Summary
Dieses Protokoll ist für die Bildgebung und Analyse der Dynamik der Zellorientierung und des Gewebewachstums in der Drosophila-Bauchepithelie konzipiert, während die Fruchtfliege einer Metamorphose unterzogen wird. Die hier beschriebene Methodik kann auf die Untersuchung verschiedener Entwicklungsstadien, Gewebe und subzellulärer Strukturen in Drosophila oder anderen Modellorganismen angewendet werden.
Abstract
Innerhalb mehrzelliger Organismen weisen reife Gewebe und Organe hohe Ordnungsgrade in den räumlichen Anordnungen ihrer Konstituentenzellen auf. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die sensorische Epithelie, bei der Zellen der gleichen oder unterschiedlichen Identitäten über die Zell-Zell-Adhäsion zusammengeführt werden, die hochorganisierte planare Muster zeigt. Zellen richten sich in der gleichen Richtung aneinander aus und zeigen über große Entfernungen eine äquivalente Polarität an. Diese Organisation der reifen Epithelie wird im Laufe der Morphogenese etabliert. Um zu verstehen, wie die planare Anordnung der reifen Epithelie erreicht wird, ist es entscheidend, die Zellorientierung und Wachstumsdynamik mit hoher raumzeitlicher Genauigkeit während der Entwicklung in vivo zu verfolgen. Robuste Analysetools sind auch unerlässlich, um lokale zu globale Übergänge zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Drosophila-Pupa ist ein ideales System zur Bewertung orientierter Zellformveränderungen, die der epitheliaalen Morphogenese zugrunde liegen. Das pupal entwickelnde Epithel bildet die äußere Oberfläche des unbeweglichen Körpers und ermöglicht eine langfristige Bildgebung intakter Tiere. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Zellverhalten sowohl auf globaler als auch auf lokaler Ebene in der pupalen Abdominalepidermis zu abbilden und zu analysieren, während es wächst. Die beschriebene Methodik kann leicht an die Abbildung von Zellverhalten in anderen Entwicklungsstadien, Geweben, subzellulären Strukturen oder Modellorganismen angepasst werden.
Introduction
Um ihre Rolle zu erfüllen, verlassen sich Epithelgewebe voll und ganz auf die räumliche Organisation ihrer zellulären Komponenten. In den meisten Epithelien werden Zellen nicht nur gegeneinander gepackt, um eine präzise Kopfsteinpflasterschicht zu schaffen, sondern sie orientieren sich relativ zu den Körperachsen.
Die funktionelle Bedeutung einer präzisen Gewebeorganisation wird bei sensorischen Epithelien wie dem Wirbeltier-Innenohr und der Netzhaut deutlich. Im ersten Fall richten sich Haar- und Stützzellen in eine bestimmte axiale Richtung aus, um mechanische Eingänge wie Schall und Bewegung1,2effizient zu erkennen. In ähnlicher Weise ist die räumliche Organisation der Photorezeptorzellen unerlässlich, um optimale optische Eigenschaften durch die Netzhaut zu erreichen3. Die räumliche Kontrolle der Zellposition und -orientierung ist daher von besonderer Bedeutung für die richtige physiologische Funktion.
Drosophila ist ein holometabolous Insekt, das eine vollständige Transformation seiner Larvenkörperstrukturen durch Metamorphose durchläuft, was zu seinem erwachsenen Gewebe führt. Die Drosophila Pupa ist ein ausgezeichnetes Modell für die nichtinvasive Live-Bildgebung einer Vielzahl von dynamischen Ereignissen, einschließlich Entwicklungszellmigration4, Zellteilung und Wachstumsdynamik5, Muskelkontraktion6, Zelltod7, Wundreparatur8und Zellorientierung9. Bei der erwachsenen Drosophilaweist das äußere Epithel einen hohen Ordnungsgrad auf. Dies ist leicht an der Anordnung von Trichomen (d.h. Zellvorsprüngen, die aus einzelnen Epithelzellen stammen) und sensorischen Borsten auf der gesamten Körperoberfläche der Fliege10zu beobachten. Tatsächlich sind Trichome in parallelen Reihen ausgerichtet, die den Luftstrom11leiten. Die Morphogenese der adulten Epithelie und die geordnete Anordnung der einzelnen Zellen beginnt während der Embryogenese und kulminiert in pupalen Stadien. Während in Embryonen Zellteilungen, Intercalationen und Formänderungen alle verringern Gewebeordnung12,13, wird dies in späteren Stadien der Entwicklung, vor allem in Pupal-Stadien, wenn die Fliege nähert Reife9.
Die immobile Drosophila pupa bietet ein ideales System zur Bewertung von Zellform- und Orientierungsänderungen. Die pupalabdominale Epidermis bietet besondere Vorteile. Während die Vorläufer des erwachsenen Kopfes, Thorax, Genitalien und Anhängsel wachsen und aus Larvenstadien gemustert werden, beginnen die Histoblasten, die in die Larvenepidermis integriert sind, erst bei der Verpuptaration zu wachsen und zu differenzieren14. Diese Funktion ermöglicht die Verfolgung aller räumlich-zeitlichen Ereignisse, die an der Etablierung der Gewebeordnung in ihrer Gesamtheit beteiligt sind9.
