Summary
Este protocolo é projetado para a imagem e análise da dinâmica da orientação celular e crescimento tecidual na epitélia abdominal Drosophila à medida que a mosca-das-frutas sofre metamorfose. A metodologia aqui descrita pode ser aplicada ao estudo de diferentes estágios de desenvolvimento, tecidos e estruturas subcelulares em Drosophila ou outros organismos modelo.
Abstract
Dentro de organismos multicelulares, tecidos e órgãos maduros apresentam altos graus de ordem nos arranjos espaciais de suas células constituintes. Um exemplo notável é dado pela epitélio sensorial, onde células das mesmas ou distintas identidades são reunidas através da adesão celular mostrando padrões planares altamente organizados. As células se alinham umas com as outras na mesma direção e exibem polaridade equivalente em grandes distâncias. Esta organização da epithelia madura é estabelecida ao longo da morfogênese. Para entender como o arranjo planar da epitélia madura é alcançado, é fundamental acompanhar a orientação celular e a dinâmica de crescimento com alta fidelidade espostetal durante o desenvolvimento in vivo. Ferramentas analíticas robustas também são essenciais para identificar e caracterizar transições locais para globais. A drosophila pupa é um sistema ideal para avaliar mudanças de forma celular orientadas subjacentes à morfogênese epitelial. O epitélio em desenvolvimento pupal constitui a superfície externa do corpo imóvel, permitindo imagens de longo prazo de animais intactos. O protocolo descrito aqui é projetado para imagem e análise de comportamentos celulares em níveis globais e locais na epiderme abdominal pupal à medida que cresce. A metodologia descrita pode ser facilmente adaptada à imagem de comportamentos celulares em outros estágios de desenvolvimento, tecidos, estruturas subcelulares ou organismos modelo.
Introduction
Para alcançar seus papéis, os tecidos epiteliais dependem totalmente da organização espacial de seus componentes celulares. Na maioria das epitélios, as células não são apenas embaladas umas contra as outras para criar uma camada precisa de paralelepípedos, mas elas se orientam em relação aos eixos do corpo.
A importância funcional da organização precisa do tecido é óbvia na epitélio sensorial, como o ouvido interno vertebrado e a retina. No primeiro caso, as células de cabelo e suporte se alinham em uma direção axial específica para sentir eficientemente entradas mecânicas como som e movimento1,,2. Da mesma forma, a organização espacial celular fotorreceptora é essencial para alcançar propriedades ópticas ideais pela retina3. O controle espacial da posição e orientação celular é, portanto, de particular relevância para a função fisiológica adequada.
Drosophila é um inseto holometaboloso que sofre uma transformação completa de suas estruturas corporais larvais através da metamorfose, dando origem aos seus tecidos adultos. A pupa Drosophila é um excelente modelo para a imagem ao vivo não invasiva de uma variedade de eventos dinâmicos, incluindo migração celular de desenvolvimento4, divisão celular e dinâmica de crescimento5,contração muscular6,morte celular7,reparação de feridas8e orientação celular9. Na Drosophilaadulta, o epitélio externo mostra um alto grau de ordem. Isso é facilmente observado nos arranjos de trichomes (ou seja, saliências celulares originárias de células epiteliais únicas) e cerdas sensoriais por toda a superfície corporal da mosca10. De fato, as trichomes estão alinhadas em linhas paralelas que guiam o fluxo de ar11. A morfogênese da epitélio adulta e o arranjo ordenado das células individuais começa durante a embriogênese e culmina durante os estágios pupais. Enquanto em divisões celulares de embriões, intercalações e alterações de forma todas as alterações diminuem a ordem tecidual12,13, isso é revertido em estágios posteriores de desenvolvimento, especialmente em estágios pupais, quando a mosca se aproxima da maturidade9.
A pupa drosophila imóvel fornece um sistema ideal para avaliar as mudanças de forma e orientação celular. A epiderme abdominal pupal apresenta vantagens especiais. Enquanto os precursores da cabeça adulta, tórax, genitália e apêndices crescem e se padronizam a partir de estágios larvais, os histoblastos, que são integrados à epiderme larval, começam a crescer ediferenciar-se apenasna pupariação 14 . Este recurso permite o acompanhamento de todos os eventos espesso envolvidos no estabelecimento da ordem tecidual em sua totalidade9.
