Summary
Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.
Abstract
Binnen meercellige organismen vertonen rijpe weefsels en organen een hoge mate van orde in de ruimtelijke ordening van hun samenstellende cellen. Een opmerkelijk voorbeeld wordt gegeven door zintuiglijke epithelia, waar cellen van dezelfde of verschillende identiteiten worden samengebracht via celcelhechting met zeer georganiseerde planaire patronen. Cellen uitlijnen op elkaar in dezelfde richting en tonen gelijkwaardige polariteit over grote afstanden. Deze organisatie van de rijpe epithelia wordt opgericht in de loop van morfogenese. Om te begrijpen hoe de vlakke opstelling van de volwassen epithelia wordt bereikt, is het cruciaal om celoriëntatie en groeidynamiek te volgen met een hoge spatiotemporale getrouwheid tijdens de ontwikkeling in vivo. Robuuste analytische instrumenten zijn ook essentieel om lokale-naar-wereldwijde overgangen te identificeren en te karakteriseren. De Drosophila pop is een ideaal systeem om georiënteerde celvormveranderingen te evalueren die ten grondslag liggen aan epitheelmorogenese. Het pupale ontwikkelende epitheel vormt het buitenoppervlak van het onbeweeglijke lichaam, waardoor op lange termijn beeldvorming van intacte dieren mogelijk is. Het hier beschreven protocol is ontworpen om celgedrag op zowel mondiaal als lokaal niveau in de pop abdominale opperhuid te beeld en te analyseren terwijl het groeit. De beschreven methodologie kan gemakkelijk worden aangepast aan de beeldvorming van celgedrag in andere ontwikkelingsstadia, weefsels, subcellulaire structuren of modelorganismen.
Introduction
Om hun rol te bereiken, epitheelweefsels volledig vertrouwen op de ruimtelijke organisatie van hun cellulaire componenten. In de meeste epithelia, cellen zijn niet alleen verpakt tegen elkaar om een nauwkeurige kasseienlaag te creëren, maar ze oriënteren zich ten opzichte van het lichaam assen.
Het functionele belang van nauwkeurige weefselorganisatie is duidelijk in zintuiglijke epithelia, zoals het gewervelde binnenoor en het netvlies. In het eerste geval richten haar- en ondersteunende cellen zich in een specifieke axiale richting om mechanische ingangen zoals geluid en beweging1,2efficiënt te voelen . Op dezelfde manier is fotoreceptorcel ruimtelijke organisatie essentieel voor het bereiken van optimale optische eigenschappen door het netvlies3. Ruimtelijke controle van de celpositie en oriëntatie is dus van bijzonder belang voor een goede fysiologische functie.
Drosophila is een holometaboleus insect dat een volledige transformatie van zijn larve lichaamsstructuren ondergaat door middel van metamorfose, wat aanleiding geeft tot zijn volwassen weefsels. De Drosophila pop is een uitstekend model voor de niet-invasieve live beeldvorming van een verscheidenheid aan dynamische gebeurtenissen, waaronder ontwikkelingscelmigratie4,celdeling en groeidynamiek5, spiercontractie6, celdood7, wondherstel8en celoriëntatie9. In de volwassen Drosophilavertoont het externe epitheel een hoge mate van orde. Dit wordt gemakkelijk waargenomen op de regelingen van trichomen (d.w.z. celuitsteeksels afkomstig van enkele epitheelcellen) en sensorische haren over het hele lichaamsoppervlak van de vlieg10. Trichomen zijn namelijk uitgelijnd in parallelle rijen die de luchtstroom11begeleiden . De morfogenese van de volwassen epithelia en de geordende opstelling van de individuele cellen begint tijdens embryogenese en culmineert tijdens de popstadia. Terwijl in embryo's celdelingen, intercalaties en vormveranderingen alle afname weefselorde12,13, wordt dit in latere stadia van ontwikkeling, vooral in pupale stadia, wanneer de vlieg rijpheid9nadert .
De immobiele Drosophila pop biedt een ideaal systeem om veranderingen in de celvorm en oriëntatie te evalueren. De pop abdominale opperhuid biedt speciale voordelen. Terwijl de voorlopers van het volwassen hoofd, thorax, genitaliën en aanhangsels groeien en een patroon krijgen van larvestadia, beginnen de histoblasten, die zijn geïntegreerd in de larve opperhuid, te groeien en te differentiëren alleen bij pupariatie14. Deze functie maakt het mogelijk om alle spatiotemporale gebeurtenissen te volgen die betrokken zijn bij de vaststelling van weefselorde in zijn geheel9.
Histoblasten worden gespecificeerd tijdens de embryonale ontwikkeling op contralaterale posities in elk vermoedelijke buiksegment. De rugbuispieroppermis van de volwassene is afgeleid van dorsolateraal gelegen histoblast nesten aanwezig op de voorste en achterste compartimenten15,16. Terwijl histoblasten zich uitbreiden en de larve epitheelcellen (LECs) vervangen, smelten de contralaterale nesten samen op de dorsale middellijn die een samenvloeiend blad17,18,19,20vormt .
