégie consiste à attribuer un horodatage aux points de temps individuels enregistrés pour s'aligner sur des moments et des événements spécifiques au cours de l'expérience. L'estampage peut être fait à l'aide de l'horloge de l'ordinateur.

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Protocol

Toutes les expériences ont été faites conformément aux comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Californie à San Diego et au Guide canadien pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par l'Université Laval Protection des animaux. comité.

1. Alignement de la trajectoire optique entre la caméra CMOS (semi-conducteur d'oxyde métallique complémentaire) et le cordon de patch individuel ou ramifié

  1. Relâchez toutes les vis sur le traducteur à 5 axes (11, figure 2B).
  2. Visdans le cordon de patch (12, Figure 2B) à l'adaptateur [SMA (sous-miniature A) ou FC (connecteur à fibre optique)] qui est apposé sur le traducteur à 5 axes.
  3. Allumez la lumière d'excitation de 470 nm (1, figure 2B) à basse puissance (100 W), et placez la pointe du patchcord pointant vers une glissière en plastique autofluorescent. Cela n'a aucune incidence sur les enregistrements futurs, mais uniquement pour visualiser le processus d'alignement.
  4. Enregistrement de la caméra CMOS (13, Figure 2B) en mode live. Augmentez le gain ou ajustez la table de recherche (LUT) jusqu'à ce que l'image ne soit pas entièrement noire. Le point est de pouvoir voir une image au point focal de l'objectif (10, Figure 2B).
  5. Avancez le traducteur à 5 axes vers l'objectif, en veillant à ce que la lumière de 470 nm soit centrée sur la fibre à l'extrémité SMA ou FC du cordon patch, jusqu'à ce qu'une image puisse être résolue sur la caméra.
  6. Ajustez les axes X et Y jusqu'à ce que l'image soit centrée et bien résolue.
  7. Visualisez la lumière émise par l'extrémité de ferrule du cordon de correction. Il doit apparaître comme un cercle isotropique. Si un cordon de correction de ramification est utilisé, la quantité de lumière émise aux extrémités de ferrule de chaque cordon de correction devrait être semblable. Si le cercle n'est pas isotropique ou si la lumière émise est inégale, ajustez le traducteur à 5 axes dans l'axe X-Y.

2. Configuration des ROIs autour des fibres pour la mesure de l'intensité fluorescente moyenne

  1. Allumez toutes les lumières d'excitation pour mieux visualiser les fibres. Ajuster le gain de la caméra de telle sorte qu'aucun pixel n'est saturé et une image claire des fibres sont présentes.
  2. Enregistrez en direct ou prenez une image préliminaire.
  3. Dessiner des ROIs autour des fibres et les garder pour la mesure des valeurs moyennes d'intensité pendant les enregistrements (Figure 2A).
  4. Pour les enregistrements de fibres multiples, testez l'indépendance dans les signaux.
    1. Enregistrement en direct de toutes les fibres.
    2. Pointez une fibre vers une source lumineuse et appuyez sur un doigt. De très grandes fluctuations devraient se produire uniquement dans ce canal (fuite acceptable 1:1000).
    3. Si les signaux ne sont pas indépendants, redessiner des ROI plus conservateurs et répéter le test d'indépendance.
  5. Pour étiqueter et garder une trace de ce retour sur investissement correspond à laquelle la fibre, le ruban adhésif coloré ou le vernis à ongles peuvent être appliqués à l'extrémité des fibres. Prenez une photo avant le début de toute expérience comme un rappel secondaire.

3. Configuration de l'arène d'enregistrement

  1. Accrochez le cordon de correction au-dessus de l'arène à l'aide de gradins, de pinces ou de supports.
  2. Assurez-vous que l'animal peut se déplacer librement dans toute l'arène, décomplexé par la longueur de la fibre.
  3. Qu'il s'agisse d'une boîte d'opéra ou d'un champ ouvert, assurez-vous que le cordon de correction sera en mesure d'atteindre l'animal avec une flexion minimale. Si cela nécessite un nez poke, assurez-vous qu'il ya assez d'espace au-dessus pour empêcher la flexion de la fibre. Évitez toute flexion ou torsion excessive du cordon de correction.