Os histoblastos são especificados durante o desenvolvimento embrionário em posições gerlaterais em cada segmento abdominal presuntivo. A epiderme abdominal dorsal do adulto deriva dos ninhos de histoblasto situados dorsolateramente presentes nos compartimentos anterior e posterior15,16. À medida que os histoblastos se expandem, substituindo as células epiteliais larvais (LECs), os ninhos contralaterais se fundem na linha média dorsal formando uma folha confluente17,,18,19,,20.
Este trabalho descreve 1) uma metodologia de dissecção, montagem e imagem ao vivo de longo prazo dos métodos analíticos Drosophila pupae e 2) para estudar a dinâmica da orientação celular e do crescimento em alta resolução espostetorial. Aqui é fornecido um protocolo detalhado, abrangendo todas as etapas necessárias desde a preparação inicial do pupae (ou seja, encenação e imagem) até a extração e quantificação das características de direcionalidade e orientação. Também descrevemos como inferir propriedades de tecidos locais a partir da análise de clones celulares. Todas as etapas descritas são minimamente invasivas e permitem análises ao vivo de longo prazo. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados e aplicados a outros estágios de desenvolvimento, tecidos ou organismos modelo.
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Protocol
NOTA: Este protocolo é dividido em cinco etapas: (1) encenar a pupae, (2) preparar a pupae para imagem, (3) imagens vivas da epitélio abdominal crescente, (4) geração de mosaicos genéticos, (5) processamento e análise de dados (incluindo seções descrevendo como analisar a dinâmica de orientação celular a partir de contornos de junção celular e dinâmica de crescimento de clones celulares).
1. Encenação de Drosophila pupae antes da imagem
- A cultura voa do genótipo adequado no meio padrão em frascos plásticos a 25 °C durante 5 dias (±12 h) após a colocação do ovo (AEL).
NOTA: A metamorfose começa dentro do confinamento das larvas de terceira instar no caso pupal às 120 h AEL até 0h após a formação do puparium (APF). Esta transição é facilmente identificável, pois as larvas param de se alimentar e se movem e a região opercular é formada(Figura 1A) a 0-12 h APF. O puparium é inicialmente macio e branco, mas progressivamente endurece e bronzeia. - Transfira prepupae branco (0 h APF) para um frasco de plástico fresco usando um pincel umedecido. Os animais podem ser mantidos em temperaturas diferentes, dependendo do experimento projetado até a idade desejada.
NOTA: A formação de pupa (ou seja, pupação) ocorre às 12h APF, quando a cabeça e os apêndices da mosca adulta são totalmente sempreados(Figura 1A). A essa altura, o caso pupal está totalmente separado da pupa, permitindo sua remoção completa(Figura 1A).
2. Preparando pupas para imagens ao vivo
NOTA: Após a encenação, as pupas são dissecadas e montadas conforme descrito abaixo (ver também Figura 1).
- Remova pupas encenadas da parede do frasco com a ajuda dos fórceps.
- Cole o lado ventral de cada pupa em um slide de vidro coberto com fita adesiva de dois lados. Bata suavemente nos espigões da cabeça (ou seja, região opercular) e na superfície dorsal da pupa com as pontas dos fórceps para garantir a adesão da caixa pupal à fita (Figura 1A,B).
NOTA: A superfície dorsal deve enfrentar-se para facilitar a dissecação do caso e a recuperação da pupa. - Inicie a dissecção sob um estereómico removendo suavemente o operculum do pupário com as fórceps(Figura 1C).
- Insira uma ponta das fórceps em um ângulo raso entre a caixa pupal e a superfície da pupa através da abertura opercular. Rasgue a caixa da cabeça à cauda lateralmente em um ou mais balanços, evitando beliscar a pupa (Figura 1D). Dobre a caixa de pupal rachada para os lados laterais enquanto você continua procedendo para a extremidade posterior(Figura 1E).
NOTA: O caso pupal é bastante rígido e racha facilmente. Em caso de alta umidade ou, em particular, fundos genotipos, o caso pupal fica mais macio e rasgar é mais difícil. Nestes casos, a rachadura do caso pupal pode ser ajudada picando suas bordas livres com ambas as pontas dos fórceps. - Remova a pupa da caixa pupal aberta inserindo cuidadosamente os fórceps sob o animal e puxando suavemente para cima(Figura 1F). A pupa grudará na ponta dos fórceps (Figura 1G−H).