Dit werk beschrijft 1) een methodologie voor dissectie, montage, en lange termijn live beeldvorming van de Drosophila pop, en 2) analytische methoden om de dynamiek van cellulaire oriëntatie en groei te bestuderen bij hoge spatiotemporale resolutie. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt, dat alle stappen omvat die nodig zijn vanaf het eerste poppenpreparaat (d.w.z. enscenering en beeldvorming) tot de extractie en kwantificering van directionaliteit en oriëntatiekenmerken. We beschrijven ook hoe lokale weefseleigenschappen kunnen afleiden uit de analyse van celklonen. Alle beschreven stappen zijn minimaal invasief en maken live-analyses op lange termijn mogelijk. De hier beschreven methoden kunnen eenvoudig worden aangepast en toegepast op andere ontwikkelingsstadia, weefsels of modelorganismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol is verdeeld in vijf stappen: (1) het ensceneren van de poppen, (2) het voorbereiden van de poppen voor beeldvorming, (3) live beeldvorming van de groeiende buikelia, (4) generatie van genetische mozaïeken, (5) gegevensverwerking en -analyse (inclusief secties die beschrijven hoe de celoriëntatiedynamiek te analyseren vanuit de contouren van de celverbinding en de groei van de groei van celklonen).
1. Enscenering van Drosophila pop voor beeldvorming
- Kweekvliegen van het juiste genotype op standaardmedium in plastic flacons bij 25 °C gedurende 5 dagen (±12 uur) na het leggen van eieren (AEL).
OPMERKING: Metamorfose begint binnen de opsluiting van de derde sterlarven in het popgeval om 120 uur AEL tot 0 uur na pupariumvorming (APF). Deze overgang is gemakkelijk te identificeren, omdat larven stoppen met voeden en bewegen en het operculaire gebied wordt gevormd (figuur 1A) bij 0-12 h APF. Het puparium is in eerste instantie zacht en wit, maar verhardt en bruint geleidelijk. - Breng witte prepupae (0 h APF) over op een verse plastic flacon met behulp van een bevochtigde kwast. Dieren kunnen bij verschillende temperaturen worden gehouden, afhankelijk van het ontworpen experiment tot de gewenste leeftijd.
OPMERKING: Poppenvorming (d.w.z. verpoppen) treedt op bij 12 uur APF, wanneer het hoofd en de aanhangsels van de volwassen vlieg volledig everted zijn (figuur 1A). Tegen die tijd is het popgeval volledig gescheiden van de pop, waardoor de volledige verwijdering ervan(figuur 1A).
2. Het voorbereiden van poppen voor live beeldvorming
LET OP: Na de enscenering worden de poppen ontleed en gemonteerd zoals hieronder beschreven (zie ook figuur 1).
- Verwijder geënsceneerde poppen van de wand van de flacon met behulp van de tangen.
- Lijm de ventrale kant van elke pop op een glazen schuif bedekt met dubbelzijdige plakband. Tik voorzichtig op de hoofdspracles (d.w.z. operculair gebied) en het dorsale oppervlak van de pop met de uiteinden van de tangen om de hechting van de popgeval aan de tape te verzekeren(figuur 1A,B).
OPMERKING: Het dorsale oppervlak moet het hoofd bieden om de dissectie van de behuizing en het herstel van de pop te vergemakkelijken. - Begin met de dissectie onder een stereomicroscoop door het operculum voorzichtig uit het puparium te verwijderen met de tang(figuur 1C).
- Steek een puntje van de tangen in een ondiepe hoek tussen de popgeval en het popoppervlak door de opercular opening. Scheur de behuizing van kop tot staart zijdelings in een of meer schommels, het vermijden van knijpen de pop (Figuur 1D). Vouw de gebarsten popgeval terug aan de zijkanten terwijl u doorgaat naar het achterste uiteinde(figuur 1E).
LET OP: De pop geval is vrij stijf en scheuren gemakkelijk. In het geval van een hoge luchtvochtigheid of in het bijzonder genotypische achtergronden wordt het popgeval zachter en is scheuren moeilijker. In deze gevallen kan het kraken van het popgeval worden geholpen door de vrije randen met beide uiteinden van de tang te prikken. - Verwijder de pop uit de open pop geval door het voorzichtig invoegen van de tangen onder het dier en voorzichtig omhoog te trekken (Figuur 1F). De pop blijft aan de punt van de tangen plakken(figuur 1G−H).
- Breng de pop met behulp van de tangen naar een schotel met glazen bodem en stort deze bovenop een kleine druppel gasdoorlatende halocarbonolie(figuur 1I). Houd de pop voorzichtig aan de ventrale kant om eventuele weefselschade te voorkomen.
