Summary
Il protocollo descrive metodi di test biomeccanici tesi efficienti e riproducibili per i tendini murini attraverso l'uso di apparecchi stampati in 3D personalizzati.
Abstract
I disturbi del tendone sono comuni, colpiscono persone di tutte le età e sono spesso debilitanti. I trattamenti standard, come i farmaci antinfiammatori, la riabilitazione e la riparazione chirurgica, spesso falliscono. Al fine di definire la funzione del tendine e dimostrare l'efficacia di nuovi trattamenti, le proprietà meccaniche dei tendini dei modelli animali devono essere determinate con precisione. I modelli animali Murine sono ora ampiamente utilizzati per studiare disturbi del tendine e valutare nuovi trattamenti per le tendinopatie; tuttavia, determinare le proprietà meccaniche dei tendini del topo è stato difficile. In questo studio è stato sviluppato un nuovo sistema per i test meccanici tendini che include apparecchi stampati in 3D che corrispondono esattamente alle anatomie dell'omero e del calcano per testare meccanicamente i tendini supraspinati e i tendini di Achille, rispettivamente. Questi apparecchi sono stati sviluppati utilizzando ricostruzioni 3D di anatomia ossea nativa, modellazione solida e produzione additiva. Il nuovo approccio ha eliminato i fallimenti di presa reali (ad esempio, il fallimento al guasto della piastra di crescita piuttosto che nel tendine), ha ridotto i tempi complessivi di test e ha aumentato la riproducibilità. Inoltre, questo nuovo metodo è facilmente adattabile per testare altri tendini murini e tendini di altri animali.
Introduction
I disturbi del tendone sono comuni e altamente diffusi tra le popolazioni anziane, atletiche e attive1,2,3. Negli Stati Uniti, ognianno vengono segnalate 16,4 milioni di lesioni ai visibili connettivi e rappresentano il 30% di tutte le visite all'ufficio medico correlate alle lesioni3,5,6,7, 8. I siti più comunemente colpiti includono la cuffia dei rotatori, il tendine di Achille e il tendine rotuleo9. Sebbene siano stati esplorati una varietà di trattamenti non operativi e operativi, tra cui farmaci antinfiammatori, riabilitazione e riparazione chirurgica, gli esiti rimangono scarsi, con un ritorno limitato alla funzione e alti tassi di fallimento5, 6. Questi scarsi esiti clinici hanno motivato studi di base e traslazionali che cercano di comprendere la tendinopatia e di sviluppare nuovi approcci di trattamento.
Le proprietà biomeccaniche della tensione sono i principali risultati quantitativi che definiscono la funzione tendinea. Pertanto, la caratterizzazione di laboratorio della tendinopatia e l'efficacia del trattamento devono includere un rigoroso test delle proprietà della tensione del tendine. Numerosi studi hanno descritto metodi per determinare le proprietà biomeccaniche dei tendini da modelli animali come ratti, pecore, cani e conigli10,11,12. Tuttavia, pochi studi hanno testato le proprietà biomeccaniche dei tendini murini, principalmente a causa delle difficoltà nell'afferrare i piccoli tessuti per il test della tensione. Poiché i modelli murini hanno numerosi vantaggi per studiare meccanicamente la tendinopatia, tra cui la manipolazione genetica, ampie opzioni di reagente e i metodi a basso costo, è necessario lo sviluppo di metodi accurati ed efficienti per testare biomeccanicamente i tessuti murini.
Al fine di testare correttamente le proprietà meccaniche dei tendini, il tessuto deve essere attanagliato in modo efficace, senza scivolare o strappo artifeffettiva all'interfaccia di presa o fratturazione della piastra di crescita. In molti casi, in particolare per i tendini corti, l'osso è afferrato su un'estremità e il tendine è afferrato sull'altra estremità. Le ossa sono tipicamente protette incorporandole in materiali come la resina epossidica13 e il polimetilelmethacritil14,15. Tendoni sono spesso collocati tra due strati di carta vetrata, incollati con cianoacrilato, e fissati utilizzando morsetti di compressione (se la sezione trasversale è piatta) o in un mezzo congelato (se la sezione trasversale è grande)15,16,17 . Questi metodi sono stati applicati per testare biomeccanicamente i tendini murini, ma le sfide sorgono a causa delle piccole dimensioni degli esemplari e del rispetto della piastra di crescita, che non ossifica mai18. Ad esempio, il diametro della testa omerale murina è di pochi millimetri, rendendo così difficile la presa dell'osso. In particolare, il test della tensione di campioni di murine supraspinatus tendino-osso spesso si traduce in fallimento alla piastra di crescita piuttosto che nel tendine o nell'entesi del tendine. Allo stesso modo, il test biomeccanico del tendine d'Achille è impegnativo. Anche se il tendine d'Achille è più grande di altri tendini murini, il calcaneus è piccolo, rendendo difficile la presa di questo osso. L'osso può essere rimosso, seguito da afferrare le due estremità del tendine; tuttavia, ciò preclude la prova dell'attaccamento tendine-osso. Altri gruppi riferiscono di afferrare l'osso di calcaneus utilizzando apparecchi su misura19,20, ancoraggio da morsetti21, fissaggio in auto cura cemento plastica22 o utilizzando una forma conica slot22, ma questi i metodi precedenti rimangono limitati da una bassa riproducibilità, da elevati tassi di guasto e da noiosi requisiti di preparazione.
L'obiettivo dello studio attuale era quello di sviluppare un metodo accurato ed efficiente per il test biomeccanico della tensione dei tendini murini, concentrandosi sui tendini sopraspinati e achille come esempi. Utilizzando una combinazione di ricostruzioni 3D dall'anatomia ossea nativa, dalla modellazione solida e dalla produzione additiva, è stato sviluppato un nuovo metodo per afferrare le ossa. Questi apparecchi fissavano efficacemente le ossa, prevenivano il fallimento della piastra di crescita, riducevano i tempi di preparazione dei campioni e aumentavano la riproducibilità dei test. Il nuovo metodo è facilmente adattabile per testare altri tendini murini così come tendini nei ratti e in altri animali.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Columbia University. I topi utilizzati in questo studio erano di sfondo C57BL/6J e sono stati acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Essi sono stati alloggiati in condizioni di barriera senza agenti patogeni e sono stati forniti cibo e acqua al libitum.