4. Enregistrements in vivo

REMARQUE: La procédure d'implantation de canule de fibre optique pour des expériences de photométrie de fibre est identique à la procédure pour l'optogénétique comme décrit dans Sparta et autres15. Nous vous recommandons d'utiliser du ciment dentaire (voir Table of Materials), qui fournit un ancrage robuste de la tête de l'os du crâne. Le ciment dentaire sera particulièrement utile dans les cas où les vis d'ancrage ne peuvent pas être utilisées.

  1. Inspecter visuellement l'extrémité distale des fibres du cordon patch à l'œil et avec un microscope minifibre. Si la surface des fibres est rayée, repolish les fibres en utilisant le fildeur de fibre / film de clapotis avec du grain fin (1 m et 0,3 m).
  2. Nettoyez les extrémités distales du cordon de correction avec 70% d'éthanol et un applicateur de pointe de coton.
  3. Nettoyez les canules à fibres optiques à l'aide de 70 % d'éthanol et d'un applicateur de pointe de coton.
  4. Connectez l'extrémité de ferrule du cordon de correction à la fibre implantée utilisant une manche fendue en céramique couverte d'un tube de rétrécissement noir. Pendant la connexion, assurez-vous que la manche est serrée, sinon utilisez un nouveau manchon.
    REMARQUE : Il y aura une grande quantité de perte de signal s'il y a n'importe quel espace entre la ferrule de corde de correction et l'implant, et les enregistrements ne fonctionneront pas.
  5. Permettre à l'animal de récupérer quelques minutes avant le début des tests comportementaux.
  6. Commencez à enregistrer le signal optique et exécutez l'expérience.
  7. Tout en enregistrant, gardez un œil attentif sur le live-trace pour assurer des enregistrements de qualité. On s'attend à ce que le signal diminue rapidement en fonction du temps dans les 2 premières min de l'enregistrement. Cet effet est causé par la désintégration LED à médiation thermique, par laquelle l'augmentation de la chaleur augmente la résistance de l'élément optique.
  8. Si un saut dans le signal qui dépasse la cinétique on/off de GCaMP se produit, c'est souvent une indication que la manche n'est pas assez serrée et l'espace entre le cordon de correction et l'implant change. Dans ce cas, arrêtez l'expérience et reconnectez l'animal à l'aide d'un nouveau manchon.

5. Analyse des données de photométrie en fibre

REMARQUE : Il s'agit d'une méthode d'analyse de données qui fonctionne bien pour la plupart des enregistrements. Cependant, d'autres approches peuvent être mises en œuvre. Exemple de code pour l'analyse des données peut être trouvé ici: https://github.com/katemartian/Photometry_data_processing.

  1. Extrait des valeurs moyennes d'intensité de fluorescence enregistrées à partir de 470 nm(Int470) et 410 nm(Int410) LED, correspondant à chaque fibre individuelle.
  2. Lisser chaque signal à l'aide d'un algorithme de moyenne mobile (Figure 3A).
  3. Effectuer la correction de base de chaque signal(figure 3A et 3B) à l'aide de l'algorithme de moindre souper pénalisé (https://github.com/zmzhang/airPLS) réévalué par itérativement (airPLS) pour enlever la pente et la basse fréquence fluctuations des signaux.
  4. Normaliser chaque signal en utilisant la valeur moyenne et l'écart type (Figure 3C):
    Equation 1
  5. En utilisant la régression linéaire robuste non négative, adapter zInt410 standardisé à zInt470 signaux (Figure 3D) à la fonction de régression:
    Equation 2
    1. Utilisez les paramètres de la régression linéaire (a, b) pour trouver de nouvelles valeurs de zInt410 monté s'adapter à zInt470(fitInt410, Figure 3D,E):
      Equation 3
  6. Calculer le dFnormalisé /F (z dF/F) (Figure 3F):
    Equation 4