OPMERKING: De druppel halocarbonolie moet klein zijn, met een diameter van ongeveer minder dan de helft van de lengte van de pop. Een dergelijke hoeveelheid is voldoende om de pop door capillariteit aan het glas te hechten en de optica voor olieonderdompelingsdoelstellingen te corrigeren. - Rol een stuk nat tissuepapier aan de randen van de schotel om de luchtvochtigheid te behouden. Bedek de schotel om uitdroging van de poppen tijdens de beeldvorming te voorkomen.
OPMERKING: Zowel vrouwelijke als mannelijke poppen kunnen worden gebruikt voor beeldvorming. We raden aan om de derde buiksegmenten (AIII) in dienst te nemen als referentiebuismetamere, omdat het bij beide geslachten bijna identiek is in termen van grootte, vorm en patronen.
3. Live beeldvorming van groeiende buikepidathelia
OPMERKING: Een omgekeerde laser scanning confocale microscoop uitgerust met een 40x/1.3 NA olie onderdompeling doelstelling werd gebruikt om pop beeld in verschillende ontwikkelingsstadia.
- Oriënteer de pop over de oliedruppel op de glazen bodem schotel volgens het domein en het proces te evalueren (bijvoorbeeld dorsolateraal voor de lange termijn live beeldvorming van de vroege uitbreiding van de rug nesten, of dorsaal om hun late expansie en weefsel remodelleren beeld). Zie figuur 1J, K en figuur 4.
- Breng de glazen bodem schotel met de gemonteerde pop naar de microscoop stadium en focus op het oppervlak van de buikstreek met behulp van het uitgezonden licht.
OPMERKING: Zelfs als dit protocol is geoptimaliseerd voor beeldvorming op omgekeerde microscopen, is het ook mogelijk om beeldvorming uit te voeren op een rechte microscoop. In dat geval wordt het monster op het microscooppodium geplaatst met het oppervlak van de glazen bodem naar boven gericht. De halocarbon olie houdt elke pop op een meniscus. - Stel de acquisitieparameters in: 1) het aantal Z-segmenten ligt meestal tussen 20−40 om een passende tweedimensionale (2D) reconstructie van de buikoppermis mogelijk te maken; 2) stapgrootte tussen elk segment (bijvoorbeeld 1 micron); 3) tijdsinterval voor opname (een interval van 5 minuten is geschikt voor high fidelity-analyses van celoriëntatiedynamiek); en 4) frameresolutie (bijvoorbeeld 1024 x 1024).
- Schakel de juiste lasers (d.w.z. 488 nm en 561 nm in om respectievelijk GFP- en RFP-fluoroforen te visualiseren) en pas de laserkracht en gain/offset-instellingen aan om de gemarkeerde cellen te visualiseren. Gebruik de laagst mogelijke laserkracht (in het bereik 5%−20%) om fotobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren.
- Stel handmatig de positie en de juiste Z-stack limieten voor meerdere poppen in met behulp van de bijgevoegde gemotoriseerde fase en de microscoop multiposition acquisition software.
4. Generatie van genetische mozaïeken om gedrag van celklonen te volgen
OPMERKING: We maken gebruik van mitotische recombinatie om genetische mozaïeken in het buikeptheel te induceren via sitespecifieke recombinatie (FLP/FRT-systeem21,22)(figuur 2).
- Cross virgin vrouwtjes die een warmte schok-inducible Flippase transgene (hs-FLP), een FLP recognition target (FRT) site op een specifieke genomische locatie (bijv. FRT-site op positie 40A aan de L-arm van chromosoom 2), en een herkenbare cellulaire marker (bijvoorbeeld Ubi-RFP.nls of Ubi-GFP.nls) distal naar de FRT-site, aan gemuteerde mannetjes die een FRT-site dragen op de gelijkwaardige genomische locatie (figuur 2A−C).
OPMERKING: Autonome en niet-autonome effecten binnen of buiten klonen voor genverlies van functie kunnen worden bestudeerd met behulp van specifieke recessieve allelen distaal naar de FRT-site. - Genereer FLP/FRT somatische klonen in de histoblasten door warmteschokbehandeling in het derde instar larve stadium van het nageslacht van het kruis. Dit wordt uitgevoerd door de plastic flacons met de dieren in een waterbad van 37 °C gedurende 45 min tot 1 uur onder te dompelen in het zwervende larven (LIII) stadium.
OPMERKING: De gevoelige periode voor mitotische recombinatie is de G2-fase van de celcyclus. Histoblasts worden gearresteerd in G2 tijdens de hele larve ontwikkeling. - Score twee klonen voor afwezigheid (d.w.z. gemuteerde cellen) of verbeterde (d.w.z. wilde type twin-spot cellen) niveaus van de fluorescerende eiwitmarkering vanaf 16 uur APF(figuur 2D).