Histoblasten werden während der embryonalen Entwicklung an kontralateralen Positionen in jedem mutmaßlichen Bauchsegment spezifiziert. Die dorsale Abdominalepidermis des Erwachsenen leitet sich von dorsolater lokalisierten Histoblastnestern ab, die an den vorderen und hinteren Fächern15,16vorhanden sind. Wenn sich Histoblasten ausdehnen und die Larvenepithelzellen (LECs) ersetzen, verschmelzen die kontralateralen Nester an der dorsalen Mittellinie und bilden ein Konfluentblatt17,18,19,20.
Diese Arbeit beschreibt 1) eine Methodik zur Zerlegung, Montage und langfristigen Live-Bildgebung der Drosophila-Pupae und 2) Analysemethoden, um die Dynamik der zellulären Orientierung und des Wachstums bei hoher raumzeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Verfügung gestellt, das alle erforderlichen Schritte von der ersten Pupae-Vorbereitung (d.h. Inszenierung und Bildgebung) bis hin zur Extraktion und Quantifizierung von Richtungs- und Orientierungsmerkmalen abdeckt. Wir beschreiben auch, wie lokale Gewebeeigenschaften aus der Analyse von Zellklonen ableiten. Alle beschriebenen Schritte sind minimalinvasiv und ermöglichen langfristige Live-Analysen. Die hier beschriebenen Methoden können leicht angepasst und auf andere Entwicklungsstadien, Gewebe oder Modellorganismen angewendet werden.
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Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll ist in fünf Schritte unterteilt: (1) Inszenierung der Welpen, (2) Vorbereitung der Pupae für die Bildgebung, (3) Live-Bildgebung der wachsenden Bauchepithelie, (4) Generierung genetischer Mosaike, (5) Datenverarbeitung und -analyse (einschließlich Abschnitten, die beschreiben, wie die Zellorientierungsdynamik anhand von Zellknotenumrissen und Wachstumsdynamik enthoben wird).
1. Inszenierung von Drosophila-Welpen vor der Bildgebung
- Kulturfliegen des entsprechenden Genotyps auf Standardmedium in Kunststofffläschchen bei 25 °C für 5 Tage (ca. 12 h) nach Dereiablage (AEL).
HINWEIS: Die Metamorphose beginnt innerhalb der Einschließung der Drittsternlarven in den Pupal-Fall bei 120 h AEL bis 0 h nach Pupariumbildung (APF). Dieser Übergang ist leicht zu erkennen, da Larven die Fütterung und Bewegung stoppen und die Operkuläre Region gebildet wird (Abbildung 1A) bei 0-12 h APF. Das Puparium ist zunächst weich und weiß, härtet aber nach und nach aus und bräunt. - Weiße Prepupae (0 h APF) mit einem feuchten Pinsel in eine frische Kunststoffflasche geben. Tiere können je nach versuchsweise bis zum gewünschten Alter bei unterschiedlichen Temperaturen gehalten werden.
HINWEIS: Die Pupabildung (d. h. Die Verpupation) tritt bei 12 h APF auf, wenn der Kopf und die Anhängsel der erwachsenen Fliege vollständig verfeinert sind (Abbildung 1A). Zu diesem Zeitpunkt ist der Pupal-Fall vollständig von der Pupa getrennt, so dass seine vollständige Entfernung (Abbildung 1A).
2. Vorbereitung von Pupae für Live-Bildgebung
HINWEIS: Nach der Inszenierung werden die Pupae wie unten beschrieben seziert und montiert (siehe auch Abbildung 1).
- Mit Hilfe der Zange die inszenierten Pupae von der Wand der Durchstechflasche entfernen.
- Kleben Sie die ventrale Seite jeder Pupa auf einem Glasschlitten, der mit doppelseitigem Klebeband bedeckt ist. Tippen Sie vorsichtig auf die Kopfspiracles (d.h. operkuläre Region) und die dorsale Oberfläche der Pupa mit den Spitzen der Zange, um die Haftung des Pupalgehäuses auf dem Band zu gewährleisten (Abbildung 1A,B).
HINWEIS: Die dorsale Oberfläche sollte nach oben treten, um die Zerlegung des Gehäuses und die Wiederherstellung der Pupa zu erleichtern. - Beginnen Sie die Zerlegung unter einem Stereomikroskop, indem Sie das Operculum vorsichtig mit den Zangen aus dem Puparium entfernen (Abbildung 1C).
- Legen Sie eine Spitze der Zange in einem flachen Winkel zwischen dem Pupalgehäuse und der Pupa-Oberfläche durch die Operkuläre Öffnung ein. Reißen Sie das Gehäuse seitlich von Kopf zu Schwanz in einer oder mehreren Schaukeln, um zu vermeiden, die Pupa zu kneifen (Abbildung 1D). Falten Sie das rissige Pupal-Gehäuse an den Seiten zurück, während Sie weiter zum hinteren Ende(Abbildung 1E) gehen.
HINWEIS: Das Pupal-Gehäuse ist ziemlich steif und knackt leicht. Bei hoher Luftfeuchtigkeit oder insbesondere genotypischen Hintergründen wird der Pupal-Fall weicher und das Reißen schwieriger. In diesen Fällen kann das Knacken des Pupal-Gehäuses durch Stechen seiner freien Kanten mit beiden Spitzen der Zange unterstützt werden. - Entfernen Sie die Pupilpe aus dem geöffneten Pupal-Gehäuse, indem Sie die Zange vorsichtig unter das Tier einsetzen und vorsichtig nach oben ziehen (Abbildung 1F). Der Pupa klebt an der Spitze der Zange (Abbildung 1G-H).