- Transfira a pupa com a ajuda dos fórceps para um prato de fundo de vidro e deposite-a em cima de uma pequena gota de óleo de halocarboneto permeável a gás(Figura 1I). Segure a pupa suavemente pelo lado ventral para evitar possíveis danos teciduais.
NOTA: A gota de óleo de halocarbono deve ser pequena, com diâmetro aproximadamente inferior à metade do comprimento da pupa. Tal quantidade é suficiente para aderir a pupa ao vidro pela capilaridade e corrigir a óptica para objetivos de imersão de óleo. - Enrole um pedaço de papel de tecido molhado nas bordas do prato para manter a umidade. Cubra o prato para evitar a desidratação da pupae durante a imagem.
NOTA: Tanto a pupa feminina quanto a fêmea podem ser empregadas para a imagem. Recomendamos a contratação do terceiro segmento abdominal (AIII) como metameração abdominal de referência, uma vez que é quase idêntica em ambos os sexos em termos de tamanho, forma e padronização.
3. Imagem ao vivo da epitélio abdominal crescente
NOTA: Um microscópio confocal de escaneamento a laser invertido equipado com um objetivo de imersão de óleo 40x/1.3 NA foi usado para a imagem de pupas em diferentes estágios de desenvolvimento.
- Oriente a pupa sobre a gota de óleo na placa de fundo de vidro de acordo com o domínio e o processo a ser avaliado (por exemplo, dorsolateralmente para imagens ao vivo de longo prazo da expansão precoce dos ninhos dorsais, ou dorsalmente para imagem de sua expansão tardia e remodelação tecidual). Ver Figura 1J,K e Figura 4.
- Transfira o prato de fundo de vidro contendo a pupae montada para o estágio do microscópio e concentre-se na superfície da área abdominal usando a luz transmitida.
NOTA: Mesmo que este protocolo seja otimizado para imagens em microscópios invertidos, também é possível realizar imagens em um microscópio vertical. Nesse caso, a amostra é colocada no estágio do microscópio com a superfície de fundo de vidro voltada para cima. O óleo de halocarboneto mantém cada pupa em um menisco. - Definir os parâmetros de aquisição: 1) o número de fatias Z geralmente estão entre 20-40 para permitir a reconstrução bidimensional apropriada (2D) da epiderme abdominal; 2) tamanho do passo entre cada fatia (por exemplo, 1 míclico); 3) intervalo de tempo para gravação (um intervalo de 5 minutos é adequado para análises de alta fidelidade da dinâmica de orientação celular); e 4) resolução de quadros (por exemplo, 1024 x 1024).
- Ligue os lasers apropriados (ou seja, 488 nm e 561 nm para visualizar fluoroforos GFP e RFP, respectivamente) e ajuste a potência do laser e as configurações de ganho/deslocamento para visualizar as células marcadas. Use a menor potência laser possível (na faixa 5%-20%) para minimizar fotobleaching e fototoxicidade.
- Defina manualmente a posição e os limites apropriados de pilha Z para várias pupas usando o estágio motorizado anexado e o software de aquisição de multiposições de microscópio.
4. Geração de mosaicos genéticos para seguir comportamentos de clones celulares
NOTA: Utilizamos recombinação mitótica para induzir mosaicos genéticos no epitélio abdominal via recombinação específica do local (sistema FLP/FRT21,22)(Figura 2).
- Fêmeas virgens cruzadas carregando um transgene Flippase indutível de choque térmico (hs-FLP), um local de alvo de reconhecimento FLP (FRT) em um local genômico específico (por exemplo, Local FRT na posição 40A no braço L do cromossomo 2), e um marcador celular reconhecível (por exemplo, Ubi-RFP.nls ou Ubi-GFP.nls) distal para o local FRT, para machos mutantes carregando um local FRT no local genômico equivalente(Figura 2A−C).
NOTA: Efeitos autônomos e não autônomos dentro ou fora de clones para qualquer perda genética de função poderiam ser estudados empregando alelos recessivos específicos distal para o local FRT. - Gerar clones somáticos FLP/FRT nos histoblastos por tratamento de choque térmico no terceiro estágio larval instar da prole da cruz. Isso é realizado submergindo os frascos de plástico contendo os animais em um banho de água a 37 °C por 45 min a 1 h no estágio das larvas errantes (LIII).