1. Sviluppo di apparecchi stampati in 3D personalizzati per afferrare l'osso
- Acquisizione di immagini ossee e costruzione di modelli ossei 3D
- sezionare l'osso di interesse nella preparazione per la creazione di modelli 3D e la stampa della presa ossea 3D; l'omero e il calcaneus sono usati come esempi nel protocollo corrente.
NOTA: nel passaggio 2.1.1 vengono fornite istruzioni dettagliate per sezionare campioni ossei-decisi-muscolari per i test meccanici. I seguenti passaggi devono essere seguiti per isolare le ossa allo scopo di creare impugnature ossee stampate in 3D.- Dissezione dell'omero: Eutanasia un topo per procedura approvata da IACUC. Rimuovere la pelle dell'estremità superiore, rimuovere tutti i muscoli sopra l'omero, disarticolare il gomito e le articolazioni glenohumeral e rimuovere con attenzione tutti i tessuti connettivi attaccati all'omero.
- Dissezione del calcaneus: Eutanasia un topo per procedura approvata da IACUC. Rimuovere la pelle dell'estremità inferiore, disarticolare l'articolazione tendine-calagno di Achille e le articolazioni tra calcaneus e altre ossa del piede, e rimuovere con attenzione tutti i tessuti connettivi attaccati al calageo.
- Eseguire una tomografia microcalcolata dell'intero osso, ad esempio eseguire la scansione dei campioni di omero e calcaneus.
NOTA: a seconda dello scanner utilizzato, le impostazioni saranno diverse. Per lo scanner utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali), le impostazioni consigliate sono: scansione a un'energia di 55 kVP, al di 0,25 filtro, con una risoluzione di 6 m.- Mescolare la polvere di agarose in acqua ultrapura e microonde per 1-3 min fino a quando l'agarose è completamente disciolto. È utile al microonde per 30-45 s, fermarsi e turbinare, e quindi continuare verso un'ebollizione. Riempire criotubi fino a tre quarti pieno di agarose. Lasciare raffreddare l'agarose per circa 5-10 min.
- Inserire l'osso nel gel di agarose (questo impedirà artefatti di movimento durante la scansione). Inserire un criotubo con osso nello scanner.
NOTA: per lo scanner utilizzato nello studio corrente, è stato utilizzato un cambio automatico campione a 16 posizioni per tutte le scansioni. Questo scanner può selezionare automaticamente l'ingrandimento in base alle dimensioni e alla forma di un campione.
- Ricostruisci le immagini di proiezione di scansione microcalcolata in immagini a sezione trasversale. Utilizzare i parametri consigliati per la combinazione scanner/software dello sperimentatore.
NOTA: Per il programma utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali) si consiglia di utilizzare i seguenti parametri di ricostruzione: Arrotondamento: 0-2, Correzione indurimento del fascio: 45, Riduzione artefatto dell'anello: 4-9 e per ricostruire le fette in TIFF a 16 bit formato. - Crea un modello 3D e salva lo standard in un formato STL compatibile con la maggior parte delle stampanti 3D e della prototipazione rapida. Per il programma utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali), effettuare le seguenti operazioni:
- Selezionare il comando File > Apri per aprire il set di dati del file. Aprire la finestra di dialogo File > Preferenze e selezionare la scheda Avanzate.
- Utilizzare l'algoritmo di rendering adattivo per costruire i modelli 3D. Questo algoritmo riduce al minimo il numero di triangoli di facet e fornisce dettagli di superficie più uniformi. Utilizzare 10 come parametro locality; questo parametro definisce la distanza in pixel al punto adiacente utilizzato per trovare il bordo dell'oggetto. Ridurre al minimo la tolleranza a 0,1 per ridurre le dimensioni del file.
NOTA: dopo aver aperto il set di dati, le immagini vengono visualizzate nella pagina "Immagini raw". - Per specificare il volume di interesse (VOI), selezionare manualmente due immagini da impostare come parte superiore e inferiore dell'intervallo VOI selezionato.
- Passare alla seconda pagina, Regione di interesse. Selezionare manualmente l'area di interesse su una singola immagine di sezione trasversale.
NOTA: la regione selezionata sarà evidenziata in rosso (ad esempio, l'area della sezione trasversale dell'omero). - Ripetere il passaggio precedente ogni 10-15 immagini di sezione trasversale.
- Passare alla terza pagina Selezione binaria. Scegliere Da set di datidal menu dell'istogramma . Verrà visualizzata la distribuzione della luminosità dell'istogramma da tutte le immagini del set di dati. Sempre nel menu istogramma, fare clic sul menu Crea un file di modello 3D.
- Salvare un modello 3D dell'osso in formato file STL.
- Perfezionare la mesh: manipolare la mesh per ridurre le dimensioni del file STL e renderla compatibile con qualsiasi programma di progettazione assistito dal computer di modellazione solida. Per il programma utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali), attenersi alla seguente procedura:
- Importa mesh e seleziona tutto da modificare. Scegliere Riduci dal set di strumenti Modifica. Quindi, selezionare Budget triangolo dal set di strumenti Riduci destinazione. Riduci il conteggio dei tri e accetta le modifiche. Salvare nuovamente il file appena ridotto in formato STL scegliendo Esporta come...
- sezionare l'osso di interesse nella preparazione per la creazione di modelli 3D e la stampa della presa ossea 3D; l'omero e il calcaneus sono usati come esempi nel protocollo corrente.
- Progettazione di apparecchi ossei personalizzati
- Osso tendine-omerale supraspinatus
- Utilizzare un programma di progettazione assistita da computer per creare un modello personalizzato di dispositivo di presa dell'omero (Figura 1, File supplementari).
NOTA: il programma utilizzato nello studio corrente è elencato nella Tabella dei materiali. - Aprire il file in formato STL dell'osso omero in un programma di modellazione solido e salvarlo come file di parti.
