Summary
Этот протокол предназначен для визуализации и анализа динамики клеточной ориентации и роста тканей в эпидемии брюшной полости Drosophila, поскольку плодовая муха подвергается метаморфозе. Описанная здесь методология может быть применена к изучению различных стадий развития, тканей и субклеточных структур в дрозофиле или других модельных организмах.
Abstract
В многоклеточных организмах зрелые ткани и органы демонстрируют высокую степень порядка в пространственных расположениях их составных клеток. Замечательный пример приводится сенсорной эпителии, где клетки же или различных идентичностей собираются вместе через клеточные клетки слипа с указанием высокоорганизованных планарных моделей. Клетки выравниваются друг с другом в том же направлении и отображают эквивалентную полярность на больших расстояниях. Эта организация зрелой эпителии устанавливается в течение морфогенеза. Чтобы понять, как достигается планарное расположение зрелой эпителии, важно отслеживать ориентацию клеток и динамику роста с высокой пространственно-временной точностью во время развития in vivo. Надежные аналитические инструменты также необходимы для выявления и характеристики переходов на местном к глобальному характеру. Дрозофила куколка является идеальной системой для оценки ориентированных изменений формы клеток, лежащих в основе эпителиального морфогенеза. Pupal развивающихся эпителий представляет собой внешнюю поверхность неподвижного тела, что позволяет долгосрочное изображение нетронутых животных. Описанный здесь протокол предназначен для изображения и анализа поведения клеток как на глобальном, так и на местном уровне в эпидермисе брюшной полости pupal по мере его роста. Описанная методология может быть легко адаптирована к визуализации клеточного поведения на других стадиях развития, тканях, субклеточных структурах или модельных организмах.
Introduction
Для достижения своей роли эпителиальные ткани полностью полагаются на пространственную организацию своих клеточных компонентов. В большинстве эпителий клетки не только упакованы друг против друга, чтобы создать точный слой булыжника, но они ориентируются относительно осей тела.
Функциональное значение точной организации тканей очевидно в сенсорных эпителиях, таких как позвоночное внутреннее ухо и сетчатка. В первом случае волосы и поддерживающие клетки выравниваются в определенном осевом направлении, чтобы эффективно чувствовать механические входы, такие как звук и движение1,2. Аналогичным образом, фоторецептор клеточной пространственной организации имеет важное значение для достижения оптимальных оптических свойств сетчатки3. Таким образом, пространственный контроль положения и ориентации клеток имеет особое значение для правильной физиологической функции.
Дрозофила является голометаболическим насекомым, которое претерпевает полное преобразование своих личинок структуры тела через метаморфозы, что приводит к его взрослых тканей. Дрозофила кукапа является отличной моделью для неинвазивных живой визуализации различных динамических событий, в том числе миграции клетокразвития 4, деление клеток и динамика роста5, сокращение мышц6, гибель клеток7, ремонт раны 8, и ориентация клеток9. У взрослой дрозофилы, внешний эпителий показывает высокую степень порядка. Это легко наблюдается на расположения трихом (т.е. выступы клеток, происходящих из отдельных эпителиальных клеток) и сенсорных щетины по всей поверхности тела мухи10. Действительно, трихом выровнены в параллельных рядах, направляющих воздушный поток11. Морфогенез эпителии взрослых и упорядоченное расположение отдельных клеток начинается во время эмбриогенеза и завершается во время стадии pupal. В то время как в эмбрионах клеточные деления, интеркалации и формы изменяют все уменьшающееся предельное управление ткани12,,13, это возвращается на более поздних стадиях развития, особенно на стадиях pupal, когда муха приближается к зрелости9.
Неподвижный кукачанка Drosophila обеспечивает идеальную систему для оценки формы клеток и изменения ориентации. Особой преимуществаю является эпидермис брюшной полости. В то время как предшественники взрослой головы, грудной клетки, гениталий и придатков растут и получают узоризм из личинок этапов, гистопласты, которые интегрированы в личиночной эпидермис, начинают расти и дифферециации только при pupariation14. Эта функция позволяет отслеживать все пространственно-временные события, участвующие в создании порядка тканей в полном объеме9.
