Summary
تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير وتحليل ديناميات اتجاه الخلية ونمو الأنسجة في ظهارة البطن Drosophila كما ذبابة الفاكهة يخضع التحول. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة هنا على دراسة مختلف مراحل النمو والأنسجة والهياكل تحت الخلوية في دروسوفيلا أو غيرها من الكائنات النموذجية.
Abstract
داخل الكائنات متعددة الخلايا ، والأنسجة الناضجة والأجهزة عرض درجات عالية من النظام في الترتيبات المكانية للخلايا المكونة لها. وهناك مثال رائع من النعت الحسي، حيث يتم جمع خلايا من نفس الهويات أو الهويات المتميزة معا عبر التصاق الخلية الخلية تظهر أنماط بلازار منظمة للغاية. الخلايا محاذاة إلى بعضها البعض في نفس الاتجاه وعرض قطبية مكافئة على مسافات كبيرة. يتم تأسيس هذه المنظمة من النعت ناضجة على مدى مورفوجينيسيس. لفهم كيفية تحقيق الترتيب البُلّي ّ للنعت الناضج ، من الأهمية بمكان تتبع اتجاه الخلية وديناميكيات النمو مع الإخلاص الصدغي العالي أثناء التطور في الجسم الحي. كما أن الأدوات التحليلية القوية ضرورية لتحديد وتوصيف التحولات المحلية إلى العالمية. وpupa Drosophila هو نظام مثالي لتقييم التغييرات شكل الخلية الموجهة الكامنة وراء مورثوجينيسيس الظهارية. تشكل ظهارة الظهارة النامية للظهارة السطح الخارجي للجسم غير المتنقل ، مما يسمح بالتصوير على المدى الطويل للحيوانات السليمة. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا لتصوير وتحليل سلوكيات الخلايا على المستويين العالمي والمحلي في البشرة البطنية الجروية أثناء نموها. يمكن تكييف المنهجية الموصوفة بسهولة مع تصوير سلوكيات الخلايا في مراحل النمو الأخرى أو الأنسجة أو الهياكل تحت الخلية أو الكائنات الحية النموذجية.
Introduction
لتحقيق أدوارها، الأنسجة الظهارية تعتمد بشكل كامل على التنظيم المكاني لمكوناتها الخلوية. في معظم النعوت، لا يتم تعبئة الخلايا ضد بعضها البعض فقط لإنشاء طبقة حصوية دقيقة ولكنها توجه نفسها نسبة إلى محاور الجسم.
الأهمية الوظيفية لتنظيم الأنسجة الدقيقة واضحة في الظهارة الحسية ، مثل الأذن الداخلية الفقارية وشبكية العين. في الحالة الأولى ، الشعر والخلايا الداعمة محاذاة في اتجاه محوري محدد لاستشعار كفاءة المدخلات الميكانيكية مثل الصوت والحركة1،2. وبالمثل، فإن التنظيم المكاني لخلية المستقبلالضوئي ضروري لتحقيق الخصائص البصرية المثلى من قبل شبكية العين3. وبالتالي فإن التحكم المكاني في موضع الخلية واتجاهها له أهمية خاصة بالنسبة للوظيفة الفسيولوجية المناسبة.
Drosophila هي حشرة ثلاثية الأبعاد تخضع لتحول كامل في هياكل جسم اليرقات من خلال التحول ، مما يؤدي إلى أنسجة البالغين. وpupa Drosophila هو نموذج ممتاز للتصوير الحي غير الغازية من مجموعة متنوعة من الأحداث الديناميكية، بما في ذلك هجرة الخلايا التنموية4،انقسام الخلية وديناميات النمو5،تقلص العضلات6،موت الخلية7،إصلاح الجرح8،واتجاه الخلية9. في دروسوفيلاالكبار ، يظهر الظهارة الخارجية درجة عالية من النظام. ويلاحظ هذا بسهولة على ترتيبات trichomes (أي نتوءات الخلايا الناشئة من الخلايا الظهارية واحدة) وشعيرات الحسية في جميع أنحاء سطح الجسم ذبابة10. في الواقع، يتم محاذاة trichomes في صفوف متوازية توجيه تدفق الهواء11. يبدأ تكوين الظهارة للبالغين والترتيب المنظم للخلايا الفردية أثناء تكوين الجنين ويتوج خلال مراحل الجرو. بينما في الأجنة أقسام الخلية، intercalations، وشكل التغييرات جميع انخفاض ترتيب الأنسجة12،13، وهذا هو عاد في مراحل لاحقة من التنمية ، وخاصة في مراحل الجرو ، عندما تقترب الذبابة النضج9.
يوفر جرو Drosophila غير المتنقل نظامًا مثاليًا لتقييم شكل الخلية وتغيرات الاتجاه. البشرة البطنية الجروية يقدم مزايا خاصة. في حين أن السلائف من رئيس الكبار، الصدر، الأعضاء التناسلية، والزوائد تنمو والحصول على منقوشة من مراحل اليرقات، والبلس، والتي يتم دمجها في البشرة اليرقات، تبدأ في النمو والتمييز فقط في pupariation14. تسمح هذه الميزة بتتبع جميع الأحداث الزمنية المكانية التي ينطوي عليها إنشاء ترتيب الأنسجة في مجملها9.