NOTA: per il software utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali), l'oggetto osseo 3D è stato salvato in formato SLDPRT. - Aprire il file di parti e creare manualmente tre piani rilevanti per l'anatomia (ad esempio, sagittale, coronale, trasversale).
- Definire manualmente il piano sagittale per tagliare attraverso l'attacco tendine supraspinatus alla maggiore tuberosità. Assicurarsi che il blocco 3D contenga il piano sagittale come piano di simmetria. Per ottenere questo risultato, aggiungere o tagliare il materiale dal blocco, se necessario.
NOTA: Questo piano di simmetria assicura che quando il campione viene inserito negli apparecchi, l'attacco tendineo e tendineo si trovino nell'asse centrale dell'apparecchio.
- Definire manualmente il piano sagittale per tagliare attraverso l'attacco tendine supraspinatus alla maggiore tuberosità. Assicurarsi che il blocco 3D contenga il piano sagittale come piano di simmetria. Per ottenere questo risultato, aggiungere o tagliare il materiale dal blocco, se necessario.
- Misurare le dimensioni dell'osso lungo ciascuno dei tre piani (ad esempio, altezza, larghezza, lunghezza).
- Misurare le dimensioni dei grip di prova meccanici in cui verrà attaccato il dispositivo stampato 3D.
- Iniziare progettando una parte a blocchi solidi (ad esempio, un cilindro solido).
- Assicurarsi che ogni dimensione del blocco sia maggiore di almeno 5 mm rispetto alle dimensioni dell'omero.
- Tenere conto dei vincoli di progettazione derivanti dai grip di prova meccanici (ad esempio, assicurarsi che il dispositivo stampato in 3D possa essere assemblato e smontato liberamente nelle impugnature di prova meccaniche).
- Creare un modello di assieme con due componenti: il blocco solido e l'osso omero destro o sinistro. Definire l'orientamento dell'osso all'interno del blocco (ad esempio, l'angolo tra il tendine e l'osso). Assicurarsi che l'intero volume osseo si adatti all'interno del blocco.
- Creare una cavità nel blocco utilizzando l'osso omero come stampo. Se si utilizza il software specificato nella Tabella dei materiali, attenersi alla seguente procedura:
- Inserire la parte di progettazione (humerus) e la base dello stampo (blocco cilindro) in un assieme intermedio. Nella finestra dell'assieme, selezionare il blocco e fare clic su Modifica componente dalla barra degli strumenti Assieme.
- Fare clic su Inserisci > Funzioni > Cavità. Selezionare Scala uniforme e immettere 0% come valore da scalare in tutte le direzioni.
- Sopprimere la parte ossea e salvare l'assieme come parte.
- Parte aperta (cilindro con cavità). Tagliare la parte lungo il piano sagittale per creare due componenti simmetrici che si adattano all'osso anteriormente e posteriormente (ad esempio, due semicilindri, come si vede nella figura 1).
NOTA: Sono progettati due componenti che si adattano all'osso anteriormente e posteriormente. Il componente anteriore include una cavità a forma sferica estesa dal lato anteriore della testa omerale fino all'attacco tendineo supraspinatus. La cavità componente posteriore ha la forma della parte posteriore dell'omero (cioè il lato posteriore della testa omerale, la tuberosità deltoide e l'epicondile mediale e laterale). - Salvare ogni componente come parte file separata.
- Per il componente anteriore, assicurarsi che la testa omerale sia incorporata nella cavità della parte definendo tolleranze appropriate.
NOTA: nello studio corrente, utilizzando il software specificato nella Tabella dei materiali,si consiglia di seguire i passaggi riportati di seguito:- Creare un taglio ruotato per smussare la geometria della mesh della cavità. Creare uno schizzo per il taglio emulando la geometria della cavità e aggiungendo una distanza di posizione.
NOTA: La distanza consente l'assemblaggio e lo smontaggio liberi tra l'osso e il componente anteriore.
- Creare un taglio ruotato per smussare la geometria della mesh della cavità. Creare uno schizzo per il taglio emulando la geometria della cavità e aggiungendo una distanza di posizione.
- Modificare il componente posteriore per imitare la geometria della cavità per creare un taglio che aggiunge spazio, come descritto in precedenza per il componente anteriore.
- Fare un taglio nel piano trasversale partendo dalla parte superiore del componente posteriore fino alla cresta del tuborlo maggiore / minore.
NOTA: come si è visto nella Figura 1 e Nella Figura 2,il componente posteriore include un taglio che crea un'apertura all'attacco tendineo. - Creare un aderente tra i due componenti per consentire l'assemblaggio libero e lo smontaggio.
NOTA: è stato creato un accoppiamento foro-albero con uno spazio di corsa sciolto per i dispositivi nello studio corrente. - Creare modelli di specchio 3D per ogni componente del dispositivo per l'arto opposto (cioè, a sinistra o a destra).
- Aggiungere un'incisione nella parte inferiore degli apparecchi per distinguere tra i lati sinistro e destro.
- Salvare tutte le parti del fissaggio in formato di file standard STL in preparazione per la stampa 3D.
- Utilizzare un programma di progettazione assistita da computer per creare un modello personalizzato di dispositivo di presa dell'omero (Figura 1, File supplementari).
- Osso tendine-calcaneus di Achille
- Seguire gli stessi passaggi descritti in precedenza per l'apparecchio testa sopraspinatus-omerale.
NOTA: Solo un insieme di apparecchi è necessario per l'Achille-calcaneal, poiché l'anatomia delle ossa calcaneus sinistra e destra è quasi simmetrica.
- Seguire gli stessi passaggi descritti in precedenza per l'apparecchio testa sopraspinatus-omerale.
- Osso tendine-omerale supraspinatus
2. Test biomeccanici dei tendini murini
- Preparazione degli spettri e misurazione dell'area trasversale
- Dissezionare il muscolo-tendine-osso di interesse nella preparazione per i test meccanici di tensione. Nello studio attuale, gli esemplari ossei di supraspinatus - tendine - omero (N-10, 5 maschi, 5 femmine) e il muscolo gastrocnemio - Achille tendon-calcaneus sono stati isolati dai topi C57BL/6J di 8 settimane.