Гистобласты определяются во время эмбрионального развития на контралатеральных позициях в каждом предполагаемом брюшном сегменте. В рознические брюшной эпидермис взрослого происходит от дорсолатерально расположен гистобласт гнезда, присутствующие в передней и задней отсеков15,16. По мере расширения гистопластов, заменяющих личиночные эпителиальные клетки (ЛЭК), контралатеральные гнезда предохраняют на дозорной средней линии, образуя конфлюентный лист17,,18,,19,20.
Эта работа описывает 1) методологию для вскрытия, монтажа и долгосрочной живой визуализации кукота Drosophila, и 2) аналитические методы для изучения динамики клеточной ориентации и роста при высоком пространственно-временном разрешении. Здесь представлен подробный протокол, охватывающий все шаги, необходимые от первоначальной подготовки куколок (т.е. постановки и визуализации) до извлечения и количественной оценки функций направленности и ориентации. Мы также описываем, как сделать вывод о местных свойствах тканей из анализа клеточных клонов. Все описанные шаги являются минимально инвазивными и позволяют проводить долгосрочный живой анализ. Описанные здесь методы могут быть легко адаптированы и применены к другим стадиям развития, тканям или модельным организмам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол делится на пять этапов: (1) постановка куколки, (2) подготовка куколки для визуализации, (3) живое изображение растущей брюшной эпителии, (4) генерации генетической мозаики, (5) обработки и анализа данных (включая разделы, описывающие, как анализировать динамику ориентации клеток от клеточных соединений и динамику роста от клеточных клонов).
1. Постановка дрозофилы купыки до изображения
- Культура летает соответствующего генотипа на стандартной среде в пластиковых флаконах при 25 градусах По цельсии в течение 5 дней (12 ч) после откладки яиц (AEL).
ПРИМЕЧАНИЕ: Метаморфозы начинается в заключении третьего в звезде личинок в pupal случае на 120 ч AEL до 0 ч после образования пупария (APF). Этот переход легко идентифицировать, потому что личинки перестают подавать и двигаться, а оперкулярная область образуется(рисунок 1А)при 0-12 ч APF. Пупарий изначально мягкий и белый, но постепенно затвердевает и загорает. - Перенесите белые препуп (0 ч APF) в свежий пластиковый флакон с помощью увлажненной кисти. До желаемого возраста животных можно содержать при разных температурах в зависимости от разработанного эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Pupa формирования (т.е. щенка) происходит при 12 ч APF, когда голова и придатки взрослой мухи полностью everted(Рисунок 1A). К этому времени pupal случае полностью отделенотота от кукота, что позволяет его полное удаление(рисунок 1А).
2. Подготовка куски для живой визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: После постановки, куски вскрыты и установлены, как описано ниже (см. также Рисунок 1).
- Удалить постановочные кулаки со стены флакона с помощью щипц.
- Клей вентральную сторону каждого куколка на стеклянной горке, покрытой двусторонней липкой лентой. Аккуратно нажмите на голову spiracles (т.е. оперкулярной области) и спинной поверхности куколки с кончиками щипцов, чтобы обеспечить прилипание pupal случае ленты(Рисунок 1A, B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность доза должна лицом вверх, чтобы облегчить вскрытие корпуса и восстановление кунпы. - Начните вскрытие под стереомикроскопом, аккуратно удалив оперкулум из пупария с помощью щипстки(рисунок 1C).
- Вставьте один кончик щипцов в небольшой угол между pupal случае и поверхности куколки через оперкулярное отверстие. Разорвать случае с головы до хвоста боковой в одном или нескольких качели, избегая щипать кукула(Рисунок 1D). Сложите назад трещины pupal случае боковой стороны, как вы держите приступить к задней конца (Рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Pupal случае довольно жесткой и трещины легко. В случае высокой влажности или, в частности, генотипического фона, pupal случае становится мягче и разрыв сложнее. В этих случаях, растрескивание pupal случае может быть оказана помощь, колоть его свободные края с обеих кончиков щипцы. - Удалите кукула из открытого pupal случае, тщательно вставив щипцов под животное и осторожно подтягивая(Рисунок 1F). Куколка будет придерживаться кончика щипцы(Рисунок 1ГЗЗ).