OPMERKING: Gemiddeld 45 min tot 1 uur bij 37 °C maakt ongeveer 2−3 dubbele klonen per bezienswaardigheid (bijvoorbeeld het buikhemisegment). Poppen met een hoge kloondichtheid (bijvoorbeeld meer dan vier tweelingklonen per hemisegment) moeten worden weggegooid uit verdere kwantitatieve analyses. - Bij kloon identificatie, beeld levende pop in het gewenste stadium en voor de gewenste lengte van de tijd, zoals beschreven in de vorige sectie.
5. Gegevensverwerking en -analyses
LET OP: Gegevens worden verwerkt met ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- Onderscheid celoriëntatie dynamiek van cel knooppunt contouren.
- Projecteer de Z-stack slices die door confocale microscopie in 2D zijn verworven met behulp van de functie Maximale Intensiteitsprojectie (MIP) van ImageJ.
OPMERKING: Het aantal segmenten per stapel moet tot een minimum worden beperkt om te voorkomen dat het geluid dat onscherp wordt gegenereerd door macrofagen die onder de opperhuid patrouilleren. - Stel een vlakke coördinatensysteem in dat betrouwbare weefseloriëntatiepunten (bijvoorbeeld A/P-compartimentgrenzen) identificeert voor analyse van elke gegevensset(figuur 3A).
OPMERKING: Met dezelfde vlakke referenties voor elke gegevensset kunnen meerdere metingen worden vergeleken. - Gebruik de OrientationJ plugin (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) van ImageJ23,24 op lokale celranden om kwalitatieve en kwantitatieve oriëntatiewaarden te verkrijgen. De plugin maakt kleurgecodeerde overlays op invoerafbeeldingen op basis van lokale oriëntaties en biedt numerieke waarden bij gebruik in kwantitatieve modus(figuur 3B−B'' en figuur C−C''').
OPMERKING: De OrientationJ plugin is gebaseerd op structuur tensoren, 2 x 2 matrix van eigenwaarden afgeleid van gradiënt en directionele derivaten (Zie referenties23,24 voor een gedetailleerde beschrijving). - Gebruik de optie OrientationJ Distribution om celrandoriëntaties te kleuren ten opzichte van het setplanaire coördinatensysteem (d.w.z. kaarten voor de oriëntatie van de celrand) (Figuur 3B). De optie Distributie is te vinden onder het plug-in menu in ImageJ. De instellingen in dienst zijn: Gaussian window sigma = 1 pixel; Kubieke spline = verloop; Minimale coherency = 20%; Minimale energie = 1%. De afdrukrichtingen van de celrand worden weergegeven als een afbeelding met kleurcodes die gebruikmaken van de optie Kleuronderzoek van de plug-in (Tint = oriëntatie; Verzadiging = samenhang; en Helderheid = invoerafbeelding).
OPMERKING: Gebieden die achtergrondfluorescentie bevatten, bieden geen richtingsinformatie en moeten handmatig worden uitgesloten van de analyse. Hoge drempelinstellingen verminderen de pixels die in de verwerkte afbeeldingen worden beschouwd. - Gebruik de optie OrientationJ Measure om cellulaire oriëntaties en directionele celceluitlijning te kwantificeren (d.w.z. coherency) (figuur 3C). De optie Meten vindt u onder het plug-in-menu in ImageJ. Genereer kleine aangrenzende niet-overlappende bezienswaardigheden (ROI's) met een uniform gewicht (64 x 64 pixels, ongeveer 20 μm x 20 μm) binnen het gebied dat wordt bezet door de histoblasten(figuur 3C).
- Bereken de dominante lokale oriëntatie (d.w.z. de gemiddelde oriëntatie tussen de door naburige cellen gemiddelde celrandoriëntatiekaart) en de samenhang van de ROI's. De software berekent de overheersende oriëntatie en lokale samenhang binnen elke ROI(figuur 3C).
OPMERKING: De grootste en kleinste eigenwaarden van de structuur tensor geschat door OrientationJ worden gebruikt om de samenhang te berekenen als de verhouding tussen hun verschil en hun som. Coherency wordt begrensd tussen waarden van 0−1. Een waarde van 1 geeft volledige uitlijning uniformiteit aan, terwijl een waarde van 0 isotropische gebieden aangeeft zonder uitlijning. - Analyseer statistisch de berekende oriëntatie- en coherencywaarden van meerdere afbeeldingen met behulp van vrije softwarepakketten zoals PAST25. Axiale gegevens zoals oriëntatiewaarden (in graden) worden op de juiste wijze beschreven door directionele statistieken.
- Bereken via de software de gemiddelde richting en cirkelvariantie voor elke set oriëntatieverdelingen. De statistische significantie van het verschil tussen de verdeling van de oriëntaties tussen verschillende genotypen of omstandigheden wordt bepaald aan de hand van de niet-parametrische Mardia-Watson-Wheeler-test (W-test) voor gelijke verdelingen.