- Übertragen Sie die Pupa mit Hilfe der Zange auf eine Glasbodenschale und legen Sie sie auf einen kleinen Tropfen gasdurchlässigem Halocarbonöl ab (Abbildung 1I). Halten Sie die Pupa vorsichtig an der ventralen Seite, um mögliche Gewebeschäden zu vermeiden.
HINWEIS: Der Tropfen Halocarbonöl muss klein sein, mit einem Durchmesser von etwa weniger als der Hälfte der Länge der Pupa. Eine solche Menge reicht aus, um die Pupilbe durch Kapillarität am Glas zu befestigen und die Optik für Öl-Tauchziele zu korrigieren. - Rollen Sie ein Stück nasses Gewebepapier an den Rändern der Schale, um die Feuchtigkeit zu erhalten. Bedecken Sie die Schale, um eine Austrocknung der Pupae während der Bildgebung zu vermeiden.
HINWEIS: Sowohl weibliche als auch männliche Pupas können für die Bildgebung verwendet werden. Wir empfehlen, die dritten Bauchsegmente (AIII) als Referenz-Bauchmetamere zu verwenden, da sie in Größe, Form und Musterung in beiden Geschlechtern nahezu identisch ist.
3. Live-Bildgebung von wachsenden Bauchepithelien
HINWEIS: Ein invertiertes konfokales Laserscanning-Mikroskop, das mit einem 40x/1,3 NA-Öl-Tauchobjektiv ausgestattet ist, wurde verwendet, um Pupae in verschiedenen Entwicklungsstadien abzubilden.
- Richten Sie die Pupa über den Öltropfen auf der Glasbodenschale entsprechend der Domäne und dem zu bewertenden Prozess aus (z.B. dorsolateral für die langfristige Live-Bildgebung der frühen Ausdehnung der Dorsalnester oder dorsal, um ihre späte Ausdehnung und Gewebeumgestaltung abzubilden). Siehe Abbildung 1J,K und Abbildung 4.
- Übertragen Sie die Glasbodenschale mit den montierten Welpen auf die Mikroskopstufe und konzentrieren Sie sich mit dem übertragenen Licht auf die Oberfläche des Bauchbereichs.
HINWEIS: Auch wenn dieses Protokoll für die Bildgebung an invertierten Mikroskopen optimiert ist, ist es auch möglich, die Bildgebung auf einem aufrechten Mikroskop durchzuführen. In diesem Fall wird die Probe auf der Mikroskopbühne platziert, wobei die Glasbodenfläche nach oben gerichtet ist. Das Halocarbonöl hält jede Pupa an einem Meniskus. - Stellen Sie die Erfassungsparameter ein: 1) die Anzahl der Z-Scheiben liegt in der Regel zwischen 20 und 40, um eine entsprechende zweidimensionale (2D) Rekonstruktion der Abdominalepidermis zu ermöglichen; 2) Schrittgröße zwischen jeder Scheibe (z. B. 1 Mikrometer); 3) Zeitintervall für die Aufzeichnung (ein 5-min-Intervall eignet sich für Hochtreueanalysen der Zellorientierungsdynamik); und 4) Rahmenauflösung (z. B. 1024 x 1024).
- Schalten Sie die entsprechenden Laser ein (d. h. 488 nm und 561 nm, um GFP- bzw. RFP-Fluorophore zu visualisieren) und passen Sie die Laserleistung und die Gain/Offset-Einstellungen an, um die markierten Zellen zu visualisieren. Verwenden Sie die geringstmögliche Laserleistung (im Bereich von 5 % bis 20 %) photobleaching und phototoxicity.
- Mit der angeschlossenen motorisierten Stufe und der Mikroskop-Multipositionserfassungssoftware können Sie die Position und die entsprechenden Z-Stack-Grenzwerte für mehrere Welpen manuell festlegen.
4. Generierung genetischer Mosaike zum Folgen des Verhaltens von Zellklonen
HINWEIS: Wir verwenden eine mitotische Rekombination, um genetische Mosaike im Bauchepithel über eine standortspezifische Rekombination (FLP/FRT-System21,22) zu induzieren (Abbildung 2).
- Querfräuzierliche Weibchen, die ein Hitzeschock-induzierbares Flippase-Transgen (hs-FLP), ein FLP-Erkennungsziel (FRT) an einem bestimmten genomischen Standort (z. B. FRT-Standort an Position 40A am L-Arm des Chromosoms 2) und ein erkennbarer zellulärer Marker (z.B. Ubi-RFP.nls oder Ubi-GFP.nls) distal zur FRT-Stelle, mutierte Männchen, die eine FRT-Stelle am äquivalenten genomischen Standort tragen (Abbildung 2A-C).
HINWEIS: Autonome und nichtautonome Effekte innerhalb oder außerhalb von Klonen für einen genverlust der Funktion könnten unter Verwendung spezifischer rezessiver Allele untersucht werden, die für die FRT-Site distal sind. - Generieren Sie FLP/FRT-Somatische Klone in den Histoblasten durch Hitzeschockbehandlung im dritten Instar-Larvenstadium der Nachkommenschaft des Kreuzes. Dies geschieht durch Untertauchen der Kunststofffläschchen mit den Tieren in einem Wasserbad bei 37 °C für 45 min bis 1 h in der Wanderlarven (LIII) Stufe.