- Перенесите куколку с помощью щипушек в стеклянное дно и отбросьте ее на небольшую каплю газопроницаемого галоуглеродного масла(рисунок 1I). Держите кукула мягко на брюшной стороне, чтобы избежать возможных повреждений тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Капля галоуглеродного масла должна быть небольшой, с диаметром примерно менее половины длины кукапов. Такого количества достаточно, чтобы приклеить куколку к стеклу капиллярностью и исправить оптику для целей погружения в масляное масло. - Roll кусок влажной бумаги ткани по краям блюда для поддержания влажности. Обложка блюдо, чтобы избежать обезвоживания кускатолей во время визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как женщины, так и мужчины кухонь могут быть использованы для визуализации. Мы рекомендуем использовать третий брюшной сегменты (AIII) в качестве эталонного метамира брюшной пол, так как он почти идентичен у обоих полов с точки зрения размера, формы и узорства.
3. Live изображения растущей эпителии брюшной полости
ПРИМЕЧАНИЕ: Перевернутый лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный целью погружения масла 40x/1.3 NA, использовался для изображения куколок на различных стадиях развития.
- Ориентируйте куколку над падением масла на стеклянно-дно тарелку согласно домену и процессу, подстерегаютому (например. dorsolaterally для долгосрочного изображения в реальном времени предыдущего расширения преоткуда гнезд, или dorsally к изображению их последнего расширения и ремоделирования ткани). Смотрите Рисунок 1J,K и Рисунок 4.
- Перенесите стеклянное дно блюдо, содержащее установленных куколки, на сцену микроскопа и сосредоточьтесь на поверхности брюшной полости с помощью передаваемого света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если этот протокол оптимизирован для визуализации на перевернутых микроскопах, можно также выполнять визуализацию на вертикальном микроскопе. В этом случае образец помещается на сцену микроскопа с поверхностью стеклянного дна вверх. Галоуглеродное масло держит каждую кукучу на мениска. - Установите параметры приобретения: 1) количество срезов, как правило, между 20-40, чтобы позволить соответствующую двухмерную (2D) реконструкцию брюшной эпидермис; 2) размер шага между каждым ломтиком (например, 1 микрон); 3) временной интервал для записи (интервал 5 мин подходит для анализа высокой точности динамики ориентации клеток); и 4) разрешение кадра (например, 1024 x 1024).
- Включите соответствующие лазеры (т.е. 488 нм и 561 нм для визуализации фторофоров GFP и RFP соответственно) и отрегулируйте лазерную мощность и настройки усиления/смещения для визуализации отмеченных клеток. Используйте самую низкую возможную мощность лазера (в диапазоне 5%-20%) для минимизации фотоотбелевания и фототоксичности.
- Вручную установите положение и соответствующие лимиты для нескольких кусков с использованием присоединенной моторизованной стадии и программного обеспечения для мультипозиционного приобретения микроскопа.
4. Поколение генетических мозаик для следовывать поведения клонов клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем митотическую рекомбинацию, чтобы вызвать генетическую мозаику в брюшной эпителии через специфичную рекомбинацию (система FLP/FRT21,,22)(Рисунок 2).
- Крест девственных самок, перевозящих тепловой шок-индуцированных Flippase transgene (hs-FLP), цель распознавания FLP (FRT) сайт в определенном геномном месте (например, МЕСТО FRT в положении 40A на рукоятке L хромосомы 2), и recognizable клеточный маркер (например, Ubi-RFP.nls или Ubi-GFP.nls) distal к месту FRT, к мужчинам мутанта нося место FRT на эквивалентном геномном положении (рисунок 2A'C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Автономные и неавтономные эффекты внутри или снаружи клонов для любой потери гена функции могут быть изучены с использованием конкретных рецессивных аллелей дистальных на сайте FRT. - Создание соматических клонов FLP/FRT в гистобластах путем обработки теплового шока на третьей стадии личинок в звезде потомства креста. Это выполняется путем погружения пластиковых флаконов, содержащих животных в водяной бане на 37 градусов по Цельсию в течение 45 мин до 1 ч на блуждающих личинок (LIII) этапе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чувствительный период для митотической рекомбинации является фазой G2 клеточного цикла. Histoblasts арестованы в G2 во время всего развития личинок. - Оценка близнецов для отсутствия (т.е. мутантных клеток) или повышение (т.е., дикий тип двухпятчечных клеток) уровни флуоресцентного маркера белка от 16 ч APF вперед (Рисунок 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, 45 мин до 1 ч при 37 градусах Цельсия делает примерно 2-3 двойных клонов на область интереса (например, гемиссегмент брюшной полости). Pupae показаны слишком высокой плотности клона (например, более четырех близнецов клонов на гемисегмент) должны быть удалены из дальнейшего количественного анализа. - При идентификации клонов, изображение живущих кусков на нужной стадии и в течение желаемого периода времени, как описано в предыдущем разделе.