- Dissezione del muscolo supraspinatus - tendine - campione osseo omero
- Eutanasia di un topo per ogni procedura approvata da IACUC. Posizionare il mouse in una posizione prona. Fare un'incisione nella pelle da sopra il gomito della zampa anteriore verso la spalla.
- Rimuovere con cura la pelle con dissezione smussata in modo che la muscolatura della spalla sia visibile. Rimuovere il tessuto che circonda l'omero fino a quando l'osso è esposto e può essere tenuto in modo sicuro con pinze.
- Tenere l'omero con pinze e rimuovere con attenzione i muscoli deltoidi e trapezi per esporre l'arco coracoacromial. Identificare l'articolazione acromioclavicolare e separare con cura la clavicola dall'acromion con una lama del bisturi.
- Facendo attenzione a non danneggiare il tendine supraspinatus e il suo attaccamento osseo, rimuovere il muscolo dal suo attacco scapolare utilizzando una lama del bisturi. Fare attenzione a non danneggiare il tendine supraspinatus e il suo attaccamento osseo, staccare la testa omerale dal glenoid; utilizzando una lama bisturi, lacerare la capsula articolare e l'infraspinatus, subscapularis, e teres tendini minori.
- Sarticolare l'articolazione del gomito per separare l'omero dall'ulna e dal raggio. Isolare l'omero - tendine supraspinatus - campione muscolare e pulire i tessuti molli in eccesso sulla testa omerale e omerale.
- Dissezione del tendine di Achille - campione osseo di calcaneus
- Eutanasia di un topo per ogni procedura approvata da IACUC. Posizionare il mouse in una posizione prona. Facendo attenzione a non danneggiare il tendine di Achille e il suo attaccamento osseo, rimuovere la pelle con dissezione smussata in modo che la muscolatura intorno alle articolazioni della caviglia e del ginocchio sia esposta.
- Utilizzando una lama bisturi, a partire dal tendine di Achille - attaccamento calcaneus, staccare con attenzione il muscolo gastrocnemius dai suoi attaccamenti prossimali.
- Disarticolare con cura il calcano dalle varie ossa adiacenti. Isolare il tendine di Achille - campione di calagiso e pulire i tessuti molli in eccesso.
- Dissezione del muscolo supraspinatus - tendine - campione osseo omero
- Determinare l'area della sezione trasversale del tendine utilizzando la tomografia microcalcolata.
NOTA: Per lo scanner utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali), le impostazioni consigliate sono: scansione a un'energia di 55 kVP, filtro Al 0,25, con una risoluzione di 5 m.- Mescolare la polvere di agarose in acqua ultrapura e microonde per 1-3 min fino a quando l'agarose è completamente disciolto. È utile al microonde per 30-45 s, fermarsi e turbinare, e quindi continuare verso un'ebollizione. Riempire criotubi fino a tre quarti pieno di agarose. Lasciare raffreddare l'agarose per circa 5-10 min.
- Sospendere il campione nel criotubo inserendo l'osso capovolto.
NOTA: Solo l'osso deve essere nel gel di agarose. Il tendine e il muscolo devono essere sospesi all'esterno.
- Dopo la scansione, rimuovere delicatamente il muscolo dal tendine utilizzando lala bisturi. Inserire il campione nell'apparecchio stampato in 3D.
NOTA: le impugnature sono riutilizzabili per ogni test. Non usare colla o resina epossidica nell'apparecchio; l'osso è tenuto in un attacco di stampa. - Inserire e incollare il tendine tra una carta velina sottile piegata (2 cm x 1 cm) e bloccare il costrutto utilizzando sottili impugnature della pellicola. Attaccare l'apparecchio stampato in 3D con il campione nelle impugnature di prova.
- Inserire il campione e le impugnature in un bagno di prova di salina tampobuffer (PBS) di fosfato a 37 gradi centigradi (ossia la temperatura corporea del mouse23).
- Dissezionare il muscolo-tendine-osso di interesse nella preparazione per i test meccanici di tensione. Nello studio attuale, gli esemplari ossei di supraspinatus - tendine - omero (N-10, 5 maschi, 5 femmine) e il muscolo gastrocnemio - Achille tendon-calcaneus sono stati isolati dai topi C57BL/6J di 8 settimane.
- Test di tensione
- Eseguire test meccanici di tensione su un telaio di prova del materiale.
NOTA: per il frame di prova utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali), il protocollo consigliato è:- Definire la lunghezza del misuratore come distanza dall'attacco del tendine al grip superiore.
- Precondizione con 5 cicli compresi tra 0,05 N e 0,2 N.
- Tenere premuto per 120 s.
- Utilizzare una tensione al fallimento dello 0,2%/s.
- Raccogliere i dati di deformazione del carico.
- Calcolare la deformazione come spostamento rispetto alla lunghezza iniziale del misuratore del tendine.
- Calcolare la sollecitazione come forza divisa per l'area sezione trasversale del tendine iniziale (misurata da microCT).
- Se interessato al comportamento viscoelastico, eseguire un rilassamento dello stress prima della prova di tensione al fallimento e utilizzare i dati per calcolare parametri come A, B, C, tau1 e tau2 dal modello viscoelastico quasilineare24.
- Dalla curva di deformazione del carico, calcolare la rigidità (pendenza della porzione lineare della curva), la forza massima e il lavoro da cedere (l'area sotto la curva fino alla forza di resa).
- Identificare la porzione lineare scegliendo una finestra di punti nella curva di deformazione del carico che massimizza il valore R2 per una regressione lineare dei minimi quadrati25.
- Determinare la rigidità come pendenza della porzione lineare della curva di spostamento del carico25,26.
- Dalla curva di sollecitazione, calcolare il modulo (pendenza della porzione lineare della curva), la forza (sollecitazione massima) e la resilienza (area sotto la curva fino a produrre sollecitazione).