6. Enregistrements bicolores simultanés

  1. Ajoutez au système de photométrie une LED de 560 nm pour exciter le capteur de calcium fluorescent rouge et les miroirs et filtres dichroiques appropriés (voir Kim et al., 2016 pour une description détaillée)12.
  2. Ajouter un séparateur d'images entre l'objectif et la caméra CMOS pour séparer les longueurs d'onde d'émission vertes et rouges (voir la figure 5). Le séparateur d'image formera deux images miroirs sur le capteur de la caméra, correspondant aux signaux rouges et verts (par exemple, un cordon patch avec 3 branches créera une image avec 6 fibres).
  3. Dessinez des ROIs autour de toutes les fibres dans les deux couleurs comme détaillé ci-dessus. Assurez-vous d'identifier clairement chaque retour sur investissement avec la fibre et le canal correspondants (vert et rouge) (Figure 4A).
  4. Déclencher l'excitation simultanée avec 470 nm et 560 nm LED et les alterner avec 410 nm LED (Figure 5A).

7. Analyse de données double couleur

  1. Suivez les étapes de la section 5 pour trouver fitInt410 pour le signal Int470 et calculer z dF/F.
  2. Étant donné que le point isosbestic pour les GECI rouges décalés est généralement inconnu, le signal enregistré avec 410 nm LED dans le canal vert peut être utilisé pour la correction du mouvement à travers les deux canaux. Suivez les étapes de la section 5 pour trouver fitInt410 pour le signal Int560 et calculer z dF/F.

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Representative Results

Les corrélations neuronales des réponses comportementales peuvent varier en fonction d'une variété de facteurs. Dans cet exemple, nous avons utilisé la photométrie in vivo de fibre pour mesurer l'activité des terminaux d'axone de la zone hypothalamic latérale (LHA) qui se terminent dans le habenula latéral (LHb). Des souris de type sauvage ont été injectées avec un virus adéno-associé (AAV) codant gCaMP6s (AAV-hSyn-GCaMP6s) dans le LHA et une fibre optique a été implantée avec la pointe immédiatement au-dessus du LHb (figure 4A). L'expression de GCaMP6s se trouve dans les corps cellulaires de la LHA et leurs terminaux d'axone se projetant au LHb, où le signal de calcium peut être enregistré. L'activation de la voie LHA-LHb favorise l'évitement passif dans le test de préférence en temps réel suggérant que cette voie transmet des signaux aversifs16. Les souris ont ensuite été connectées au système de photométrie en fibre, placées dans une arène ouverte pendant 6 min, et exposées à des bouffées d'air aversives de 1 sec toutes les 60 secondes. La fluorescence mesurée a considérablement augmenté en même temps que l'administration des bouffées d'air(figure 4B-C). Chez les souris exprimant des protéines fluorescentes vertes (PFG), aucun changement dans le signal n'a été détecté lors de l'administration des bouffées d'air(figure 4C). Après des tests comportementaux, le site d'injection dans le LHA et le placement de fibres au-dessus du LHb ont été confirmés histologiquement (Figure 4A).