5. Обработка и анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные обрабатываются с помощью ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).
- Различать динамику ориентации клеток от контуров клеточного соединения.
- Проект срезов, приобретенных конфокальной микроскопией в 2D, с использованием функции максимальной интенсивности проекции (MIP) ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество срезов на стек следует свести к минимуму, чтобы избежать вне фокуса шума, создаваемого макрофаги патрулируют под эпидермис. - Установите систему планарных координат, определяющую надежные ориентиры тканей (например, границы отсека A/P) для анализа каждого набора данных(рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование одних и тех же планарных ссылок для каждого набора данных позволит сравнить несколько измерений. - Используйте плагин OrientationJ (bigwww.epfl.ch/demo/orientation/) ImageJ23,24 на локальных краях ячейки для получения качественных и количественных значений ориентации. Плагин отображает цветные накладки на входных изображениях на основе локальных ориентаций и обеспечивает числовые значения при использовании в количественном режиме(рисунок 3B'B' и Рисунок C'C'''').
ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин OrientationJ основан на структуре тензоров, 2 х 2 матрицы eigenvalues, полученных из градиентных и направленных производных (см. ссылки23,24 для подробного описания). - Используйте опцию «Дистрибуция Ориентации J» для цветовых ориентиров к опереки ячеек по отношению к установленной системе планарных координат (т.е. карты ориентации опереков ячеек)(рисунок 3B). Вариант распределения находится под меню плагина в ImageJ. Настройки для использования: Гауссиан окно сигма 1 пиксель; Кубический Сплайн - Градиент; Минимальная согласованность - 20%; Минимальная энергия - 1%. Ориентации на оперенные ячейки отображаются в виде цветного изображения с использованием опции Color Survey плагина (Hue s ориентация; Насыщенность и согласованность; и Яркость и входном изображении).
ПРИМЕЧАНИЕ: Области, которые содержат фонфлуоресценции не обеспечивают какой-либо направленной информации и должны быть вручную исключены из анализа. Настройки высокого порога уменьшают пиксели, рассматриваемые в обработанных изображениях. - Используйте опцию OrientationJ Measure для количественной оценки клеточных ориентаций и выравнивания клеток (т.е. согласованности)(рисунок 3C). Опция Measure находится под меню плагина в ImageJ. Создание небольших смежных неперекрывающихся областей, представляющих интерес (ROIs) равномерного веса (64 х 64 пикселей, около 20 мкм х 20 мкм) в пределах области, занимаемой гистобластами (Рисунок 3C).
- Рассчитайте доминирующую локальную ориентацию (т.е. усредненнюю ориентацию между соседними ячейками в среднем на карту ориентации опереки ячейки) и согласованность от ROIs. Программное обеспечение вычисляет преобладающую ориентацию и локальную согласованность в рамках каждой рентабельности инвестиций(рисунок 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Самые большие и маленькие eigenvalues структуры тензор оценивается OrientationJ используются для расчета согласованности как соотношение между их разница и их сумма. Согласованность ограничена между значениями 0'1. Значение 1 указывает на полное единообразие выравнивания, в то время как значение 0 указывает на изотропные области без выравнивания. - Статистический анализ рассчитанных значений ориентации и согласованности с нескольких изображений с помощью свободных пакетов программного обеспечения, таких как PAST25. Осевые данные, такие как значения ориентации (в градусах), надлежащим образом описаны направленной статистикой.