NOTA: utilizzando l'algoritmo RANSAC, la deformazione della resa (valore x) è definita come il primo punto in cui l'y-fit ha deviato più dello 0,5% del valore di sollecitazione previsto (valore y). La sollecitazione del rendimento è il valore y corrispondente della deformazione di rendimento.
NOTA: Oltre al carico monotono della tensione al fallimento descritto nello studio attuale, il carico ciclico può fornire importanti informazioni sull'affaticamento dei tendini e/o sulle proprietà viscoelastiche. Ad esempio, Freedman e altri hanno riportato le proprietà di affaticamento dei tendini murini di Achille27. - Dopo il completamento dei test di tensione, eseguire una tomografia microcalcolata dell'intero osso, ad esempio, eseguire la scansione dei campioni di omero e calcaneus.
NOTA: Per lo scanner utilizzato nello studio corrente (Tabella dei materiali), le impostazioni consigliate sono: scansione a un'energia di 55 kVP, filtro Al 0,25, con una risoluzione di 6 m.- Ripetere i passaggi da 1.1.2.1– 1.1.2.2.
- Ripetere il passaggio 1.1.3.
- Utilizzare un programma di visualizzazione 3D compatibile con lo scanner per creare un modello 3D con rendering del volume dell'oggetto acquisito.
NOTA: il programma utilizzato nello studio corrente è elencato nella Tabella dei materiali. - Determinare la modalità di errore e l'area del sito di errore controllando l'oggetto 3D.
- Eseguire test meccanici di tensione su un telaio di prova del materiale.
- Analisi statistica: mostra tutti i risultati del campione come media e deviazione standard (SD). Fai confronti tra i gruppi usando i test t dello studente (a due code e non accoppiati). Impostare significato su p < 0.05.
NOTA: il software statistico utilizzato nello studio corrente è elencato nella Tabella dei materiali.
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Representative Results
Gli apparecchi stampati in 3D sono stati utilizzati per testare i tendini di murine supraspinatus e Achille di 8 settimane. Tutti i campioni testati meccanicamente hanno avuto esito negativo durante l'ittesi, come caratterizzato da scansioni microCT, ispezione visiva e analisi video dopo test di tensile. Un confronto uno-a-uno dei metodi precedenti e correnti per il test del tendine supraspinatus nel nostro laboratorio è mostrato Figura 3. Nel metodo precedente28,29,30, l'osso omero è stato incorporato in epossidica e una graffetta è stata posta sopra la testa omerale nel tentativo di prevenire la frattura della piastra di crescita. 4-6 ore sono state necessarie per consentire alla resina epossidica di curare completamente (Figura 3), consentendo solo 6-8 campioni da testare in una giornata tipica. Un'ulteriore limitazione dell'approccio è stata l'efficacia dipendente dall'utente del posizionamento della graffetta per prevenire la frattura della piastra di crescita. I risultati dei test che utilizzano questi metodi precedenti erano altamente variabili, con coefficienti di variazione dell'ordine del 30% per la maggior parte dei parametri e tassi di guasto delle piastre di crescita di circa il 10%-20%. Come riassunto nella Figura 3, il tempo di preparazione dei campioni utilizzando i nuovi metodi è stato ridotto a 5-10 minuti, il che rende pratico testare 16-20 campioni al giorno. Inoltre, sono stati eliminati i guasti delle piastrine di crescita.
Rispetto alla metodologia di altri per testare i tendini murini14,15,17,25,28,29,30,31 ,32,33, i nuovi metodi erano più efficienti e riproducibili. Per i tendini supraspinatus, le proprietà strutturali come il carico massimo (3,8 , 0,6 N) e la rigidità (12,7 x 1,8 N/mm), nonché le proprietà dei materiali normalizzati come la sollecitazione massima (8,7 mPa e i moduloni (51,7 - 13,5 MPa) avevano coefficienti notevolmente inferiori di coefficienti di variazioni rispetto ai risultati della letteratura (Tabella 1). Per il tendine d'Achille, le proprietà meccaniche come il carico massimo (7,8 x 1,1 N) e la rigidità (13,2 e 1,9 N/mm) avevano coefficienti di variazioni inferiori rispetto ai risultati della letteratura19,21,22 ,32,33,34,35,36,37,38, mentre la sollecitazione massima (24,2 - 5,4 MPa) e il modulo (73,2 ) 22.1 MPa) aveva coefficienti di variazioni simili a quelli riportati nella letteratura(tabella 2).
Il sesso animale ha avuto un effetto significativo sulle proprietà meccaniche dei tendini supraspinatus e Achille (Figura 4). Quando si confrontano i tendini sopraspinatus maschili e femminili, ci sono stati aumenti significativi della forza massima (p - 0,002) e il lavoro da produrre (p - 0,008). Tra i due gruppi si sono accerchiate tendenze tra la rigidità (p e 0,057), lo stress (p - 0,068), il modulo (p - 0,061) e la resilienza (p - 0,078). Quando si confrontano i tendini di Achille maschili e femminili, si sono verificati aumenti significativi dello stress massimo(p - 0,0006) e della resilienza (p - 0,0019). C'erano tendenze tra i due gruppi per il lavoro da cedere (p - 0,079) e il modulo (p - 0,074) e nessuna differenza per la forza massima (p - 0,1880) e la rigidità (p - 0,6759).