NOTA: O período sensível para recombinação mitótica é a fase G2 do ciclo celular. Histoblasts são presos no G2 durante todo o desenvolvimento larval. - Escore clones gêmeos para ausência (ou seja, células mutantes) ou níveis aprimorados (ou seja, células de ponto duplo do tipo selvagem) do marcador de proteína fluorescente a partir de 16 h APF em diante(Figura 2D).
NOTA: Em média, 45 min a 1 h a 37 °C renderiza aproximadamente 2-3 clones gêmeos por região de interesse (por exemplo, o hemisegment abdominal). Pupas mostrando também uma alta densidade de clones (por exemplo, mais de quatro clones gêmeos por hemisegment) devem ser descartados de outras análises quantitativas. - Após a identificação do clone, a imagem viva pupae na fase desejada e pelo tempo desejado, conforme descrito na seção anterior.
5. Processamento e análises de dados
NOTA: Os dados são processados usando ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- Diferencie a dinâmica de orientação celular dos contornos de junção celular.
- Projete as fatias de pilha Z adquiridas pela microscopia confocal em 2D usando a função De projeção de intensidade máxima (MIP) do ImageJ.
NOTA: O número de fatias por pilha deve ser mantido ao mínimo para evitar o ruído fora de foco gerado por macrófagos patrulhando sob a epiderme. - Defina um sistema de coordenadas planar identificando marcos de tecido confiáveis (por exemplo, limites de compartimento A/P) para análise de cada conjunto de dados(Figura 3A).
NOTA: A contratação das mesmas referências de planar para cada conjunto de dados permitirá a comparação de várias medições. - Utilize o plugin OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) da ImageJ23,24 nas bordas celulares locais para obter valores qualitativos e quantitativos de orientação. O plugin torna sobreposições codificadas por cores em imagens de entrada com base em orientações locais e fornece valores numéricos quando usados no modo quantitativo(Figura 3B−B'' e Figura C−C''').
NOTA: O plugin OrientationJ é baseado em tensores de estrutura, matriz 2 x 2 de eigenvalues derivados de derivativos gradientes e direcionais (Ver referências23,24 para uma descrição detalhada). - Use a opção OrientationJ Distribution para color-code cell edge orientações relativas ao sistema de coordenadas planar definido (ou seja, mapas de orientação de borda de celular)(Figura 3B). A opção Distribuição é encontrada no menu plugin no ImageJ. As configurações a serem utilizadas são: Sigma de janela gaussiana = 1 pixel; Spline cúbico = Gradiente; Coerência Mínima = 20%; Energia Mínima = 1%. As orientações de borda celular são exibidas como uma imagem codificada por cores que emprega a opção De Pesquisa de Cores do plugin (Hue = orientação; Saturação = coerência; e Brilho = imagem de entrada).
NOTA: As áreas que contenham fluorescência de fundo não fornecem nenhuma informação direcional e devem ser excluídas manualmente da análise. As configurações de alto limiar reduzem os pixels considerados nas imagens processadas. - Use a opção OrientaçãoJ Medida para quantificar orientações celulares e alinhamento direcional célula-célula (ou seja, coerência) (Figura 3C). A opção Medir é encontrada no menu plugin no ImageJ. Gerar pequenas regiões de interesse adjacentes não sobrepostas (ROIs) de peso uniforme (64 x 64 pixels, cerca de 20 μm x 20 μm) dentro da área ocupada pelos histoblastos(Figura 3C).
- Calcule a orientação local dominante (ou seja, a orientação média entre o mapa de orientação de borda celular mediana das células vizinhas) e a coerência dos ROIs. O software calcula a orientação predominante e coerência local dentro de cada ROI (Figura 3C).
NOTA: Os maiores e menores valores de eigen da estrutura tensor estimados pelo OrientationJ são empregados para calcular a coerência como a razão entre sua diferença e sua soma. A coerência é limitada entre valores de 0-1. Um valor de 1 indica uniformidade de alinhamento total, enquanto um valor de 0 indica áreas isotrópicas sem alinhamento. - Analise estatisticamente os valores calculados de orientação e coerência a partir de múltiplas imagens usando pacotes de software livre, como PAST25. Dados axiais, como valores de orientação (em graus) são devidamente descritos por estatísticas direcionais.