- С помощью программного обеспечения вычислите среднее направление и круговую дисперсию для каждого набора распределений ориентации. Статистическая значимость разницы между распределением ориентаций между различными генотипами или условиями определяется с помощью непараметрического теста Mardia-Watson-Wheeler (W-test) для равного распределения.
- Рассчитайте статистическую значимость разницы в согласованности приприменении непараметрического теста Колмогорова-Смирнова (тест К-С). Отображение данных графически по желанию (полярные участки, диаграммы баров, участки коробок и т.д.).
- Проект срезов, приобретенных конфокальной микроскопией в 2D, с использованием функции максимальной интенсивности проекции (MIP) ImageJ.
- Динамика роста от клеточных клонов
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги позволяют получить геометрические и параметры формы для ячеек из 2D MIP изображений, содержащих клон (ы) интерес. Для сравнения между несколькими клонами изображения должны быть приобретены с одинаковыми настройками.- Сегментклон области, рисуя их контуры с помощью инструмента выбора Freehand ImageJ.
- Рассчитать геометрические и параметры формы с помощью инструмента Set Measurements ImageJ в меню Analyse. Активировать область, периметр, Fit Ellipse, и формы дескриптор вариантов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит получить различные геометрические параметры, включая область (сумма пикселей внутри клона), периметр (сумма пикселя клонной границы), соотношение сторон (AR, соотношение между основными и незначительными осями наиболее подходящего Эллипса Легендра, вписанного в клонную границу), и угол ориентации (т.е. угол основной оси относительно границы). - Вычисление немерных соотношений из этих измерений восстанавливает параметры формы. К ним относятся округлость (4 х «область»/х «основная ось»2),шероховатость (твердость - область/выпуклостная область) и круговая (4 х «область»/«периметр»2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из параметров формы представляет степень отклонения клонов от идеальных форм, таких как круг или ограниченный выпуклой корпус, и все они ограничены между значениями 0 и 1. Значения, равные 1, указывают на максимальную симметрию (т.е. минимальную сложность). - Статистический анализ геометрических и формовых параметров между различными генотипами или условиями с помощью Microsoft Excel и/или PAST. Статистическая значимость разницы определяется с помощью непарного двуххвостого студенческого t-теста на равную среднее или непараметрического Колмогорова-Смирнова K-S-теста на равное распределение между условиями. Данные могут отображаться графически по желанию (например, диаграммы баров, участки коробок и т.д.). Смотрите рисунок 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанный выше протокол охватывает подготовку крозофилы кунпек для длительной живой визуализации и процедуры анализа ориентации клеток и динамики роста брюшной эпидермиса. Применяя эту методологию, можно создавать фильмы высокого разрешения развивающихся куколки на период до 48 ч без значительного фотоотбеления или фототоксичности. Снимки, изображающие эпидермис брюшной полости (например, гистопласты и LECs) в разных точках времени и от куска, ориентированных под разными углами, отображаются на рисунке 4. Последующий анализ этих фильмов позволяет выявить и количественно определить динамику локальных и глобальных изменений основных геометрических и формовых параметров, модулированных при расширении гистобластов и замене LECs. Эти анализы могут быть выполнены в различных сценариях и конкретных фонах мутантов. Они также могут быть использованы для клонов, в которых экспрессия генов изменяется, что приводит к автономной потере или усилению функциональных условий. Это позволило бы исследовать неавтономные ответы в окружающих клетках, облегчая идентификацию механизмов перекрестного разговора или клеточной связи(рисунок 5). Этот подход был недавно использован в выявлении жира / Dachsous / Четыре совместных пути в качестве ключевого элемента направления и ориентации клеток выравнивания во время развертывания планарной полярной картины брюшной эпидермис взрослого9.