- Bereken de statistische significantie van het verschil in coherency van de niet-parametrische Kolmogorov-Smirnov-test (K-S-test). Gegevens grafisch weergeven naar wens (poolpercelen, staafdiagrammen, vakplots, enz.).
- Projecteer de Z-stack slices die door confocale microscopie in 2D zijn verworven met behulp van de functie Maximale Intensiteitsprojectie (MIP) van ImageJ.
- Groeidynamiek van celklonen
OPMERKING: Met de volgende stappen kunnen geometrische en vormparameters voor cellen uit 2D MIP-afbeeldingen met de kloon(en) van belang worden opgehaald. Voor vergelijkingen tussen meerdere klonen moeten afbeeldingen worden verkregen met dezelfde instellingen.- Segmenteer kloongebieden door hun contouren te tekenen met het gereedschap AfbeeldingJ-selectie uit vrije hand.
- Bereken geometrische en vormparameters met behulp van het gereedschap Metingen instellen van ImageJ onder het menu Analyseren. Activeer de opties Area, Perimeter, Fit Ellipseen Shape Descriptor.
OPMERKING: Hiermee kunnen diverse geometrische parameters worden opgehaald, waaronder het gebied (som van de pixels binnen de kloon), de omtrek (som van de pixel van de kloonrand), de beeldverhouding (AR, de verhouding tussen de grote en kleine assen van de best-fit Legendre-ellips die in de kloonrand is ingeschreven) en de oriëntatiehoek (d.w.z. de hoek van de belangrijkste as van de kloon ten opzichte van de voorste grens). - Als u niet-dimensionale verhoudingen uit deze metingen berekent, worden de vormparameters opgehaald. Deze omvatten rondheid (4 x [gebied]/π x [belangrijke as]2), ruwheid (stevigheid - gebied/bollig gebied) en circulariteit (4π x [gebied]/[perimeter]2).
OPMERKING: Elk van de vormparameters vertegenwoordigt de mate van afwijking van de klonen van ideale vormen zoals een cirkel of een begrensde bolle romp, en ze zijn allemaal begrensd tussen waarden van 0 en 1. Waarden gelijk aan 1 geven maximale symmetrie aan (d.w.z. minimale complexiteit). - Analyseer geometrische en vormparameters statistisch tussen verschillende genotypen of omstandigheden met Microsoft Excel en/of PAST. Statistische significantie van het verschil wordt bepaald aan de hand van een onbetaalde tweezijdige student t-test voor gelijk gemiddelde of de niet-parametrische Kolmogorov-Smirnov K-S-test voor gelijke verdelingen tussen de omstandigheden. Gegevens kunnen naar wens grafisch worden weergegeven (bijvoorbeeld staafdiagrammen, vakplots, enz.). Zie figuur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hierboven beschreven protocol heeft betrekking op de bereiding van Drosophila-poppen voor langdurige live beeldvorming en de procedures voor de analyse van celoriëntatie en groeidynamiek van de buikopperken. Door het toepassen van deze methode is het mogelijk om hoge resolutie films van de zich ontwikkelende poppen te genereren voor perioden van maximaal 48 uur zonder significante fotobleaching of fototoxiciteit. Snapshots met de buikopperhuid (bijvoorbeeld histoblasten en LECs) op verschillende tijdstippen en van poppen gericht onder verschillende hoeken worden weergegeven in figuur 4. De daaropvolgende analyse van deze films maakt identificatie en kwantificering van de dynamiek van lokale en mondiale veranderingen in de belangrijkste geometrische en vormparameters gemoduleerd tijdens de uitbreiding van histoblasten en de vervanging van LED's. Deze analyses kunnen worden uitgevoerd in verschillende scenario's en specifieke mutantenachtergronden. Ze kunnen ook worden gebruikt voor klonen waarin genexpressie wordt gewijzigd, wat leidt tot autonoom verlies of winst van functieomstandigheden. Dit zou het mogelijk maken om niet-autonome reacties in omliggende cellen te verkennen, waardoor de identificatie van cross talk- of celcommunicatiemechanismen(figuur 5)wordt vergemakkelijkt. Deze aanpak is onlangs toegepast bij de identificatie van de Fat/Dachsous/Four jointed pathway als een belangrijk element dat de uitlijning van cellen stuurt en oriënteert tijdens de invoering van het vlakke polaire patroon van de buikopperhuid van de volwassene9.