HINWEIS: Der empfindliche Zeitraum für die mitotische Rekombination ist die G2-Phase des Zellzyklus. Histoblasten werden in G2 während der gesamten Larvenentwicklung verhaftet. - Punkte Sie Zwillingsklone für Abwesenheit (d. h. mutierte Zellen) oder verbesserte (d. h. wildtypige Zwillingsfleckenzellen) des fluoreszierenden Proteinmarkers ab 16 h APF ab (Abbildung 2D).
HINWEIS: Im Durchschnitt machen 45 min bis 1 h bei 37 °C nur etwa 2 x 3 Zwillingsklone pro Interessengebiet (z. B. das Bauchhemisegment). Pupae mit einer zu hohen Klondichte (z. B. mehr als vier Zwillingsklone pro Hemisegment) sollten aus weiteren quantitativen Analysen verworfen werden. - Bei der Klonidentifikation, Bild lebende Welpen in der gewünschten Phase und für die gewünschte Zeit, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.
5. Datenverarbeitung und -analysen
HINWEIS: Die Daten werden mit ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) verarbeitet.
- Unterscheiden Sie die Zellausrichtungsdynamik von den Umrissen der Zellverknüpfung.
- Projizieren Sie die Z-Stack-Slices, die durch konfokale Mikroskopie in 2D erworben wurden, mit der Funktion Maximale Intensitätsprojektion (Maximum Intensity Projection, MIP) von ImageJ.
HINWEIS: Die Anzahl der Slices pro Stapel sollte auf ein Minimum beschränkt werden, um zu vermeiden, dass Makrophagen unter der Epidermis patrouillieren. - Legen Sie ein planares Koordinatensystem fest, das zuverlässige Gewebemarkierungen (z. B. A/P-Fachgrenzen) für die Analyse jedes Datasets identifiziert (Abbildung 3A).
HINWEIS: Die Verwendung der gleichen planaren Referenzen für jeden Datensatz ermöglicht den Vergleich mehrerer Messungen. - Verwenden Sie das OrientationJ-Plugin (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) von ImageJ23,24 auf lokalen Zellkanten, um qualitative und quantitative Orientierungswerte zu erhalten. Das Plugin rendert farbcodierte Overlays auf Eingabebildern basierend auf lokalen Ausrichtungen und stellt numerische Werte bereit, wenn es im quantitativen Modus verwendet wird (Abbildung 3B'B'' und Abbildung C'C'''').
HINWEIS: Das OrientationJ-Plugin basiert auf Struktur-Tensoren, 2 x 2-Matrix von Eigenwerten, die aus Gradienten- und Richtungsderivaten abgeleitet sind (siehe Referenzen23,24 für eine detaillierte Beschreibung). - Verwenden Sie die Option OrientationJ-Verteilung, um Zellenkantenausrichtungen relativ zum planaren Koordinatensystem (d. h. Zellkantenausrichtungskarten)(Abbildung 3B) zu kodieren. Die Distributionsoption befindet sich unter dem Plugin-Menü in ImageJ. Die Einstellungen sind: Gaußsche Fenster sigma = 1 Pixel; Kubischer Spline = Gradient; Mindestkoscherität = 20%; Minimale Energie = 1%. Zellenkantenausrichtungen werden als farbcodiertes Bild mit der Option Farbvermessung des Plugins (Hue = Ausrichtung; Sättigung = Koscherität; und Helligkeit = Eingabebild).
HINWEIS: Bereiche, die Hintergrundfluoreszenz enthalten, liefern keine Richtungsinformationen und müssen manuell von der Analyse ausgeschlossen werden. Einstellungen mit hohen Schwellenwerten reduzieren die Pixel, die in den verarbeiteten Bildern berücksichtigt werden. - Verwenden Sie die Option OrientationJ Measure, um zelluläre Ausrichtungen und gerichtete Zell-Zell-Ausrichtung (d. h. Koherenz) zu quantifizieren (Abbildung 3C). Die Option Messen befindet sich im Plugin-Menü in ImageJ. Generieren Sie kleine benachbarte, nicht überlappende Bereiche von Interesse (ROIs) mit gleichem Gewicht (64 x 64 Pixel, ca. 20 x 20 m) innerhalb des bereichs, der von den Histoblasts belegt wird (Abbildung 3C).
- Berechnen Sie die vorherrschende lokale Ausrichtung (d. h. die gemittelte Ausrichtung zwischen benachbarter Zellen-gemittelten Zellkantenausrichtungskarte) und Koherenz aus den ROIs. Die Software berechnet die vorherrschende Ausrichtung und lokale Koherenz innerhalb jedes ROI (Abbildung 3C).
ANMERKUNG: Die größten und kleinsten Eigenwerte des von OrientationJ geschätzten Strukturtensors werden verwendet, um die Koherenz als Verhältnis zwischen ihrer Differenz und ihrer Summe zu berechnen. Die Koscherenz wird zwischen Werten von 0 x 1 begrenzt. Der Wert 1 gibt die vollständige Ausrichtungsgleichmäßigkeit an, während ein Wert von 0 isotrope Bereiche ohne Ausrichtung angibt. - Analysieren Sie die berechneten Orientierungs- und Koherenzwerte aus mehreren Bildern mit freien Softwarepaketen wie PAST25. Axialdaten wie Orientierungswerte (in Grad) werden durch Richtungsstatistiken entsprechend beschrieben.