Рисунок 1: Рассекание и монтаж кунп( для живой визуализации. (A) Слева направо: дорсальный вид препупов на 0 ч APF (слева) и куколки на 14 ч APF до (средний) и после (справа) удаление непрозрачного pupal случае. Указана оперкулярная область (белые наконечники стрел). (B) Показан необходимый набор инструментов для вскрытия. Слева направо: стеклянная горка, двусторонняя липкая лента, пара щипочек и блюдо со стеклянным дном. (C) Постановочные куколки обездвижены на двусторонней липкой ленте на стеклянных горках dorsal вверх. Коппаловый случай каждой куколки открывается из оперкулярной области хирургическими щипцовами. (DиE) Пилинг pupal случае постепенно. Корпус разрывается и складывается на стороны пяловых от головы до живота. (FиH) Куколка аккуратно поднимается с брюшной стороны кончиками щипцев(G)и переносится в стеклянное дно блюдо за минимальную каплю галоуглеродного масла. (Я) Куколоки затем надлежащим образом ориентированы (дорсолатерально, сверху; дорсально, снизу). Несколько куколок могут быть установлены одновременно, повторяя шаги, показанные в панелях CиI. (J) Изображение, показывающее контуры клеток дорсального гистобластского гнезда сегмента AIII, выражающего развязной маркер Атпа::GFP. Куколка была ориентирована dorsolaterally и изображен на 14 ч APF. Шкала бар No 22 мкм. (K) Изображение эквивалентно (J), но с точки зрения доза. Динамика развития тканей может быть визуализирована в течение нескольких часов. Смотрите также Рисунок 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Поколение генетической мозаики через систему FLP/FRT. (A) Родительская гетерозиготная клетка (бледная пурпурная) несет рецессивный мутантный аллель (прямоугольник) на одной хромосомой руке и ген, кодируя для флуоресцентного маркера (магента) в другой хромосомой руке (левая рука хромосомы 2 (2L) в этом примере. Участки FRT (оранжевые прямоугольники) сконструированы в обеих руках в одинаковых хромосомных положениях, проксиальных к центромере (серые овалы). (B) Активация рекомбиназы FLP тепловым шоком в клетках, приостановленных в G2, приводит к рекомбинации между ФРТ родственных хроматидов 1-1' и 2-2'. В результате происходит обмен региона на участки FRT (FRT40A на 2L). Увеличенное представление отображается на правой панели. (C) При полярной сегрегации перестроенных регионов (1-1' и 2-2') во время митоза, генерируются две генетически разные дочерние клетки. Одна дочь гомозиготна для рецессивного аллеля и для всей хромосомой руки дистальной к месту рекомбинации. Эта клетка не имеет гена, который кодирует флуоресцентный маркер, отрицательно отмеченный белым цветом. Другая дочерня клетка будет гомозиготной для руки дикого типа, что приведет к двойному пятну и выражает две копии генов, кодирующих сядя нищенствующий для флуоресцентного маркера (темного пурпурного). Для простоты не показаны сегрегации перестроенных регионов с противоположными полюсами митотической клетки (т.е. 1'2 и 1'2') не показаны. Они приводят к клеткам, фенотипически неотличимым от родительской клетки (гетерозиготный фон, бледный пурпурный). (D) Изображение, показывающее клонов в отсеке, генерируемом через СОматическую рекомбинацию FLP/FRT на третьей стадии личинок instar и визуализированное на 26 h APF. Клоны клеток отмечены отсутствием RFP.nls (черный) и гомозиготного выражения RFP.nls (яркий пурпурный, двойные пятна) в противном случае heterozygous RFP.nls фон (дим-пурпурный). Эквивалентные события могут быть достигнуты для участков FRT, расположенных в других хромосомных местах (2R, 3L, 3R и X). Смотрите также Рисунок 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Иллюстрация измерений ориентации клеток. Для извлечения информации о клеточных ориентациях, сначала установлена система планарных координат, соотносящая ориентацию клеток с оси ткани(A). Во-вторых, клеточные ориентации извлекаются из клеточных контуров(B). Наконец, клеточные ориентации и выравнивания с оси ткани количественно (C). (A)Слева, диаграмма бокового взгляда кунпы ориентированы в соответствии с системой планарных координат. Красные твердые и циановые линии определяют декартовую плоскость, представляющую границу anteroposterior (A/P) и дорсальную средней линии соответственно. В середине, перевернутое изображение, показывающее дорсолатеральный вид расширения гистобластов на 26 ч APF, изложенных стыковочным маркером Atp::GFP (входном изображении). Положение границы A/P выделено красной линией. Справа осевой компас, показывающий цветовой код, применяемый для описания ориентаций