يتم تحديد البلس أثناء النمو الجنيني في المواقف المخالفة في كل جزء من أجزاء البطن المفترضة. البشرة البطنية الظهرية للبالغين مشتقة من أعشاش الهيستوبلاستقع الظهرية الموجودة في المقصورات الأمامية والخلفية15،16. كما توسع الهيستوبلاسس، واستبدال الخلايا الظهارية اليرقات (LECs)، والأعشاش الكونترافين الصمامات في خط الوسط الظهري تشكيل ورقة ملتوية17،18،19،20.
يصف هذا العمل 1) منهجية للتشريح، وتركيب، والتصوير الحي على المدى الطويل من الخوخ Drosophila، و 2) الطرق التحليلية لدراسة ديناميات التوجه الخلوي والنمو في دقة زمنية عالية. يتم توفير بروتوكول مفصل هنا ، يغطي جميع الخطوات المطلوبة من إعداد الخوخ الأولي (أي التدريج والتصوير) إلى استخراج وتقدير خصائص الاتجاه والتوجيه. كما أننا نصف كيفية استنتاج خصائص الأنسجة المحلية من تحليل استنساخ الخلايا. جميع الخطوات الموصوفة هي الحد الأدنى من الغازية وتسمح بإجراء تحليلات حية على المدى الطويل. يمكن تكييف الأساليب الموصوفة هنا بسهولة وتطبيقها على مراحل النمو الأخرى أو الأنسجة أو الكائنات الحية النموذجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: ينقسم هذا البروتوكول إلى خمس خطوات: (1) إعداد الجرو، (2) إعداد الجرو للتصوير، (3) التصوير الحي لظهارة البطن المتنامية، (4) توليد الفسيفساء الوراثية، (5) معالجة البيانات وتحليلها (بما في ذلك أقسام تصف كيفية تحليل ديناميكيات اتجاه الخلية من الخطوط العريضة لتقاطع الخلايا وديناميكيات النمو من استنساخ الخلايا).
1. التدريج من الخوخ Drosophila قبل التصوير
- ذباب الثقافة من النمط الجيني المناسب على المتوسط القياسي في قوارير بلاستيكية عند 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام (± 12 ساعة) بعد وضع البيض (AEL).
ملاحظة: يبدأ التحول داخل حبس يرقات النجم الثالث في حالة الجرو عند 120 ساعة AEL حتى 0 ساعة بعد تكوين الخوبة (APF). يمكن التعرف على هذا الانتقال بسهولة ، لأن اليرقات تتوقف عن التغذية والتحرك ويتم تشكيل المنطقة النوية(الشكل 1A)في 0-12 ساعة APF. الجرو في البداية لينة وبيضاء، ولكن تصلب تدريجيا وتانس. - نقل prepupae الأبيض (0 ح APF) إلى قارورة بلاستيكية طازجة باستخدام فرشاة طلاء رطبة. يمكن الاحتفاظ بالحيوانات في درجات حرارة مختلفة اعتمادًا على التجربة المصممة حتى العمر المطلوب.
ملاحظة: تشكيل الخوخ (أي الجرو) يحدث في 12 ساعة APF، عندما يكون الرأس والملاحق من ذبابة الكبار everted تماما(الشكل 1A). بحلول هذا الوقت يتم فصل حالة الجرو تماما من الخوخ، مما يسمح إزالتها كاملة(الشكل 1A).
2. إعداد الخوخ للتصوير الحي
ملاحظة: بعد التدريج، يتم تشريح الخوخ وتركيبه كما هو موضح أدناه (انظر أيضا الشكل 1).
- إزالة pupae مرحلي من جدار القارورة بمساعدة ملقط.
- الغراء الجانب البطني من كل جرو على شريحة زجاجية مغطاة الشريط لزجة على الوجهين. اضغط بلطف على spiracles الرأس (أي منطقة opercular) والسطح الظهري للخوا مع نصائح من ملقط لضمان التصاق حالة الجرو إلى الشريط(الشكل 1A، B).
ملاحظة: يجب أن تواجه سطح الظهر حتى لتسهيل تشريح القضية واسترداد الخوخ. - بدء تشريح تحت ستيريوميلسكوب عن طريق إزالة بلطف operculum من الخوب مع الملقط(الشكل 1C).
- إدراج طرف واحد من الملقط في زاوية ضحلة بين حالة الجرو وسطح الخوخ من خلال فتحة opercular. المسيل للدموع القضية من الرأس إلى الذيل في وقت لاحق في واحد أو أكثر من الأرجوحة، وتجنب معسر الخوخ(الشكل 1D). أضعاف مرة أخرى حالة جروا متصدع إلى الجانبين الجانبي كما يمكنك الحفاظ على المضي قدما إلى النهاية الخلفية(الشكل 1E).
ملاحظة: حالة الجرو جامدة جدا وتشققات بسهولة. في حالة ارتفاع الرطوبة أو على وجه الخصوص خلفيات genotypic ، تصبح حالة الجرو أكثر ليونة وتمزق أكثر صعوبة. في هذه الحالات ، يمكن مساعدة تكسير حالة الجرو عن طريق وخز حوافه الحرة مع كل من نصائح الملقط. - إزالة الخوخ من حالة الجرو فتح المتابعة عن طريق إدراج بعناية ملقط تحت الحيوان وسحب بلطف ما يصل(الشكل 1F). سوف الجرو التمسك غيض من ملقط(الشكل 1G−H).