Figura 1: rappresentativi di modelli 3D di apparecchi per l'omero (riga superiore) e il calcaneus (riga inferiore). (A) Modelli 3D delle ossa. (B) Modelli smontati degli apparecchi. (C) Modelli assemblati degli apparecchi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: apparecchi stampati in 3D rappresentativi. (A) Fissaggio per test biomeccanici di tendini supraspinatus di topi di 8 settimane con un angolo di 180 gradi tra l'omero e il tendine supraspinatus. (B) Fissaggio per test biomeccanici di tendini supraspinatus di topi di 8 settimane con un angolo di 135 gradi tra l'omero e il tendine supraspinatus. (C) Fissaggio per test biomeccanici dei tendini murini d'Achille con un angolo di 120 gradi tra il tendine di Cachille e achille. (D) Fissaggio per test biomeccanici di tendini supraspinatus di ratti adulti Sprague Dawley con un angolo di 180 gradi tra l'omero e il tendine supraspinatus. Barra della scala: 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto dei metodi precedenti e correnti per il test meccanico dei tendini supraspinatus murini. (A) Precedenti metodi di preparazione dei campioni utilizzati nel nostro laboratorio prima dei test meccanici: l'omero è stato in vaso in epossidica fino alla testa omerale per stabilizzare l'osso, è stata posta una graffetta sopra la testa omerale per prevenire la frattura della piastra di crescita e, affinché la resina epossidica guarisse, i campioni sono stati lasciati a temperatura ambiente per 4-6 ore prima dei test meccanici. (B) I metodi di preparazione degli indumenti utilizzati nello studio corrente (Passaggi 1.2 e 2.1.4): In alto a sinistra viene illustrata una rappresentazione 3D degli apparecchi prodotti da un programma di modellazione solido. I dispositivi stampati in 3D sono riutilizzabili e facilmente assemblati e smontati. L'estremità ossea del campione viene inserita negli apparecchi, fissando la piastra di crescita ed esponendo il tendine per afferrare e testare. L'estremità del tendine è incollata tra una carta velina sottile piegata e inserita nelle impugnature. Il tempo di preparazione per ogni campione è di 10–15 minuti. (C) Curve rappresentative di deformazione del carico per la prova di tensile del tendine supraspinatus con metodi attuali. (D) Curva rappresentativa di deformazione del carico per la prova di tensile del tendine supraspinatus che mostra un guasto della piastra di crescita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetto sessuale sulle proprietà meccaniche dei tendini supraspinatus (SST) e Achille (ACHT). C'è stato un effetto significativo del sesso su molte delle proprietà meccaniche basate su test t non accoppiati (effetto sessuale, p < 0,05). Dati indicati come media : deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Misurazione dell'area trasversale da microCT. (A) Misurazione minima dell'area trasversale lungo la lunghezza del tendine supraspinatus. (B) Misurazione minima dell'area trasversale lungo la lunghezza del tendine d'Achille. Solo il tendine corretto deve essere selezionato per la misurazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Proprietà strutturali | Proprietà dei materiali | |||||||||||
| Animali | Forza massima (N) | Rigidità (N/mm) | Stress massimo (Mpa) | Modulo (MPa) | ||||||||
| autore | N | origini | Media : SD | COV(%) | Media : SD | COV (%) | Media : SD | COV (%) | Media : SD | COV (%) | ||
| Beason et al. Giornale di chirurgia spalla e gomito (2013)15 | 10 | C57Bl/6 | 0,93-0,34 | 36.56 | 95.1-39.8 | 41.85 | 3,40-1,56 | 45.88 | 312,8 - 127,0 | 40.60 | ||
| Bell et al. Giornale di ricerca ortopedica (2014)31 | 6 | C57Bl/6 | 1,22 x 0,52 | 42.62 | 2,37 - 1,6 | 67.51 | Nr | Nr | ||||
| Cong et al. Giornale di ricerca ortopedica (2018)17 | 8 | C57Bl/6 | 5,38 x 2,404 # | 44.68 | 4,25 x 1,67 # | 39.29 | Nr | Nr | ||||
| Annals di Ingegneria Biomedica (2014)32 | 10 | NR (db / ) | Nr | 84,44 x 27,23 | 32.25 | Nr | 476 x 186,27 | 39.13 | ||||
| Connizzo et al. Giornale di Ingegneria Biomedica (2013)14 | Nr | C57/BL6 | Nr | Nr | Nr | 297 x 148,90 | 50.13 | |||||
| Acta Biomaterialia (2019)28 | 12 | Cd-1 Mouse IGS (WT) | 5.0 - 0.7 | 14 | 9.2 - 2,9 | 31.52 | 33 X 35 | 106.06 | Nr | |||
| Eekhoff et al. Giornale di Ingegneria Biomedica (2017)33 | 13 | Eln | Nr | 8,50 x 2,95 | 34.71 | 5,96 x 3,23 | 54.19 | 101,2 x 50,8 | 50.20 | |||
| Killian et al FASEB Journal (2016)29 | 8 | C57BL/6 | Nr | Nr | 7,79 x 2,61 | 33.50 | 58,32 x 31,73 | 54.41 | ||||
| Schwartz et al. Osso (2014)25 | 20 | Cd-1 Mouse IGS (WT) | 4.11 - 0,79 | 19.22 | 8,58 x 3,78 | 44.06 | 12,29 x 5,95 | 48.41 | 133,80 - 59,41 | 44.40 | ||
| Schwartz et al. Sviluppo (2015)30 | 12 | (Rosa-DTA (DTA) x Gli1-CreERT2 ) ScxCre; Smofl/fl (WT) | 4,16 x 0,29 | 6.97 | 11.04 - 1,98 | 17.93 | 26,24 x 5,81 | 22.14 | 121,89 x 44,18 | 36.25 | ||
| COV medio | 27.34 | COV medio | 38.64 | COV medio | 51.70 | COV medio | 45.02 | |||||
| Nuovo metodo | 10 | C57BL/6J | 3,79 x 0,62 | 16.41 | 12,73 x 1,81 | 14.20 | 8,71 x 3,04 | 34.91 | 51,67 x 13,54 | 26.20 | ||
Tabella 1: Proprietà meccaniche dei tendini supraspinatus. Media - SD e coefficiente di variazione (COV) per le proprietà strutturali e materiali stimate utilizzando nuovi metodi rispetto a quelli riportati nella letteratura. [NR: non riportato, non segnalato a partire dalla figura(e), - deviazione standard calcolata dall'errore standard riportato, deformazione misurata utilizzando linee di macchia ottica].