Figuur 1: Ontleden en monteren van poppen voor live beeldvorming. (A) Van links naar rechts: dorsale weergave van een prepupa bij 0 h APF (links) en van een pop bij 14 uur APF voor (midden) en na (rechts) het verwijderen van het ondoorzichtige popgeval. Het operculaire gebied wordt aangegeven (witte pijlpunten). (B) De essentiële toolkit voor dissectie wordt getoond. Van links naar rechts: glazen schuif, dubbelzijdige plakband, een tang en een schotel met glazen bodem. (C) Geënsceneerde poppen zijn geïmmobiliseerd op dubbelzijdige plakband op glazen platen dorsale kant omhoog. Het popgeval van elke pop wordt geopend vanuit het operculaire gebied met chirurgische tangen. (D−E) Het schillen van het popgeval verloopt geleidelijk. Het geval is gescheurd en gevouwen aan de pupal kanten van het hoofd aan de buik. (F−H) De pop wordt voorzichtig van de ventrale kant met de uiteinden van de tang(G)getild en overgebracht naar een schotel met glazen bodem over een minimale druppel halocarbonolie. (I) De pop is dan op de juiste manier georiënteerd (dorsolateraal, boven; dorsaal, onder). Meerdere poppen kunnen tegelijkertijd worden gemonteerd door de stappen in panelen C−Ite herhalen. (J) Afbeelding met de omtrek van de cellen van het dorsale histoblastnest van het AIII-segment dat de junctional marker Atpα::GFP uitdrukt. De pop was dorsolateraal georiënteerd en afgebeeld op 14 h APF. Schaalbalk = 22 μm. (K) Afbeelding gelijk aan (J), maar vanuit een dorsale oogpunt. De dynamiek van weefselontwikkeling kan gedurende enkele uren worden gevisualiseerd. Zie ook figuur 4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Generatie van genetische mozaïeken via FLP/FRT-systeem. (A) Een ouderlijke heterozygootcel (pale magenta) draagt een recessief mutantallel (gestippelde rechthoek) op een chromosoomarm en een gen dat codeert voor een fluorescerende marker (magenta) in de andere chromosoomarm [de linkerarm van het chromosoom 2 (2L) in dit voorbeeld]. FRT-sites (oranje rechthoeken) zijn ontworpen in beide armen op dezelfde chromosomale posities proximale aan de centromere (grijze ovalen). (B) De activering van FLP recombinase door hitteschok in cellen onderbroken in G2 leidt tot de recombinatie tussen de FRT's van zusterchromatids 1-1' en 2-2". Als gevolg hiervan wordt de regio distal naar de FRT sites (FRT40A op 2L) uitgewisseld. Op het rechterpaneel wordt een vergrote weergave weergegeven. (C) Bij de polaire segregatie van de herschikte gebieden (1-1' en 2-2') tijdens mitose worden twee genetisch verschillende zustercellen gegenereerd. Een dochter is homozygoot voor het recessieve allel en voor het gehele chromosoomarm distaal naar de plaats van recombinatie. Deze cel mist het gen dat codeert voor de fluorescerende marker, negatief gemarkeerd in het wit. De andere dochter cel zal homozygoot voor het wilde type arm, waardoor aanleiding tot een twin-spot en het uitdrukken van twee kopieën van de genen coderen voor de fluorescerende marker (donkere magenta). Voor de eenvoud worden niet de scheiding van herschikte gebieden naar tegenovergestelde polen van de mitotische cel (d.w.z. 1−2 en 1'−2') getoond. Deze geven aanleiding tot cellen fenotypically niet te onderscheiden van de ouderlijke cel (heterozygootachtige achtergrond, bleke magenta). (D) Afbeelding met klonen in het A-compartiment gegenereerd via FLP/FRT-somatische recombinatie in het derde instarlarven stadium en gevisualiseerd bij 26 uur APF. Klonen van cellen worden gekenmerkt door de afwezigheid van RFP.nls (zwart) en homozygootlijke expressie van RFP.nls (heldere magenta, twee plekken) in een verder heterozygoot RFP.nls achtergrond (dim magenta). Gelijkwaardige gebeurtenissen kunnen worden bereikt voor FRT-sites op andere chromosomale locaties (2R, 3L, 3R en X). Zie ook figuur 5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Illustratie van celoriëntatiemetingen. Om informatie over celoriëntasaties te extraheren, wordt eerst een vlakke coördinatensysteem ingesteld om celoriëntatie met weefselas te relateren (A). Ten tweede worden celoriëntaaties geëxtraheerd uit celcontouren(B). Ten slotte worden celoriëntaaties en uitlijningen met de weefselas gekwantificeerd(C). (A) Aan de linkerkant, een diagram van een zijdelingse weergave van een pop georiënteerd volgens de vlakke coördinatensysteem. De rode vaste en de cyaan stippellijnen definiëren het Cartesiaanse vlak dat respectievelijk de anteroposterior (A/P) grens en de dorsale middellijn vertegenwoordigt. In het midden, een omgekeerde afbeelding met een dorsolaterale weergave van de uitdijende histoblasten op 26 uur APF geschetst door de junctional marker Atpα::GFP (input afbeelding). De positie van de A/P-grens wordt gemarkeerd met een rode lijn. Aan de rechterkant, een