- Através do software, calcule a direção média e a variância circular para cada conjunto de distribuições de orientação. A significância estatística da diferença entre a distribuição das orientações entre diferentes genótipos ou condições é determinada utilizando-se o teste não paramétrico Mardia-Watson-Wheeler (W-test) para distribuições iguais.
- Calcule a significância estatística da diferença na coerência aplicando o teste kolmogorov-smirnov não paramétrico (teste K-S). Exibir dados graficamente conforme desejado (gráficos polares, gráficos de barras, gráficos de caixa, etc.).
- Projete as fatias de pilha Z adquiridas pela microscopia confocal em 2D usando a função De projeção de intensidade máxima (MIP) do ImageJ.
- Dinâmica de crescimento de clones celulares
NOTA: As etapas a seguir permitem a recuperação de parâmetros geométricos e de forma para células a partir de imagens 2D MIP contendo o (s) clone(s) de interesse. Para comparações entre vários clones, as imagens devem ser adquiridas com as mesmas configurações.- Segmentar áreas de clones desenhando seus contornos com a ferramenta Seleção de Mão Livre ImageJ.
- Calcule parâmetros geométricos e de forma usando a ferramenta Definir medidas do ImageJ no menu Analisar. Ative as opções Area, Perimeter, Fit Ellipsee Shape Descriptor.
NOTA: Isso permitirá a recuperação de diversos parâmetros geométricos, incluindo a área (soma dos pixels dentro do clone), o perímetro (soma do pixel da borda do clone), a proporção (AR, a razão entre os eixos maior e menor da elipo legendre mais bem encaixada na borda do clone) e o ângulo de orientação (ou seja, o ângulo do eixo principal do clone em relação ao limite anteroposterior). - O cálculo das razões não dimensionais dessas medidas recupera parâmetros de forma. Estes incluem arredondamento (4 x [área]/π x [eixo principal]2),rugosidade (solidez - área/área convexa) e circularidade (4π x [área]/[perímetro]2).
NOTA: Cada um dos parâmetros de forma representa o grau de desvio dos clones de formas ideais, como um círculo ou um casco convexo delimitado, e todos eles são limitados entre os valores de 0 e 1. Valores iguais a 1 indicam simetria máxima (ou seja, complexidade mínima). - Analisar estatisticamente parâmetros geométricos e de forma entre diferentes genótipos ou condições usando o Microsoft Excel e/ou PAST. A significância estatística da diferença é determinada usando o teste t de um aluno de duas caudas não verificado para igual média ou o teste K-S não paramétrico kolmogorov-smirnov para distribuições iguais entre as condições. Os dados podem ser exibidos graficamente conforme desejado (por exemplo, gráficos de barras, gráficos de caixa, etc.). Ver Figura 5.
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Representative Results
O protocolo descrito acima abrange a preparação da pupae Drosophila para imagens vivas de longo prazo e os procedimentos para análise da orientação celular e dinâmica de crescimento da epiderme abdominal. Aplicando essa metodologia é possível gerar filmes de alta resolução da pupae em desenvolvimento por períodos de até 48h sem fotobleaching significativo ou fototoxicidade. Instantâneos que retratam a epiderme abdominal (por exemplo, histoblasts e LECs) em diferentes pontos de tempo e de pupas orientadas em diferentes ângulos são mostrados na Figura 4. A análise subsequente desses filmes permite a identificação e quantificação da dinâmica das mudanças locais e globais nos principais parâmetros geométricos e de forma modulados durante a expansão dos histoblastos e a substituição de LECs. Essas análises podem ser realizadas em diferentes cenários e origens mutantes específicas. Eles também podem ser empregados para clones nos quais a expressão genética é alterada, levando à perda autônoma ou ganho de condições de função. Isso permitiria a exploração de respostas não cancerígenas em células circundantes, facilitando a identificação de mecanismos de comunicação entrelúlneas ou celulares(Figura 5). Esta abordagem foi recentemente empregada na identificação da via gorda/dachsous/Quatro articulada como elemento-chave direcionando e orientando o alinhamento das células durante a implantação do padrão polar planar da epiderme abdominal do adulto9.