- Berechnen Sie über die Software die mittlere Richtung und die kreisförmige Varianz für jeden Satz von Orientierungsverteilungen. Die statistische Signifikanz der Differenz zwischen der Verteilung der Ausrichtungen zwischen verschiedenen Genotypen oder Bedingungen wird mit dem nichtparametrischen Mardia-Watson-Wheeler-Test (W-Test) für gleiche Verteilungen bestimmt.
- Berechnen Sie die statistische Signifikanz der Koherenzdifferenz unter Anwendung des nicht-parametrischen Kolmogorov-Smirnov-Tests (K-S-Test). Daten grafisch nach Belieben anzeigen (Polarplots, Balkendiagramme, Boxplots usw.).
- Projizieren Sie die Z-Stack-Slices, die durch konfokale Mikroskopie in 2D erworben wurden, mit der Funktion Maximale Intensitätsprojektion (Maximum Intensity Projection, MIP) von ImageJ.
- Wachstumsdynamik von Zellklonen
HINWEIS: Die folgenden Schritte ermöglichen das Abrufen von geometrischen und Formparametern für Zellen aus 2D-MIP-Bildern, die den Klon(e) von Interesse enthalten. Für Vergleiche zwischen mehreren Klonen müssen Bilder mit den gleichen Einstellungen erfasst werden.- Segmentieren Sie Klonbereiche, indem Sie ihre Konturen mit dem Werkzeug ImageJ-Freihandauswahl zeichnen.
- Berechnen Sie geometrische und Formparameter, indem Sie das Werkzeug Messungen festlegen von ImageJ unter dem Menü Analysieren verwenden. Aktivieren Sie die Optionen Area, Perimeter, Fit Ellipseund Shape Descriptor.
ANMERKUNG: Dies ermöglicht das Abrufen verschiedener geometrischer Parameter, einschließlich der Fläche (Summe der Pixel innerhalb des Klons), des Umfangs (Summe des Pixels des Klonrahmens), des Seitenverhältnisses (AR, das Verhältnis zwischen der Haupt- und der Nebenachse der am besten passenden Legendre-Ellipse, die in den Klonrahmen eingeschrieben ist) und des Ausrichtungswinkels (d. h. des Winkels der Hauptachse des Klons relativ zur Anteroposterior-Grenze). - Die Berechnung nichtdimensionaler Verhältnisse aus diesen Messungen ruft Formparameter ab. Dazu gehören Rundheit (4 x [Fläche]/x [Hauptachse]2), Rauheit (Solidität - Fläche/Konvexe Fläche) und Zirkularität (4 x [Fläche]/[Umfang]2).
HINWEIS: Jeder der Formparameter stellt den Grad der Abweichung der Klone von idealen Formen wie einem Kreis oder einem begrenzten konvexen Rumpf dar und sie sind alle zwischen Werten von 0 und 1 begrenzt. Werte gleich 1 weisen auf maximale Symmetrie (d. h. minimale Komplexität) hin. - Analysieren Sie geometrisch und Formparameter zwischen verschiedenen Genotypen oder Bedingungen mithilfe von Microsoft Excel und/oder PAST. Die statistische Signifikanz der Differenz wird anhand eines ungepaarten zweischwanzigen Schüler-T-Tests für gleichen Mittelwert oder des nicht-parametrischen Kolmogorov-Smirnov K-S-Tests für gleiche Verteilungen zwischen Bedingungen ermittelt. Die Daten können beliebig grafisch dargestellt werden (z.B. Balkendiagramme, Boxplots usw.). Siehe Abbildung 5.
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Representative Results
Das oben beschriebene Protokoll umfasst die Vorbereitung von Drosophila-Pupae für die langfristige Live-Bildgebung und die Verfahren zur Analyse der Zellorientierung und Wachstumsdynamik der Abdominalepidermis. Durch die Anwendung dieser Methode ist es möglich, hochauflösende Filme der sich entwickelnden Pupae für Zeiträume von bis zu 48 h ohne signifikante Photobleichung oder Phototoxizität zu erzeugen. Schnappschüsse, die die Abdominalepidermis (z.B. Histoblasten und LECs) zu unterschiedlichen Zeitpunkten und aus Pupae in verschiedenen Winkeln darstellen, sind in Abbildung 4dargestellt. Die anschließende Analyse dieser Filme ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung der Dynamik lokaler und globaler Veränderungen in den wichtigsten geometrischen und Formparametern, die während der Expansion von Histoblasten und dem Austausch von LECs moduliert werden. Diese Analysen können in verschiedenen Szenarien und spezifischen mutierten Hintergründen durchgeführt werden. Sie können auch für Klone eingesetzt werden, bei denen die Genexpression verändert wird, was zu einem autonomen Verlust oder Gewinn von Funktionsbedingungen führt. Dies würde die Erforschung nichtautonomer Reaktionen in umgebenden Zellen ermöglichen und die Identifizierung von Cross-Talk- oder Zellkommunikationsmechanismen erleichtern (Abbildung 5). Dieser Ansatz wurde vor kurzem bei der Identifizierung des Fett/Dachsous/Vier Gelenkweges als Schlüsselelement für die Ausrichtung und Ausrichtung der Zellen während der Bereitstellung des planaren Polarmusters der Abdominalepidermis des Erwachsenen9eingesetzt.