Figure 1
Figure 1 : Stratégies et approches pour l'expression GECI avec une spécificité anatomique et cellulaire. (A) Un vecteur viral adéno-associé virus (AAV) codant GCaMP6 (AAV-GCaMP6) est injecté dans une région du cerveau d'intérêt. La fibre optique peut être implantée de façon chronique avec la pointe placée sur les corps cellulaires (1) ou sur les terminaux d'axone (2). Pour l'expression sélective dans une population neuronale génétiquement définie, un AAV cre-dépendant (par exemple, AAV-DIO-GCaMP6) peut être injecté chez des souris transgéniques exprimant la cre recombinase dans une population neuronale spécifique. (B) Pour l'imagerie calcique bicolore, dans cet exemple, un AAV-GCaMP6s est injecté dans une région du cerveau d'intérêt, et un AAV cre-dépendant codant un GECI rouge-shifted (par exemple, jrGECO1a ; AAV-DIO-jrGECO1a) est injecté dans une population neuronale génétiquement définie dans une région cérébrale cible. La fibre optique est implantée pour l'imagerie simultanée du signal calcique des terminaux d'axone (fluorescence verte) et des corps cellulaires (fluorescence rouge). (C) Pour une stratégie virale intersectionnelle, un vecteur viral avec des propriétés de transport rétrogrades (comme retroAAV17) codant la cre recombinase (retroAAV-cre) est injecté dans la région du cerveau cible avec un AAV-DIO-GCaMP6s injecté dans la région du cerveau projetant dans la même souris. Des canules de fibre optique sont implantées au-dessus des corps cellulaires pour l'enregistrement fiable de signal calcium-dépendant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Schéma photométrie de fibre. (A) La lumière d'excitation de deux LED (410 nm et 470 nm) passe à travers une série de filtres et de miroirs dichroïques et produit un point d'excitation à la distance de travail de l'objectif 20x. La lumière passe à travers un seul cordon de patch ou des fibres groupées (pour plusieurs enregistrements de site) qui sont connectés aux canules implantées. La fluorescence émise est recueillie par les mêmes fibres, filtrée et projetée sur un capteur de caméra CMOS. Sur les images capturées, l'intensité moyenne de fluorescence est enregistrée aux ROIs de chaque fibre. Pour acquérir simultanément des signaux à partir de 410 nm et 470 nm LED, un multiplexage de division temporelle est implémenté (diagramme inférieur droit). (B) Image de notre système photométrie sur mesure et de ses composants : (1) Fibre à la LED de 465 nm, (2) Fibre à la LED de 405 nm, (3) Collimators, (4) filtre bandpass de 470 nm, (5) filtre bandpass 410 nm, (6) 535 nm bandpass filtre, (7) Tube lens, (8) Cube 425 miroir dichroique, (9) Cube avec longpass 495 miroir dichroïque, (10) objectif 20x, (11) traducteur à 5 axes, (12) cordon de patch mono- ou en fibre groupée, (13) caméra CMOS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Analyse des données de photométrie en fibre. (A) Lissé moyenne intensités fluorescentes (Int) enregistrées à partir de 470 nm (ligne bleue supérieure) et 410 nm (ligne pourpre inférieure) longueurs d'onde d'excitation. Les lignes noires sont des lignes de base trouvées à l'aide de l'algorithme airPLS. (B) Changements d'intensité relative des signaux après correction de base. (C) Signaux normalisés de 470 nm et 410 nm (zInt470, haut; zInt410, bas). (D) Ajustement linéaire robuste non négatif de 470 nm et 410 nm de signaux. (E) Alignement de la trace Int410 à Int470 en fonction de l'ajustement. (F) Changement corrigé et normalisé de fluorescence dépendante du calcium (z dF/F). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs. (A) Diagramme de la procédure expérimentale. Un AAV-GCaMP6s est injecté dans le LHA des souris et 4 semaines plus tard, une canule de fibre optique est implantée au-dessus du LHb pour l'enregistrement terminal d'axone de signal. Les images confocales représentatives de l'expression des GCaMP6 dans les corps cellulaires des neurones De LHA (à gauche) et de leurs terminaux d'axone projetant vers le LHb (à droite) sont des images convergentes représentatives. (B) Signal de calcium représentatif trace à des bouffées d'air (barres verticales pointillées) mesurées à partir des terminaux d'axone lHA projetant LHb mesurés à partir d'une souris GCaMP6s-exprimant. (C) Parcelle péri-événement de la réponse moyenne de calcium aux événements d'airpuff. La ligne verte épaisse représente la moyenne et les régions à ombrage vert représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM, panneau gauche), et le signal mesuré avant et après une bouffée d'air (3 souris, 15 événements). (D,E) Mêmes mesures que (B,C) pour les souris exprimant le GFP (2 souris, 10 événements). Les barres d'échelle sont de 200 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Schéma de la photométrie en fibre bicolore. (A) Une LED supplémentaire de 560 nm, des filtres et des miroirs dichroiques appropriés, et un séparateur d'image avant que le capteur de la caméra ne soit ajouté à la configuration originale. (B) Composants du système de photométrie : (1) Fibre à la LED de 560 nm, (2) Fibre à la LED 465 nm, (3) Fibre au filtre 405 nm LED, (4) Collimators, (5) 560 nm bandpass filtre, (6) 470 nm bandpass filtre, (7) 410 nm bandpass filtre, (8) Cube avec longpass 495 miroir dichroïque , (9) Cube avec miroir dichroic à longpass 425, (10) Cube avec miroir dichroïque 493/574, (11) objectif 20x, (12) traducteur à 5 axes, (13) cordon de patch mono- ou en fibre groupée, (14) Splitter image, (15) caméra CMOS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La photométrie par fibre est une approche accessible qui permet aux chercheurs d'enregistrer la dynamique du calcium en vrac à partir de populations neuronales définies chez les animaux en mouvement libre. Cette méthode peut être combinée avec un large éventail de tests comportementaux, y compris "mouvement lourd" tâches telles que les tests de natation forcée2, la peur conditionnement18, interactions sociales1,4, et d'autres7, 8,19,20. Cela permet aux chercheurs d'observer quels comportements ou stimuli stimulent l'activité dans une population neuronale particulière ou vice versa.