Figura 1: Dissecando e montando pupas para imagens vivas. (A) Da esquerda para a direita: vista dorsal de uma prepupa a 0 h APF (esquerda) e de uma pupa às 14h APF antes (meio) e depois (direita) a remoção do caso pupal opaco. A região opercular é indicada (pontas de flecha branca). (B) O kit de ferramentas essencial para dissecção é mostrado. Da esquerda para a direita: lâmina de vidro, fita adesiva de dois lados, um par de fórceps e um prato de fundo de vidro. (C) Pupas encenou são imobilizadas em fita adesiva de dois lados em lâminas de vidro lado dorsal para cima. O caso pupal de cada pupa é aberto a partir da região opercular com fórceps cirúrgicos. (D−E) O peeling do caso pupal é gradual. A caixa é rasgada e dobrada para os lados pupal da cabeça para o abdômen. (F−H) A pupa é suavemente levantada do lado ventral com as pontas dos fórceps (G) e transferida para um prato de fundo de vidro sobre uma gota mínima de óleo halocarboneto. (I) A pupa é então adequadamente orientada (dorsolateralmente, superior; dorsalmente, inferior). Várias pupas podem ser montadas simultaneamente repetindo as etapas mostradas nos painéis C−I. (J) Imagem mostrando o contorno das células do ninho histoblast dorsal do segmento AIII expressando o marcador de junção Atpα::GFP. A pupa foi orientada dorsolateralmente e imagem às 14 horas de APF. Barra de escala = 22 μm. (K) Imagem equivalente a (J) mas do ponto de vista dorsal. A dinâmica do desenvolvimento do tecido pode ser visualizada por várias horas. Veja também Figura 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de mosaicos genéticos via sistema FLP/FRT. (A) Uma célula heterozigous parental (magenta pálida) carrega um alelo mutante recessivo (retângulo tracejado) em um braço cromossomo e uma codificação genética para um marcador fluorescente (magenta) no outro braço cromossomo [braço esquerdo do cromossomo 2 (2L) neste exemplo]. Os locais FRT (retângulos laranjas) são projetados em ambos os braços nas mesmas posições cromossômicas proximais ao centromere (ovais cinzentos). (B) A ativação da recombinase flp por choque térmico em células pausadas em G2 leva à recombinação entre os FRTs das cromátides irmãs 1-1' e 2-2'. Como resultado, a região distal para os locais FRT (FRT40A em 2L) é trocada. Uma visão ampliada é mostrada no painel direito. (C) Após a segregação polar das regiões reorganizadas (1-1' e 2-2') durante a mitose, duas células irmãs geneticamente diferentes são geradas. Uma filha é homozigiosa para o alelo recessivo e para todo o braço cromossomo distal para o local da recombinação. Esta célula não tem o gene que codifica para o marcador fluorescente, marcado negativamente em branco. A outra célula filha será homozigosa para o braço tipo selvagem, dando origem a um ponto duplo e expressando duas cópias dos genes codificados para o marcador fluorescente (magenta escura). Para a simplicidade, não são mostradas segregações de regiões reorganizadas para polos opostos da célula mitótica (ou seja, 1−2 e 1'−2') não são mostradas. Estes dão origem a células fenotipicamente indistinguíveis da célula parental (fundo heterozigoso, magenta pálida). (D) Imagem mostrando clones no compartimento A gerados via recombinação somática FLP/FRT no terceiro estágio de larvas instar e visualizados a 26 h APF. Clones de células são marcados pela ausência de RFP.nls (preto) e expressão homozigos de RFP.nls (magenta brilhante, pontos gêmeos) em um fundo RFP.nls heterozigos (dim magenta). Eventos equivalentes podem ser realizados para locais FRT localizados em outros locais cromossômicos (2R, 3L, 3R e X). Veja também Figura 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustração das medidas de orientação celular. Para extrair informações sobre orientações celulares, primeiro é definido um sistema de coordenadas planar para relacionar orientação celular com eixo tecidual (A). Em segundo lugar, as orientações celulares são extraídas dos contornos celulares(B). Por último, as orientações celulares e alinhamentos com o eixo tecidual são quantificados(C). (A) À esquerda, um diagrama de uma visão lateral de uma pupa orientada de acordo com o sistema de coordenadas do planar. As linhas vermelhas sólidas e as linhas tracejadas de ciano definem o plano cartesiano representando o limite anteroposterior (A/P) e a linha média dorsal, respectivamente. No meio, uma imagem invertida mostrando uma visão dorsolateral dos histoblastos em expansão a 26 h APF delineado pelo marcador de junção Atpα::GFP (imagem de entrada). A posição do limite A/P é destacada com uma linha vermelha. À direita, uma bússola axial mostrando o código de cor aplicado para descrever orientações de borda celular (polígonos) ou orientações de células medianas (barras). (B) Exibição do menu Plugins/OrientationJ e da janela De Distribuição OrientationJ. (B) Exibição da janela OrientationJ Distribution mostrando as configurações dos parâmetros empregados para obter o mapa de orientação da borda da célula à direita. (B'') Ilustração dos contornos de células codificadas por cores em células idealizadas. Um círculo não mostra nenhuma cor preferida. (C) Exibição da janela OrientaçãoJ Medida. (C) Capturas de tela sequenciais da janela OrientationJ Measure mostrando como medir a orientação local e a coerência em ROIs consecutivos de peso uniforme. O ângulo de orientação local e a coerência para cada região são exibidos como elipsoides. (C'') Representação dos resultados finais da medição de orientação. Os elipsoides exibem visualmente a orientação (ou seja, ângulo do eixo mais longo elipsoide em relação ao limite A/P) e coerência (ou seja, relação entre o eixo mais longo e o mais curto do elipsoide). Os valores numéricos de ambos os parâmetros são salvos em uma planilha para análises posteriores. (C'') Ilustração dos contornos de células codificados por cores e orientação celular mediada (barras) em células idealizadas. Um círculo não mostra nenhuma orientação preferida. (C''') Representação da orientação local preferida de cada ROI (mapa de orientação média local). As cores destacam a orientação de cada região. Anterior é para a esquerda. Barra de escala = 22 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens ao vivo de longo prazo da epitélio abdominal crescente. (A) Instantâneos representativos de filmes de imagem de longo prazo desde as fases iniciais até as fases finais da expansão do histoblast. Topo: Vistas esquemáticas de uma pupa orientada para imagens dorsolaterais às 16h e 26 h APF. O território ocupado pelos ninhos visíveis do lado dorsolateral da pupa é destacado em cinza escuro às 16 e 26 horas de APF. Inferior: Imagens mostrando contornos celulares de histoblasts e LECs rotulados pela expressão onipresente do marcador de junção Atpα::GFP. O limite A/P fica entre os dois compartimentos destacados (Células coloridas falsas em azul = compartimento anterior; verde = compartimentos posteriores). (B) Instantâneos representativos de filmes de imagem de longo prazo desde as fases iniciais até as fases tardias da confluência dos ninhos. Topo: Vista esquemática de uma pupa orientada para imagem dorsal às 32h e 48 h APF. Inferior: Contornos celulares (rotulados e coloridos como em A). Observe que o marcador Atpα::GFP permite delinear a forma de células epiteliais individuais ao longo do tempo com alta resolução. Barra de escala = 22 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Propriedades teciduais extraídas da análise clonal. (A) Exemplos de clones do tipo selvagem no compartimento A marcados pela ausência de RFP.nls (preto) e seus pontos gêmeos (magenta brilhante) a 26 h APF. Os clones alongam-se ao longo das fronteiras segmentais. Clones gêmeos organizam em paralelo ou em conjunto. Barra de escala = 22 μm. (B) Topo: Imagens que ilustram os parâmetros quantificados a partir dos contornos do clone. Inferior: Tabela resumida que informa os valores médios dos parâmetros indicados para animais de tipo selvagem (n = 29). (C) Morfologia de um clone tipo selvagem a 26 h (esquerda) e 47 h (direita) APF. O clone mostra morfologia de fronteira complexa em ambos os estágios. (D) Parcelas de caixa e bigode para parâmetros geométricos a 26 h (amarelo claro) e 47 h APF (amarelo escuro). A área média e o perímetro aumentam significativamente nesta janela de tempo. (E) Parcelas polares representando a orientação dos clones (tamanho da lixeira 18°, abundância proporcional à área). A orientação é mantida durante a expansão e remodelação. (F) Parcelas de caixa e bigode para parâmetros de forma a 26 h (amarelo claro) e 47 h APF (amarelo escuro). Rugosidade (solidez), arredondamento e circularidade mal mudam. Os valores medianos são mostrados com uma linha horizontal vermelha e os bigodes estendem-se aos valores mínimos e máximos da distribuição. As estatísticas foram realizadas com teste K-SM ou W-tests (p < 0,0001**** p > 0,05 não significativo). Anterior é para a esquerda, dorsal é para cima. Barra de escala = 16 μm. Genótipo é hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A ordem de longo alcance é uma característica essencial da maioria das unidades fisiológicas funcionais. Durante a morfogênese, a ordem é alcançada através da integração de instruções complexas implementadas com alta precisão temporal e espacial. Restrições múltiplas e multinível são integradas em arranjos teciduais estereotipados.