Abbildung 1: Sezieren und Montieren von Pupas für Live-Bildgebung. (A) Von links nach rechts: dorsale Ansicht einer Prepupa bei 0 h APF (links) und einer Pupa bei 14 h APF vor (Mitte) und nach (rechts) der Entfernung des undurchsichtigen Pupalgehäuses. Der bedienliche Bereich ist angegeben (weiße Pfeilspitzen). (B) Das wesentliche Instrumentarium für die Zerlegung wird angezeigt. Von links nach rechts: Glasrutsche, doppelseitiges Klebeband, ein Paar Zangen und eine Glasbodenschale. (C) Inszenierte Pupas sind auf doppelseitigem Klebeband auf Glasrutschen dorsale Seite nach oben immobilisiert. Der Pupal-Fall jeder Pupa wird aus der operkulären Region mit chirurgischen Zangen geöffnet. (D-E) Das Peeling des Pupal-Gehäuses erfolgt schrittweise. Das Gehäuse ist zerrissen und zu den Pupalseiten vom Kopf bis zum Bauch gefaltet. (F-H) Die Pupa wird sanft von der ventralen Seite mit den Spitzen der Zange (G) angehoben und über einen minimalen Tropfen Halocarbonöl auf eine Glasbodenschale übertragen. (I) Die Pupa ist dann entsprechend ausgerichtet (dorsolater, oben; dorsal, unten). Mehrere Pupae können gleichzeitig montiert werden, indem die Schritte wiederholt werden, die in den Panels C-Igezeigt werden. (J) Bild, das die Umrisse der Zellen des dorsalen Histoblastnests des AIII-Segments zeigt, das die Kreuzungsmarkierung Atp::GFP ausdrückt. Die Pupa wurde dorsolater allateral ausgerichtet und bei 14 h APF abgebildet. Skala bar = 22 m. (K) Bildäquivalent zu (J) aber aus dorsaler Sicht. Die Dynamik der Gewebeentwicklung kann für mehrere Stunden visualisiert werden. Siehe auch Abbildung 4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Erzeugung genetischer Mosaike über FLP/FRT-System. (A) Eine elterliche heterozygote Zelle (blasses Magenta) trägt ein rezessives mutiertes Allel (gestricheltes Rechteck) auf einem Chromosomenarm und ein Gen, das für einen fluoreszierenden Marker (Magenta) im anderen Chromosomarm [in diesem Beispiel den linken Arm des Chromosoms 2 (2L)] kodiert. FRT-Standorte (orange Rechtecke) werden in beiden Armen in den gleichen Chromosomenpositionen proximal zum Zentromer (graue Ovale) konstruiert. (B) Die Aktivierung der FLP-Rekombimeiße durch Hitzeschock in zellen, die in G2 angehalten werden, führt zur Rekombination zwischen den FRTs der Schwesterchromatiden 1-1' und 2-2'. Dadurch wird die Region, die sich an die FRT-Standorte distal ist (FRT40A auf 2L), ausgetauscht. Eine vergrößerte Ansicht wird auf dem rechten Fenster angezeigt. (C) Bei der polaren Segregation der neu angeordneten Regionen (1-1' und 2-2') während der Mitose werden zwei genetisch unterschiedliche Schwesterzellen erzeugt. Eine Tochter ist homozygot für das rezessive Allel und für den gesamten Chromosomenarm distal bis zur Stelle der Rekombination. Dieser Zelle fehlt das Gen, das für den fluoreszierenden Marker kodiert, negativ weiß markiert. Die andere Tochterzelle wird für den Wildtyparm homozygot sein, was zu einem Doppelpunkt führt und zwei Kopien der Gene ausdrückt, die für den fluoreszierenden Marker (dunkles Magenta) kodieren. Der Einfachheit halber werden keine Segregationen von neu angeordneten Bereichen zu entgegengesetzten Polen der mitotischen Zelle (d. h. 1,2 und 1'-2') angezeigt. Daraus entstehen Zellen, die phänotypisch nicht von der Elternzelle zu unterscheiden sind (heterozygoter Hintergrund, blasses Magenta). (D) Bild, das Klone im A-Fach zeigt, die durch somatische FLP/FRT-Rekombination im dritten Instar-Larvenstadium erzeugt und bei 26 h APF visualisiert werden. Klone von Zellen sind durch das Fehlen von RFP.nls (schwarz) und homozygoter Expression von RFP.nls (helles Magenta, Zwillingsflecken) in einem ansonsten heterozygoten RFP.nls Hintergrund (dim magenta) gekennzeichnet. Äquivalente Ereignisse können für FRT-Standorte an anderen chromosomalen Standorten (2R, 3L, 3R und X) erreicht werden. Siehe auch Abbildung 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Abbildung der Messungen der Zellausrichtung. Um Informationen über Zellausrichtungen zu extrahieren, wird zunächst ein planares Koordinatensystem festgelegt, um die Zellausrichtung mit der Gewebeachse in Beziehung zu setzen (A). Zweitens werden Zellausrichtungen aus Zellumrissen extrahiert (B). Zuletzt werden Zellausrichtungen und Ausrichtungen mit der Gewebeachse quantifiziert (C). (A) Auf der linken Seite ein Diagramm einer seitlichen Ansicht einer Pupa, die nach dem planaren Koordinatensystem ausgerichtet ist. Die roten Volumenkörper und die gestrichelten Cyanlinien definieren die kartesische Ebene, die die Anteroposteriorgrenze (A/P) bzw. die dorsale Mittellinie darstellt. In der Mitte ein umgekehrtes Bild, das eine dorsolaterale Ansicht der expandierenden Histoblasten bei 26 h APF zeigt, die durch die Kreuzungsmarkierung Atp::GFP (Eingabebild) umrissen wird. Die Position der A/P-Grenze wird mit einer roten Linie hervorgehoben. Auf der rechten Seite ein