| Proprietà strutturali | Proprietà dei materiali | |||||||||
| Animali | Forza massima (N) | Rigidità (N/mm) | Stress massimo (Mpa) | Modulo di Young (MPa) | ||||||
| autore | N | origini | Media : SD | COV(%) | Media : SD | COV (%) | Media : SD | COV (%) | Media : SD | COV (%) |
| Boivin et al. Muscoli, Legamenti e Tendtendons Journal (2014)19 | 6 | Topi magra non diabetici | 8.1 - 0,6 | 7.41 | 3,9 x 0,7 | 17.95 | Nr | 16 x 3,7 | 23.13 | |
| Annals di Ingegneria Biomedica (2014)32 | 10 | Db/ | Nr | 20,39 x 2,43 | 11.92 | Nr | 152,94 x 44,12 | 28.85 | ||
| Eekhoff et al. Giornale di ingegneria biomeccanica (2017)33 | 8 | Eln | Nr | 18,86 x 3,37 | 17.87 | 10,55 x 2,97 | 28.15 | 443,8 x 131,7 | 29.68 | |
| Giornale di ricerca ortopedica di Mikic et al. | 20 | C57BL/6-J x 129SV/J | Nr | Nr | 18 X 5 | 27.78 | 61 X 20 | 32.79 | ||
| Giornale di Chirurgia Investigativa (2000)22 | 20 | BALB/c (in inglese) | 8.4 - 1,1 | 13.10 | 6,3 - 1,2 | 19.05 | Nr | Nr | ||
| Shu e tramite Peer J (2018)21 | 9 | C57BL/6 | 9,6 x 3,84 | 39.96 | 8.19 X 3,63 | 44.32 | 27,55 x 10,54 | 38.26 | Nr | |
| Sikes et al. Giornale di ricerca ortopedica (2018)35 | 7 | C57BL/6 | Nr | Nr | 19.53 - 7,03 | 0.36 | 62,82 : 20,20 | 32.16 | ||
| Wang et al. Giornale di ricerca ortopedica (2006)36 | 9 | A/J | 8.4 - 1,2 | 14.29 | 12,2 x 2,8 | 22.95 | 78,2 - 8,6 | 11.00 | 713,9 x 203,7 | 28.53 |
| Wang et al. Giornale di ricerca ortopedica (2006)36 | 8 | C57BL/6J | 10,2 e 1,4 | 13.73 | 13,1 - 2,5 | 19.08 | 97,4 x 11,4 | 11.70 | 765,1 - 179,6 | 23.47 |
| Wang et al. Giornale di ricerca ortopedica (2006)36 | 7 | C3H/HeJ | 12,5 x 1,7 | 13.60 | 14,1 - 3,2 | 22.70 | 97,5 x 10,9 | 11.18 | 708,6 x 127,8 | 18.04 |
| Wang et al. Giornale di ricerca ortopedica (2011)37 | 7 | C57BL/6 | 6,6 x 1,7 | 25.76 | 8.2 - 1,4 | 17.07 | 13,4 x 3,7 | 27.61 | 86,8 x 15,5 | 17.86 |
| Biologia matriciale (2016)38 | Nr | CD-1 e C57BL/6J | 6,73 x 3,74 | 55.57 | 12,03 x 3,34 | 27.76 | 25,4 x 15,14 | 59.61 | 632,31 - 113,79 | 18.00 |
| COV medio | 22.93 | COV medio | 22.07 | COV medio | 23.96 | COV medio | 25.25 | |||
| Nuovo metodo | 12 | C57BL/6J | 7,8 - 1,08 | 13.91 | 13.19 x 1,86 | 14.08 | 24,16 x 5,42 | 22.45 | 73.17 - 16,14 | 22.06 |
Tabella 2: Proprietà meccaniche dei tendini di Achille. Media : SD e COV per le proprietà strutturali e materiali stimate utilizzando nuovi metodi rispetto a quelli riportati nella letteratura. [NR: non riportato, - stimato a partire da cifre, - deviazione standard calcolata dall'errore standard riportato].
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Discussion
I modelli animali Murine sono comunemente usati per studiare i disturbi del tendine, ma la caratterizzazione delle loro proprietà meccaniche è impegnativa e non comune nella letteratura. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo efficiente e riproducibile nel tempo per il test della tensione dei tendini murini. I nuovi metodi hanno ridotto il tempo necessario per testare un campione da ore a minuti ed eliminato un elemento di presa importante che era un problema comune nei metodi precedenti.
Diversi passaggi descritti in questo protocollo sono fondamentali per produrre apparecchi efficaci che testano meccanicamente i supraspinati murini e i tendini d'Achille. In primo luogo, il passaggio 1.1.4 è necessario creare un modello 3D dell'osso desiderato; tuttavia, a causa della risoluzione tipicamente elevata utilizzata per questa scansione, la dimensione del file potrebbe essere troppo grande per essere utilizzata con programmi di modellazione solida. Il software utilizzato in questo protocollo ha ridotto con successo le dimensioni del file (passaggio 1.1.6) e la geometria dell'oggetto conservato, anche se altri software possono anche essere efficaci per raggiungere questo obiettivo. In secondo luogo, ogni sito anatomico ha criteri di progettazione specifici da considerare per una presa efficace. Per la progettazione dell'apparecchio tendineo supraspinatus, è fondamentale: (i) fissare la testa omerale per evitare guasti alla piastra di crescita (passaggio 1.2.1.12), (ii) definire una veste di gioco che eviti il disimpegno dell'osso omero dallo stampo durante il test (passaggio 1.2.1.12.1) e (iii) orientare l'osso omero per formare un angolo di 180 gradi con l'asse lungo del tendine (passaggio 1.2.1.7). Per il design dell'apparecchio tendinere di Achille, è fondamentale: (i) definire una vestibilità che impugna il piccolo osso di calcaneus senza scivolare fuori dall'apparecchio durante i test e (ii) orientare l'osso di calcaneus per formare un angolo di 120 gradi (flessibilità del piano 30) con l'asse lungo del tendine. In terzo luogo, la misurazione accurata dell'area della sezione trasversale del tendine (passaggio 2.1.2) è fondamentale per calcolare correttamente la sollecitazione ingegneristica per la determinazione delle proprietà del materiale. Per misurare l'area trasversale del tendine supraspinatus, si consiglia di microcalcolare le scansioni tomografiche microcalcolate dell'esemplare osseo-tendine-muscolare sospeso in un criotubo con un fondo piatto, con l'osso tenuto a testa in giù nel tubo con agarose. Solo l'osso omero deve essere inserito nel gel di agarose, mentre la testa omerale con il tendine e il muscolo attaccato deve essere scansionata in aria. Poiché il tendine supraspinatus ha una geometria giocata in quanto si inserisce nell'osso, il modo più coerente per misurare l'area della sezione trasversale è quello di determinare l'area minima della sezione trasversale lungo la lunghezza del tendine. Una procedura simile dovrebbe essere seguita per misurare l'area trasversale del tendine d'Achille. Per il tendine d'Achille, le scansioni di tomografia microcalcolate ad alta risoluzione rivelano due tessuti distinti: il tendine corretto e la guaina circostante, che appare come una tonalità più chiara. Per stimare in modo coerente l'area minima della sezione trasversale per il tendine di Achille, solo il tendine corretto deve essere selezionato per lamisurazione( Figura 5 ). Infine, le impugnature sono riutilizzabili e piccole variazioni da campione a campione non influiscono sulla loro efficacia. Ogni osso deve essere scansionato una volta (ad esempio, per lo studio attuale, omero sinistro, omero destro e calcaneus) e deve essere creato un modello 3D per ogni osso. Inoltre, per gli animali della stessa età, la geometria ossea è quasi identica, quindi lo stesso apparecchio può essere utilizzato per testare tutti i campioni. In questo manoscritto, sono stati utilizzati apparecchi stampati in 3D specifici per i topi di 8 settimane (topi adulti malarici maturi) per testare i tendini. Non era necessario creare infissi separati maschili e femminili. Per altre fasce d'età (ad esempio topi di 4 settimane) o topi con fenotipi ossei unici, si raccomanda la produzione di apparecchi che si adattano alle particolari geometrie delle ossa.