- نقل الخوخ بمساعدة ملقط إلى طبق الزجاج القاع وإيداعه على رأس قطرة صغيرة من النفط الهالوكربون نفاذها الغاز(الشكل 1أنا). عقد الجرو بلطف من الجانب البطني لتجنب أي ضرر محتمل الأنسجة.
ملاحظة: يجب أن يكون قطرة زيت الهالكربون صغيرة، وقطرها أقل من نصف طول الخوخ. هذا المبلغ يكفي لتمسك الجرو إلى الزجاج عن طريق الشعيرات الدموية وتصحيح البصريات لأهداف الغمر النفط. - لفة قطعة من ورق الأنسجة الرطبة على حواف الطبق للحفاظ على الرطوبة. غطي الطبق لتجنب جفاف الخوخ أثناء التصوير.
ملاحظة: يمكن استخدام كل من الجرو الأنثوي والذكر للتصوير. نوصي باستخدام شرائح البطن الثالثة (AIII) كميتامير البطن المرجعية لأنها متطابقة تقريبا في كلا الجنسين من حيث الحجم والشكل والنقش.
3. التصوير الحي لظهارة البطن المتنامية
ملاحظة: تم استخدام مجهر بؤري ليزر مقلوب مجهز بهدف غمر الزيت 40x/1.3 NA لتصوير الخوخ في مراحل النمو المختلفة.
- توجيه الخوخ على انخفاض النفط على طبق قاع الزجاج وفقا للمجال وعملية لتقييم (على سبيل المثال dorsolaterally للتصوير الحي على المدى الطويل من التوسع المبكر للأعشاش الظهرية، أو الظهرية لتصوير توسعها في وقت متأخر وإعادة عرض الأنسجة). انظر الشكل 1J, K والشكل 4.
- نقل الطبق الزجاجي السفلي الذي يحتوي على الخوخ المركب إلى مرحلة المجهر والتركيز على سطح منطقة البطن باستخدام الضوء المنقول.
ملاحظة: حتى إذا تم تحسين هذا البروتوكول للتصوير على المجاهر المقلوبة، فمن الممكن أيضًا إجراء التصوير على المجهر المنتصب. في هذه الحالة ، يتم وضع العينة على مرحلة المجهر مع سطح القاع الزجاجي الذي يواجه لأعلى. زيت الهالوكربون يحمل كل الخوخ على الغضروف المفصلي. - تعيين معلمات الاستحواذ: 1) عادة ما يكون عدد شرائح Z بين 20-40 للسماح بإعادة بناء البشرة البطنية المناسبة ثنائية الأبعاد؛ (2) 2) حجم الخطوة بين كل شريحة (على سبيل المثال، 1 ميكرون)؛ 3) الفاصل الزمني للتسجيل (فاصل زمني 5 دقيقة هو مناسبة لتحليلات عالية الدقة من ديناميات اتجاه الخلية)؛ و 4) دقة الإطار (على سبيل المثال، 1024 × 1024).
- قم بتشغيل الليزر المناسب (أي 488 نانومتر و561 نانومتر لتصور GFP و RFP fluorophores على التوالي) وضبط طاقة الليزر وإعدادات الكسب /الإزاحة لتصور الخلايا المميزة. استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة (في النطاق 5%-20%) لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية.
- قم بتعيين الموضع وحدود Z-Stack المناسبة يدويًا للخواب المتعددة باستخدام المرحلة الآلية المرفقة وبرامج اكتساب الموضع المتعدد للمجهر.
4. توليد الفسيفساء الوراثية لمتابعة سلوكيات استنساخ الخلايا
ملاحظة: نحن نستخدم إعادة التركيب mitotic للحث على الفسيفساء الوراثية في ظهارة البطن عبر إعادة التركيب الخاصة بالموقع (نظام FLP/FRT21،22)(الشكل 2).
- أنثى عذراء متقاطعة تحمل متحولة فليباز لا يمكن اختزالها للصدمات الحرارية (hs-FLP)، وهو موقع هدف التعرف على الجبهة (FRT) في موقع جينومي محدد (على سبيل المثال، موقع FRT في الموضع 40A في ذراع L من الكروموسوم 2) ، وعلامة خلوية يمكن التعرف عليها (على سبيل المثال ، Ubi-RFP.nls أو Ubi-GFP.nls) distal إلى موقع FRT ، إلى الذكور المتحولين الذين يحملون موقع FRT في موقع الجينوم المكافئ(الشكل 2A −C).
ملاحظة: يمكن دراسة الآثار المستقلة وغير المستقلة داخل أو خارج المستنسخين لأي فقدان الجينات للوظيفة باستخدام alleles المتنحية محددة distal إلى موقع FRT. - توليد النسخ الجسدية FLP / FRT في الأنسجة عن طريق علاج الصدمات الحرارية في المرحلة الثالثة من اليرقات instar من ذرية الصليب. ويتم ذلك عن طريق غمر القنينات البلاستيكية التي تحتوي على الحيوانات في حمام مائي على 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة في مرحلة اليرقات الهائمة (LIII).
ملاحظة: الفترة الحساسة لإعادة التركيب mitotic هي مرحلة G2 من دورة الخلية. يتم القبض على الهيستوبلاس في G2 خلال تطور اليرقات بأكملها. - تسجيل نسخ مزدوجة للغياب (أي الخلايا المتحولة) أو المحسنة (أي الخلايا البرية ذات البقعة المزدوجة) من علامة البروتين الفلوري من 16 ساعة APF فصاعداً(الشكل 2D).