axialer Kompass, der den Farbcode anzeigt, der angewendet wird, um Zellkantenausrichtungen (Polygone) oder gemittelte Zellausrichtungen (Balken) zu beschreiben. (B) Anzeige des Menüs Plugins/OrientationJ und desOrientationJ Fensters OrientationJ Distribution. (B') Anzeige des Fensters OrientationJ-Verteilung mit den Einstellungen der Parameter, die zum Abrufen der Zellenkantenausrichtungskarte auf der rechten Seite verwendet werden. (B'') Abbildung der farbcodierten Zellumrisse auf idealisierten Zellen. Ein Kreis zeigt keine bevorzugte Farbe an. (C) Anzeige des Fensters OrientationJ Measure. (C') Sequenzielle Screenshots des Fensters OrientationJ Measure zeigen, wie lokale Ausrichtung und Koherenz in aufeinander folgenden ROIs mit gleichmäßiger Gewichtung gemessen werden. Der lokale Ausrichtungswinkel und die Koherenz für jeden Bereich werden als Ellipsoide angezeigt. (C'') Darstellung der Endergebnisse der Orientierungsmessung. Ellipsoide zeigen visuell die Ausrichtung (d. h. den Winkel der ellipsoidlängsten Achse in Bezug auf die A/P-Grenze) und die Koherenz (d. h. das Verhältnis zwischen der längsten und der kürzeren Achse des Ellipsoids) an. Die numerischen Werte beider Parameter werden für weitere Analysen in einer Kalkulationstabelle gespeichert. (C''') Abbildung der farbcodierten Zellumrisse und der gemittelten Zellausrichtung (Balken) auf idealisierten Zellen. Ein Kreis zeigt keine bevorzugte Ausrichtung an. (C'''') Darstellung der bevorzugten lokalen Ausrichtung jedes ROI (lokal gemittelte Orientierungskarte). Die Farben unterstreichen die Ausrichtung jeder Region. Anterior ist auf der linken Seite. Skalenbalken = 22 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Langzeit-Live-Bildgebung von wachsenden Abdominalepithelien. (A) Repräsentative Schnappschüsse aus Langzeitfilmen von frühen bis späten Phasen der Histoblast-Erweiterung. Oben: Schematische Ansichten einer Pupa, die für dorsolaterale Bildgebung bei 16 h und 26 h APF ausgerichtet ist. Das von den Nestern aus sichtbare Gebiet der Dorsolateralen Seite der Pupa ist bei 16 und 26 h APF dunkelgrau hervorgehoben. Unten: Bilder, die Zellumrisse von Histoblasten und LECs zeigen, die durch den allgegenwärtigen Ausdruck des Junction-Markers Atp::GFP gekennzeichnet sind. Die A/P-Grenze liegt zwischen den beiden hervorgehobenen Fächern (Fake farbige Zellen in blau = vorderes Fach; grün = hintere Fächer). (B) Repräsentative Schnappschüsse aus Langzeit-Bildfilmen von frühen bis späten Phasen des Zusammenflusses von Nestern. Oben: Schematische Ansicht einer Pupa, die für die dorsale Bildgebung bei 32 h und 48 h APF ausgerichtet ist. Unten: Zellumrisse (beschriftet und gefärbt wie in A). Beachten Sie, dass der Atp::GFP-Marker eine Abgrenzung der Form einzelner Epithelzellen im Laufe der Zeit mit hoher Auflösung ermöglicht. Skalenbalken = 22 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Gewebeeigenschaften, die aus der klonalen Analyse extrahiert wurden. (A) Beispiele für Wilde-Klone im A-Fach, das durch das Fehlen von RFP.nls (schwarz) und ihren Zwillingsflecken (helles Magenta) bei 26 h APF gekennzeichnet ist. Die Klone verziehen sich entlang der Segmentgrenzen. Zwillingsklone arrangieren parallel oder im Tandem. Skalenbalken = 22 m. (B) Top: Bilder, die die Parameter veranschaulichen, die aus den Klonumrissen quantifiziert werden. Unten: Zusammenfassungstabelle mit den Durchschnittswerten für die angegebenen Parameter für Wildtiere (n = 29). (C) Morphologie eines Wild-Typ-Klons bei 26 h (links) und 47 h (rechts) APF. Der Klon zeigt komplexe Rahmenmorphologie in beiden Phasen. (D) Box- und Schnurrbartplots für geometrische Parameter bei 26 h (hellgelb) und 47 h APF (dunkelgelb). Die durchschnittliche Fläche und der Umfang nehmen in diesem Zeitfenster deutlich zu. (E) Polardiagramme, die die Ausrichtung der Klone darstellen (Behältergröße 18°, Häufigkeit proportional zur Fläche). Die Orientierung wird während des Ausbaus und Umbaus aufrechterhalten. (F) Box- und Schnurrbartplots für Formparameter bei 26 h (hellgelb) und 47 h APF (dunkelgelb). Rauheit (Solidität), Rundheit und Zirkularität ändern sich kaum. Die Medianwerte werden mit einer roten horizontalen Linie angezeigt, und Diebeswerte erstrecken sich auf die minimalen und maximalen Werte der Verteilung. Die Statistiken wurden mit K-SM-Tests oder W-Tests durchgeführt (p < 0.0001****, p > 0.05 nicht signifikant). Anterior ist auf der linken Seite, dorsal ist oben. Skalenbalken = 16 m. Genotyp ist hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Langfristige Ordnung ist ein wesentliches Merkmal der meisten funktionellen physiologischen Einheiten. Bei der Morphogenese wird Ordnung durch die Integration komplexer Instruktionen erreicht, die mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision umgesetzt werden. Mehrere und mehrstufige Konsprossen sind in stereotype Gewebeanordnungen integriert.