на опереки ячеек (полигоны) или усредненной ориентации клеток (бары). (B) Отображение меню Plugins/OrientationJ и окна распределения OrientationJ. OrientationJ (B') Отображение окна распределения OrientationJ, показывающее параметры параметров, используемых для получения карты ориентации опереки ячейки справа. (B'') Иллюстрация цветокодированных очертаний клеток на идеализированных ячейках. Круг не показывает предпочтительного цвета. (C) Отображение окна измерения OrientationJ. (C') Последовательные скриншоты окна OrientationJ Measure, показывающие, как измерить локальную ориентацию и согласованность в последовательных рентабельности равномерного веса. Угол локальной ориентации и согласованность для каждого региона отображаются как эллипсоиды. (C'') Представление окончательных результатов измерения ориентации. Эллипсоиды визуально отображают ориентацию (т.е. угол эллипсоидной длинной оси по отношению к границе A/P) и согласованность (т.е. соотношение между самой длинной и более короткой осью эллипсоида). Численные значения обоих параметров сохраняются в таблице для дальнейшего анализа. (C'' )) Иллюстрация цветокодированных очертаний клеток и усредненные ориентации клеток (баров) на идеализированные ячейки. Круг не показывает никакой предпочтительной ориентации. (C''' )) Представление предпочтительной местной ориентации каждой рентабельности инвестиций (местная усредненная карта ориентации). Цвета подчеркивают ориентацию каждого региона. Передняя часть слева. Шкала бар 22 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Долгосрочная живая визуализация растущей эпителии брюшной полости. (A) Представитель снимки из долгосрочных изображений фильмов от ранней до поздней фазы расширения гистобласта. Вверху: Схематические виды куколки, ориентированной на дорсолатеральную визуализацию на 16 ч и 26 ч APF. Территория, занимаемая гнездами, видимыми с дорсолатеральной стороны куколки, выделена темно-серым цветом в 16 и 26 ч АПФ. Внизу: Изображения, показывающие контуры клеток как из гистобластов, так и LECs, помеченные вездесущим выражением развязного маркера Atp::GFP. Граница A/P находится между двумя выделенными отсеками (поддельные цветные ячейки в синем и передний отсек; зеленые отсеки). (B) Представитель снимки из долгосрочных изображений фильмов от ранней до поздней фазы слияния гнезд. Вверху: схематический вид куколки, ориентированной на дорсальную визуализацию на 32 ч и 48 ч APF. Внизу: Контуры клеток (помечены и окрашены как в A). Обратите внимание, что маркер Atp':GFP позволяет разграничение формы отдельных эпителиальных клеток с течением времени с высоким разрешением. Шкала бар 22 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Свойства тканей, извлеченные из клонального анализа. (A) Примеры клонов дикого типа в отсеке A, отмеченные отсутствием RFP.nls (черный) и их двойные пятна (яркий пурпурный) на 26 ч APF. Клоны удлиняют вдоль сегментальных границ. Двойные клоны устраиваются параллельно или в тандеме. Шкала бар 22 мкм. (B) Топ: Изображения, иллюстрирующие параметры, количественные из контуров клона. Внизу: Сводная таблица, в искаженном для обозначенных параметров для диких животных (n No 29). (C) Морфология клона дикого типа на 26 ч (слева) и 47 ч (справа) APF. Клон показывает сложную морфологию границы на обоих этапах. (D) Коробка и усы графики для геометрических параметров на 26 ч (светло-желтый) и 47 ч APF (темно-желтый). Усредненная площадь и периметр значительно увеличиваются в это временное окно. (E) Полярные участки, представляющие ориентацию клонов (размер бин 18 ", изобилие пропорционально области). Ориентация поддерживается во время расширения и реконструкции. (F) Коробка и усы графики для параметров формы на 26 ч (светло-желтый) и 47 ч APF (темно-желтый). Грубость (твердость), округлость и круговорота едва меняются. Медианные значения отображаются красной горизонтальной линией, а усы расширяются до минимальных и максимальных значений распределения. Статистика была выполнена с K-SM-тестом или W-тестами (p lt; 0.0001, р.; 0,05 не значительны). Передняя часть слева, дорсаль вверх. Шкала бар No 16 мкм. Генотип hsflp1.22; FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дальнобойный порядок является важной характеристикой большинства функциональных физиологических единиц. Во время морфогенеза порядок достигается за счет интеграции сложных инструкций, реализованных с высокой временной и пространственной точностью. Многоуровневые ограничения интегрированы в стереотипные механизмы ткани.