ملاحظة: في المتوسط، 45 دقيقة إلى ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لا يقدم سوى 2-3 استنساخ توأم لكل منطقة ذات أهمية (على سبيل المثال، جزء البطن). وينبغي التخلص من البوبالتي التي تبين كثافة استنساخ عالية جداً (على سبيل المثال، أكثر من أربعة مستنسخات توأملكل جزء من الهيمي) من تحليلات كمية أخرى. - على هوية استنساخ، صورة الكائنات الحية pupae في المرحلة المطلوبة ولمدة المطلوبة من الوقت كما هو موضح في القسم السابق.
5 - تجهيز البيانات وتحليلها
ملاحظة: تتم معالجة البيانات باستخدام ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- تمييز ديناميكيات اتجاه الخلية عن الخطوط العريضة لتقاطع الخلية.
- قم بمشروع شرائح Z-stack التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر المحوري في 2D باستخدام وظيفة إسقاط الكثافة القصوى (MIP) لـ ImageJ.
ملاحظة: يجب الاحتفاظ بعدد الشرائح لكل مكدس إلى الحد الأدنى لتجنب الضوضاء خارج التركيز الناتجة عن الضامة التي تقوم بدوريات تحت البشرة. - تعيين نظام إحداثيات بلانكار يحدد معالم الأنسجة الموثوقة (على سبيل المثال، حدود مقصورة A/P) لتحليل كل مجموعة بيانات(الشكل 3A).
ملاحظة: استخدام نفس المراجع المخططة لكل مجموعة بيانات سيسمح بمقارنة قياسات متعددة. - استخدم البرنامج المساعد OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) من ImageJ23،24 على حواف الخلايا المحلية للحصول على قيم الاتجاه النوعي والكمي. يقدم المكون الإضافي تراكبات مرمزة بالألوان على صور الإدخال استنادًا إلى التوجهات المحلية ويوفر قيمًا رقمية عند استخدامها في الوضع الكمي(الشكل 3B−B' والشكل C−C'''".
ملاحظة: يستند البرنامج المساعد OrientationJ على الشدات البنية، مصفوفة 2 × 2 من القيم eigenvalues المشتقة من المشتقات التدرجية والاتجاهية (انظر المراجع23،24 للحصول على وصف مفصل). - استخدم خيار توزيع OrientationJ لاتجاهات حافة الخلية رمز اللون بالنسبة إلى نظام تنسيق المخططات المحددة (أي خرائط اتجاه حافة الخلية)(الشكل 3B). تم العثور على خيار التوزيع ضمن القائمة البرنامج المساعد في ImageJ. الإعدادات لتوظيف هي: غاوسي نافذة سيغما = 1 بكسل; سطر مكعب = تدرج؛ الحد الأدنى من الاتساق = 20 في المائة؛ الحد الأدنى للطاقة = 1%. يتم عرض الاتجاهات حافة الخلية كصورة مرمزة بالألوان توظيف خيار مسح اللون من البرنامج المساعد (هوى = التوجه؛ التشبع = التماسك؛ والسطوع = صورة الإدخال).
ملاحظة: المناطق التي تحتوي على فلورسالخلفية لا توفر أية معلومات الاتجاه ويجب استبعاديدوياً من التحليل. تقلل إعدادات العتبة العالية من وحدات البكسل التي يتم أخذها في الاعتبار في الصور المعالجة. - استخدم خيار قياس OrientationJ لتحديد التوجهات الخلوية ومحاذاة الخلية الالخلية الاتجاهية (أي التماسك)(الشكل 3C). تم العثور على خيار القياس ضمن قائمة البرنامج المساعد في ImageJ. إنشاء مناطق صغيرة متجاورة غير متداخلة ذات أهمية (ROIs) ذات وزن موحد (64 × 64 بكسل، حوالي 20 ميكرومتر × 20 ميكرومتر) داخل المنطقة التي تشغلها البلستين(الشكل 3C).
- حساب الاتجاه المحلي السائد (أي متوسط الاتجاه بين خريطة اتجاه حافة الخلية التي متوسطها الخلايا المجاورة) والتماسك من ROIs. البرنامج يحسب الاتجاه السائد والتماسك المحلي داخل كل عائد استثمار(الشكل 3C).
ملاحظة: يتم استخدام أكبر وأصغر قيم eigenor من الشد هيكل المقدرة من قبل OrientationJ لحساب الاتساق كنسبة بين الفرق ومجموعها. ويكون التماسك مرتبطاً بقيم 0-1. تشير قيمة 1 إلى توحيد المحاذاة الكاملة، بينما تشير قيمة 0 إلى مناطق متساوي الخواص بدون محاذاة. - تحليل إحصائي امن قيم التوجيه والتماسك المحسوبة من صور متعددة باستخدام حزم البرمجيات الحرة مثل PAST25. يتم وصف البيانات المحورية مثل قيم الاتجاه (بالدرجات) بشكل مناسب بواسطة إحصائيات الاتجاه.
- من خلال البرنامج، قم بحساب متوسط الاتجاه والتباين الدائري لكل مجموعة من توزيعات التوجيه. يتم تحديد الأهمية الإحصائية للفرق بين توزيع الاتجاهات بين الأنماط الجينية المختلفة أو الشروط باستخدام اختبار Mardia-Watson-Wheeler غير البارامتري (W-test) للتوزيعالمتساوي.