Polaridade e direcionalidade são fundamentais para o arranjo espacial ordenado durante o desenvolvimento. Polaridade implica quebra de simetria durante o desenvolvimento. A realização da assimetria é necessária para a determinação dos eixos anteroposterior embrionário (A/P) e dorsoventral (D/V) e organização adulta26. Além desse papel inicial, as assimmetrias locais são essenciais para a diversidade morfológica em todos os níveis. A direcionalidade é um complemento essencial de assimetria e polaridade durante a morfogênese. A ordem global é implementada pela capacidade das células de sentir e transmitir sinais localmente em uma base celular-celular com um sentido ou orientação precisa. As assimemetrias unicelulares harmonizam cooperativamente ao longo do tempo orientando posições ou movimentos dentro de direções específicas no espaço. A comunicação celular implica fatores secretos, contatos celulares e entradas mecânicas. Os sinais atuam em campos de células que primeiro localmente e depois modificam globalmente seus comportamentos27.
Este trabalho apresenta uma maneira simples de analisar os comportamentos coordenados das células individuais, incluindo sua orientação planar e parâmetros de crescimento durante o desenvolvimento da ordem tecidual. A morfogênese do abdômen adulto de Drosophila durante a pupação apresenta uma série de vantagens técnicas sobre outros modelos equivalentes, como extensão da banda germinal/ retração28 ou fechamento dorsal29 durante a embriogênese de mosca, morfogense de asa drosophila ex vivo30,gabinete ventral em Caenorhabditis elegans31, ou fusão palatal em camundongos32, entre outros.
Primeiro, a morfogênese do abdômen constitui um processo que pode ser seguido em sua totalidade in vivo. Imagens vivas contínuas da substituição dos LECs pelos histoblastos podem ser realizadas a partir das 12h de APF, quando a pupa é formada, até a conclusão da morfogênese epitelial adulta. Em segundo lugar, permite a análise de um conjunto completo de comportamentos celulares, como migração celular, divisão, mudanças de forma, delaminação e intercalação. Por último, é receptivo à interferência genética e à análise clonal. Efeitos autônomos e não autônomos de perda e ganho de atividades de função podem ser monitorados ao vivo através da empregação de marcadores apropriados. No entanto, a pupa como um sistema modelo apresenta algumas pequenas limitações. Devido à sua forma vazia, não é possível realizar imagens ao vivo simultâneas de eventos laterais e dorsais com alta resolução. Este problema pode ser superado realizando imagens sequenciais em pupas dorsolateral e dorsalmente orientadas ou melhor, empregando microscopia seletiva de iluminação de plano (SPIM) de múltiplas folhas de luz. Outra desvantagem é a presença de duas populações celulares diferentes de diferentes tamanhos nas análises (ou seja, LECs poliploides e histoblastos diploides). Isso pode tornar a segmentação de imagens complexa e as duas populações celulares devem ser analisadas separadamente.
No futuro, a imagem a longo prazo da pupa de Drosophila pode ser facilmente adaptada para estudar uma gama completa de fenômenos morfogenéticos, incluindo a coordenação do desenvolvimento epidérmico, muscular e neural durante a metamorfose em condições selvagens e mutantes. Além disso, os algoritmos e plugins em uso podem ser empregados para estudar a organização, a padronização e a dinâmica de muitos outros tecidos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesses.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Martín-Blanco por discussões úteis. Agradecemos também a Nic Tapon (The Crick Institute, Londres, Reino Unido), o Bloomington Stock Center (University of Indiana, EUA) e flybase (por anotação genética Drosophila). Federica Mangione foi apoiada por uma bolsa de pré-doutorado da JAE-CSIC. O laboratório Martín-Blanco foi financiado pelo Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P e BFU2017-82876-P) e da Fundação Ramón Areces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
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