Полярность и направленность имеют решающее значение для упорядоченного пространственного расположения во время разработки. Полярность подразумевает нарушение симметрии во время разработки. Достижение асимметрии необходимо для определения эмбриональных anteroposterior (A/P) и дорсовентральных (D/V) осей и взрослых организаций26. Помимо этой ранней роли, локальные асимметрии имеют важное значение для морфологического разнообразия на всех уровнях. Направленность является важным дополнением асимметрии и полярности во время морфогенеза. Глобальный порядок осуществляется способностью клеток чувствовать и передавать сигналы локально на базе клетки к клетке с точным чувством или ориентацией. Одиночные ячейки асимметрии гармонируют совместно с течением времени, ориентируя позиции или движения в определенных направлениях в пространстве. Сотовая связь подразумевает высекреченные факторы, контакты с ячейками и механические входы. Сигналы действуют на поля хл.клеток, которые сначала локально, а затем глобально изменить свое поведение27.
Эта работа представляет собой простой способ анализа скоординированного поведения отдельных клеток, включая их планарную ориентацию и параметры роста при развитии порядка тканей. Морфогенез взрослого живота Drosophila во время ощения представляет собой ряд технических преимуществ по сравнению с другими эквивалентными моделями, такими как расширение зародышевой полосы / опровержение28 или дорсального закрытия29 во время мухи эмбриогенеза, Drosophila крыло морфогенеза ex vivo30, брюшной корпус в Caenorhabditis elegans31, или палтальное слияние в32.
Во-первых, морфогенез живота представляет собой процесс, который может следовать в полном объеме in vivo. Непрерывное живое изображение замены LECs гистобластами может быть выполнено от 12 ч APF, когда куколка формируется, до завершения взрослого эпителиального морфогенеза. Во-вторых, он позволяет анализировать полный набор клеточного поведения, таких как миграция клеток, деление, изменения формы, делемирование и интеркалация. Наконец, он поддается генетическому вмешательству и клональному анализу. Автономные и неавтономные последствия потери и выгоды функциональной деятельности можно контролировать в прямом эфире с помощью соответствующих маркеров. Тем не менее, кука, как модель системы представляет некоторые незначительные ограничения. Из-за своей формы яйцеклетки, невозможно выполнять одновременные живые изображения боковых и царских событий с высоким разрешением. Эта проблема может быть преодолена путем выполнения последовательной визуализации в дорсолатерально и дорсально ориентированных куколок или лучше, используя несколько углов свет листселективного самолета освещения микроскопии (SPIM) микроскопии. Другим недостатком является наличие в анализах двух различных популяций клеток разных размеров (т.е. полиплоидных LECs и диплоидных гистобластов). Это может сделать сегментацию изображений сложной и две популяции клеток должны быть проанализированы отдельно.
В будущем, долгосрочная визуализация крософилы куколка может быть легко адаптирована для изучения полного спектра морфогенетических явлений, включая координацию эпидермального, мышечного и нервного развития во время метаморфоз ы в условиях дикого типа и мутантов. Кроме того, алгоритмы и плагины, используемые могут быть использованы для изучения организации, шаблона и динамики многих других тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории Мартин-Бланко за полезные обсуждения. Мы также благодарим Ника Тапона (Институт Крика, Лондон, Великобритания), Блумингтонский фондовый центр (Университет Индианы, США) и FlyBase (за аннотацию гена Дрозофилы). Федерика Манджоне была поддержана JAE-CSIC предварительной стипендий. Лаборатория Мартина-Бланко финансировалась из Программы Estatal de Fomento de la Investigacion Cientefica y T'cnica de Excelencia (BFU2014-57019-P и BFU2017-82876-P) и из Фонда Рамона Аресеса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analysis Software | - | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | - | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | - | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux's archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, Ø, Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, Suppl . 41-60 (1988).