- حساب الأهمية الإحصائية للفرق في الاتساق تطبيق اختبار كولموجوروف-سميرنوف غير بارامتري (اختبار K-S). عرض البيانات بيانيا حسب الرغبة (المؤامرات القطبية، والرسوم البيانية الشريطية، ومخططات مربع، الخ).
- قم بمشروع شرائح Z-stack التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر المحوري في 2D باستخدام وظيفة إسقاط الكثافة القصوى (MIP) لـ ImageJ.
- ديناميات النمو من استنساخ الخلايا
ملاحظة: الخطوات التالية تسمح باسترداد معلمات هندسية وشكل للخلايا من صور MIP 2D التي تحتوي على استنساخ (المستنسخين) من الفائدة. للمقارنة بين استنساخ متعددة، يجب الحصول على الصور مع نفس الإعدادات.- منطقة استنساخ الجزء عن طريق رسم معالمها مع أداة اختيار اليد الحرة ImageJ.
- احسب المعلمات الهندسية ومعلمات الشكل باستخدام أداة تعيين القياسات لـ ImageJ ضمن قائمة التحليل. تنشيط خيارات المنطقة والمحيط والقطع الناقص الملائمة وواصف الشكل.
ملاحظة: سيسمح هذا باسترجاع معلمات هندسية متنوعة بما في ذلك المنطقة (مجموع البيكسلات داخل المستنسخ)، والمحيط (مجموع بكسل حد المستنسخ)، ونسبة العرض إلى الارتفاع (AR، والنسبة بين المحاور الرئيسية والثانوية للقطع الناقص الأكثر ملاءمة للقطع الناقص Legendre المنقوش ة في حدود المستنسخ)، وزاوية الاتجاه (أي زاوية المحور الرئيسي للاستنساخ بالنسبة للحدود الخلفية). - حساب النسب غير الأبعاد من هذه القياسات يسترد معلمات الشكل. وتشمل هذه الاستدارة (4 × [منطقة] / x [المحور الرئيسي]2)، والخشونة (الصلابة - المنطقة / المنطقة المحدبة) ، والتعميم (4ο x [منطقة] / [محيط]2).
ملاحظة: كل من معلمات الشكل يمثل درجة انحراف المستنسخين من الأشكال المثالية مثل دائرة أو بدن محدب يحدها، وجميعها مقيدة بين قيم 0 و 1. تشير القيم المساوية لـ 1 إلى أقصى قدر من التماثل (أي الحد الأدنى من التعقيد). - تحليل إحصائيا المعلمات الهندسية والشكل بين الأنماط الجينية المختلفة أو الشروط باستخدام مايكروسوفت إكسل و / أو PAST. يتم تحديد الأهمية الإحصائية للفرق باستخدام اختبار t الطالب غير المقترن بذيلين للمتوسط المتساوي أو اختبار Kolmogorov-Smirnov K-S-S-غير البارامتري للتوزيع المتساوي بين الظروف. يمكن عرض البيانات بيانيا ً حسب الرغبة (على سبيل المثال، المخططات الشريطية، مخططات الصناديق، وما إلى ذلك). انظر الشكل 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يغطي البروتوكول المذكور أعلاه إعداد الخوخ Drosophila للتصوير الحي على المدى الطويل وإجراءات تحليل اتجاه الخلية وديناميكيات نمو البشرة البطنية. من خلال تطبيق هذه المنهجية فمن الممكن لتوليد أفلام عالية الدقة من الخوخ النامية لفترات تصل إلى 48 ساعة دون تبييض ضوئي كبير أو سمية ضوئية. وترد في الشكل 4لقطات تصور البشرة البطنية (على سبيل المثال، البلس الهيستوبلاسس وLECs) في نقاط زمنية مختلفة ومن الخوخ الموجهة في زوايا مختلفة . يسمح التحليل اللاحق لهذه الأفلام بتحديد وتقدير ديناميكيات التغيرات المحلية والعالمية في المعلمات الهندسية والشكلية الرئيسية التي تم تعديلها أثناء توسع البلس واستبدال الـ LECs. ويمكن إجراء هذه التحليلات في سيناريوهات مختلفة وخلفيات متحولة محددة. كما يمكن استخدامها للمستنسخين التي يتم فيها تغيير التعبير الجيني ، مما يؤدي إلى فقدان مستقل أو اكتساب ظروف الوظيفة. وهذا من شأنه أن يسمح باستكشاف الاستجابات غير المستقلة في الخلايا المحيطة، مما يسهل تحديد آليات الاتصال عبر أو الخلية(الشكل 5). وقد استخدم هذا النهج مؤخرا في تحديد الدهون / Dachsous / أربعة مسار مشترك كعنصر رئيسي توجيه وتوجيه محاذاة الخلايا أثناء نشر النمط القطبي البلعمن من البشرة البطنية للبالغين9.