Polarität und Richtung sind entscheidend für eine geordnete räumliche Anordnung während der Entwicklung. Polarität impliziert Symmetriebruch während der Entwicklung. Die Erreichung der Asymmetrie ist notwendig für die Bestimmung der embryonalen Anteroposterior (A/P) und dorsoventral (D/V) Achsen und Erwachsenenorganisation26. Über diese frühe Rolle hinaus sind lokale Asymmetrien für die morphologische Vielfalt auf allen Ebenen unerlässlich. Die Richtung ist eine wesentliche Ergänzung von Asymmetrie und Polarität während der Morphogenese. Globale Ordnung wird durch die Fähigkeit von Zellen implementiert, Signale lokal auf einer Zell-zu-Zell-Basis mit einem präzisen Sinn oder einer Genauausrichtung zu erfassen und zu übertragen. Einzelne Zellasymmetrien harmonieren kooperativ im Laufe der Zeit, indem Positionen oder Bewegungen innerhalb bestimmter Richtungen im Raum ausgerichtet werden. Die Zellkommunikation impliziert sezernierte Faktoren, Zell-Zell-Kontakte und mechanische Eingaben. Signale wirken auf Felder von Zellen, die zuerst lokal und dann global ihr Verhalten ändern27.
Diese Arbeit stellt eine einfache Möglichkeit dar, das koordinierte Verhalten einzelner Zellen zu analysieren, einschließlich ihrer planaren Ausrichtung und Wachstumsparameter während der Entwicklung der Gewebeordnung. Die Morphogenese des erwachsenen Bauches von Drosophila während der Pupation bietet eine Reihe von technischen Vorteilen gegenüber anderen gleichwertigen Modellen wie Keimbandverlängerung/ Rückzug28 oder Rückenverschluss29 während der Fliegenembryogenese, Drosophila Wing Morphogenesis ex vivo30, ventrales Gehäuse in Caenorhabditis elegans31, oder Palatalfusion bei Mäusen32, unter anderem.
Erstens stellt die Bauchmorphogenese einen Prozess dar, der in seiner Gesamtheit in vivo verfolgt werden kann. Kontinuierliche Live-Bildgebung des Ersatzes der LECs durch die Histoblasten kann von 12 h APF, wenn die Pupa gebildet wird, bis zur Vollendung der epitheliaalen Morphogenese erwachsene durchgeführt werden. Zweitens ermöglicht es die Analyse eines vollständigen Satzes von Zellverhalten wie Zellmigration, Division, Formänderungen, Delamination und Intercalation. Schließlich ist es für genetische Interferenzen und klonale Analysen zugänglich. Autonome und nichtautonome Auswirkungen von Verlust und Gewinn von Funktionsaktivitäten können live mit geeigneten Markern überwacht werden. Das Pupa als Modellsystem weist jedoch einige kleinere Einschränkungen auf. Aufgrund seiner eiförmigen Form ist es nicht möglich, gleichzeitige Live-Bildgebung von lateralen und dorsalen Ereignissen mit hoher Auflösung durchzuführen. Dieses Problem kann durch sequenzielle Bildgebung in dorsolateral und dorsal orientierten Pupas oder besser, durch den Einsatz mehrerer Winkel Lichtbogen selektive Ebene Beleuchtungsmikroskopie (SPIM) Mikroskopie zu überwinden. Ein weiterer Nachteil ist das Vorhandensein von zwei verschiedenen Zellpopulationen unterschiedlicher Größe in den Analysen (d. h. polyploide LECs und diploide Histoblasten). Dadurch kann die Bildsegmentierung komplex werden, und die beiden Zellpopulationen müssen separat analysiert werden.
In Zukunft kann die Langzeitbildgebung von Drosophila-Pupae leicht angepasst werden, um eine vollständige Palette von morphogenetischen Phänomenen zu untersuchen, einschließlich der Koordination der epidermalen, muskulären und neuronalen Entwicklung während der Metamorphose bei wildem Typ und mutierten Bedingungen. Darüber hinaus können die verwendeten Algorithmen und Plugins verwendet werden, um die Organisation, Musterung und Dynamik vieler anderer Gewebe zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Labors von Martin-Blanco für die hilfreichen Diskussionen. Wir danken auch Nic Tapon (The Crick Institute, London, UK), dem Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) und FlyBase (für Drosophila Gen Anmerkung). Federica Mangione wurde von einem JAE-CSIC Predoctoral Fellowship unterstützt. Finanziert wurde das Labor von Martén-Blanco aus dem Programa Estatal de Fomento de la Investigacion Cientéfica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P und BFU2017-82876-P) und der Fundacion Ramén Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, Suppl . 41-60 (1988).