axiaal kompas met de kleurcode toegepast om celrand oriëntaties (veelhoeken) of gemiddeld cel oriëntaties (bars) te beschrijven. (B) Weergave van het menu Plugins/OrientationJ en het oriëntatievenster. OrientationJ (B)) Weergave van het oriëntatievenster van de distributie met de instellingen van de parameters die worden gebruikt om de oriëntatiekaart voor de celrand aan de rechterkant te verkrijgen. (B"") Illustratie van de kleurgecodeerde celcontouren op geïdealiseerde cellen. Een cirkel geeft geen voorkeurskleur weer. (C) Weergave van het venster OriëntatieJ-maat. C. Sequentiële schermafbeeldingen van het venster OrientationJ-maat laten zien hoe u lokale oriëntatie en samenhang meten in opeenvolgende ROI's met een uniform gewicht. De lokale oriëntatiehoek en coherency voor elke regio worden weergegeven als ellipsoïden. C')) Weergave van de uiteindelijke resultaten van de oriëntatiemeting. Ellipsoïden geven visueel de oriëntatie weer (d.w.z. de hoek van de langste aellipsas ten opzichte van de A/P-grens) en de samenhang (d.w.z. de verhouding tussen de langste en de kortere as van de ellipsoïde). De numerieke waarden van beide parameters worden opgeslagen in een spreadsheet voor verdere analyses. (C'')) Illustratie van de kleurgecodeerde celcontouren en de gemiddelde celoriëntatie (balken) op geïdealiseerde cellen. Een cirkel geeft geen voorkeursoriëntatie weer. (C''')) Weergave van de gewenste lokale oriëntatie van elke ROI (lokaal gemiddelde oriëntatiekaart). De kleuren markeren de oriëntatie van elke regio. Voorste is aan de linkerkant. Schaalbalk = 22 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Lange termijn live beeldvorming van groeiende abdominale epithelia. (A) Representatieve snapshots van lange termijn imaging films uit de vroege tot late fasen van histoblast expansie. Top: Schematische weergaven van een pop gericht op dorsolaterale beeldvorming bij 16 uur en 26 uur APF. Het gebied bezet door de nesten zichtbaar vanaf de dorsolaterale kant van de pop is gemarkeerd in donkergrijs op 16 en 26 h APF. Onder: afbeeldingen met celcontouren van zowel histoblasten als LECs met het alomtegenwoordige expressie van de junctional marker Atpα::GFP. De A/P-grens ligt tussen de twee gemarkeerde compartimenten (Nepgekleurde cellen in blauw = voorste compartiment; groen = achterste compartimenten). (B)Representatieve momentopnamen van lange termijn beeldvormingsfilms van vroege tot late fasen van nesten samenvloeiing. Top: Schematische weergave van een pop gericht op dorsale beeldvorming bij 32 uur en 48 h APF. Onder: Celcontouren (gelabeld en gekleurd als in A). Houd er rekening mee dat de Atpα::GFP-markering de vorm van individuele epitheelcellen na verloop van tijd met hoge resolutie afbakent. Schaalbalk = 22 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Weefseleigenschappen uit kloonanalyse. (A) Voorbeelden van wilde type klonen in het A-compartiment gekenmerkt door de afwezigheid van RFP.nls (zwart) en hun dubbele vlekken (heldere magenta) op 26 uur APF. De klonen verlengen langs de segmentale grenzen. De tweelingklonen schikken in parallel of in tandem. Schaalbalk = 22 μm. (B) Top: Afbeeldingen ter illustratie van de parameters gekwantificeerd uit de kloon contouren. Onder: Overzichtstabel met de gemiddelde waarden voor de aangegeven parameters voor wilde dieren (n = 29). (C) Morfologie van een wild type kloon op 26 uur (links) en 47 h (rechts) APF. De kloon toont complexe randmorfologie in beide stadia. (D) Box- en snorharenpercelen voor geometrische parameters bij 26 uur (lichtgeel) en 47 h APF (donkergeel). Het gemiddelde gebied en de omtrek nemen aanzienlijk toe in dit tijdvenster. (E) Polaire percelen die de oriëntatie van de klonen vertegenwoordigen (bakgrootte 18°, overvloed evenredig aan het gebied). Oriëntatie wordt gehandhaafd tijdens uitbreiding en verbouwing. (F) Box- en snorharenpercelen voor vormparameters bij 26 uur (lichtgeel) en 47 h APF (donkergeel). Ruwheid (stevigheid), rondheid en circulariteit veranderen nauwelijks. De mediaanwaarden worden weergegeven met een rode horizontale lijn en snorharen reiken tot de minimum- en maximumwaarden van de verdeling. Statistieken werden uitgevoerd met K-SM-tests of W-tests (p < 0,0001****, p > 0,05 niet significant). Voorste is aan de linkerkant, dorsale is omhoog. Schaalbalk = 16 μm. Genotype is hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De orde van de lange afstand is een essentieel kenmerk van de meeste functionele fysiologische eenheden. Tijdens morfogenese wordt de orde bereikt door de integratie van complexe instructies die met hoge temporele en ruimtelijke precisie worden uitgevoerd. Meerdere en multilevel beperkingen zijn geïntegreerd in gestereotypeerde weefsel regelingen.