En dépit de sa simplicité prima facie, il ya des considérations importantes lors de la mise en œuvre de la photométrie fibre, et le système détaillé dans ce protocole offre plusieurs avantages contournant les pièges communs. Tout d'abord, il tire parti du fait que les variantes GCaMP ont un point d'excitation isosbestic indépendant en calcium autour de 410 nm21 et multiplexage de division temporelle pour corriger les changements calcium-dépendants dans les signaux presque simultanément12. Lorsque les neurones exprimant GCaMP sont excités avec 410 nm longueur d'onde, l'intensité des émissions de GCaMP est indépendante de sa liaison au calcium et se comporte essentiellement comme un GFP à faible efficacité. Le multiplexage de division temporelle utilise à la fois 410 nm de longueurs d'onde d'excitation calcium-dépendantes de 410 nm dans le même enregistrement. Le signal enregistré avec la longueur d'onde d'excitation de 410 nm est utilisé comme un contrôle pour le mouvement calcium-indépendant et les changements d'artefact dans l'intensité de fluorescence. Des stratégies alternatives qui n'incluent pas les utilisations simultanées de l'excitation isosbestique de GCaMP peuvent être envisagées. Par exemple, il est possible de préparer deux cohortes d'animaux, l'une exprimant gFP et l'autre exprimant GCaMP2. Cependant, ce n'est pas un contrôle parfait, car il est à travers les animaux et il est plus difficile d'identifier si une réponse donnée dans un animal donné était un artefact. Deuxièmement, la configuration de photométrie de fibre décrite permet aux chercheurs de mesurer l'activité dans plusieurs voies simultanément, ouvrant la porte aux questions concernant la propagation de signal dans tout le cerveau. Troisièmement, l'enregistrement bicolore permet une flexibilité supplémentaire pour disséquer différentes voies dans la même région du cerveau combinant des GECI verts et rouges(figure 1).

Avec les enregistrements de photométrie en fibre, la fluorescence à très faible émission doit être enregistrée par le bruit de fond. Par conséquent, il est crucial d'assurer la collecte maximale de la fluorescence émise par les GECI. Tout d'abord, lors de l'élaboration d'une stratégie virale, il faut considérer que l'enregistrement à partir de terminaux peut être difficile, parce que les terminaux d'axone dans le domaine de l'enregistrement peuvent être rares. Pour résoudre ce problème, une stratégie virale intersectionnelle alternative peut être envisagée permettant l'expression de GCaMP dans une région d'intérêt ciblée et des canules de fibre optique implantées au-dessus des corps cellulaires, où la fluorescence plus robuste peut être mesuré22,23,24. Un autre facteur qui peut avoir un impact négatif sur le rapport signal-bruit est la qualité de la canule de fibre optique et du cordon patch. Pour les implantations, la ferrule en acier inoxydable est préférable, car la zirconia est très autofluorescente et augmentera le signal de fond. Il est essentiel d'utiliser les canules à fibres optiques de la plus haute qualité avec des connecteurs terminaux bien polis et des taux de transmission élevés (transmission de 85 %). Tout défaut dans les fibres entraînera une diminution du rapport signal-bruit. Le cordon de patch de fibre optique devrait être de haute qualité aussi bien. Les fournisseurs produisent des fibres spécialement conçues pour la photométrie en fibre, dans laquelle l'autofluorescence est réduite au minimum autant que possible. Les cordons de patch sur mesure n'atteignent souvent pas l'efficacité requise. Il est également important d'optimiser l'alignement de la trajectoire optique pour obtenir une image avec toutes les fibres bien résolues au point focal de l'objectif. En outre, l'ouverture numérique (NA) de la fibre doit correspondre à celle du cordon de patch ainsi que l'objectif utilisé avec le système. Tout décalage NA se traduira soit par l'excitation ou la perte de lumière d'émission. Toutes les étapes précédentes fourniront des signaux clairs dépendants du calcium. Cependant, une correction de signal est toujours nécessaire. La plupart des enregistrements ont une diminution exponentielle de la fluorescence en raison de l'autofluorescence dans les fibres, la carie LED à médiation thermique, et le photoblanchiment. Cette diminution varie selon les fibres et les canaux, et il est important de l'enlever dans chaque canal séparément en utilisant l'algorithme airPLS décrit dans la section protocole. Deuxièmement, la correction du mouvement doit être prise en compte. Même si les signaux GCaMP semblent élevés là où les changements d'artefacts semblent dénués de sens, il est important de le corriger avec un signal indépendant en calcium. Le graphique avec des signaux alignés 410 nm et 470 nm est une référence montrant quels changements d'intensité sont causés par GCaMP et non par des artefacts.