الشكل 1: تشريح وتركيب الخوخ للتصوير الحي. (أ)من اليسار إلى اليمين: منظر الظهري للإعداد ية عند 0 ساعة APF (يسار) وللخوابة في 14 ساعة APF قبل (منتصف) وبعد (يمين) إزالة حالة الجراء المبهمة. يشار إلى المنطقة opercular (رؤوس الأسهم البيضاء). (ب)تظهر مجموعة الأدوات الأساسية للتشريح. من اليسار إلى اليمين: شريحة زجاجية، شريط لاصق على الوجهين، زوج من الملقط، وطبق زجاجي القاع. (C) يتم شل الاعقال على شريط لاصق على الوجهين على الجانب الظهري الشرائح الزجاجية. يتم فتح حالة الجرو لكل جرو من المنطقة النوية مع ملقط جراحية. (D−E) تقشير حالة الجرو تدريجي. يتم تمزيق القضية وطيها إلى الجانبين الجراء من الرأس إلى البطن. (F−H) يتم رفع الجرو بلطف من الجانب البطني مع نصائح من ملقط(G)ونقلها إلى طبق قاع الزجاج على قطرة الحد الأدنى من زيت الهالكربون. (ط)ثم توجه الجرو بشكل مناسب (dorsolaterally، أعلى؛ dorsally، أسفل). يمكن تركيب الخوخ المتعدد في وقت واحد عن طريق تكرار الخطوات الموضحة في اللوحات C−I. (J)صورة تظهر الخطوط العريضة لخلايا عش الهستوبلاس الظهري للجزء AIII الذي يعبر عن علامة التقاطع Atpα::GFP. وكان الجرو موجهة dorsolaterally وصورة في 14 ساعة APF. شريط مقياس = 22 ميكرومتر (K) صورة تعادل (J) ولكن من وجهة نظر الظهر. يمكن تصور ديناميات تطور الأنسجة لعدة ساعات. انظر أيضا الشكل 4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توليد الفسيفساء الوراثية عبر نظام FLP/FRT. (أ)خلية هيتيروزيغوس الأبوية (أرجواني شاحب) يحمل أليل متحولة متنحية (مستطيل متقطع) على ذراع كروموسوم واحد وترميز الجينات لعلامة الفلورسنت (أرجواني) في الذراع الكروموسومية الأخرى [الذراع الأيسر للكروموسوم 2 (2L) في هذا المثال]. تم تصميم مواقع FRT (مستطيلات برتقالية) في كلا الذراعين في نفس المواقع الكروموسومية القريبة من المركزية (البيضاويات الرمادية). (ب)تفعيل إعادة دمج FLP عن طريق الصدمة الحرارية في الخلايا المتوقفة في G2 يؤدي إلى إعادة التركيب بين FRTs من الكروماتيدات الشقيقة 1-1 'و 2-2'. ونتيجة لذلك، يتم تبادل المنطقة البعيدة إلى مواقع FRT (FRT40A على 2L). يتم عرض طريقة عرض مكبرة على اللوحة اليمنى. (C)عند الفصل القطبي للمناطق المعاد ترتيبها (1-1' و 2-2') أثناء الانقسام، يتم إنشاء خليتين شقيقتين مختلفتين وراثياً. ابنة واحدة هو homozygous للallele المتنحية ولكامل الذراع الكروموسوم distal إلى موقع إعادة التركيب. تفتقر هذه الخلية إلى الجين الذي يشفر علامة الفلورسنت، التي تحمل علامة بيضاء. الخلية ابنة أخرى ستكون homozygous للذراع نوع البرية، مما يؤدي إلى بقعة مزدوجة والتعبير عن نسختين من ترميز الجينات لعلامة الفلورسنت (أرجواني الظلام). للبساطة، لا تظهر حالات الفصل بين المناطق المعاد ترتيبها والأعمدة المقابلة للخلية الميطيّة (أي 1−2 و1'−2'). هذه تؤدي إلى خلايا لا يمكن تمييزها بشكل ظاهري من الخلية الأبوية (خلفية heterozygous ، أرجواني شاحب). (D)صورة تظهر المستنسخات في المقصورة التي تم إنشاؤها عبر إعادة تركيب الخلايا الجسدية FLP/FRT في مرحلة اليرقات الانستارية الثالثة وتصورها على 26 ساعة APF. وتتميز استنساخ الخلايا من قبل عدم RFP.nls (أسود) والتعبير homozygous من RFP.nls (أرجواني مشرق، بقع التوأم) في خلفية rfP.nls heterozygous خلاف ذلك (أرجواني خافت). يمكن تحقيق أحداث مكافئة لمواقع FRT الموجودة في مواقع كروموسومية أخرى (2R و 3L و 3R و X). انظر أيضا الشكل 5. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توضيح قياسات اتجاه الخلية. لاستخراج معلومات حول توجهات الخلية، أولاً يتم تعيين نظام إحداثيات بلار لربط اتجاه الخلية بمحور الأنسجة (A). ثانياً، يتم استخراج اتجاهات الخلية من الخطوط العريضة للخلايا(B). أخيرا، يتم قياس اتجاهات الخلية والمحاذاة مع محور الأنسجة(C). (أ)على اليسار، رسم تخطيطي للعرض الجانبي للخواب الموجهة وفقا لنظام إحداثيات البلان. تحدد الخطوط الصلبة الحمراء وخطوط سماوي المندفع ة المستوى الديكارتي الذي يمثل حدود anteroposterior (A/P) وخط منتصف الظهر على التوالي. في الوسط، صورة مقلوبة تظهر عرض ًا دوريًا للانفجارات الهسفية الآخذة في التوسع عند 26 ساعة APF موضحة بواسطة علامة التقاطع Atpα::GFP (صورة الإدخال). يتم تمييز موضع حدود A /P بخط أحمر. على اليمين، بوصلة محورية تظهر رمز اللون المطبق لوصف اتجاهات حافة الخلية (المضلعات) أو متوسط اتجاهات الخلية (أشرطة). (ب)عرض القائمة الإضافات /OrientationJ ونافذة توزيع OrientationJ. (ب) عرض إطار توزيع OrientationJ الذي يعرض إعدادات المعلمات المستخدمة للحصول على خريطة اتجاه حافة الخلية على اليمين. (B'') رسم توضيحي للخلية المرمزة بالألوان على الخلايا المثالية. لا تظهر الدائرة أي لون مفضل. (C)عرض إطار قياس OrientationJ. (C') لقطات متتابعة من نافذة قياس OrientationJ توضح كيفية قياس التوجه المحلي والتماسك في المؤشرات المتتالية ذات الوزن الموحد. يتم عرض زاوية الاتجاه المحلي والتماسك لكل منطقة كقطع ناقصة. (C'') تمثيل النتائج النهائية لقياس التوجيه. تعرض الإهليلكيدات بصريًا الاتجاه (أي زاوية أطول محور إهليلجي فيما يتعلق بحدود A/P) والتماسك (أي النسبة بين المحور الأطول والأقصر للناقص). يتم حفظ القيم العددية لكلا المعلمتين في جدول بيانات لمزيد من التحليلات. (C''' ) توضيح الخطوط العريضة للخلية المرمزة بالألوان ومتوسط اتجاه الخلية (القضبان) على الخلايا المثالية. لا تظهر الدائرة أي اتجاه مفضل. (C''''') تمثيل التوجه المحلي المفضل لكل عائد استثمار (خريطة توجيه متوسطة محليًا). الألوان تسليط الضوء على اتجاه كل منطقة. الأنتيريور إلى اليسار. شريط المقياس = 22 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التصوير الحي على المدى الطويل لظهارة البطن المتنامية. (أ)لقطات تمثيلية من أفلام التصوير على المدى الطويل من المراحل المبكرة إلى المراحل المتأخرة من التوسع الهستوبلاسس. أعلى: وجهات النظر التخطيطية للخواقة الموجهة للتصوير الظهري في 16 ساعة و 26 ساعة APF. يتم تسليط الضوء على الأراضي التي تحتلها الأعشاش المرئية من الجانب الرجانبي من الخوخ باللون الرمادي الداكن في 16 و 26 ساعة APF. أسفل: الصور التي تظهر الخطوط العريضة للخلايا من كل من البلس والمصابيح المسمى من قبل التعبير في كل مكان من علامة تقاطع Atpα::GFP. تقع حدود A /P بين المقصوراتتين المميزة (الخلايا الملونة المزيفة باللون الأزرق = المقصورة الأمامية؛ والخضراء = المقصورات الخلفية). (ب)لقطات تمثيلية من أفلام التصوير على المدى الطويل من المراحل المبكرة إلى المراحل المتأخرة من التقاء الأعشاش. أعلى: عرض تخطيطي للخواقة الموجهة للتصوير الظهري في 32 ساعة و 48 ساعة APF. أسفل: الخطوط العريضة الخلية (المسمى والملونة كما هو الحال في A). لاحظ أن علامة Atpα::GFP تسمح بترسيم شكل الخلايا الظهارية الفردية مع مرور الوقت بدقة عالية. شريط المقياس = 22 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: خصائص الأنسجة المستخرجة من تحليل البرسيم. (أ)أمثلة من الحيوانات المستنسخة من النوع البري في المقصورة التي تميزت بعدم وجود RFP.nls (أسود) وبقعها التوأم (أرجواني مشرق) في 26 ساعة APF. المستنسخين ممدود على طول الحدود القطاعية. استنساخ التوأم ترتيب بالتوازي أو جنبا إلى جنب. شريط المقياس = 22 ميكرومتر. (ب)الأعلى: صور توضح المعلمات المحددة كميا من الخطوط العريضة استنساخ. أسفل: جدول ملخص يبلغ عن متوسط القيم للمعلمات المشار لها للحيوانات البرية (n = 29). (C)مورفولوجيا من نوع البرية استنساخ في 26 ساعة (يسار) و 47 ساعة (يمين) APF. يظهر المستنسخ مورفولوجيا الحدود المعقدة في كلتا المرحلتين. (D)مربع وشعيرات المؤامرات للمعلمات الهندسية في 26 ساعة (أصفر فاتح) و 47 ساعة APF (الأصفر الداكن). ويزداد متوسط المساحة ومحيط المنطقة زيادة كبيرة في هذه الفترة الزمنية. (E)المؤامرات القطبية التي تمثل اتجاه المستنسخين (حجم سلة المهملات 18 درجة، وفرة تتناسب مع المنطقة). يتم الحفاظ على التوجه أثناء التوسع وإعادة عرض. (و)مربع وشعيرات المؤامرات لمعلمات الشكل في 26 ساعة (أصفر فاتح) و 47 ساعة APF (الأصفر الداكن). الخشونة (الصلابة) ، والاستدارة ، والتعميم بالكاد تتغير. يتم عرض القيم الوسيطة بخط أفقي أحمر وتمتد شعيرات إلى القيم الدنيا والقصوى للتوزيع. تم إجراء الإحصاءات مع اختبار K-SM أو اختبارات W (p < 0.0001****, p > 0.05 ليست كبيرة). الأنتيريور إلى اليسار، دورسال فوق. شريط المقياس = 16 ميكرومتر. النمط الجيني هو hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النظام بعيد المدى هو سمة أساسية لمعظم الوحدات الفسيولوجية الوظيفية. خلال تكوين الشكل ، يتم تحقيق النظام من خلال دمج التعليمات المعقدة التي يتم تنفيذها بدقة زمنية ومكانية عالية. يتم دمج القيود متعددة المستويات والمتعددة المستويات في ترتيبات الأنسجة النمطية.