Polariteit en directionaliteit zijn cruciaal voor de geordende ruimtelijke ordening tijdens de ontwikkeling. Polariteit impliceert symmetrie breken tijdens de ontwikkeling. Het bereiken van asymmetrie is noodzakelijk voor de bepaling van de embryonale anteroposterior (A/P) en dorsoventrale (D/V) assen en volwassen organisatie26. Naast deze vroege rol zijn lokale asymmetrieën essentieel voor morfologische diversiteit op alle niveaus. Directionaliteit is een essentiële aanvulling op asymmetrie en polariteit tijdens morfogenese. Globale orde wordt geïmplementeerd door het vermogen van cellen om signalen lokaal te voelen en te verzenden op een cel-naar-cel basis met een nauwkeurig gevoel of oriëntatie. De asymmetrieën van de enige cellen harmoniseren coöperatief in tijd door posities of bewegingen binnen bepaalde richtingen in ruimte te oriënteren. Celcommunicatie impliceert geheime factoren, celcelcontacten en mechanische ingangen. Signalen werken op cellenvelden die eerst lokaal en vervolgens wereldwijd hun gedrag wijzigen27.
Dit werk biedt een eenvoudige manier om het gecoördineerde gedrag van individuele cellen te analyseren, inclusief hun vlakke oriëntatie en groeiparameters tijdens de ontwikkeling van weefselvolgorde. De morfogenese van de volwassen buik van Drosophila tijdens verpopping presenteert een reeks technische voordelen ten opzichte van andere gelijkwaardige modellen zoals kiembandextensie/ intrekking28 of dorsale sluiting29 tijdens vliegembryogenese, Drosophila vleugelmorfogenese ex vivo30, ventrale behuizing in Caenorhabditis elegans31, of palatale fusie bij muizen32, o.a.
Ten eerste vormt buikmorfogenese een proces dat in zijn geheel in vivo kan worden gevolgd. Continue live beeldvorming van de vervanging van de LECs door de histoblasten kan worden uitgevoerd vanaf 12 uur APF, wanneer de pop wordt gevormd, tot de voltooiing van volwassen epitheelorfogenese. Ten tweede, het maakt het mogelijk de analyses van een volledige set van celgedrag, zoals celmigratie, verdeling, vormveranderingen, delaminatie, en intercalatie. Ten slotte is het vatbaar voor genetische interferentie en kloonanalyse. Autonome en niet-autonome effecten van verlies en winst van functieactiviteiten kunnen live worden gevolgd door gebruik te maken van geschikte markers. Echter, de pop als een model systeem presenteert een aantal kleine beperkingen. Door zijn eivormige vorm is het niet mogelijk om gelijktijdige live beeldvorming uit te voeren van laterale en dorsale gebeurtenissen met hoge resolutie. Dit probleem kan worden opgelost door het uitvoeren van sequentiële beeldvorming in dorsolateraal en dorsaal georiënteerde poppen of beter, door gebruik te maken van meerdere hoeken licht blad selectieve vlakverlichting microscopie (SPIM) microscopie. Een ander nadeel is de aanwezigheid van twee verschillende celpopulaties van verschillende grootte in de analyses (d.w.z. polyploïde LECs en diploïde histoblasten). Dit kan beeldsegmentatie complex maken en de twee celpopulaties moeten afzonderlijk worden geanalyseerd.
In de toekomst kan de langetermijnbeeldvorming van Drosophila-poppen gemakkelijk worden aangepast om een volledig scala aan morfogenetische verschijnselen te bestuderen, waaronder de coördinatie van epidermale, gespierde en neurale ontwikkeling tijdens metamorfose bij wilde type- en mutantaandoeningen. Bovendien kunnen de algoritmen en plugins in gebruik worden gebruikt om de organisatie, patronen en dynamiek van vele andere weefsels te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij willen de leden van het laboratorium Martín-Blanco bedanken voor nuttige discussies. We danken ook Nic Tapon (The Crick Institute, Londen, UK), het Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) en FlyBase (voor Drosophila gen annotatie). Federica Mangione werd ondersteund door een JAE-CSIC predoctorale fellowship. Het Laboratorium Martín-Blanco werd gefinancierd uit het Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P en BFU2017-82876-P) en van de Fundación Ramón Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, Suppl . 41-60 (1988).