L'ajout d'une LED d'excitation de 560 nm, de lentilles dichroiques appropriées et d'un beamsplitter permet l'enregistrement simultané de la fluorescence verte et rouge. Cela ouvre la possibilité de surveiller l'activité neuronale de deux populations neuronales génétiquement distinctes ou de surveiller l'activité présynaptique à partir des terminaux d'axone (par exemple, l'expression de GCaMP6), et l'activité neuronale postsynaptique (par exemple, l'expression jrGECO1a). Lors de la mise en œuvre d'enregistrements bicolores, des considérations importantes doivent être gardées à l'esprit. La photoconversion et la photoactivation significatives ont été rapportées pour beaucoup de GECi rouge-décalés, où l'illumination avec 405 nm, 488 nm, et 560 nm peut augmenter la fluorescence calcium-indépendante25. L'utilisation de jrGECO1a et RCaMP1b peut minimiser ce problème26. Une autre préoccupation lors de l'imagerie à double couleur est le signal vert qui fuit dans le canal rouge. De nombreuses stratégies peuvent être envisagées pour éviter ce problème. Par exemple, il est possible d'entremêler les trois longueurs d'onde d'excitation pour exciter le point isosbestic du capteur de calcium vert (410 nm), le signal calcium-dépendant du capteur de calcium vert (470 nm), et le capteur rouge de calcium (560 nm) dans l'ordre. Dans ce cas, il est possible de s'appuyer sur le point isosbestic du capteur vert pour la correction du mouvement. Enfin, lors de l'imagerie à double couleur, il est préférable d'acquérir un signal plus fort à partir du capteur de calcium rouge (par exemple, des somas cellulaires) parce que ceux-ci ont des émissions de fluorescence plus faibles par rapport aux capteurs verts.

De nouveaux capteurs fluorescents génétiquement codés ont été développés pour la détection in vivo rapide et spécifique de la libération de neurotransmetteur22,23,24. Ces capteurs émettent de la fluorescence verte lorsqu'ils sont liés à leur ligand endogène respectif et peuvent être combinés avec des GECI à changement rouge, tels que jrGECO1a, pour la détection simultanée de la libération de neurotransmetteurs en même temps que les changements dans l'activité neuronale de fibres optiques multiples simples5,27.

La photométrie en fibre offre une flexibilité exquise pour surveiller l'activité neuronale chez les animaux en mouvement libre grâce à des cordons de fibres optiques flexibles et légers. Cependant, il n'est pas bien adapté aux situations nécessitant un déplacement entre les compartiments, comme les tests de chambre clair-obscurité. Cela sera possible avec d'autres développements dans le système de photométrie sans fil28. Enfin, alors qu'il fournit de grands avantages lors de la surveillance de la dynamique neuronale de plusieurs régions du cerveau, ou de populations neuronales distinctes, le signal obtenu dans la photométrie des fibres est un agrégat de nombreux neurones qui ne peuvent pas tirer avec la même dynamique temporelle et ne sera pas résolu. Cependant, il fournit une approche complémentaire à l'imagerie microendoscopique microinodocopique de calcium in vivo résolvant le signal somatique de calcium de dizaines à des centaines de neurones individuels29. Enfin, lors de l'enregistrement à partir de fibres multiples dans un seul animal, il peut être difficile de différencier si le signal provient des terminaux ou des somas cellulaires. Concevoir soigneusement des expériences peut surmonter la plupart de ces limitations. Cependant, le développement de nouveaux GECI exclusivement localisés aux somas cellulaires fournira plus de résolution au cours des expériences d'imagerie calcique multifibres.