Dopo la progettazione e la stampa 3D degli apparecchi, per garantire la riproducibilità e l'efficienza dell'approccio, 10 campioni di tendini provenienti da topi dello stesso sfondo e dell'età dello studio pianificato devono essere in genere testati (la dimensione esatta del campione può variare a seconda del tessuto e modello animale). Le proprietà meccaniche di questi tendini devono essere determinate per garantire che i coefficienti di variazione per le proprietà strutturali e materiali siano compresi nell'intervallo previsto, come descritto nella tabella 1 e nella tabella 2. Questi test pilota dovrebbero anche confermare che non si verificano fallimenti attuali (ad esempio, fallimento della piastra di crescita). Per ottenere i risultati desiderati per tendini diversi dai tendini diversi dai tendini sopraspinati e d'Achille descritti nella carta corrente possono essere necessari più cicli di progettazione, prototipazione e convalida.
Un certo numero di gruppi hanno segnalato le proprietà meccaniche dei tendini murini. Il coefficiente delle variazioni in questi studi è in genere elevato, rendendo spesso difficile raccogliere le differenze tra i gruppi di confronto. Inoltre, le differenze metodologiche nella presa dei tessuti tra i vari studi rendono difficile determinare se le proprietà di fallimento sono rilevanti per il tendine o a causa di fallimenti di presa artifactuali. Per confrontare i nuovi metodi di prova con le metodologie esistenti, è stata eseguita una revisione della letteratura e sono stati riassunti i risultati di 20 studi (Tabella 1 e Tabella 2). Nella letteratura, per i test meccanici del tendine supraspinatus, i coefficienti medi di variazione per la massima forza, rigidità, stress massimo e modulo erano rispettivamente del 27%, 39%, 52%, e 45%. Per i test meccanici del tendine d'Achille, i coefficienti medi di variazione per forza massima, rigidità, stress massimo e modulo erano rispettivamente del 23%, 22%, 24% e 25%. Nello studio attuale, il nuovo metodo per testare i tendini murini ha portato a una riduzione del 32%-63% dei coefficienti di tendini sopraspinatus di variazione e al 6%-39% di riduzione dei coefficienti di variazione dei tendini di Achille.
Non esiste una metodologia standard corrente per afferrare le ossa, quindi non è chiaro in che misura i problemi di presa artifactuali abbia influenzato le proprietà meccaniche segnalate dei tendini murini. La maggior parte dei gruppi riporta la presa dell'osso dell'omero utilizzando resina epossidica13, polimethylmethacrylate (PMMA)14,15 , o cianoacrylate 16 e fissando la testa omerale applicando un secondo rivestimento di PMMA 14 ,15, o cianoacrylate16 e fissando la testa omerale applicando un secondo rivestimento di PMMA14, utilizzando un apparecchio personalizzato39 e/o inserendo un graffetta25,28,30. Allo stesso modo, altri gruppi riferiscono presa dell'osso molto più piccolo di calcaneus utilizzando apparecchi su misura19,20, ancoraggio da morsetti21, fissando in auto curando cemento plastico22 o utilizzando una forma conica slot22. Tuttavia, questi metodi rimangono limitati da bassa riproducibilità, alti tassi di fallimento artifactuali e requisiti di preparazione che richiedono molto tempo. I nuovi metodi presentati in questo studio hanno eliminato i fallimenti di presa artifactuali e hanno triplicato il numero di campioni che possono essere testati in un giorno. Inoltre, questi metodi non sono limitati ai tendini supraspinatus e Achille, in quanto sono facilmente adattabili per testare altri tendini murini e tendini da modelli animali più grandi. Per testare i tendini di animali più grandi, tuttavia, il modulo del materiale fisso stampato 3D deve essere abbastanza alto da non essere conforme alla forza del tendine in fase di test.
Diversi studi hanno dimostrato differenze basate sul sesso nei disturbi del tendine che indicano che le donne hanno ridotto la funzione dopo il trattamento dopo la lesione del tendine40,41,42. Nello studio attuale, il sesso ha avuto un effetto significativo sulle proprietà meccaniche dei tendini murini. Come guidato dai National Institutes of Health (NIH), si consiglia di tenere conto del sesso come variabile biologica nella progettazione di ricerca di modelli animali in cui saranno misurate le proprietà meccaniche tendinee.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato sostenuto dal NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade - #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
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