القطبية والاتجاه أمر حاسم لترتيب المكانية أمر أثناء التنمية. القطبية تعني كسر التماثل أثناء التنمية. تحقيق عدم التماثل ضروري لتحديد الأنثارات الجنينية (A /P) والظهرية (D / V) والمنظمة الكبار26. وإلى جانب هذا الدور المبكر، فإن أوجه عدم التماثل المحلية ضرورية للتنوع المورفولوجي على جميع المستويات. الاتجاه هو تكملة أساسية من عدم التماثل والقطبية خلال مورفوجينيسيس. يتم تنفيذ النظام العالمي من خلال قدرة الخلايا على استشعار ونقل الإشارات محليا على قاعدة الخلية إلى الخلية مع شعور دقيق أو التوجه. وتنسجم أوجه عدم التماثل بين الخلايا المفردة بشكل تعاوني مع مرور الوقت من خلال توجيه المواقف أو الحركات ضمن اتجاهات معينة في الفضاء. يُسبّط الاتصال الخلوي بالعوامل المُفرزة، واتصالات الخلية، والمدخلات الميكانيكية. تعمل الإشارات على حقول الخلايا التي تقوم أولاً محلياً ثم عالمياً بتعديل سلوكياتها27.
يقدم هذا العمل طريقة بسيطة لتحليل السلوكيات المنسقة للخلايا الفردية ، بما في ذلك توجهاتها ومعلمات نموها أثناء تطوير ترتيب الأنسجة. مورفوجينيسيس البطن الكبار من Drosophila أثناء التطفل يقدم سلسلة من المزايا التقنية على نماذج أخرى مكافئة مثل تمديد النطاق الجرثومي / التراجع28 أو إغلاق الظهرية29 خلال الأجنة ذبابة، Drosophila الجناح morphogenesis ex vivo30، الضميمة البطنية في Caenorhabditis elegans31، أو الانصهار palatal في الفئران32، من بين أمور أخرى.
أولاً، يشكل تكوين البطن عملية يمكن اتباعها في مجملها في الجسم الحي. يمكن إجراء التصوير المباشر المستمر لاستبدال LECs بواسطة الأنسجة من 12 ساعة APF ، عندما يتم تشكيل الخوخ ، حتى الانتهاء من تكوين مورفوجينيسيس الظهاري البالغ. ثانياً، يسمح بتحليل مجموعة كاملة من سلوكيات الخلايا مثل هجرة الخلايا، والتقسيم، وتغيرات الشكل، وإزالة الصفاة، والربط. وأخيراً، فإنه قابل للتداخل الوراثي والتحليل البرسيمي. ويمكن رصد الآثار المستقلة وغير المستقلة للخسارة ومكاسب أنشطة الوظائف على الهواء مباشرة باستخدام علامات مناسبة. ومع ذلك ، فإن pupa كنظام نموذجي يقدم بعض القيود الطفيفة. نظرًا لشكله الأوفي ، لا يمكن إجراء تصوير مباشر متزامن للأحداث الجانبية والظهرية بدقة عالية. يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق إجراء التصوير التسلسلي في الجرو الموجهة نحو الظهر ية والظهرية أو أفضل ، من خلال توظيف زوايا متعددة ضوء ورقة ضوء الإضاءة الانتقائية المجهرية (SPIM). عيب آخر هو وجود اثنين من مجموعات الخلايا المختلفة من أحجام مختلفة في التحليلات (أي، LECs polyploid والهيستومات diploid). وهذا يمكن أن يجعل تجزئة الصورة معقدة ويجب تحليل مجموعات الخلية اثنين بشكل منفصل.
في المستقبل ، يمكن تكييف التصوير على المدى الطويل لخواب Drosophila بسهولة لدراسة مجموعة كاملة من الظواهر المورفولوجية بما في ذلك تنسيق البشرة والعضلات والتطور العصبي أثناء التحول في النوع البري والظروف المتحولة. وعلاوة على ذلك ، قد تستخدم الخوارزميات والإضافات المستخدمة لدراسة التنظيم ، والنقش ، وديناميات العديد من الأنسجة الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد في صاحبي البلاغ تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونود أن نشكر أعضاء مختبر مارتين - بلانكو على المناقشات المفيدة. كما نشكر Nic Tapon (معهد كريك، لندن، المملكة المتحدة)، ومركز بلومينغتون للأوراق المالية (جامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) وFlyBase (للشرح الجيني Drosophila). تم دعم فيديريكا مانجيون من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه من JAE-CSIC. تم تمويل مختبر مارتن بلانكو من Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P و BFU2017-82876-P) ومن Fundación Ramón Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, Suppl . 41-60 (1988).