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Disclosures

Sage Aronson est le PDG et fondateur de Neurophotometrics Ltd., qui vend des systèmes de photométrie multifibres.

Acknowledgments

Ces travaux ont été appuyés par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG : RGPIN-2017-06131) à C.P. C. P. est un chercheur-boursier frSQ. Nous remercions également la Plateforme d'Outils Moléculaires (https://www.neurophotonics.ca/fr/pom) pour la production des vecteurs viraux utilisés dans cette étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long Thorlabs SH25S100
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long Thorlabs SH25S050
1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long Thorlabs SH25S038
1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable Thorlabs M59L01
12.7 mm Optical Post Thorlabs TR30/M
12.7 mm Pedestal Post Holder Thorlabs PH20EM
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube Thorlabs KPS101
20x objective Thorlabs RMS20X #10 in Figure 2, #11 in Figure 5
30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount Thorlabs CM1-DCH/M #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5
405 nm LED Doric Lenses CLED_405 #2 in Figure 2
410 nm bandpass filter Thorlabs FB410-10 #5 in Figure 2; #7 in Figure 5
465 nm. LED Doric Lenses CLED_465 #1 in Figure 2
470 nm bandpass filter Thorlabs FB470-10 #4 in Figure 2; #6 in Figure 5
560 nm bandpass filter Semrock FF01-560/14-25 #5 in Figure 5
560 nm LED Doric Lenses CLED_560 #1 in Figure 3
5-axis kinematic Mount Thorlabs K5X1 #11 in Figure 2, #12 in Figure 5
Achromatic Doublet Thorlabs AC254-035-A-ML #7 in Figure 2
Adaptor for 405 collimator Thorlabs AD11F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Adaptor for ajustable collimator Thorlabs AD127-F #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Aluminum Breadboard Thorlabs MB1824
Clamping Fork Thorlabs CF125
Cube connector Thorlabs CM1-CC
Dual 493/574 dichroic Semrock FF493/574-Di01-25x36 #10 in Figure 5
Emission filter for GCaMP6 Semrock FF01-535/22-25 #6 in Figure 2
Enclosure with Black Hardboard Panels Thorlabs XE25C9
Externally SM1-Threaded End Cap for Machining Thorlabs SM1CP2M
Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder Thorlabs SM1QP #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5
Fixed Collimator for 405 nm light Thorlabs F671SMA-405 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Fixed collimator for 470 and 560 nm light Thorlabs F240SMA-532 #3 in Figure 2; #4 in Figure 5
Green emission filter Semrock FF01-520/35-25 In light beam splitter
High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera Thorlabs DCC3260M #13 in Figure 2, #15 in Figure 5
Light beam splitter Neurophotometrics SPLIT #14 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff Thorlabs DMLP425R #8 in Figure 2, #9 in Figure 5
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff Semrock FF495-Di03 #9 in Figure 2, #8 in Figure 5
Metabond dental cement C&B
M8 - M8 cable Doric Lenses Cable_M8-M8
Optic fiber cannulas Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Optic fiber Patchcords Doric Lenses Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence
Red emission filter Semrock FF01-600/37-25 In light beam splitter
T7 LabJack LabJack
T-cube LED Driver Thorlabs LEDD1B
USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 Thorlabs CAB-DCU-T3

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References

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Comportement Numéro 152 indicateur de calcium génétiquement codé GCaMP photométrie des fibres comportement voies neuronales animaux en mouvement libre
Photométrie multifibres pour enregistrer l'activité neuronale chez les animaux en mouvement libre
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Martianova, E., Aronson, S., Proulx, More

Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. J. Vis. Exp. (152), e60278, doi:10.3791/60278 (2019).

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